專利名稱：制備富含對(duì)映體的α－羥基羧酸及酰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備富含對(duì)映體的α-羥基羧酸及酰胺的方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種方法，其中在第一步驟中，在醇腈酶的存在下由氰化物給體、醛和酮生成羥腈，而所述羥腈通過腈水解酶或腈水合酶在第二步驟中進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸。本發(fā)明還涉及以此方式操作的反應(yīng)體系，及可以實(shí)現(xiàn)上述二步驟反應(yīng)的新有機(jī)體。
在有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中，富含對(duì)映體的α-羥基羧酸及酰胺是重要的合成產(chǎn)品。這些化合物可成功作為用于配體合成的前體分子、作為手性外消旋體-拆分試劑、或作為制備生物活性物質(zhì)的中間體產(chǎn)品。
這類化合物的傳統(tǒng)合成方法通常采取羥腈反應(yīng)，隨后通過形成非對(duì)映的鹽來進(jìn)行酸水解和外消旋體的拆分(Bayer-Walter，Lehrbuchder Organischen Chemie，S.Hirzel Verlag Stuttgart，第22版555頁)。在酰胺階段可任選地停止水解反應(yīng)，或?qū)τ谒峥扇^程執(zhí)行。
迄今為止，光學(xué)活性的α-羥基羧酸的制備也可以通過以下方法實(shí)現(xiàn)或者在手性催化劑如諸如醇腈酶之類的酶的存在下，以氰化物給體對(duì)醛的不對(duì)稱加成反應(yīng)的形式實(shí)現(xiàn)羥腈的形成，然后再進(jìn)行“傳統(tǒng)的”水解；或者備選地制備外消旋的羥腈，然后在腈水解酶的存在下進(jìn)行對(duì)映選擇性水解。在以醇腈酶為酶的存在下通過氫氰酸與醛的轉(zhuǎn)化形成手性羥腈的以上第一種方法由例如Effenberger等進(jìn)行過描述(F.Effenberger等，Angew.Chem.1987，99，491-492)。在此所給出的反應(yīng)發(fā)生在由不與水混溶、優(yōu)選為乙酸乙酯的有機(jī)溶劑相和水相組成的兩相體系中。在此情況下實(shí)現(xiàn)了至少部分具有出色的收率和光學(xué)純度的醛的轉(zhuǎn)化。已有人就羥腈的光學(xué)純度徹底研究了在酶(R)-醇腈酶和(S)-醇腈酶的存在下氰化物給體對(duì)醛的酶加成反應(yīng)?；蛘撸龇磻?yīng)也可在純粹的水體系中進(jìn)行，并優(yōu)選在低pH值下進(jìn)行反應(yīng)(U.Niedermeyer，M.R.Kula，Angew.Chem.1990，102，423)。在這類反應(yīng)中也使用了固定化酶(DE-PS 1300111)。還嘗試過在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行酶促反應(yīng)(P.Methe等，US-PS 5,122,462；J.Am.Chem.Soc.，1999，120，8587；US 5,177,242)。其它的轉(zhuǎn)化方法還見述于US-PS 5,122,462；Biotechno1.Prog.1999，15，98-104；J.Am.Chem.Soc.，1999，120，8587)。此外，還開發(fā)了固定(S)-醇腈酶的方法，在其操作方式下(S)-醇腈酶可與(R)-醇腈酶相媲美。這樣，Effenberger等通過將(S)-醇腈酶附著到硝化纖維的載體上獲得了其固定化(F.Effenberger等，Angew.Chem.1996，108，493-494)。Andruski等闡述了酶附著到多孔膜來實(shí)現(xiàn)固定化(US 5,177,242)。盡管有這些部分前途十分看好的所提議使用固定化酶的解決方案，但最近報(bào)道使用非固定化酶的研究再一次不斷地出現(xiàn)在出版物上(如EP-A 0927766和US 5,714,356)。
雖然在羥腈的生物催化不對(duì)稱合成過程中獲得了出色的對(duì)映選擇性，但隨后所需的水解步驟有很大的問題，該水解步驟要使用強(qiáng)無機(jī)酸通過“傳統(tǒng)的”酸水解來實(shí)現(xiàn)。這會(huì)產(chǎn)生大量的鹽廢物，造成經(jīng)濟(jì)和生態(tài)問題。此外，所需的水解條件也不利，原因在于要求的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)且溫度高。在此水解條件下，具有很大的外消旋化風(fēng)險(xiǎn)。
獲得要求的光學(xué)活性α-羥基羧酸及酰胺的備選方法涉及-如上所述-外消旋羥腈的酶水解。
這種轉(zhuǎn)化可通過腈水解酶來催化。腈水解酶為可以將有機(jī)氰基化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸的酶。它們屬于E.C.3.5.5.1類，尤其可用于(+)-異丁苯丙酸合成的商業(yè)應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)已知狀態(tài)的概況可參見Enzyme Catalysis in Organic Synthesis，VCH，1995，367頁及以下幾頁。Yamamoto等(Appl.Environ.Microbiol.1991，57，3028-32)也描述了使用腈水解酶制備富含對(duì)映體的扁桃酸。
腈水合酶屬于E.C.4.2.1.84類。它們由α，β-亞基(subunit)組成，可以以具有高達(dá)20多個(gè)不同基的多聚體多肽的形式存在(Bunch A.W.(1998)，Nitriles，inBiotechnology，8a卷，Biotransformations I，第6章，Eds.Rehm H.J.，Reed G.，Wiley-VCH，277-324頁；Kobayashi，M.；Shimizu，S.(1998)Metalloenzyme Nitrile Hydratasestructure，regulation，and application to biotechnology.Nature Biotechnology 16(8)，733-736)。許多文獻(xiàn)介紹了從腈到酰胺的酶轉(zhuǎn)化(EP 0362829(Nitto)；DE 4480132(Institute Gniigenetika)；WO98/32872(Novus)；US 5,200,331；DE 3922137；EP 0445646；Enzyme Catalysis in Organic Synthesis，VCH，1995，365頁及以下幾頁)。
然而，這些備選的方法也存在許多缺點(diǎn)。對(duì)映選擇性經(jīng)常不能＞99％ee，而這在制藥要求中尤其是前提。此外，由于存在腈水解酶和腈水合酶對(duì)氰化物給體的存在敏感的風(fēng)險(xiǎn)，所以開始時(shí)羥腈必須很純。
所有以前方法中的一個(gè)普遍的缺點(diǎn)是所述工藝的兩階段特征，這導(dǎo)致了時(shí)空收率和總體工藝效率明顯降低。由于必須考慮到酶促羥腈合成和酶促腈皂化的反應(yīng)條件互不相容，所以必須采用包括兩個(gè)條件重整階段的兩階段工藝。
本發(fā)明的目的是提供制備富含對(duì)映體的α-羥基羧酸/酰胺的另一種方法的說明書。從經(jīng)濟(jì)和生態(tài)觀點(diǎn)來看，本方法應(yīng)該具有技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)。尤其是在使用的原料成本、可靠性及效率(如時(shí)空收率)上應(yīng)優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的方法，并且應(yīng)能避免現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)。尤其是應(yīng)該可以避免源自以前所有方法的兩階段特性。
這些目的以權(quán)利要求中指明的方式來實(shí)現(xiàn)。
事實(shí)上，在制備富含對(duì)映體的α-羥基羧酸或富含對(duì)映體的α-羥基羧酸酰胺的方法中，起點(diǎn)是氰化物給體、醛或酮，并且在醇腈酶及腈水解酶或腈水合酶的存在下后者以極其驚人的、并且根據(jù)本發(fā)明是特別有利的方式進(jìn)行反應(yīng)，因此，可得到所述目的的解決方案。使用本發(fā)明的體系可以得到收率非常好、對(duì)映體的富集度特別高的富含對(duì)映體的α-羥基羧酸/酰胺。產(chǎn)生本發(fā)明時(shí)本領(lǐng)域的技術(shù)人員絕不可能知道所述酶的多級(jí)連用可以以此方式有效應(yīng)用于現(xiàn)有的反應(yīng)介質(zhì)。就此而言，可認(rèn)為尤其令人驚訝，特別是可用的氰化物數(shù)量相當(dāng)多，卻沒有產(chǎn)生現(xiàn)有技術(shù)所預(yù)期的抑制效應(yīng)，尤其是對(duì)腈水解酶或腈水合酶而言。
相應(yīng)地，本發(fā)明的一個(gè)具體構(gòu)想涉及這樣的事實(shí)，即在制備富含對(duì)映體的α-羥基羧酸的方法中，氰化物給體在醇腈酶和腈水解酶的存在下與醛或酮一起轉(zhuǎn)變。
類似地，富含對(duì)映體的α-羥基羧酸酰胺可以在醇腈酶和腈水合酶的存在下由氰化物給體、醛或酮得到。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員所能立即想到的用于此目的的所有酶可用作醇腈酶。從Enzyme Catalysis in Organic Synthesis，Eds.K.Drauz，H.Waldmann，VCH，1995，580頁及下頁中可找到選取的酶。在給定的反應(yīng)條件下使用這些酶帶來長(zhǎng)的可使用壽命，而充分的轉(zhuǎn)化具有優(yōu)勢(shì)。這些酶尤其應(yīng)該是源自于選自以下組中有機(jī)體的那些醇腈酶兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、巴西三葉膠和木薯(Mannihotesculenta)。為了制備(R)-羥腈，使用了源自命名的微生物體或杏核的醇腈酶。就此而言應(yīng)當(dāng)指出，為了制備(S)-α-羥基羧酸，優(yōu)選應(yīng)當(dāng)利用(S)-系列的醇腈酶，反過來，也可以保證充分轉(zhuǎn)化為最終的分子。
就腈水解酶而言，原則上可以類似地使用所有可獲得的腈水解酶，只要在給定的環(huán)境條件下其可以保證充分的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化率。從Enzyme Catalysis in Organic Synthesis，Eds.K.Drauz，H.Waldmann，VCH，1995，365頁及下頁可找到選取的酶。這些酶尤其應(yīng)該是源自于選自以下組中有機(jī)體的那些酶紅球菌菌株或糞產(chǎn)堿菌。通過與起可逆作用的醇腈酶相互作用，腈水解酶使腈官能向羧酸發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)化。由此可保證形成的羥腈失去平衡，并導(dǎo)致根據(jù)使用過量的組分而使醛或酮或氰化物給體完全轉(zhuǎn)化。為了保證成品中所要求的對(duì)映體純度，腈水解酶應(yīng)以對(duì)映選擇性盡量高的方式進(jìn)行反應(yīng)。在此情況下，對(duì)使用的醇腈酶的對(duì)映選擇性要求并不是很高。然而，如果使用的腈水解酶的對(duì)映選擇性不夠高，則應(yīng)強(qiáng)調(diào)適當(dāng)有所不同的醇腈酶的存在。
就腈水合酶而言，原則上可以類似地使用所有可獲得的腈水合酶，只要在給定的環(huán)境條件下可以保證充分的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化率。從Enzyme Catalysis in Organic Synthesis，Eds.K.Drauz，H.Waldmann，VCH，1995，365頁及下頁可找到選取的酶。這些酶尤其應(yīng)該是源自于選自以下組中紅球菌菌株的有機(jī)體的那些酶，尤其是紅球菌物種(R.spec.)、紫紅紅球菌(R.rhodochrous)和紅平紅球菌(R.erythropolis)。在本說明書中，可以參考EP 03001715.6專利以及這里所指定并優(yōu)選使用的腈水合酶。通過與起可逆作用的醇腈酶相互作用，腈水合酶使腈官能向羧酸發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)化。由此，可保證形成的羥腈失去平衡，并導(dǎo)致根據(jù)使用過量的組分而使醛或酮或氰化物給體完全轉(zhuǎn)化。為了保證成品中所要求的對(duì)映體純度，腈水合酶應(yīng)以對(duì)映選擇性盡量高的方式進(jìn)行反應(yīng)。在此情況下，對(duì)使用的醇腈酶的對(duì)映選擇性要求并不是很高。然而，如果使用的腈水合酶的對(duì)映選擇性不夠高，則應(yīng)強(qiáng)調(diào)適當(dāng)有所不同的醇腈酶的存在。應(yīng)當(dāng)指出，作為進(jìn)一步酶促水解或傳統(tǒng)水解的結(jié)果，由該體系生成的富含對(duì)映體的α-羥基羧酸酰胺可以轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酸。如果就此而言在酰胺階段產(chǎn)生的對(duì)映體純度不夠，則可進(jìn)一步使用以對(duì)映選擇方式工作的酰胺酶來改進(jìn)。合適的酰胺酶可在Enzyme Catalysis inOrganic Synthesis，VCH，1995，367頁及以下幾頁找到。
上述酶可以應(yīng)用于本發(fā)明的方法中，其既可以是野生型，也可以是通過誘變改良而另外開發(fā)的變種?？梢缘玫礁纳频拿阜€(wěn)定性和/或選擇性的誘變方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。具體而言，這些方法為飽和誘變、隨機(jī)誘變、改組方法(shuffling methods)以及位點(diǎn)定向誘變(Eigen M.和Gardinger W.(1984)Evolutionary molecularengineering based on RNA replication.Pure & Appl.Chem.56(8)，967-978；Chen & Arnold(1991)Enzyme engineering for nonaqueous solventsrandom mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organicmedia.Bio/Technology 9，1073-1077；Horwitz，M.和L.Loeb(1986)″Promoters Selected From Random DNA Sequences″Proceedings OfThe National Academy Of Sciences Of The United States Of America83(19)7405-7409；Dube，D.和L.Loeb(1989)″Mutants Generated ByThe Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active Site Of TheBeta-Lactamase Gene″Biochemistry 28(14)5703-5707；Stemmer PC(1994).Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.Nature.370；389-391以及Stemmer PC(1994)DNA shuffling by randomfragmentation and reassemblyIn vitro recombination for molecularevolution.Proc Natl Acad Sci USA.91；10747-10751)。根據(jù)本法明，術(shù)語“改善的選擇性”應(yīng)理解為對(duì)映選擇性的提高和/或基質(zhì)選擇性的降低。
在給定情況下考慮的酶可以作為經(jīng)均質(zhì)純化的化合物、并以自由體的形式在應(yīng)用中使用。此外，所述酶也可以作為未受損的寄生生物的成分使用，或者與分解的且任意高度純化的宿主生物的細(xì)胞團(tuán)一起使用。所述酶還可以以固定化的形式使用(Bhavender P.Sharma，Lorraine F.Bailey和Ralph A.Messing，″ImmobilisierteBiomaterialien-Techniken und Anwendungen″，Angew.Chem.1982，94，836-852)。冷凍干燥法對(duì)固定化具有有利的影響(Dordick等.J.Am.Chem.Soc.194，116，5009-5010；Okahata等，Tetrahedron Lett.1997，38，1971-1974；Adlercreutz等，Biocatalysis 1992，6，291-305)。特別優(yōu)選在諸如以下表面活性物質(zhì)的存在下進(jìn)行冷凍干燥Aerosol OT或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)或Brij 52(二甘醇單十六烷基醚)(Goto等，Biotechnol.Techniques 1997，11，375-378)。作為CLECs來使用也是可以想到的(St Clair等，Angew Chem Int Ed Engl 2000 Jan，39(2)，380-383)。
原則上，本發(fā)明的具體方法可以在純的水溶液中進(jìn)行。然而，也可以在水溶液中加入任意比例的水溶性有機(jī)溶劑，以便例如就少量水溶性基質(zhì)對(duì)反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。特別考慮以乙二醇、DME或甘油作為這類溶劑。但是以溶劑混合物作為水相的多相體系、尤其是兩相體系也可進(jìn)一步用于本發(fā)明方法中。這里，某些不溶于水的溶劑經(jīng)證實(shí)是相當(dāng)?shù)?DE 10233107)。其中就此所陳述的相應(yīng)地適用于此。
原則上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可自由選擇反應(yīng)期間的主要溫度。這種人員優(yōu)先接受配方(receipt)的指導(dǎo)，并在盡可能短的時(shí)間內(nèi)以盡可能高的收率得到純度盡可能高的產(chǎn)品。此外，所使用的酶在使用的溫度下應(yīng)具有充分的穩(wěn)定性，進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的對(duì)映選擇性應(yīng)盡可能高。對(duì)于衍生自嗜熱生物的酶的使用，80-100C的溫度可以明確代表反應(yīng)過程中溫度范圍的上限。至于水體系中的低限，-15℃的溫度顯然是合理的。所述溫度范圍優(yōu)選調(diào)節(jié)在10℃-60℃，更優(yōu)選為20℃-40℃。
反應(yīng)期間的pH值可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)酶的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)化率來進(jìn)行確定，并針對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。一般來說，針對(duì)酶的pH優(yōu)選范圍可以選擇為3-11。優(yōu)選可得到3.0-10.0，特別是6.0-9.0的pH范圍。
在進(jìn)一步的配置中，本發(fā)明涉及酶促反應(yīng)體系，該體系包含醇腈酶、腈水解酶或腈水合酶、水、氰化物給體及醛或酮。任選地，另外可以存在有機(jī)溶劑，如以上所詳細(xì)描述的。
原則上就該反應(yīng)體系而言，原先已陳述的有關(guān)本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)及優(yōu)選實(shí)施方案同樣適用。
所述反應(yīng)體系可以有利地應(yīng)用于，例如，既可間歇操作又可連續(xù)操作的攪拌罐、多級(jí)攪拌罐或膜反應(yīng)器中。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語“膜反應(yīng)器”應(yīng)理解為任何一種其中催化劑封裝在反應(yīng)器內(nèi)，而低分子量物質(zhì)可以供應(yīng)給或可以離開所述反應(yīng)器的反應(yīng)容器。就此而言，所述膜可以直接集成在反應(yīng)室中，或可以以獨(dú)立的過濾模件結(jié)合在外面，反應(yīng)溶液連續(xù)地或間歇地流經(jīng)過濾模件，而滯留物則回流到反應(yīng)器中。尤其合適的實(shí)施方案描述在WO 98/22415和Wandrey等在Jahrbuch 1998，Verfahrenstechnikund Chemieingenieurwesen，VDI 151頁及以下幾頁；Wandrey等在Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds，2卷，VCH 1996，832頁及以下幾頁；Kragl等，Angew.Chem.1996，6，684及下頁。
除了間歇和半連續(xù)的操作模式外，該裝置可以實(shí)施連續(xù)操作模式，如所希望的，可以按交叉流過濾模式(

圖1)或以死端過濾(圖2)進(jìn)行。兩種方法的變化形式原則上在現(xiàn)有技術(shù)中有描述(EngineeringProcesses for Bioseparations，Ed.L.R.Weatherley，Heinemann，1994，135-165；Wandrey等，Tetrahedron Asymmetry 1999，10，923-928)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面由具有用于醇腈酶和腈水解酶或腈水合酶的克隆基因的全細(xì)胞催化劑構(gòu)成。本發(fā)明的全細(xì)胞催化劑應(yīng)當(dāng)優(yōu)選具有就醇腈酶或備選的腈水解酶或腈水合酶之一而言的以上所提及的代表物。在腈水合酶存在的情況下，所述全細(xì)胞催化劑應(yīng)類似地優(yōu)選包含用于酰胺酶的克隆基因。這類有機(jī)體的制備方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的(PCT/EP00/08473；PCT/US00/08159；Sambrook等，1989，Molecular cloningA Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Balbas P & Bolivar F.1990；Design andconstruction of expression plasmid vectors in E.coli，MethodsEnzymology 185，14-37；VectorsA Survey of Molecular CloningVectors and Their Uses.R.L.Rodriguez & D.T.Denhardt，Eds205-225)。其中所闡述的處理模式可以以同樣的方式在此實(shí)施。就一般的流程而言(PCR、克隆、表達(dá)等)，也可以參考以下文獻(xiàn)及其中相應(yīng)的引用文獻(xiàn)Universal GenomeWalkerTM Kit User Manual，Clontech，3/2000及其中所引用的文獻(xiàn)；Triglia T.；Peterson，M.G.和Kemp，D.J.(1988)，A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lieoutside the boundaries of known sequences，Nucleic Acids Res.16，8186；Sambrook，J.；Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，Molecular cloningalaboratory manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork；Rodriguez，R.L.和Denhardt，D.T.(eds)(1988)，Vectorsa surveyof molecular cloning vectors and their uses，Butterworth，Stoneham。
這種有機(jī)體的優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)表達(dá)了兩種酶體系，而只需為反應(yīng)培養(yǎng)一種rec有機(jī)體。為了使酶的表達(dá)與其轉(zhuǎn)化率相匹配，妥善編碼的核酸片段可以以不同的復(fù)制份數(shù)容納在不同的質(zhì)粒上，和/或可以對(duì)不同強(qiáng)表達(dá)的基因使用不同的強(qiáng)啟動(dòng)子。使用以此方式匹配的酶體系，有利的是不會(huì)引起中間體化合物的積聚，因?yàn)樵撝虚g化合物在合適的情況下可起阻礙反應(yīng)的作用，從而使所考慮的反應(yīng)可以以最佳的總速率進(jìn)行。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)此已充分了解(PCT/EP 00/08473；Gellissen等，.Appl.Microbiol.Biotechnol.1996，46，46-54)。就微生物而言，原則上可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員能考慮到的可應(yīng)用于此目的的所有微生物，舉例來說，例如諸如多形漢遜酵母、畢赤酵母、釀酒酵母菌的酵母，諸如大腸桿菌、枯草桿菌的原核生物，或諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞的真核細(xì)胞。應(yīng)優(yōu)選大腸桿菌(E.coli)菌株用于此目的。更詳細(xì)地應(yīng)優(yōu)選E.coli XL1 Blue、NM 522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP10-或HB101。就所述生物而言，尤其優(yōu)選使用DE 10155928中所命名的微生物。
就醛或酮而言，可以使用含有脂肪族或芳香族/雜芳香族殘基的那些醛或酮。只要證明這些殘基對(duì)實(shí)際轉(zhuǎn)化是惰性的，它們就可以任意地支化和/或取代。在所述反應(yīng)中有利地為使用以下通式(I)的化合物 其中R1可以表示(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C8)烷氧基烷基、(C3-C8)環(huán)烷基、(C6-C18)芳基、(C7-C19)芳烷基、(C3-C18)雜芳基、(C4-C19)雜芳烷基、((C1-C8)烷基)1-3-(C3-C8)環(huán)烷基、((C1-C8)烷基)1-3-(C6-C18)芳基、((C1-C8)烷基)1-3-(C3-C18)雜芳基，并且R2可以表示H、R1。
就氰化物給體而言，可以考慮本領(lǐng)域的技術(shù)人員在給定條件下能得到的所有化合物。尤其應(yīng)使用可以盡可能便宜地獲得的那些，然而應(yīng)強(qiáng)調(diào)這些化合物在本發(fā)明反應(yīng)中的最佳轉(zhuǎn)化率的重要性。根據(jù)定義，氰化物給體為在給定反應(yīng)條件下能釋放出CN-離子的化合物。具體而言，這些氰化物為選自以下組中的那些氫氰酸及諸如堿金屬氰化物、三甲基甲硅烷氰化物的金屬氰化物。
一般地，在本發(fā)明的反應(yīng)中其過程是這樣的諸如以下(野生型，通過重組手段制備)的生物質(zhì)、或未損的寄生生物(例如，全細(xì)胞催化劑)中的酶與醛或酮一起被注入水性反應(yīng)基體中，然后加入氰化物給體，舉例來說如堿金屬氰化物(氰化鈉)。在合適的反應(yīng)條件下，通過中間體直接形成相應(yīng)的羥腈，并由此形成富含對(duì)映體的α-羥基羧酸或酰胺。這些產(chǎn)物可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法從反應(yīng)混合物中分離開來。該過程優(yōu)選的實(shí)施方法是這樣的通過過濾去除相對(duì)高分子量的組分，而酸或酰胺則通過結(jié)晶立即直接從混合物中分離，或者，對(duì)親脂性的酸或酰胺而言，應(yīng)在分離之前插入有機(jī)介質(zhì)中的萃取步驟。也可以通過離子交換色譜法對(duì)酸進(jìn)行重新調(diào)理。
這樣，例如苯甲醛就可以和氰化鈉一起轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的扁桃酸，其高的收率為＞80％、優(yōu)選＞85％、進(jìn)一步更優(yōu)選＞90％、91％、92％、93％、94％，再進(jìn)一步優(yōu)選＞95％、96％、97％，對(duì)映體富集度為＞90％、91％、92％、93％、94％，進(jìn)一步優(yōu)選＞95％、96％、97％，并且極優(yōu)選為＞98％、99％。
從制備本發(fā)明的全細(xì)胞催化劑的角度來看，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用以前描述過的現(xiàn)有技術(shù)的方法。具體地，腈水解酶或腈水合酶、同時(shí)還有醇腈酶被包含在所述全細(xì)胞催化劑中。相關(guān)的基因序列可從公共資源的基因數(shù)據(jù)庫中搜集到，例如，可從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(Internet:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html)查到。就此而言特別優(yōu)選的是酶，尤其是對(duì)氰化物具有高耐受性的腈水解酶或腈水合酶。就此而言，應(yīng)優(yōu)選這樣的過程相應(yīng)的序列應(yīng)與相應(yīng)要求的基因序列如啟動(dòng)子等一起連接成一個(gè)質(zhì)粒或連接到多個(gè)質(zhì)粒上。此后，所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)變成選定的有機(jī)體，后者被復(fù)制，然后活性克隆-未損的或壓碎的生物質(zhì)形式的-被插入到所述反應(yīng)中。在產(chǎn)生本發(fā)明時(shí)，完全不清楚以這樣的方式可以實(shí)現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化，并取得如此好的結(jié)果。
被稱為(C1-C8)烷基的是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，及其所有鍵合異構(gòu)體。這些可以被以下基團(tuán)單取代或多取代(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)烷基。
術(shù)語“(C2-C8)烯基”應(yīng)理解為如以上所表示的具有至少一個(gè)雙鍵的、除了甲基以外的(C1-C8)烷基殘基。
術(shù)語“(C2-C8)炔基”應(yīng)理解為如以上所表示的具有至少一個(gè)三鍵的、除了甲基以外的(C1-C8)烷基殘基。
術(shù)語“(C3-C8)環(huán)烷基”應(yīng)理解為環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基殘基等。它們可以由一個(gè)或多個(gè)鹵素和/或含N、O、P、S原子的殘基所取代，和/或可以具有在環(huán)中包含N、O、P、S原子的殘基，舉例來說，如1-、2-、3-、4-哌啶基，1-、2-、3-吡咯烷基，2-、3-四氫呋喃基，2-、3-、4-嗎啉基。后者可以被以下基團(tuán)單取代或多取代(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷基。
術(shù)語“(C6-C18)芳基殘基”應(yīng)理解為含6-18個(gè)碳原子的芳族殘基。這些包括尤其是諸如苯基、萘基、蒽基、菲基、聯(lián)苯殘基的化合物。后者可以被以下基團(tuán)單取代或多取代(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷基。
(C7-C19)芳烷基殘基是通過(C1-C8)烷基殘基與所述分子鍵合的(C6-C18)芳基殘基。
(C1-C8)烷氧基是通過氧原子與所考慮的分子鍵合的(C1-C8)烷基殘基。
(C1-C8)鹵烷基是被一個(gè)或多個(gè)鹵原子取代的(C1-C8)烷基殘基。
(C3-C18)雜芳基殘基在本發(fā)明范圍內(nèi)表示5-、6-或7-元的含有3-18個(gè)碳原子的芳環(huán)體系，該體系具有雜原子，例如在雜環(huán)中的氮、氧或硫?？紤]到的這類雜芳族化合物有，具體而言諸如以下的殘基1-、2-、3-呋喃基，1-、2-、3-吡咯基，1-、2-、3-噻吩基，2-、3-、4-吡啶基，2-、3-、4-、5-、6-、7-吲哚基，3-、4-、5-吡唑基，2-、4-、5-咪唑基，吖啶基，喹啉基，菲啶基，2-、4-、5-、6-嘧啶基。后者可以被以下基團(tuán)單取代或多取代(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷基。
術(shù)語“(C4-C19)雜芳烷基”應(yīng)理解為對(duì)應(yīng)于(C7-C19)芳烷基殘基的雜芳香族體系。
所考慮的鹵素為氟、氯、溴和碘。
術(shù)語“富含對(duì)映體的”所表示的實(shí)際情況是當(dāng)混合物中存在一個(gè)光學(xué)對(duì)映體時(shí)，其另一個(gè)的比例量為＞50％。
當(dāng)存在一個(gè)立構(gòu)中心時(shí)，所提出的結(jié)構(gòu)涉及兩種可能的對(duì)映體，當(dāng)分子中存在多于一個(gè)的立構(gòu)中心時(shí)，所述結(jié)構(gòu)將涉及所有可能的非對(duì)映體，而就非對(duì)映體而言，其涉及包含以下所討論化合物中的兩種可能的對(duì)映體。
所引述的文獻(xiàn)段落應(yīng)視為由本發(fā)明的公開內(nèi)容所包括。
權(quán)利要求
1.一種在醇腈酶和腈水解酶或腈水合酶的存在下從氰化物給體、醛或酮制備富含對(duì)映體的α-羥基羧酸或富含對(duì)映體的α-羥基羧酸酰胺的方法。
2.一種在醇腈酶和腈水解酶的存在下從氰化物給體、醛或酮制備富含對(duì)映體的α-羥基羧酸的方法。
3.一種在醇腈酶和腈水合酶的存在下從氰化物給體、醛或酮制備富含對(duì)映體的α-羥基羧酸酰胺的方法。
4.權(quán)利要求1-3之一的方法，其特征在于使用了選自以下組中有機(jī)體的或植物成分的醇腈酶兩色蜀黍、巴西三葉膠、木薯和杏核。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于使用了選自以下組中有機(jī)體的腈水解酶紅球菌菌株或糞產(chǎn)堿菌。
6.權(quán)利要求1或3的方法，其特征在于使用了選自以下組中有機(jī)體的腈水合酶紅球菌物種、紫紅紅球菌和紅平紅球菌。
7.前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于所述反應(yīng)在pH值為6.0-9.0的含水介質(zhì)中進(jìn)行。
8.前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于所述反應(yīng)在20-40C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
9.一種酶促反應(yīng)體系，該體系含有醇腈酶、腈水解酶或腈水合酶、水、氰化物給體及醛或酮。
10.一種全細(xì)胞催化劑，該催化劑具有用于醇腈酶及腈水解酶或腈水合酶的克隆基因。
11.權(quán)利要求9的全細(xì)胞催化劑，其特征在于當(dāng)存在腈水合酶時(shí)，所述全細(xì)胞催化劑同樣具有用于酰胺酶的克隆基因。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于制備富含對(duì)映體的α－羥基羧基酸和酰胺的酶促方法，該方法包括，在一個(gè)步驟中通過羥腈的中間階段，將羰基化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酸/酰胺。本發(fā)明還提供了一種這樣操作的反應(yīng)體系以及一種優(yōu)選用于此反應(yīng)的全細(xì)胞催化劑。
文檔編號(hào)C12P13/00GK1867677SQ200480029641
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2004年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者卡爾海因茨·德羅茲, 斯特凡·布赫霍爾茨, 哈拉爾德·格勒格爾 申請(qǐng)人:德古薩股份公司