專利名稱：生物催化劑的固定的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠，涉及它們的制造方法并涉及它們作為生物催化劑的應用。
含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠可用作各種依賴于細胞內(nèi)所含的酶的生物轉化的生物催化劑。例如，包含含有腈水合酶的紅球菌屬菌株的包裹的細菌細胞的聚丙烯酰胺珠可用來將腈轉化成酰胺。
含有酶的聚丙烯酰胺珠已經(jīng)描述于Nilsson等(Biochim.Biophys.Acta 1972，268，253-256)。將三乙醇胺-HCl緩沖液(0.05M，pH 7.0，0.5mL)中的過硫酸銨(0.25g，1.1mmol)溶液和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.5mL，0.385mg，3.3mmol)加入三乙醇胺-HCl緩沖液(0.05M，pH 7.0)中的(60mL)胰蛋白酶(60mg)、丙烯酰胺(8.55g，120mmol)和N，N′-亞甲基-雙丙烯酰胺(0.45g，2.9mmol)的溶液。將該溶液邊攪拌邊加入含有失水山梨糖醇倍半油酸酯(1mL)的有機相(甲苯/氯仿 290∶110，400mL)。在4℃聚合30分鐘。Nilsson等(Biochim.Biophys.Acta 1972，268，253-256)未描述將細胞包裹入聚丙烯酰胺珠。
Mosbach等(US 4,647,536A)描述了制造各種含有包裹的細胞的珠聚合物，其中動物油、植物油、磷酸三丁酯、液體硅酮、石蠟油或苯二甲酸二丁酯被用作水不溶相。通過將丙烯酰胺(17.6g，248mmol)和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(1.2g，8mmol)溶于tris(三羥基甲基氨基甲烷)緩沖液(100mL，0.05M，pH 7)，將8mL該溶液與酵母細胞或酶(例如過氧化物酶體，10mg/mL，2mL)以及過硫酸銨(0.4g/mL，20μL(8mg，0.03mmol))混合并將該混合物分散在豆油(40mL)中制造了含有酵母細胞或酶的聚丙烯酰胺珠。當已經(jīng)達到合適的珠大小時加入N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(100μL，77.0mg，0.66mmol)。
本發(fā)明的一個目的是提供含有細胞的聚丙烯酰胺珠以及它們的制備方法。
該目的是通過權利要求12所述的聚丙烯酰胺珠和權利要求1所述的方法實現(xiàn)的。
本發(fā)明的制造含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠的方法包括以下步驟(i)提供丙烯酸單體混合物的水溶液，(ii)提供在過硫酸鹽水溶液中的細胞的懸浮液，
(iii)提供在不與水混溶的液體中的叔胺水溶液的乳液，上述液體可任選含有表面活性劑，(iv)混合步驟(i)提供的溶液和步驟(ii)提供的懸浮液，(v)將步驟(iv)中獲得的混合物加入步驟(iii)中提供的攪拌的乳液，和(vi)聚合丙烯酸單體的混合物同時包裹細胞以形成含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠。
本發(fā)明方法的優(yōu)點在于，在加入丙烯酸單體、細胞和過硫酸鹽之前已將叔胺加入不與水混溶的液體。
用本發(fā)明方法形成的聚丙烯酰胺珠是球形或近乎球形的。
所述聚丙烯酰胺珠的大小可為0.01-5mm，機械強度至少為10mN。優(yōu)選地，所述聚丙烯酰胺珠的大小為0.05-3mm，機械強度至少為200mN。更優(yōu)選地，所述聚丙烯酰胺珠的大小為0.1-1.5mm，機械強度至少為300mN。
所述機械強度是通過對置于兩個平板之間的珠施壓直到珠破裂來測量的。
所述細胞可以是細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。優(yōu)選地，所述細胞是細菌細胞，更優(yōu)選地，它是諾卡氏菌形放線菌(nocardioformActinomycete)屬細菌或腸桿菌科細菌的細胞。再優(yōu)選地，所述細胞是紅球菌屬或埃希氏菌屬細菌的細胞，且最優(yōu)選地，它是紅球菌屬細菌的細胞。
革蘭氏陽性菌的例子有諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)、醋酸桿菌屬(Acetobacterium)、放線菌屬(Actinomyces)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、戈登氏菌屬(Gordona)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、紅球菌屬(Rhodococcus)或擬無枝酸菌屬(Amycolatopsis)的細菌，革蘭氏陰性菌的例子有諸如醋桿菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaliges)、從毛單胞菌屬(Comamonas)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)或克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的細菌。
諾卡氏菌形放線菌屬細菌的例子有戈登氏菌屬、諾卡氏菌屬、紅球菌屬和擬無枝酸菌屬的細菌。腸桿菌科細菌的例子有檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬和克雷伯氏菌屬的細菌。
所述細胞可用本領域已知的方法培養(yǎng)。
所述細菌細胞的染色體上可含有編碼感興趣酶的基因，或者可用含有編碼感興趣酶的基因的質(zhì)粒轉化。
如果細菌細胞的染色體上可含有編碼感興趣酶的基因，并且該酶是分解代謝酶，則可在存在合適的酶誘導物時培養(yǎng)該細菌細胞。例如，可在存在腈水合酶誘導物時培養(yǎng)紅球菌屬菌株的細胞以誘導腈水合酶表達。合適的紅球菌屬菌株腈水合酶誘導物的例子有甲基丙烯酰胺、巴豆酰胺和丙酰胺。
如果細菌細胞用含有編碼感興趣酶的基因的質(zhì)粒轉化，且該基因出于誘導型啟動子控制之下，則可在培養(yǎng)期間的合適點上誘導編碼感興趣酶的基因轉錄。誘導型啟動子的例子有trp、lac、tac、阿拉伯糖和鼠李糖啟動子。誘導取決于所采用的啟動子，例如，鼠李糖啟動子可通過加入L-鼠李糖來誘導。
培養(yǎng)之后可從發(fā)酵液中分離含有感興趣的酶的細胞。優(yōu)選細胞在5℃以下儲存在合適的緩沖液中。
所述丙烯酸單體混合物可由至少一個單官能丙烯酸單體和至少一個雙官能丙烯酸單體構成。
單官能丙烯酸單體可以是下式表示的單體 式中，R1是H或甲基，R2選自NH2、NHR3，N(R3)2、NH-(CH2)n-N(R3)2和O-(CH2)n-N(R3)2R3在每次出現(xiàn)時為C1-4-烷基，和n是1-4的整數(shù)。
單官能丙烯酸單體的例子有丙烯酰胺(R1＝H，R2＝NH2)，甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，R2＝NH2)，N-烷基丙烯酰胺(R1＝H，R2＝NHR3，R3＝C1-4-烷基)如N-乙基丙烯酰胺(R3＝乙基)、N-異丙基丙烯酰胺(R3＝異丙基)或N-叔丁基丙烯酰胺(R3＝叔丁基)，N-烷基甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，R2＝NHR3，R3＝C1-4-烷基)如N-乙基甲基丙烯酰胺(R3＝乙基)或N-異丙基甲基丙烯酰胺(R3＝異丙基)，N，N-二烷基丙烯酰胺(R1＝H，R2＝N(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如N，N-二甲基丙烯酰胺(R3＝甲基)和N，N-二乙基-丙烯酰胺(R3＝乙基)，N-[(二烷基氨基)烷基]丙酰胺(R1＝H，R2＝NH-(CH2)n-NH(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如N-[3-(二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺(n＝3，R3＝甲基)或N-[3-(二乙基氨基)丙基]丙烯酰胺(n＝3，R3＝乙基)，N-[(二烷基氨基)烷基]甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，R2＝NH-(CH2)n-NH(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(R3＝甲基)或N-[3-(二乙基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(R3＝乙基)，丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯(R1＝H，R2＝O-(CH2)n-NH(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(n＝2，R3＝甲基)、丙烯酸2-(二甲基氨基)丙酯(n＝3，R3＝甲基)或丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯(n＝2，R3＝乙基)，以及甲基丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯(R1＝甲基，R2＝O-(CH2)n-NH(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(n＝2，R3＝甲基)。
N-烷基丙烯酰胺、N-烷基甲基丙烯酰胺、N，N-二烷基丙烯酰胺、N，N-二烷基-甲基丙烯酰胺、N-[(二烷基氨基)烷基]丙烯酰胺、N-[(二烷基氨基)-烷基]甲基丙烯酰胺、丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯和丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯可用本領域已知的方法制備，例如通過使烯丙酰氯、丙烯酸甲酯、甲基烯丙酰氯或甲基丙烯酸甲酯與各自的烷基胺、二烷基氨或(二烷基氨基)烷基胺或(二烷基氨基)醇反應。
雙官能丙烯酸單體可以是下式表示的單體。
式中，R1是H或甲基-X-是-(CH2)n-或-(CH-OH)n-n是1-4的整數(shù)雙官能丙烯酸單體的例子有N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(R1＝H，-X-＝-(CH2)n-，n＝1)，N，N′-亞甲基雙甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，-X-＝(CH2)n，N＝1)，N，N′-亞乙基雙丙烯酰胺(R1＝H，-X-＝-(CH2)n-，n＝2)，N，N′-亞乙基雙-甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，-X-＝-(CH2)n-，n＝2)，N，N′-亞丙基雙丙烯酰胺(R1＝H，-X-＝-(CH2)n-，n＝3)和N，N′-(1，2-二羥基亞乙基)雙丙烯酰胺(R1＝H，-X-＝-(CH-OH)n-，n＝2)雙官能丙烯酸單體可用本領域已知的方法制備，例如，其中-X-是-(CH2)的雙官能丙烯酸單體可通過使烯丙酰氯、丙烯酸甲酯、甲基烯丙酰氯或甲基丙烯酸甲酯與各自的二胺反應來制備。
優(yōu)選地，所述雙官能丙烯酸單體選自N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙甲基丙烯酰胺和N，N′-(1，2-二-羥基亞乙基)雙丙烯酰胺，所述單官能單體選自丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N，N-二烷基丙烯酰胺、N-[(二烷基-氨基)烷基]甲基丙烯酰胺、(二烷基氨基)烷基丙烯酸酯和(二烷基氨基)烷基甲基丙烯酸酯。
更優(yōu)選地，所述雙官能丙烯酸單體是N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，所述單官能單體選自丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯。
所述過硫酸鹽可以是任何水溶性過硫酸鹽。水溶性過硫酸鹽的例子有過硫酸銨和堿金屬的過硫酸鹽。堿金屬的例子有鋰、鈉和鉀。優(yōu)選地，所述過硫酸鹽是過硫酸銨或過硫酸鉀，更優(yōu)選地，它是過硫酸銨。
所述叔胺可以是任何水溶性叔胺。優(yōu)選地，所述叔胺是N，N，N′，N′-四甲基乙二胺或3-(二甲基氨基)丙腈，更優(yōu)選地，它是N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。
所述不與水混溶的液體可以是任何在聚合溫度下是液態(tài)的不與水混溶物質(zhì)。不與水混溶的液體的例子有礦物油、植物油和合成的油類。礦物油的例子有甲苯、二甲苯、脫芳構的混合烴如Exxsol D100和混合異鏈烷烴如Isopar M。植物油的例子有葵花籽油、橄欖油、花生油、杏仁油、紅花油、豆油和玉米油。合成油的例子有硅酮油。
優(yōu)選不與水混溶的液體是礦物油。更優(yōu)選地，它是飽和烴或其混合物。最優(yōu)選地，它是脫芳構的混合烴或混合異鏈烷烴。
所述不與水混溶的液體可任選含有表面活性劑。所述表面活性劑可以是任何合適的表面活性劑。合適的表面活性劑的例子有非離子表面活性劑如失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、乙二醇脂肪酸酯或甘油脂肪酸酯，以及陽離子表面活性劑如四烷基銨鹽，其中至少一個烷基含有至少8個碳原子。脂肪酸的例子有油酸或硬脂酸。烷基的例子有乙基、丙基和丁基。含有至少8個碳原子的烷基的例子有辛基、壬基和癸基。
表面活性劑/油的比例可以高達0.10∶1(w/w)。優(yōu)選不使用表面活性劑。
可將丙烯酸單體溶于水或緩沖液來提供丙烯酸單體混合物的水溶液?？蓪⑦^硫酸鹽在水或緩沖液中的溶液與細胞在水或緩沖液中的懸液混合來提供在過硫酸鹽水溶液中的細胞懸浮液。優(yōu)選將丙烯酸單體溶于緩沖液并將細胞懸浮在該緩沖液中，將pH調(diào)至5-10，該范圍適合感興趣的酶。例如，6-8的pH范圍適合來自紅球菌屬菌株的腈水合酶。
可在不與水混溶的液體中將叔胺在水或緩沖液中的溶液乳化來提供在不與水混溶的液體中的叔胺水溶液的乳液。
優(yōu)選地，丙烯酸單體混合物的水溶液、過硫酸鹽水溶液中的細胞懸液以及不與水混溶的液體中的叔胺水溶液的乳液(其中所述液體任選含有表面活性劑)進行脫氧，例如通過用氮氣凈化。
將丙烯酸單體混合物的水溶液以及過硫酸鹽水溶液中的細胞懸液混合并立即邊攪拌邊滴入在不與水混溶的液體中的叔胺水溶液的乳液中。合適的攪拌器的例子有三葉或四葉渦輪攪拌器、螺旋槳攪拌器或visco-jet攪拌器。優(yōu)選使用visco-jet攪拌器。優(yōu)選地，聚合在5-35℃下進行。更優(yōu)選地，聚合在15-25℃下進行，且最優(yōu)選在18-22℃下進行。
下面是聚合步驟的優(yōu)選比例丙烯酸單體混合物/水的比例優(yōu)選為0.05∶1-0.5∶1(w/w)。更優(yōu)選為0.1∶1-0.3∶1(w/w)。最優(yōu)選為0.2∶1-0.28∶1(重量/重量(w/w))。
雙官能丙烯酸單體/單官能丙烯酸單體的比例優(yōu)選為0.001∶1-0.8∶1(mol/mol)。更優(yōu)選為0.01∶1-0.08∶1(mol/mol)。最優(yōu)選為0.03∶1-0.06∶1(mol/mol)。
干細胞/丙烯酸單體混合物的比例優(yōu)選為0.001∶1-1∶1(w/w)。更優(yōu)選為0.2∶1-0.9∶1。再優(yōu)選為0.4-0.8∶1(w/w)。最優(yōu)選為0.5∶1-0.7∶1(w/w)。
過硫酸鹽/丙烯酸單體混合物的比例優(yōu)選為0.0001∶1-0.1∶1(mol/mol)。更優(yōu)選為0.001∶1-0.05∶1(mol/mol)。最優(yōu)選為0.002∶1-0.03∶1(mol/mol)。
叔胺/過硫酸鹽的比例優(yōu)選為0.2∶1-50∶1(mol/mol)。優(yōu)選為0.8∶1-10∶1(mol/mol)。最優(yōu)選為1∶1-5∶1(mol/mol)。
油/水的比例優(yōu)選為1.2∶1-10∶1(w/w)。更優(yōu)選為1.3∶1-7∶1(w/w)。再優(yōu)選為1.4∶1-5∶1(w/w)。最優(yōu)選為1.5∶1-4∶1(w/w)。
優(yōu)選地，聚合反應之后獲得的聚丙烯酰胺珠被分離，例如通過傾析或過濾。分離的珠可用水或水溶液洗滌以除去痕量的不與水混溶的液體，并且可儲存在合適的緩沖液中。
用本發(fā)明方法獲得的含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠也是本發(fā)明的一個部分。優(yōu)選地，所述包裹的細胞是含有腈水合酶的紅球菌屬菌株的細胞。
本發(fā)明的另一部分是將上述含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠用作生物催化劑以將底物轉化成產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述底物是腈而所述產(chǎn)物是相應的酰胺。更優(yōu)選地，所述底物是3-氰基吡啶而所述產(chǎn)物是煙酰胺。
腈的例子有氨腈、氰基乙酸、丙二腈(malonodinitrile)、氰基乙酸甲酯、丙烯腈、丁腈、戊腈、丁烯腈、甲基丙烯腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯腈、2-氯苯腈、4-氯苯腈、吡嗪基腈(pyrazinecarbonitrile)、吡嗪-2，3-二腈、2-氟代腈、噻吩-2-腈、新戊腈(pivalonitrile)和環(huán)丙腈(cyclopropanecarbonitrile)。
轉化可以分批反應或連續(xù)反應進行。優(yōu)選地，反應是在合適的緩沖液中在10-35℃下進行的。


圖1顯示了在3-氰基吡啶連續(xù)反應生成煙酰胺的過程中反應混合物中煙酰胺的濃度與時間的關系。
圖2顯示了在3-氰基吡啶連續(xù)反應生成煙酰胺的過程中反應混合物中3-氰基吡啶的濃度與時間的關系。
圖3顯示了在3-氰基吡啶連續(xù)反應生成煙酰胺的過程中3-氰基吡啶到煙酰胺的轉化率與時間的關系。
實施例1培養(yǎng)紅球菌屬菌株1.1.制備預培養(yǎng)物(preculture)在含有1.25％(w/w)酵母提取物、0.05％(w/w)MgSO4·7H2O、0.003％(w/w)CoCl2·6H2O、0.5％(w/w)檸檬酸鈉、0.75％(w/w)甲基丙烯酰胺和0.2％(w/w)KH2PO4的無菌培養(yǎng)基(200mL，pH 7.0)內(nèi)接種紅球菌屬菌株的瓊脂平板培養(yǎng)物。將預培養(yǎng)物在錐形瓶(500mL)中于28℃以120rpm培養(yǎng)48小時。
1.2.制備培養(yǎng)物在含有1.25％(w/w)酵母提取物、0.05％(w/w)MgSO4·7H2O、0.003％(w/w)CoCl2·6H2O、0.5％(w/w)檸檬酸鈉、0.75％(w/w)甲基丙烯酰胺和0.2％(w/w)KHPO4的無菌培養(yǎng)基(12L，pH 7.0)內(nèi)接種按實施例1.1的描述獲得的紅球菌屬菌株的預培養(yǎng)物(200mL)。將此培養(yǎng)物在發(fā)酵罐(12L)中于28℃，pH 7.0，溶解氧濃度＞40％(28℃下，1體積空氣/(發(fā)酵液的體積×分鐘)時溶解的氧氣的濃度，)和300-400rpm培養(yǎng)48小時。細胞通過離心收獲，用磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7.0)洗滌，濃縮至于細胞濃度為15-20％(w/w)并儲存在-40℃。
實施例2紅球菌屬菌株的腈水合酶活性測定在25℃下將含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠(濕重0.2g)加到磷酸鹽緩沖液(0.05M，pH 7.0，30mL)中的3-氰基吡啶(1.59g)溶液中。在5和15分鐘后取出樣品(1000μl)。將這些樣品立即與20μl H2SO4(48％(w/w))混合，用甲醇/水＝40∶60(v/v)的混合物稀釋100倍體積，過濾(孔徑0.2μm)并用HPLC分析(柱C8反相，流速1mL/min，流動相甲醇/水＝40∶60(v/v))，波長210nm，25℃)。將濕的生物催化劑在55℃、20毫巴下干燥4小時后獲得干的聚丙烯酰胺珠。
實施例3將紅球菌屬菌株的細胞包裹在聚丙烯酰胺珠中將丙烯酰胺(42.25g，594mmol)、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(3.75g，24mmol)和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(1.5g，9mmol)溶于磷酸鹽緩沖液(37.5g，50mM，pH7.0)并將溶液的pH調(diào)至7.0。在按實施例1的描述獲得的紅球菌屬菌株細胞的懸浮液(20％(w/w)干細胞，165g)中加入用蒸餾水(5g)配制的過硫酸銨(0.465g，2mmol)溶液。在反應器(1L)中于350rpm下將用蒸餾水(5g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.232g，2mmol)溶液分散于礦物油(Exxsol D100，350g)。單體溶液、細胞懸浮液和油各自用氮氣凈化15分鐘。單體溶液(流速2.5g/min)和細胞懸浮液(流速5g/min)被分別泵入一2.5mL的混合燒瓶。在20℃將所得混合物立即邊攪拌(350rpm，visco-jet攪拌器)邊滴入油中。完全加入反應混合物后再在20℃攪拌3.5小時。所得含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠通過過濾分離，用蒸餾水洗滌并使其在水中溶脹。將該聚丙烯酰胺珠于4℃儲存在兩倍體積的儲存緩沖液(3.55g/L硫酸鈉，0.25％(w/w)脫氫乙酸，鈉鹽，0.05％(w/w)煙酰胺，pH 7.0)中。溶脹的珠為規(guī)則的球形，其大小為200-1200μm，機械強度＞300mN。干聚丙烯酰胺珠/濕聚丙烯酰胺珠的比例是0.11∶1(w/w)。比活為9.5μmol煙酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
實施例4將3-氰基吡啶轉化成煙酰胺，分批反應25℃下，將在實施例3中獲得的含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠(100g濕重)溫和攪拌加入磷酸鹽緩沖液(0.05M，pH 7.0，400mL)中的3-氰基吡啶(40g，3.8mol)溶液。15分鐘后，99％的3-氰基吡啶被轉化成煙酰胺，30分鐘后99％的3-氰基吡啶被轉化成煙酰胺。
實施例5將3-氰基吡啶轉化成煙酰胺，連續(xù)反應
25℃下，將在實施例3中獲得的含有紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠(100g濕重)加入磷酸鹽緩沖液(0.05M，pH 7.0，400mL)中的3-氰基吡啶(40g，3.8mol)溶液。溫和攪拌反應混合物，在其中連續(xù)加入用磷酸鹽緩沖液(0.05M，pH 7.0)配制的3-氰基吡啶(10％(w/w))溶液，并連續(xù)取出反應混合物(不含聚丙烯酰胺珠)。在25℃下連續(xù)轉化3.1小時，為期5周。5周后未觀察到珠的磨損。確定3-氰基吡啶和煙酰胺的濃度(見圖1和2)并計算轉化率(見圖3)。
實施例6將紅球菌屬菌株的細胞包裹入聚丙烯酰胺珠將丙烯酰胺(422.5g，5940mmol)、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(37.5g，240mmol)和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(15g，90mmol)溶于磷酸鹽緩沖液(375g，50mM，pH 7.0)并將溶液的pH調(diào)至7.0。在按實施例1的描述獲得的紅球菌屬菌株細胞的懸浮液(16％(w/w)干細胞，1650g)中加入用蒸餾水(25g)配制的過硫酸銨(4.65g，20mmol)溶液。在反應器(10L)中將用蒸餾水(25g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(2.32g，20mmol)溶液分散于礦物油(Exxsol D100，3500g)。單體溶液、細胞懸浮液和油各自用氮氣凈化15分鐘。單體溶液(流速13.5g/min)和細胞懸浮液(流速27g/min)被分別泵入一常規(guī)的管子。在20℃將所得混合物邊攪拌(215rpm，visco-jet攪拌器)邊泵入油中。完全加入反應混合物后再在20℃攪拌3.5小時。按實施例3的描述將所得含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠分離、洗滌和儲存。溶脹的珠為規(guī)則的球形，其大小為200-1200μm，機械強度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/濕聚丙烯酰胺珠的比例是0.09∶1(w/w)。比活為7.3μmol煙酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
實施例7含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠的儲存穩(wěn)定性將實施例5中獲得的含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠于4℃在水性儲存溶液(3.55g/L硫酸鈉，0.25％(w/w)脫氫乙酸鈉，鈉鹽，0.05％(w/w)煙酰胺，pH 7.0)中儲存50周。每五周取出樣品。將聚丙烯酰胺珠分離，用蒸餾水洗滌并在25℃下在新鮮的儲存溶液(3.55g/L硫酸鈉，0.25％(w/w)脫氫乙酸，鈉鹽，0.05％(w/w)煙酰胺，pH 7.0)中懸浮1小時。按實施例2的描述確定腈水合酶的活性。確定干聚丙烯酰胺珠/濕聚丙烯酰胺珠的比例。在55℃和20毫巴下將濕聚丙烯酰胺珠干燥4小時后獲得干聚丙烯酰胺珠。
表1含有紅球菌屬細胞的聚丙烯酰胺珠的儲存穩(wěn)定性
實施例8將紅球菌屬菌株的細胞包裹入聚丙烯酰胺珠用類似于實施例3所述的包裹方法進行包裹，但使用用蒸餾水(7.0g)配制的過硫酸銨(1.86g，8mmol)溶液和用蒸餾水(5g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.928g，8mmol)溶液。按實施例3的描述將所得含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠分離、洗滌和儲存。溶脹的珠為規(guī)則的球形，其大小為250-1300μm，機械強度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/濕聚丙烯酰胺珠的溶脹率為0.12∶1(w/w)。比活為7.8μmol煙酰胺/(min×mg聚丙烯酰胺珠)。
實施例9將紅球菌屬菌株的細胞包裹入聚丙烯酰胺珠用類似于實施例3所述的包裹方法進行包裹，但使用紅球菌屬菌株細胞的懸浮液(16％(w/w)干細胞)且聚合反應在10℃進行9小時。按實施例3的描述將所得含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠分離、洗滌和儲存。溶脹的珠為規(guī)則的球形，其大小為250-1300μm，機械強度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/濕聚丙烯酰胺珠的比例為0.09∶1(w/w)。比活為7.3μmol煙酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
實施例10將紅球菌屬菌株的細胞包裹入聚丙烯酰胺珠將丙烯酰胺(42.25g，426mmol)、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(3.75g，24mmol)和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(1.5g，9mmol)溶于磷酸鹽緩沖液(37.5g，50mM，pH7.0)并將溶液的pH調(diào)至7.0。在按實施例1的描述獲得的紅球菌屬菌株細胞的懸浮液(18％(w/w)干細胞，165g)中加入用蒸餾水(7g)配制的過硫酸銨(1.86g，8mmol)溶液。在反應器(1L)中將用蒸餾水(7g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.928g，8mmol)溶液分散于礦物油(Exxsol D100，350g)。單體溶液、細胞懸浮液和油分別用氮氣凈化15分鐘。單體溶液(流速2.5g/min)和細胞懸浮液(流速5g/min)被分別泵入一2.5mL的混合燒瓶。在20℃將所得混合物立即邊攪拌(350rpm，visco-jet攪拌器)邊滴入油中。完全加入反應混合物后再在20℃攪拌3.5小時。按實施例3的描述將所得含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠通過過濾分離，洗滌并儲存。溶脹的珠為規(guī)則的球形，其大小為200-700μm，機械強度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/濕聚丙烯酰胺珠的比例是0.21∶1(w/w)。比活為5.4μmol煙酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
實施例11將紅球菌屬菌株的細胞包裹入聚丙烯酰胺珠用類似于實施例10所述的包裹方法進行包裹，但用丙烯酰胺(42.25g，594mmol)代替N，N-二甲基丙烯酰胺(42.25g，426mmol)并用N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(1.5g，9mmol)代替甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(1.5g，9mmol)。按實施例3的描述將所得含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠分離、洗滌和儲存。溶脹的珠為規(guī)則的球形，其大小為150-1200μm，機械強度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/濕聚丙烯酰胺珠的比例為0.13∶1(w/w)。比活為5.9μmol煙酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
實施例12培養(yǎng)包含具有在鼠李糖啟動子轉錄控制之下編碼酰胺酶的基因的質(zhì)粒的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)種的菌株12.1.制備預-預培養(yǎng)物(pre-preculture)在含有1.6％(w/w)胰胨、1.0％(w/w)酵母提取物、0.5％(w/w)NaCl和0.01％(w/w)氨芐青霉素的無菌培養(yǎng)基(5mL，pH 7.0)內(nèi)接種包含具有在鼠李糖啟動子轉錄控制之下編碼酰胺酶的基因的質(zhì)粒的大腸埃希氏菌種的菌株的瓊脂平板培養(yǎng)物。將預-預培養(yǎng)物在振蕩器上于37℃培養(yǎng)12小時。
12.2.制備預培養(yǎng)物在實施例12.1所述的無菌培養(yǎng)基(100mL)內(nèi)接種5mL按實施例12.1的描述獲得的大腸埃希氏菌種的菌株的預-預培養(yǎng)物。將此預培養(yǎng)物在振蕩器上于37℃培養(yǎng)。在OD6000.25時在培養(yǎng)物中加入0.2％(w/w)L-鼠李糖。在OD6005時通過離心收獲細胞，用緩沖液(1.80g/L乙二胺四乙酸，2.65g/L二鈉鹽/乙酸鈉緩沖液，pH 7.0)洗滌兩次并重懸于相同的緩沖液中，使干細胞濃度為15-20％(w/w)。細胞懸浮液儲存在-40℃。
實施例13酰胺酶測定37℃下，將含有包裹的含酰胺酶的埃希氏菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠(0.4g濕重)邊攪拌邊加入用磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH 8.0，9mL)配制的2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(1.0g)溶液。在0、30和60分鐘后取出樣品(200μl)。測量形成的氨的摩爾量。形成的氨的摩爾量等于形成的2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酸的摩爾量。
實施例14將包含具有在鼠李糖啟動子轉錄控制之下編碼酰胺酶的基因的質(zhì)粒的大腸埃希氏菌種的菌株包裹入聚丙烯酰胺珠用類似于實施例3所述的包裹方法進行包裹，但使用按實施例12的描述獲得的大腸埃希氏菌種菌株細胞的懸浮液(19％(w/w)干細胞)、用蒸餾水(7.0g)配制的過硫酸銨(1.86g，8mmol)溶液以及用蒸餾水(5g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.928g，8mmol)溶液，并在400rpm(visco-jet攪拌器)下進行聚合。按實施例3的描述將所得含有包裹的大腸埃希氏菌種菌株細胞的聚丙烯酰胺珠通過過濾分離并于4℃儲存在磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH 7.0)中。溶脹的珠為不規(guī)則的球形，其大小為200-2000μm，機械強度＞200mN。干聚丙烯酰胺珠/濕聚丙烯酰胺珠的比例是0.21∶1(w/w)。比活為0.029μm 2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
實施例15將2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺轉化成2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酸，分批反應在37℃，將實施例14中獲得的含有包含具有編碼酰胺酶的基因的質(zhì)粒的大腸埃希氏菌種菌株的細胞的聚丙烯酰胺珠(0.4g濕重)加入用磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.0，10mL)配制的2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(1.0g，6.366mmol)溶液中，保持1小時。形成2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酸(2％)。
實施例16
將包含具有在鼠李糖啟動子轉錄控制之下編碼酰胺酶的基因的質(zhì)粒的大腸埃希氏菌種的菌株包裹入聚丙烯酰胺珠將丙烯酰胺(21.13g，297mmol)、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(1.88g，12mmol)和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(0.75g，4.8mmol)溶于磷酸鹽緩沖液(18.75g，50mM，pH 7.0)并將溶液的pH調(diào)至7.0。在按實施例12的描述獲得的大腸埃希氏菌種菌株細胞的懸浮液(19％(w/w)干細胞，82.5g)中加入用蒸餾水(2.5g)配制的過硫酸銨(0.93g，4mmol)溶液。在反應器(1L)中于450rpm下將用蒸餾水(5g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.928g，8mmol)溶液分散于礦物油(Exxsol D100，350g)。單體溶液、細胞懸浮液和油分別用氮氣凈化15分鐘。單體溶液(流速2.5g/min)和細胞懸浮液(流速5g/min)被分別泵入一2.5mL的混合燒瓶。在20℃將所得混合物立即邊攪拌(450rpm，visco-jet攪拌器)邊滴入油中。完全加入反應混合物后再在20℃攪拌3.75小時。按實施例3的描述將所得含有包裹的大腸埃希氏菌種菌株細胞的聚丙烯酰胺珠分離并洗滌，在4℃儲存在磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH 7.0)中。溶脹的珠為不規(guī)則的球形，其大小為1000-2000μm，機械強度＞200mN。干聚丙烯酰胺珠/濕聚丙烯酰胺珠的比例是0.25∶1.00(w/w)。比活為0.016μmol煙酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
實施例17使用含有包裹的含腈水合酶的紅球菌屬細胞的聚丙烯酰胺珠作為將腈轉化成酰胺的生物催化劑在25℃下，將在實施例7中獲得的含有包裹的紅球菌屬菌株細胞的聚丙烯酰胺珠(25g濕重)溫和攪拌加入磷酸鹽緩沖液(0.05M，pH 7.0，400mL)中或磷酸鹽緩沖液(0.05M，pH 7，100mL)和甲醇的混合物中的腈溶液。在5、15和60分鐘后取出樣品并立即與H2SO4(48％(w/w)，0.03mL)混合。反應混合物通過HPLC或GC分析。測定比活。結果示于表2。
表2用含有含腈水合酶的紅球菌屬細胞的聚丙烯酰胺珠作為生物催化劑時各種腈到相應的酰胺的生物轉化。
權利要求
1.一種制備含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠的方法，所述方法包括以下步驟(i)提供丙烯酸單體混合物的水溶液，(ii)提供在過硫酸鹽水溶液中的細胞的懸浮液，(iii)提供在不與水混溶的液體中的叔胺水溶液的乳液，所述液體任選含有表面活性劑，(iv)混合步驟(i)提供的溶液和步驟(ii)提供的懸浮液，(v)將步驟(iv)中獲得的混合物邊攪拌邊加入步驟(iii)中提供乳液，(vi)聚合丙烯酸單體的混合物，同時包裹細胞以形成含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺珠的大小為0.05-3mm，機械強度至少為200mN。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺珠的大小為0.1-1.5mm，機械強度至少為300mN。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，干細胞/丙烯酸單體混合物的比例為0.001∶1-1∶1(w/w)。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，干細胞/丙烯酸單體混合物的比例為0.2∶1-0.9∶1(w/w)。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞是細菌細胞。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述細胞是諾卡氏菌形放線菌屬細菌或腸桿菌科細菌的細胞。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述叔胺是N，N，N’，N’-四甲基乙二胺或3-(二甲基氨基)丙腈。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述不與水混溶的液體是礦物油。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，未使用表面活性劑。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(vi)中形成的聚丙烯酰胺珠被分離。
12.用權利要求1-11中任一項所述方法獲得的含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠。
13.如權利要求12所述的聚丙烯酰胺珠，其特征在于，所述包裹的細胞是含有腈水合酶的紅球菌屬菌株的細胞。
15.如權利要求12或13所述的聚丙烯酰胺珠作為將底物轉化成產(chǎn)物的生物催化劑的用途。
16.如權利要求15所述的用途，其特征在于，所述底物是腈，所述產(chǎn)物是相應的酰胺。
17.如權利要求16所述的用途，其特征在于，所述腈是3-氰基吡啶，所述產(chǎn)物是煙酰胺。
全文摘要
用包括以下步驟的方法制備了含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠(i)提供丙烯酸單體混合物的水溶液，(ii)提供在過硫酸鹽水溶液中的細胞的懸浮液，(iii)提供在不與水混溶的液體中的叔胺水溶液的乳液，上述液體可任選含有表面活性劑，(iv)混合步驟(i)提供的溶液和步驟(ii)提供的懸浮液，(v)將步驟(iv)中獲得的混合物加入步驟(iii)中提供攪拌的乳液，(vi)聚合丙烯酸單體的混合物，同時包裹細胞以形成含有包裹的細胞的聚丙烯酰胺珠。
文檔編號C12P17/12GK1871345SQ200480031541
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月26日 優(yōu)先權日2003年10月27日
發(fā)明者J·巴特, K·魯濱遜, J·齊格瓦 申請人:隆薩股份公司