專(zhuān)利名稱(chēng)：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及輪狀病毒疫苗制劑。本發(fā)明涉及來(lái)自一種輪狀病毒血清型的減毒輪狀病毒群體在預(yù)防與來(lái)自另一種輪狀病毒血清型的輪狀病毒感染有關(guān)的疾病中的用途。具體地講，本發(fā)明涉及來(lái)自G1血清型的減毒輪狀病毒群體在預(yù)防與來(lái)自非G1血清型的輪狀病毒感染有關(guān)的疾病中的用途。
背景技術(shù)：
在世界許多地區(qū)，急性傳染性腹瀉是疾病和死亡的主要原因。在發(fā)展中國(guó)家，腹瀉疾病的影響令人吃驚。在亞洲、非洲和拉丁美洲，估計(jì)每年的腹瀉病例為30-40億例，這些病例中約500-1000萬(wàn)導(dǎo)致死亡(Walsh，J.A.等N.Engl.J.Med.，301967-974(1979))。
輪狀病毒(rotavirus)被認(rèn)為是嬰幼兒及低齡兒童嚴(yán)重腹瀉的最主要的原因之一(Estes，M.K.Rotaviruses and Their Replication in FieldsVirology，第三版，F(xiàn)ields等編輯，Raven出版社，Philadelphia，1996)。據(jù)估計(jì)輪狀病毒疾病是每年超過(guò)100萬(wàn)例死亡的原因。輪狀病毒所引起的疾病最普遍影響的是6-24個(gè)月大的兒童，在溫帶，該病的流行高峰期一般發(fā)生在較冷的月份，而在熱帶，則全年保持不變。輪狀病毒通常以糞-口途徑，通過(guò)人傳人進(jìn)行傳播，潛伏期約1-3天。與6-24個(gè)月齡組的感染不同，新生兒一般無(wú)癥狀或僅出現(xiàn)輕微病癥。與低齡兒童通常所發(fā)生的嚴(yán)重疾病相比，大多數(shù)成年人因曾經(jīng)感染過(guò)輪狀病毒而受到保護(hù)，因此大多數(shù)成年人的感染輕微或無(wú)癥狀(Offit，P.A.等，Comp.Ther.，8(8)21-26，1982)。
輪狀病毒一般為球狀，其名稱(chēng)源自其獨(dú)特的外殼和內(nèi)殼的衣殼結(jié)構(gòu)或者雙層殼衣殼結(jié)構(gòu)(double-shelled capsid structure)。通常，輪狀病毒雙層殼衣殼結(jié)構(gòu)包裹著內(nèi)層蛋白殼或含有基因組的核心。輪狀病毒的基因組由11個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA組成，該RNA編碼至少11個(gè)不同的病毒蛋白。這些病毒蛋白(viral protein，VP)中被稱(chēng)為VP4和VP7的兩種蛋白，排列在雙層殼衣殼結(jié)構(gòu)的外層。輪狀病毒的內(nèi)衣殼是一種蛋白，該蛋白是被稱(chēng)為VP6的輪狀病毒蛋白。尚不清楚這三種特殊的輪狀病毒蛋白，在輪狀病毒感染后誘發(fā)免疫應(yīng)答中的相對(duì)重要性。但是，VP6蛋白決定組抗原(group antigen)和亞組抗原(subgroup antigen)，而VP4蛋白和VP7蛋白則是血清型(serotype)特異性的決定因素。
迄今為止，已鑒定出至少14種輪狀病毒G血清型和11種輪狀病毒P血清型(Linhares A.C.& Bresse J.S.，Pan.Am.J.Publ.Health2000，9，305-330)。其中，人輪狀病毒中，已鑒定出10種G血清型和6種P血清型。
VP7蛋白是一種分子量(MW)為38,000的糖蛋白(非糖基化時(shí)為34,000MW)，為第7、第8或第9基因組節(jié)段的翻譯產(chǎn)物(因不同的毒株而異)。輪狀病毒感染后，該蛋白刺激中和抗體的形成。VP4蛋白是一種分子量約88,000的非糖基化蛋白，為第4基因組節(jié)段的翻譯產(chǎn)物。在輪狀病毒感染后，該蛋白同樣刺激中和抗體的形成。
由于VP4蛋白和VP7蛋白均為中和抗體所針對(duì)的病毒蛋白，因此相信它們將是開(kāi)發(fā)輪狀病毒疫苗的主要候選者，以提供針對(duì)輪狀病毒疾病的保護(hù)作用。
已知在兒童期的早期，天然輪狀病毒感染會(huì)誘發(fā)保護(hù)性免疫。因此，十分需要一種減毒輪狀病毒活疫苗。優(yōu)選該疫苗應(yīng)為口服疫苗，因?yàn)檫@是該病毒的天然感染途徑。
發(fā)現(xiàn)該病毒后，用于預(yù)防輪狀病毒感染的早期疫苗開(kāi)發(fā)，始于二十世紀(jì)七十年代。最初，對(duì)來(lái)自動(dòng)物和人體的減毒株進(jìn)行了研究，取得了各式各樣或令人失望的結(jié)果。更多近期的努力集中在較為成功的人-動(dòng)物重配株(reassortant)上。
Ward描述了被稱(chēng)作89-12的輪狀病毒株；參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,474,773和Bernstein，D.L.等，Vaccine，16(4)，381-387，1998。89-12毒株是1988年從采自一個(gè)患天然輪狀病毒病的14個(gè)月大兒童的大便樣本中分離出來(lái)的。根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,474,773，如Ward在J.Clin.Microbiol.，19，748-753，1984中所述的方法，HRV 89-12人輪狀病毒隨后在原代非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞中通過(guò)2次傳代，并在MA-104細(xì)胞中通過(guò)4次傳代，進(jìn)行培養(yǎng)適應(yīng)。然后，在MA-104細(xì)胞中進(jìn)行3次噬斑純化(至第9次傳代)，再進(jìn)行2次傳代后使之在這些細(xì)胞中生長(zhǎng)。再進(jìn)行一次傳代(第12次傳代)，將其保藏于ATCC，保藏號(hào)為ATCC VR 2272。該保藏毒株稱(chēng)為89-12C2。
Bernstein等人于1998年在Vaccine中的論文在下文稱(chēng)為Vaccine(1998)論文。該論文描述了口服給予候選人輪狀病毒活疫苗的安全性和免疫原性。該疫苗得自89-12毒株，通過(guò)在原代AGMK細(xì)胞中傳代26次，但未經(jīng)過(guò)噬斑純化，然后在所建立的AGMK細(xì)胞系中再傳代7次(共傳代33次)使之減毒。
下文中，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代26次的上述材料被稱(chēng)為P26，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代33次的材料被稱(chēng)為P33。一般而言，89-12通過(guò)傳代n次所得到的輪狀病毒被稱(chēng)為Pn。
在P33材料后的樣品，在非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)細(xì)胞中再傳代5次。該材料被稱(chēng)為P38。
Vaccine(1998)論文所述的P26分離株(isolates)和P33分離株沒(méi)有在培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，也沒(méi)有進(jìn)行分析以確定其遺傳特征。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)中所述的P26群體(population)包括多種變異株(variant)的混合物。這已通過(guò)下述遺傳特征得到證實(shí)(參見(jiàn)實(shí)施例)。因此，P26不是用于再傳代，尤其不是可靠的用于生產(chǎn)不同批次疫苗的一致性群體。同樣地，P33包括多種變異株的混合物，也不是可靠的用于生產(chǎn)不同批次的疫苗的一致性群體。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，P26材料為至少三種VP4基因變異株的混合物。P33和P38同樣為兩種變異株的混合物。在評(píng)價(jià)針對(duì)這些變異株而接種P33的嬰幼兒血清中的中和抗體效價(jià)時(shí)，就中和表位而言，這些變異株的抗原性似乎不同于保藏在ATCC的89-12C2毒株。
此外，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予嬰幼兒P33材料時(shí)，這兩種確定的變異株進(jìn)行復(fù)制并排泄。在100例接種嬰幼兒中，僅2例顯示出因輪狀病毒感染而引起的胃腸炎癥狀，而安慰劑組中有20％被感染。這些發(fā)現(xiàn)提示，所述變異株與消除輪狀病毒疾病有關(guān)。
WO 0112797公開(kāi)了輪狀病毒變異株的分離方法及從克隆的(均一的)人輪狀病毒株獲得的改良減毒輪狀病毒活疫苗。也公開(kāi)了一種減毒輪狀病毒群體(分離株)，其特征在于它包括單一變異株或基本單一變異株，所述變異株由編碼至少一種被稱(chēng)為VP4和VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定。在題目為拉丁美洲兒童(Latm Americaninfants)(Perez等，第42屆抗微生物藥物和化療的交叉學(xué)科會(huì)議(Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy，ICAAC 2002)，2002年9月27-30日，San Diego)的會(huì)議論文上，報(bào)告了此類(lèi)針對(duì)G9不均一毒株的口服減毒人輪狀病毒疫苗的保護(hù)功效。WO 0112797的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為編碼P43的VP4蛋白的核苷酸序列。
圖2為編碼P43的VP7蛋白的核苷酸序列。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，我們確定了減毒輪狀病毒群體(attenuated rotaviruspopulation)，其特征在于它包含單一變異株或基本單一變異株，所述變異株由編碼至少一種被稱(chēng)為VP4和VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定，可用作疫苗，并提供交叉保護(hù)作用以抵抗與疫苗所用血清型不同血清型的輪狀病毒感染所引起的疾病。
具體地講，G1輪狀病毒群體[例如按照布達(dá)佩斯條約，保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal CellCultures，ECACC)，Vaccine Research and Production Laboratory，PublicHealth Laboratory Service，Centre for Applied Microbiology andResearch，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，United Kingdom，保藏日為1999年8月13日，保藏號(hào)為99081301]的用途，可用于預(yù)防由G1輪狀病毒血清型和至少一種非G1輪狀病毒血清型(例如G2、G3、G4和G9輪狀病毒血清型)所引起的疾病。
因此，本發(fā)明涉及來(lái)自一種輪狀病毒血清型的減毒輪狀病毒群體在預(yù)防與來(lái)自另一種輪狀病毒血清型的輪狀病毒感染有關(guān)的疾病中的用途，其中所述血清型優(yōu)選由輪狀病毒G蛋白的序列所限定。
優(yōu)選所述輪狀病毒群體的特征在于它包括單一變異株或基本單一變異株，所述變異株由編碼至少一種被稱(chēng)為VP4和VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列所限定。
優(yōu)選所述輪狀病毒群體包括VP4病毒蛋白和/或VP7病毒蛋白，所述VP4病毒蛋白和/或VP7病毒蛋白得自ECACC保藏材料99081301，適合于提供交叉保護(hù)作用。
優(yōu)選所述減毒輪狀病毒血清型為G1，能夠針對(duì)由G1輪狀病毒血清型和非G1輪狀病毒血清型所引起的疾病提供交叉保護(hù)作用，所述非G1輪狀病毒血清型選自諸如以下的血清型G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。
具體地講，G1減毒輪狀病毒群體[例如按照布達(dá)佩斯條約，保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal CellCultures，ECACC)，Vaccine Research and Production Laboratory，PublicHealth Laboratory Service，Centre for Applied Microbiology andResearch，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，United Kingdom，保藏日為1999年8月13日，保藏號(hào)為99081301]的用途，可用于預(yù)防由G1輪狀病毒血清型和至少一種、優(yōu)選至少兩種、更優(yōu)選至少三種、最優(yōu)選至少四種非G1輪狀病毒血清型所引起的疾病，所述非G1輪狀病毒血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，免疫應(yīng)答是針對(duì)兩種以上輪狀病毒非G1血清型而誘導(dǎo)的，尤其是針對(duì)任何選自以下的血清型而誘導(dǎo)的G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。優(yōu)選具有針對(duì)這些血清型中至少兩種、至少三種、至少四種、更優(yōu)選至少五種或更多種的異型保護(hù)，這些血清型不同于疫苗組合物的血清型。除同型(G1)保護(hù)外，最優(yōu)選免疫應(yīng)答是針對(duì)至少一種、優(yōu)選至少兩種、更優(yōu)選至少三種、最優(yōu)選至少四種以下非G1血清型所誘導(dǎo)的G2、G3、G4和G9。
具體地講，本發(fā)明提供來(lái)自G1血清型的減毒輪狀病毒株在制備用于誘導(dǎo)針對(duì)不是G1或G9的輪狀病毒的免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的用途。在一個(gè)優(yōu)選的方面，免疫應(yīng)答還是針對(duì)因G9血清型和/或G1血清型的輪狀病毒感染所誘導(dǎo)的。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，免疫應(yīng)答是針對(duì)兩種以上輪狀病毒血清型所誘導(dǎo)的，這些血清型不是G1或G9。除了G1或G9血清型外，通常其它任何血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G10、G11、G12、G13和G14。優(yōu)選具有針對(duì)這些血清型中至少兩種、至少三種、至少四種、更優(yōu)選至少五種或更多種的異型保護(hù)，這些血清型不同于疫苗組合物的血清型。最優(yōu)選免疫應(yīng)答是針對(duì)所有以下非G1血清型所誘導(dǎo)的G2、G3、G4和G9。
本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)針對(duì)來(lái)自輪狀病毒血清型的輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予受試者包含來(lái)自不同血清型的減毒輪狀病毒疫苗的組合物。
優(yōu)選所述方法是誘導(dǎo)針對(duì)輪狀病毒非G9血清型的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予受試者包含輪狀病毒G1血清型疫苗的組合物，所述疫苗包含本文所定義的單一變異株或基本單一變異株。
優(yōu)選所述疫苗組合物中的輪狀病毒群體具G1P1A P[8]特異性。更優(yōu)選所述輪狀病毒群體包括VP4病毒蛋白和/或VP7病毒蛋白，來(lái)自ECACC保藏材料99081301，適合于誘發(fā)免疫應(yīng)答，一般提供交叉保護(hù)作用。優(yōu)選所用輪狀病毒疫苗為ECACC保藏材料99081301，或來(lái)源于該保藏材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明不包括對(duì)應(yīng)于ECACC 99081301的輪狀病毒株在上述用于誘導(dǎo)針對(duì)單獨(dú)的G9血清型的免疫應(yīng)答的方法或用途中的應(yīng)用，盡管總的來(lái)講不排除用于誘導(dǎo)針對(duì)G9的免疫應(yīng)答的該G1毒株與誘導(dǎo)針對(duì)其它G血清型的免疫應(yīng)答的聯(lián)合應(yīng)用。
本發(fā)明適當(dāng)?shù)厣婕霸谏鲜龇椒ɑ蛴猛局械腉1P8輪狀病毒株。
優(yōu)選所述疫苗按兩劑方案使用。
優(yōu)選所述疫苗提供針對(duì)胃腸炎的交叉保護(hù)作用。因此，另一方面，本發(fā)明提供一種方法，其中在接種個(gè)體的群體中，所用組合物針對(duì)由與該組合物中存在的減毒輪狀病毒型別不同的輪狀病毒感染所引起的腹瀉的保護(hù)率高達(dá)60％。另一方面，本發(fā)明提供一種方法，其中所述組合物針對(duì)由與該組合物中存在的減毒輪狀病毒型別不同的輪狀病毒感染所引起的胃腸炎的保護(hù)率高達(dá)81％。又一方面，本發(fā)明提供一種方法，其中所述組合物包含G1輪狀病毒株，在接種個(gè)體的群體中，針對(duì)由至少兩種非G1血清型輪狀病毒感染所引起的嚴(yán)重胃腸炎的保護(hù)率高達(dá)83％。
在接種個(gè)體的群體中，優(yōu)選針對(duì)由與該組合物中存在的減毒輪狀病毒型別不同的輪狀病毒感染所引起的腹瀉和/或胃腸炎和/或嚴(yán)重胃腸炎的保護(hù)率為10-90％，更優(yōu)選20-80％，最優(yōu)選至少50％。
提供交叉保護(hù)作用所用的輪狀病毒疫苗具有以下優(yōu)選的特征優(yōu)選本發(fā)明的輪狀病毒群體為克隆變異株。
所謂包括單一變異株或基本單一變異株的群體，是指含有不超過(guò)10％、優(yōu)選小于5％、最優(yōu)選小于1％的一種或多種不同變異株的輪狀病毒群體?？赏ㄟ^(guò)在合適的細(xì)胞類(lèi)型中傳代，或者通過(guò)進(jìn)行一系列的一個(gè)或多個(gè)克隆步驟，使病毒群體純化至均一或基本均一。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是包括單一變異株的群體更適于制備批次一致的疫苗。由編碼主要病毒蛋白的核苷酸序列所限定的具體變異株，在預(yù)防輪狀病毒感染時(shí)也可能與功效提高有關(guān)。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明輪狀病毒群體中的單一變異株或基本單一變異株，是VP4基因的核苷酸序列中包含至少一個(gè)以下堿基的變異株從起始密碼子起788位的腺嘌呤堿基(A)、802位的腺嘌呤堿基(A)和501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明群體中的單一變異株或基本單一變異株，是VP7基因的核苷酸序列中包含至少一個(gè)以下堿基的變異株從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)、897位的腺嘌呤(A)或897位的鳥(niǎo)嘌呤(G)。優(yōu)選897位具有腺嘌呤(A)。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明群體中的單一變異株，在VP4基因序列中，從起始密碼子起788位和802位具有腺嘌呤(A)，501位具有胸腺嘧啶(T)。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明群體中的單一變異株，在VP7基因序列中，從起始密碼子起605位具有胸腺嘧啶(T)，897位具有腺嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤(A/G)。最優(yōu)選在VP7序列中，897位具有腺嘌呤(A)。
在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明群體中的單一變異株，在VP4基因序列中，從起始密碼子起788位和802位具有腺嘌呤(A)，501位具有胸腺嘧啶(T)，在VP7序列中，從起始密碼子起605位具有胸腺嘧啶(T)，897位具有腺嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤(A/G)。最優(yōu)選在VP7序列中，897位具有腺嘌呤(A)。
在另一個(gè)方面，所述單一變異株包括編碼VP4蛋白的核苷酸序列(其中核苷酸序列如圖1所示)和/或編碼VP7蛋白的核苷酸序列(其中核苷酸序列如圖2所示)。
本發(fā)明所用優(yōu)選的輪狀病毒群體可通過(guò)包括下述步驟的方法得到輪狀病毒制備物在合適的細(xì)胞類(lèi)型中傳代；任選用下述步驟之一選擇均一培養(yǎng)物a)有限稀釋?zhuān)换?br> b)單個(gè)噬菌斑分離；和通過(guò)對(duì)VP4和/或VP7基因序列的合適區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定，檢查存在的基本單一變異株。
優(yōu)選所述群體來(lái)源于如上所述的P33毒株或P26毒株。
可通過(guò)定量或半定量雜交技術(shù)，例如狹線印跡雜交或噬菌斑雜交，適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行序列測(cè)定。
優(yōu)選所選變異株是在起始輪狀病毒制劑給予人類(lèi)受試者，特別是兒童時(shí)，進(jìn)行復(fù)制和排泄的變異株。
用本發(fā)明方法所得到的克隆病毒群體，可通過(guò)在合適的細(xì)胞系中進(jìn)一步傳代進(jìn)行擴(kuò)增。
上述方法中，用于輪狀病毒群體傳代的合適細(xì)胞類(lèi)型包括非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞，其可以是已建立的細(xì)胞系或原代AGMK細(xì)胞。合適的AGMK細(xì)胞系包括例如Vero(ATCC CCL-81)、DBS-FRhL-2(ATCC CL-160)、BSC-1(ECACC 85011422)和CV-1(ATCC CCL-70)。合適的還有MA-104(獼猴)和MRC-5(人-ATCC CCL-171)細(xì)胞系。Vero細(xì)胞特別優(yōu)選用于擴(kuò)增目的。Vero細(xì)胞中的傳代得到高的病毒產(chǎn)率。
檢測(cè)用所述方法得到的病毒群體是否是單一變異株的技術(shù)，以及測(cè)定該單一變異株性質(zhì)的技術(shù)，包括本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法或標(biāo)準(zhǔn)雜交方法，將在下文中進(jìn)行說(shuō)明。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，使用合適的輪狀病毒，特別是使用具有89-12毒株特征的輪狀病毒及其傳代衍生物，來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。
一個(gè)特別優(yōu)選的單一變異株群體為P43，P43是從P33(一種在合適細(xì)胞類(lèi)型中培養(yǎng)傳代33次的分離的人輪狀病毒)通過(guò)一系列終點(diǎn)稀釋克隆步驟，再將克隆材料在Vero細(xì)胞中傳代進(jìn)行擴(kuò)增而獲得的。
按照布達(dá)佩斯條約，將P43群體保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures，ECACC)，VaccineResearch and Production Laboratory，Public Health Laboratory Service，Centre for Applied Microbiology and Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，United Kingdom，保藏日為1999年8月13日，保藏號(hào)為99081301。
雖然該所示的公眾獲取途徑是得到人輪狀病毒P43最簡(jiǎn)單的方法，但也可通過(guò)本發(fā)明所給出的方法或其它方法得到類(lèi)似的和功能基本相同的輪狀病毒。此類(lèi)功能基本相同的輪狀病毒被視為在生物學(xué)上等同于本發(fā)明的人輪狀病毒P43，因此包括在本發(fā)明的總的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)該理解，本發(fā)明包括具有本文所述P43變異株特征的輪狀病毒群體。
另外，還應(yīng)該理解，本發(fā)明包括通過(guò)對(duì)保藏的P43 ECACC99081301作進(jìn)一步處理而得到的材料，所述處理例如用該活病毒經(jīng)再傳代、克隆或其它方法進(jìn)行繁殖，或者用包括遺傳工程技術(shù)或重配技術(shù)(reassortant technique)的方式對(duì)P43進(jìn)行修飾。這些步驟和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。
本發(fā)明所包括的來(lái)源于保藏的P43的材料，包括蛋白材料和基因材料。尤其令人感興趣的是，包含至少一種P43抗原或至少一種P43節(jié)段的重配輪狀病毒，例如包含輪狀病毒強(qiáng)毒株的重配子(reassortant)，該重配子所包含的輪狀病毒強(qiáng)毒株的11個(gè)基因組節(jié)段中有1個(gè)基因組節(jié)段或其部分，被P43的基因組節(jié)段或其部分所置換。準(zhǔn)確地講，輪狀病毒重配可具有許多有用的特性，該輪狀病毒重配子中編碼NSP4的節(jié)段或部分節(jié)段是P43節(jié)段或P43的部分節(jié)段。重配輪狀病毒及其制備技術(shù)是眾所周知的(Foster，R.H.和Wagstaff，A.J.Tetravalent Rotavirus Vacine，a review.ADIS drug evaluation(四價(jià)輪狀病毒疫苗，綜述。受滋病藥物評(píng)價(jià))，BioDrugs，Gev，9(2)，155-178，1998)。
尤其令人感興趣的材料是P43的子代和P43的免疫活性衍生物。免疫活性衍生物，是指從P43病毒或用P43病毒所得到的材料，特別是所述病毒的抗原，當(dāng)將所述材料注射到宿主動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，能夠誘發(fā)針對(duì)輪狀病毒發(fā)生反應(yīng)的免疫應(yīng)答。
在使輪狀病毒適應(yīng)合適的細(xì)胞系，例如Vero細(xì)胞時(shí)，可能需要對(duì)病毒進(jìn)行處理以便除去任何潛在的污染物，例如任何可能存在的外來(lái)因子，否則就會(huì)引起污染。就乙醚敏感性外來(lái)病毒而論，可使用下文所述的乙醚處理方法進(jìn)行處理。本發(fā)明還涉及在整個(gè)方法中將此類(lèi)乙醚處理作為任選步驟，以得到減毒活輪狀病毒或用所述減毒活輪狀病毒所配制的疫苗的內(nèi)容。
優(yōu)選包含有單一輪狀病毒變異株或基本單一輪狀病毒變異株的疫苗，然而，使用單一變異株或基本單一變異株并不是必需的。本發(fā)明的交叉保護(hù)性輪狀病毒株可與其它輪狀病毒株聯(lián)合應(yīng)用，以提供針對(duì)輪狀病毒感染或輪狀病毒疾病的額外保護(hù)作用或交叉保護(hù)作用。
因此，P43與其它輪狀病毒變異株(例如其它克隆變異株，或其它病毒，特別是其它減毒病毒)的混合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類(lèi)混合物用于下文所述的本發(fā)明的疫苗中。
本發(fā)明還提供能夠提供交叉保護(hù)作用的減毒輪狀病毒活疫苗，優(yōu)選所述疫苗包含基本單一變異株的群體、合適的佐劑或藥用載體，并將其混合在一起。
優(yōu)選本發(fā)明的輪狀病毒疫苗為含有單一輪狀病毒株的單價(jià)輪狀病毒疫苗。
本發(fā)明的特別優(yōu)勢(shì)在于提供輪狀病毒活疫苗，所述疫苗中活的減毒輪狀病毒是人輪狀病毒，因而不會(huì)引起腸套疊。
按照本發(fā)明，與減毒輪狀病毒株一起使用的合適藥用載體包括本領(lǐng)域已知的適合于口服給藥，特別是適合于嬰幼兒的藥用載體。此類(lèi)載體包括但不限于糖類(lèi)、多元醇、氨基酸、氫氧化鋁、氫氧化鎂、羥基磷灰石、滑石粉、二氧化鈦、氫氧化鐵、硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、明膠、植物胨、黃原膠、caraghenane、阿拉伯樹(shù)膠、β-環(huán)糊精。
本發(fā)明還提供制備輪狀病毒疫苗的方法，例如在合適穩(wěn)定劑存在下，將該病毒冷凍干燥，或者將本發(fā)明的病毒與合適的佐劑或藥用載體混合在一起。
將本發(fā)明病毒配制在病毒體或脂質(zhì)體等脂質(zhì)型載體中，配制在水包油型乳液中，或者與載體顆粒配制在一起，可能也會(huì)有優(yōu)勢(shì)。另一方面，或者另外，所述制劑中也可包括免疫刺激劑，例如本領(lǐng)域已知的用于口服疫苗的免疫刺激劑。此類(lèi)免疫刺激劑包括細(xì)菌毒素，特別是以全毒素(完整分子)形式或僅B鏈(CTB)形式的霍亂毒素(CT)和大腸桿菌(E.coli)的熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)。在WO 96/06627、WO 93/13202和US 5,182,109中，描述了比天然LT難轉(zhuǎn)化為它們的活性形式的突變型LT(mLT)。
可有利地包括在內(nèi)的另外的免疫刺激劑為皂苷衍生物，例如QS21和單磷酰脂質(zhì)A，特別是3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)。WO 98/56415中描述了作為口服佐劑的純化皂苷。皂苷和單磷酰脂質(zhì)A可以單用或者聯(lián)用(例如WO 94/00153)，并且可以與其它藥劑一起制成佐劑系統(tǒng)。3D-MPL為眾所周知的佐劑，由Montana的RibiImmunochem公司生產(chǎn)，GB 2122204中描述了它的制備方法。
有關(guān)口服免疫用載體和佐劑的概述可參見(jiàn)Vaccine Design，TheSubunit and Adjuvant Approach，Powell和Newman編輯，Plenum出版社，紐約，1995。
本發(fā)明還提供給人類(lèi)受試者、尤其是嬰幼兒接種疫苗的方法，所述方法包括給予需要接種的受試者有效量的本發(fā)明疫苗組合物。優(yōu)選所述減毒活疫苗是通過(guò)口服給藥途徑給予的。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的減毒輪狀病毒株與抗酸劑一起配制，以使因胃酸所引起的疫苗失活降為最低。合適的抗酸組分包括無(wú)機(jī)抗酸劑，例如氫氧化鋁Al(OH)3和氫氧化鎂Mg(OH)2。適用于本發(fā)明的市售抗酸劑包括Mylanta(商品名)，其中包含氫氧化鋁和氫氧化鎂。這些抗酸劑不溶于水，以混懸劑出售。
氫氧化鋁為本發(fā)明疫苗組合物中特別優(yōu)選的組分，因?yàn)樗粌H提供抗酸作用，而且提供佐劑作用。
同樣適于用作本發(fā)明疫苗抗酸劑的是有機(jī)抗酸劑，例如有機(jī)酸羧酸鹽。本發(fā)明疫苗組合物中優(yōu)選的抗酸劑包括有機(jī)酸羧酸鹽，優(yōu)選檸檬酸鹽，例如檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。
可用于本發(fā)明疫苗組合物中特別優(yōu)選的抗酸劑為不溶性無(wú)機(jī)鹽——碳酸鈣(CaCO3)。碳酸鈣能夠與輪狀病毒締合，并在與碳酸鈣締合的過(guò)程中保持輪狀病毒的活性。
在灌裝步驟中，為了防止碳酸鈣沉淀，制劑中優(yōu)選含有粘性劑(viscous agent)。
可使用的可行的粘性劑包括假塑性賦形劑。假塑性溶液，是指與其攪拌時(shí)的粘度相比，靜置時(shí)粘度較高的溶液。該類(lèi)型的賦形劑為天然聚合物，例如阿拉伯樹(shù)膠、黃耆樹(shù)膠、瓊脂、藻酸鹽、果膠或半合成聚合物例如羧甲基纖維素(Tyloses C)、甲基纖維素(Methocels A、Viscotrans MC、Tylose MH和MB)、羥丙基纖維素(Klucels)和羥丙基甲基纖維素(Methocels E和K、ViscontransMPHC)。通常，該假塑性賦形劑與觸變劑一起使用?；蛘呖捎玫恼承詣榫叩土鲃?dòng)能力的假塑性賦形劑。在足夠濃度下，此類(lèi)聚合物產(chǎn)生結(jié)構(gòu)流體排列，導(dǎo)致靜置時(shí)具低流動(dòng)能力的高粘性溶液。該系統(tǒng)需給予一定的能量才能使之流動(dòng)和移動(dòng)。需要外部能量(攪拌)暫時(shí)破壞結(jié)構(gòu)流體排列以得到流體溶液。
此類(lèi)聚合物的實(shí)例為卡波普(Carbopols)和黃原膠。
觸變性賦形劑靜置時(shí)呈凝膠結(jié)構(gòu)，而攪拌時(shí)則形成流體溶液。觸變性賦形劑的實(shí)例為Veegum(硅酸鎂鋁)和Avicel RC(約89％微晶纖維素和11％羧甲基纖維素鈉)。
本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選包括選自黃原膠或淀粉的粘性劑。
因此，本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選與碳酸鈣和黃原膠聯(lián)合配制。
適用于本發(fā)明組合物的其它組分包括糖，例如蔗糖和/或乳糖。
本發(fā)明的疫苗組合物可包含另外的組分，包括例如矯味劑(特別用于口服疫苗)和抑菌劑。
可以設(shè)計(jì)本發(fā)明疫苗組合物的不同包裝規(guī)格。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疫苗作為液體制劑給予。優(yōu)選液體制劑在給藥前用至少下列兩種組分重建i)病毒組分；ii)液體組分。
在該實(shí)施方案中，所述病毒組分和液體組分通常存放在獨(dú)立的容器中，此容器可方便地為一個(gè)容器中獨(dú)立的隔室，或?yàn)榭梢阅撤N方式連接的獨(dú)立的容器，使得重建最終疫苗組合物時(shí)，所述疫苗組合物不會(huì)暴露在空氣中。
重建前，病毒可為干的形式或液體形式。優(yōu)選病毒組分是凍干的。凍干病毒比水溶液中的病毒更為穩(wěn)定。凍干病毒可用液體抗酸組合物適當(dāng)?shù)刂亟?，以配制液體疫苗制劑。或者，凍干病毒可用水或水溶液重建，在這種情況下，凍干病毒組合物優(yōu)選包含抗酸組分。
優(yōu)選所述疫苗制劑包含病毒組分、碳酸鈣和黃原膠，其中各組分配制在一起并存放在第一個(gè)隔室或容器內(nèi)，臨用前該疫苗制劑用存放在第二個(gè)隔室或容器中的水或水溶液進(jìn)行重建。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疫苗組合物為固體制劑，優(yōu)選為放入口中時(shí)適于立即溶解的凍干塊。凍干制劑可方便地以裝入藥物泡罩包裝中的片劑形式提供。
另一方面，本發(fā)明提供用于口服給藥的速溶片劑形式的輪狀病毒疫苗。
另一方面，本發(fā)明提供包含活的減毒輪狀病毒株、特別是人輪狀病毒株的組合物，其中所述組合物為放入口中能夠立即溶解的凍干固體制劑。
優(yōu)選本發(fā)明的速溶片劑在受試者的口中足夠快地溶解，以防止吞下未溶解的片劑。該方法對(duì)于兒童用輪狀病毒疫苗特別有利。
優(yōu)選所述病毒是活的減毒人輪狀病毒，其中該病毒與無(wú)機(jī)抗酸劑(例如碳酸鈣)和粘性劑(例如黃原膠)配制在一起。
本發(fā)明的又一個(gè)方面是提供凍干制劑，其中病毒組分為任何輪狀病毒株，該病毒與碳酸鈣和黃原膠配制在一起。
可按照已知技術(shù)，使用適量的活病毒，配制并給予本發(fā)明的疫苗，在一般接種者中提供針對(duì)輪狀病毒感染的有效保護(hù)作用而沒(méi)有顯著的毒副作用。適量的活病毒通常是每劑104-107病灶形成單位(focus forming units，ffu)。典型的疫苗劑量可包括105-106ffu/劑，可在一段時(shí)間內(nèi)分幾劑給予，例如兩個(gè)月間隔內(nèi)給予兩劑。然而通過(guò)給予兩劑以上的劑量，例如3劑方案或4劑方案也可獲益，特別在發(fā)展中國(guó)家。劑量間隔時(shí)間可超過(guò)兩個(gè)月或者在兩個(gè)月以?xún)?nèi)。對(duì)于單劑方案或多劑方案，活病毒的最佳量，以及給藥的最佳時(shí)間，可通過(guò)包括觀察受試者的抗體效價(jià)和其它反應(yīng)等標(biāo)準(zhǔn)研究予以確定。
本發(fā)明的疫苗還可包含針對(duì)其它疾病有保護(hù)作用的其它合適的活病毒，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)?；蛘?，其它合適的口服給藥用活病毒疫苗，可以分劑，但與本發(fā)明的輪狀病毒疫苗組合物同時(shí)給予。
對(duì)接種Vaccine(1998)論文中所述P33材料的12名4-6個(gè)月大的嬰兒的血清，進(jìn)行了P33、P38、P43和P89-12C2的中和試驗(yàn)。
對(duì)于P33、P38和P43，所有所測(cè)血清的中和滴度范圍相似。統(tǒng)計(jì)分析表明，針對(duì)所有這三種病毒的總的中和滴度無(wú)顯著性差異。這提示P33、P38和P43的構(gòu)象中和表位和非構(gòu)象中和表位一樣很好地被接種P33的嬰兒的抗P33血清所識(shí)別。該觀察結(jié)果間接提示，該體外試驗(yàn)所觀測(cè)到的中和表位在P33、P38和P43之間并沒(méi)有改變。
然而，P89-12C2的中和滴度范圍與P33、P38和P43的中和滴度范圍顯著不同。這一觀察結(jié)果提示，P33、P38和P43的構(gòu)象中和表位和非構(gòu)象中和表位不是一樣很好地被接種P33的嬰兒的抗P33血清所識(shí)別。這一觀察結(jié)果間接提示，該體外試驗(yàn)所觀測(cè)到的中和表位在89-12C2與P33、P38和P43之間有所改變。
本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施方案包括1.來(lái)自G1血清型的減毒輪狀病毒株在制備用于誘導(dǎo)針對(duì)不是G1輪狀病毒或G9輪狀病毒的免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的用途。
2.第1項(xiàng)的用途，其中免疫應(yīng)答是針對(duì)由G9血清型和/或G1血清型引起的輪狀病毒感染所額外誘導(dǎo)的。
3.第1項(xiàng)或第2項(xiàng)的用途，其中所述免疫應(yīng)答是針對(duì)兩種以上輪狀病毒血清型所誘導(dǎo)的，這些血清型不是G1或G9。
4.第1-3項(xiàng)中任一項(xiàng)所要求保護(hù)的用途，其中除G1血清型或G9血清型外的血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G10、G11、G12、G13和G14。
5.第1-4項(xiàng)中任一項(xiàng)的用途，其中免疫應(yīng)答是針對(duì)所有以下非G1血清型所誘導(dǎo)的G2、G3、G4和G9。
6.第1-5項(xiàng)中任一項(xiàng)的用途，其中所述G1輪狀病毒疫苗組合物包含單一輪狀病毒變異株或基本單一輪狀病毒變異株，所述變異株由編碼至少一種被稱(chēng)為VP4和VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定。
7.第6項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含具有VP4基因的輪狀病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含至少一個(gè)以下堿基從起始密碼子起788位的腺嘌呤堿基(A)、802位的腺嘌呤堿基(A)和501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
8.第7項(xiàng)的用途，其中所述VP4基因的核苷酸序列中包含以下核苷酸從起始密碼子起788位和802位的腺嘌呤堿基(A)和501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
9.第6項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含具有VP7基因的輪狀病毒，所述VP7基因在其核苷酸序列中包含至少一個(gè)以下堿基從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)、897位的腺嘌呤(A)和897位的鳥(niǎo)嘌呤(G)。
10.第7項(xiàng)的用途，其中所述VP7基因的核苷酸序列中包含以下核苷酸從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)或鳥(niǎo)嘌呤(G)。
11.第1-10項(xiàng)中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含具有VP4基因的輪狀病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含從起始密碼子起788位和802位的腺嘌呤(A)和501位的胸腺嘧啶(T)；并且其中所述VP7基因在其核苷酸序列中包含從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)。
12.第1-11項(xiàng)中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物能夠?qū)啝畈《靖腥舅鸬奈改c炎和/或腹瀉提供保護(hù)作用，所述輪狀病毒的血清型不同于所述組合物中存在的減毒輪狀病毒的G1血清型。
13.第12項(xiàng)的用途，其中在接種個(gè)體的群體中，所述組合物針對(duì)由至少兩種血清型的輪狀病毒感染所引起的嚴(yán)重胃腸炎的保護(hù)率高達(dá)83％，這些血清型不同于所述組合物中存在的減毒輪狀病毒的G1血清型。
14.第13項(xiàng)的用途，其中所述嚴(yán)重胃腸炎是由至少四種非G1血清型的輪狀病毒感染所引起的。
15.第14項(xiàng)的用途，其中所述非G1血清型為G2、G3、G4和G9血清型。
16.第1-15項(xiàng)中任一項(xiàng)的用途，其中所述輪狀病毒株為ECACC保藏材料99081301，或者可得自或來(lái)源于ECACC保藏材料99081301。
17第1-16項(xiàng)中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗按兩劑方案使用。
以下非限制性的實(shí)施例用于舉例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1證明第26次傳代(P26)的89-12毒株是多種變異株的混合物對(duì)來(lái)自不同傳代批次的VP4基因和VP7基因進(jìn)行測(cè)序?qū)P4基因和VP7基因進(jìn)行測(cè)序，該基因來(lái)自傳代病毒P26(原代AGMK細(xì)胞)、傳代病毒P33(建立的(與原代相反)AGMK細(xì)胞系)、傳代病毒P41和傳代病毒P43。在一支試管/一個(gè)步驟中，對(duì)總RNA提取物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。
引物Rota 5bis和引物Rota 29bis擴(kuò)增完整的VP4基因，引物Rota1和引物Rota 2bis擴(kuò)增完整的VP7基因。用不同引物測(cè)定PCR材料的序列(參見(jiàn)表1)。
在VP4中，傳代病毒P26序列與傳代病毒P33序列有3個(gè)堿基不同(從起始密碼子起501位bp、788位bp和802位bp)，而在VP7中，也有3個(gè)堿基不同(從起始密碼子起108位bp、605位bp和897位bp)。
對(duì)傳代病毒P26的VP4和VP7序列掃描顯示，在突變位置，存在作為背景的傳代病毒P33序列。由此可見(jiàn)，傳代病毒P26是至少兩種變異株的混合物。
傳代病毒P33序列掃描在VP4中似乎為均一的，對(duì)于VP7則是不均一的(參見(jiàn)表2)。
傳代病毒P38(得自傳代病毒33)在Vero細(xì)胞中傳代5次，表現(xiàn)出與傳代病毒P33(AGMK細(xì)胞系)相同的VP4序列和VP7序列。因此，P33和P38群體間無(wú)重大改變。
表1用于RT-PCR和測(cè)序的寡核苷酸
表2用于雜交的寡核苷酸
表2中黑體字所示堿基為VP4和VP7中具體序列變異的位點(diǎn)。
表3VP4基因和VP7基因的序列變異3.1
注意在來(lái)自開(kāi)發(fā)至產(chǎn)品批次水平的三個(gè)克隆的第二個(gè)克隆中，VP7 897bp位置的核苷酸為G，而不是P43所選克隆的A。這導(dǎo)致在氨基酸序列中，甲硫氨酸取代異亮氨酸。從接種P33材料的嬰幼兒大便中排泄出相應(yīng)所選的P43克隆的變異株，及在VP7中從起始密碼子起897bp為G的克隆的變異株。
在表3.1中，在某一特定位置上有兩個(gè)可選擇的堿基，其中第一個(gè)表示出現(xiàn)在主要群體中的堿基，而第二個(gè)為出現(xiàn)在次要群體中的堿基。主要變異群體和次要變異群體是通過(guò)測(cè)序中信號(hào)的強(qiáng)度而判斷的。
3.2
表3.2顯示變異株間核苷酸差異所引起的氨基酸變化。
表4
狹線印跡雜交AGMK細(xì)胞中傳代病毒P26和傳代病毒P33間群體的改變，通過(guò)狹線印跡雜交得到進(jìn)一步的證實(shí)。使經(jīng)RT/PCR所產(chǎn)生的VP4基因片段和VP7基因片段與對(duì)各變異株專(zhuān)一的寡核苷酸探針雜交(參見(jiàn)表3.1和表3.2)。與用Rota 16、Rota 35和Rota 36而不是Rota 15雜交的P26對(duì)比，P33材料VP4的PCR片段，在788位和802位上僅與Rota 16雜交，而不與Rota 15或Rota 35或Rota 36雜交。這些結(jié)果證實(shí)P26中存在至少三種變異株(參見(jiàn)表4)。
對(duì)于P33材料VP7的PCR片段，897位與Rota 41和Rota 42雜交。這些結(jié)果證實(shí)P33材料中存在至少兩種變異株。
實(shí)施例2P43克隆的分離與表征為了將P33組分分離成均一的病毒群體，在Vero細(xì)胞中對(duì)P33/AGMK進(jìn)行了3次終點(diǎn)稀釋?zhuān)貌《居糜诟腥綱ero細(xì)胞。
用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)選擇陽(yáng)性孔根據(jù)常規(guī)方法，從各孔中所檢測(cè)的最大量的病灶，以及各板上最多所分離的陽(yáng)性孔證實(shí)了病毒的生長(zhǎng)。在96孔微量滴定板中，經(jīng)3次終點(diǎn)稀釋傳代后，10個(gè)陽(yáng)性孔在Vero細(xì)胞中成功擴(kuò)增，并對(duì)其產(chǎn)率進(jìn)行評(píng)價(jià)。
根據(jù)產(chǎn)率，將這三個(gè)克隆開(kāi)發(fā)成產(chǎn)品批次的傳代水平。通過(guò)多克隆抗體的免疫識(shí)別，在這三個(gè)克隆間和這些克隆與P33間表現(xiàn)出相似性。通過(guò)狹線印跡雜交對(duì)克隆的均一性進(jìn)行評(píng)價(jià)。單個(gè)克隆的最終選擇以產(chǎn)率和序列為基礎(chǔ)。
所選克隆在Vero細(xì)胞中，通過(guò)連續(xù)傳代進(jìn)行擴(kuò)增，以得到母種(Master seed)，工作種(Working seed)和最終的產(chǎn)品批次。
通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增材料的VP4和VP7的測(cè)序(結(jié)構(gòu)特征)，以及通過(guò)PCR擴(kuò)增材料的VP4和VP7特異性狹線印跡雜交(均一性)，表征所選克隆不同傳代水平的遺傳特征。圖1和圖2分別表示P43材料的VP4基因序列和VP7基因序列，與P41相同。
通過(guò)用寡核苷酸探針進(jìn)行選擇性雜交，對(duì)所選克隆的均一性進(jìn)行評(píng)價(jià)，所述寡核苷酸探針在P26/原代AGMK的序列測(cè)定中，用于區(qū)別確定的各變異株中VP4區(qū)和/或VP7區(qū)的核苷酸變化(參見(jiàn)表4)。
VP4片段與Rota 16雜交，而不與Rota 15、Rota 35或Rota 36雜交。
VP7片段與Rota 41雜交，而不與Rota 42雜交。
這些結(jié)果證實(shí)P43為均一群體。
實(shí)施例3潛在外源病毒的去除向P33(生長(zhǎng)于AGMK)中加入乙醚，使終濃度為20％，為時(shí)1小時(shí)。然后向乙醚中通入氮?dú)?5分鐘。觀察到對(duì)P33種子(seed)的滴度無(wú)影響。
實(shí)施例4減毒活疫苗的制備通過(guò)以下方法制備用于嬰幼兒口服給藥的上述產(chǎn)品批次。
1.凍干病毒用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備不同劑量的病毒。將冷凍純化病毒塊解凍，用合適的培養(yǎng)基組合物(本案為Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′smodified eagle Medium，DMEM)稀釋至所需的標(biāo)準(zhǔn)病毒濃度，本案為106.2ffu/ml。然后，將經(jīng)稀釋的病毒用凍干穩(wěn)定劑(4％蔗糖、8％葡聚糖、6％山梨糖醇、4％氨基酸)進(jìn)一步稀釋至目標(biāo)病毒滴度，本案為105.6ffu/劑。將0.5ml等量的穩(wěn)定病毒組合物無(wú)菌條件下分裝到3ml小瓶中。然后用橡皮塞子不完全地蓋上各小瓶，真空下凍干樣品，然后，將小瓶完全蓋好，用鋁蓋在小瓶四周卷邊以固定塞子。
使用時(shí)，用以下抗酸重建劑之一重建病毒(a)檸檬酸鹽重建劑將檸檬酸鈉溶于水中，過(guò)濾除菌，無(wú)菌條件下按1.5ml的量分裝到重建容器中，濃度為每1.5ml劑量544mg檸檬酸鈉·2H2O。重建容器可為例如3ml小瓶，或4ml小瓶，或2ml注射器、或用于口服給藥的軟塑料擠管。作為使無(wú)菌組分保持在無(wú)菌條件下的一個(gè)備選方法，最終容器可進(jìn)行高壓滅菌。
(b)Al(OH)3重建劑將無(wú)菌氫氧化鋁混懸劑(Mylanta-商品名)在無(wú)菌條件下用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋?zhuān)?ml的量在無(wú)菌條件下分裝到重建容器(例如2ml注射器，或軟塑料擠管)中，各含有48mg Al(OH)3。無(wú)菌條件下使用無(wú)菌組分的一個(gè)備選方法是用γ射線照射氫氧化鋁混懸劑(優(yōu)選在稀釋后階段)。
可包括防止混懸劑沉淀的標(biāo)準(zhǔn)成分。此類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)成分包括例如硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素和硅氧烷聚合物。還可包括對(duì)羥基苯甲酸丁酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯等抑菌劑或用于食品的其它標(biāo)準(zhǔn)抑菌劑以及矯味劑。
2.液體制劑中的凍干病毒與Al(OH)3用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備不同劑量的病毒。將冷凍純化病毒塊解凍，用合適的培養(yǎng)基組合物(本案為Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM))稀釋至所需的標(biāo)準(zhǔn)病毒濃度，本案為106.2ffu/ml。加入氫氧化鋁混懸劑，達(dá)到最終量為48mg/劑，病毒組合物用凍干穩(wěn)定劑(4％蔗糖、8％葡聚糖、6％山梨糖醇、4％氨基酸)稀釋至目標(biāo)病毒滴度，本案為105.6ffu/劑。將0.5ml等量的穩(wěn)定病毒組合物在無(wú)菌條件下分裝到3ml小瓶中。然后，按第1部分所述方法，對(duì)小瓶進(jìn)行凍干和密封。
3.用于泡罩包裝中的凍干病毒與Al(OH)3用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備不同劑量的病毒。將冷凍純化病毒塊解凍，用合適的培養(yǎng)基組合物(本案為Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM))稀釋至所需的標(biāo)準(zhǔn)病毒濃度，本案為106.2ffu/ml。加入氫氧化鋁混懸劑，達(dá)到最終量為48mg/劑，病毒組合物用凍干穩(wěn)定劑稀釋至105.6ffu/劑的目標(biāo)病毒滴度，所述凍干穩(wěn)定劑可為4％蔗糖、4％葡聚糖或4％氨基酸，或?yàn)槊髂z，或?yàn)橹参镫耍驗(yàn)辄S原膠。使用無(wú)菌灌裝操作，將0.5ml劑量或優(yōu)選更少劑量分裝到泡罩腔中。將所述組合物凍干，通過(guò)熱封裝密封泡罩腔。
任選包括防止氫氧化鋁混懸劑沉淀的標(biāo)準(zhǔn)成分。此類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)成分包括例如硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素和硅氧烷聚合物。還可包括矯味劑。
實(shí)施例5不同制劑中輪狀病毒的病毒滴定5.1含乳糖制劑和含蔗糖制劑的比較表5
如上表所示，P43輪狀病毒或與蔗糖或與乳糖一起配制。
凍干前的病毒滴定是在完全液體制劑(含有蔗糖、葡聚糖、山梨糖醇、氨基酸)中未經(jīng)凍干步驟的病毒滴度。
良好結(jié)果凍干步驟所得減少＜0.5log，以及在“37℃1周后”(加速穩(wěn)定性試驗(yàn))所得減少＜0.5log。病毒滴定的精確度約為±0.2log。
結(jié)果表明可用蔗糖代替乳糖。
5.2精氨酸的作用和用麥芽糖醇代替山梨糖醇表6
結(jié)果表明，加入精氨酸(已知精氨酸在凍干期間能增強(qiáng)病毒的穩(wěn)定性，并可提供堿性介質(zhì)以抵消胃酸)后，病毒滴度維持不變。
山梨糖醇趨于使凍干塊的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度大幅度降低。如上所示，這可用麥芽糖醇代替山梨糖醇加以克服，病毒滴度依然維持不變。
5.3各種制劑組合物本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明多種制劑都是可行的。
表7
5.4輪狀病毒和Al(OH)3抗酸劑之間的締合表8
用Al(OH)3作為抗酸劑。結(jié)果表明，輪狀病毒與不溶性無(wú)機(jī)鹽(Al(OH)3)締合，因?yàn)殡x心時(shí)它與Al(OH)3在一起(上清液中的病毒活性減少)。
5.5病毒滴定前用檸檬酸鈉溶解Al(OH)3抗酸劑表9
當(dāng)輪狀病毒與Al(OH)3締合時(shí)，有可能凍干每個(gè)成分(包括Al(OH)3)。凍干后，通過(guò)將Al(OH)3溶解于檸檬酸鈉中可能使輪狀病毒復(fù)原。該步驟不損傷輪狀病毒，在溶解步驟后其活性保持不變。
5.6Al(OH)3-輪狀病毒締合釋放后輪狀病毒的感染性病毒釋放(通過(guò)載體溶解)的機(jī)制可能在體內(nèi)充分進(jìn)行。實(shí)際上pH6以下，氫氧化鋁完全溶解，因此，輪狀病毒將在胃中釋放。
在胃中，Al+++離子不被吸收(J.J.Powell，R.Jugdaohsingh和R.P.H.Thompson，The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinaltrack(礦物質(zhì)吸收在胃腸道內(nèi)的調(diào)節(jié))，Proceedings of the NutritionSociety(1999)，58，147-153)。
在腸道中，由于pH升高，不溶性形式的鋁沉淀出來(lái)(Al(OH)3或AlPO4)，并通過(guò)自然途徑清除。
尚不清楚新形成的Al(OH)3(或AlPO4)沉淀物是否能與游離輪狀病毒重新締合。這提出了Al(OH)3-輪狀病毒締合物本身感染性的問(wèn)題。
也有可能通過(guò)其它機(jī)制從Al(OH)3-輪狀病毒締合物中釋放出輪狀病毒。例如，賴(lài)氨酸干擾Al(OH)3上的病毒吸附。
已知如硼酸根、硫酸根、碳酸根和磷酸根等陰離子特異性地吸附在氫氧化鋁上，因此，理論上應(yīng)當(dāng)有可能從Al(OH)3-輪狀病毒締合物中置換(通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)吸附位點(diǎn))輪狀病毒。
因此，輪狀病毒可從輪狀病毒-Al(OH)3締合物中釋放出來(lái)，所釋放的輪狀病毒保持活性。
該釋放或通過(guò)在胃中溶解Al(OH)3(經(jīng)胃中HCl，或經(jīng)體外檸檬酸鈉)，或通過(guò)堿性氨基酸(賴(lài)氨酸)置換輪狀病毒得以實(shí)現(xiàn)。
5.7Al(OH)3-輪狀病毒締合物的感染性單劑凍干輪狀病毒用水重建，再分成兩部分。第一部分作為對(duì)照，加入額外體積的水。第二部分加入24mg懸浮于0.240ml水中的Al(OH)3(臨床前病毒滴定)。
當(dāng)存在Al(OH)3時(shí)，輪狀病毒具活性，與對(duì)照樣品比較，病毒滴定值較高。
不分開(kāi)凍干劑量的情況下，加入12mg Al(OH)3或24mg Al(OH)3，重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。
此時(shí)，對(duì)照樣品是用檸檬酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液重建的樣品。
因此，在存在Al(OH)3時(shí)，病毒滴度再一次較高。
DRVC003A46 DRVC003A46 DRVC003A46+ + +1.5ml WL緩沖液 12mg Al(OH)324mg Al(OH)3/0.120ml/0.240ml+ +1.380ml H2O1.260ml H2O5.34 6.246.055.32 5.956.26
如上述實(shí)施例，輪狀病毒與Al(OH)3顆粒締合，因?yàn)榭赏ㄟ^(guò)離心除去病毒。DRVC003A46為凍干輪狀病毒制劑(蔗糖2％；葡聚糖4％；山梨糖醇3％；氨基酸2％)。
SDSAA＝2％蔗糖，4％葡聚糖，3％山梨糖醇，2％氨基酸。
根據(jù)對(duì)上清液所進(jìn)行的病毒滴定，吸附輪狀病毒所需的Al(OH)3量似乎較低(從一劑凍干劑5.7log起，按比例升高病毒滴定)
表10
Al(OH)3上吸附輪狀病毒所需時(shí)間似乎較短在24mg Al(OH)3存在下，重建一劑凍干輪狀病毒，0分鐘、15分鐘、60分鐘和24小時(shí)后離心。病毒滴定前，將“沉淀物(culot)”重懸于SDSAA中表11
5.8用CaCO3作為抗酸劑為了避免疫苗中含有鋁，使用另一種不溶性無(wú)機(jī)鹽CaCO3(碳酸鈣)代替抗酸劑Al(OH)3。
使用CaCO3所觀察到的現(xiàn)象與Al(OH)3所述現(xiàn)象類(lèi)似-輪狀病毒與無(wú)機(jī)鹽締合；-與無(wú)機(jī)鹽締合時(shí)，輪狀病毒活性保持；-用酸溶解無(wú)機(jī)堿有可能從締合物中釋放輪狀病毒；-抗酸劑和輪狀病毒有可能共凍干。
CaCO3和輪狀病毒締合在第一個(gè)試驗(yàn)中，凍干輪狀病毒(病毒滴度5.7)用CaCO3水混懸劑(50mg/1.5ml)重建；然后離心，將上清液的病毒滴度與沉淀物的病毒滴度進(jìn)行比較。

該結(jié)果表明，超過(guò)90％的輪狀病毒與CaCO3締合。
另外，當(dāng)病毒締合時(shí)，有可能實(shí)現(xiàn)滴定并恢復(fù)最初的病毒量。
另外，病毒滴度略高于未加CaCO3所得的病毒滴度。
CaCO3與輪狀病毒的締合量?jī)龈奢啝畈《居煤?1.5ml)的CaCO3混懸劑重建10mg50mg100mg然后離心，將上清液的病毒滴度與沉淀物的病毒滴度進(jìn)行比較。
表12
因此，清楚可見(jiàn)，CaCO3越多，病毒締合越多，上清液中的病毒越少。
然而，總劑量并不完全恢復(fù)(預(yù)期總量至少5.3或甚至如之前所得到的5.8——見(jiàn)上)。
Baby Rossett-Rice抗酸滴定中CaCO3對(duì)輪狀病毒的保護(hù)作用用10劑凍干輪狀病毒(DRVC003A46)和50mg CaCO3，進(jìn)行兩種baby Rossett-Rice滴定在經(jīng)典Rossett-Rice滴定中，將抗酸劑與輪狀病毒混合，并將HCl加入該介質(zhì)中。
在“反向(inverse)”baby Rossett-Rice中，情形相反抗酸劑滴加到HCl庫(kù)(pool)中(正如在體內(nèi)發(fā)生的一樣)。
表13
因此，在該體外實(shí)驗(yàn)中，在HCl存在下，碳酸鈣能夠保護(hù)約20％的輪狀病毒，而氫氧化鋁則不能保護(hù)。
5.9輪狀病毒在CaCO3抗酸劑存在下的凍干表14
這是“整體(all in one)”凍干——輪狀病毒和抗酸劑(CaCO3)在同一小瓶中一起凍干。為了防止灌裝步驟中CaCO3沉淀，需要粘性劑。此類(lèi)粘性劑的實(shí)例包括黃原膠和淀粉。即使在黃原膠和淀粉存在下，輪狀病毒的活性仍然保持不變。
5.10放入口中時(shí)迅速崩解的凍干片劑下列制劑證實(shí)了″lyoc″概念，即凍干塊在口中迅速溶解。
表15
在“l(fā)yoc概念”中，可使用黃原膠和淀粉(維持凍干塊迅速溶解的特性)。
實(shí)施例6碳酸鈣作為輪狀病毒疫苗組合物中抗酸劑的用途當(dāng)CaCO3的水混懸劑用作輪狀病毒的抗酸劑時(shí)，由于碳酸鈣粉末密度值接近2.6，平均顆粒粒徑為30μm，因此碳酸鈣顆粒遇水時(shí)存在迅速沉淀的問(wèn)題。這種沉淀可被下列因素減緩1.增加周?chē)橘|(zhì)的密度；2.增加周?chē)橘|(zhì)的粘度；3.減小顆粒粒徑；4.保持顆粒間相互分開(kāi)。
6.1增加周?chē)橘|(zhì)的密度當(dāng)將CaCO3-水混懸劑(當(dāng)置于注射器中)加入到凍干塊(含有2％蔗糖、4％葡聚糖、3％山梨糖醇、2％氨基酸)中時(shí)，周?chē)橘|(zhì)的密度增加，但CaCO3沉淀的速度與CaCO3-水混懸劑的沒(méi)有太大區(qū)別。
6.2增加周?chē)橘|(zhì)的粘度假塑性賦形劑假塑性溶液是指與其攪拌時(shí)的粘度相比，靜置時(shí)粘度較高的溶液。
該類(lèi)型的常用賦形劑為天然聚合物，例如阿拉伯樹(shù)膠黃耆樹(shù)膠瓊脂藻酸鹽果膠半合成聚合物，例如羧甲基纖維素(Tyloses C)甲基纖維素(Methocels A、Viscotrans MC、Tylose MH和MB)羥丙基纖維素(Klucels)羥丙基甲基纖維素(Methocels E和K、Viscontrans MPHC)通常這些假塑性賦形劑與觸變劑結(jié)合使用。
具低流動(dòng)能力的假塑性賦形劑在足夠濃度下，那些聚合物產(chǎn)生結(jié)構(gòu)流體排列，導(dǎo)致高粘性溶液在靜置時(shí)具有低流動(dòng)能力。該系統(tǒng)需給予一定的能量才能使之流動(dòng)和移動(dòng)。
需要外部能量(攪拌)暫時(shí)破壞結(jié)構(gòu)流體排列以得到流體溶液。
此類(lèi)聚合物的實(shí)例為卡波普(Carbopols)和黃原膠。
觸變性賦形劑就這些賦形劑來(lái)說(shuō)，靜置時(shí)得到凝膠結(jié)構(gòu)；而在攪拌時(shí)，則得到流體溶液。
觸變性賦形劑的實(shí)例為Veegum(硅酸鎂鋁)和Avicel RC(約89％微晶纖維素和11％羧甲基纖維素鈉)。
6.3減小顆粒粒徑CaCO3顆粒粒徑的減小導(dǎo)致化合物抗酸能力的降低。
6.4保持顆粒間相互分開(kāi)在Veegum和Avicel中情況如此，因其不溶性顆粒(約1μm)比CaCO3顆粒小，為防止聚集而分布在CaCO3顆粒間。
實(shí)施例7產(chǎn)品設(shè)計(jì)下述方案說(shuō)明可行產(chǎn)品設(shè)計(jì)的實(shí)施例。
7.1注射器中的CaCO3凍干小瓶中已裝有臨床批號(hào)的輪狀病毒，可將抗酸劑加入到注射器內(nèi)的重建液體中。
在該產(chǎn)品包裝規(guī)格中，不僅在灌裝步驟，而且在產(chǎn)品的總保存期(至少二年)內(nèi)，都必須控制CaCO3的沉淀。
7.2凍干小瓶中的CaCO3 7.3泡罩中凍干在這一情況下，輪狀病毒、CaCO3和黃原膠一起直接在泡罩中凍干。

實(shí)施例8不同輪狀病毒株的凍干表16
在″Fields″第二版第1361頁(yè)(Raven出版社(1990))中，DS-1、P和VA70毒株分別被描述為人輪狀病毒對(duì)照株G2、G3和G4血清型。
在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將不同輪狀病毒株凍干。
實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)于所有輪狀病毒株，凍干期間的病毒滴度和加速穩(wěn)定(37℃1周)時(shí)的病毒滴度均維持不變。
實(shí)施例9成人中輪狀病毒疫苗一劑口服給藥的I期安全性研究在18-45歲健康成人中，進(jìn)行了I期研究，以評(píng)價(jià)106.0ffu P43疫苗單次口服劑量的安全性和反應(yīng)原性。
臨床實(shí)驗(yàn)為雙盲和隨機(jī)的。實(shí)驗(yàn)為安慰劑對(duì)照和獨(dú)立的。研究在比利時(shí)一家獨(dú)立中心進(jìn)行。
研究群體共招募了33名受試者，11名分在安慰劑組，22名分在疫苗組，所有人都完成了該項(xiàng)研究。所有志愿者皆為白種人。年齡范圍介于18-44歲，接種時(shí)，他們的平均年齡為35.3歲。試驗(yàn)從一月份開(kāi)始，剛好在一個(gè)月內(nèi)結(jié)束。
材料疫苗根據(jù)Good Manufacturing Practices(藥品生產(chǎn)管理規(guī)范)(GMP)條例，生產(chǎn)、純化、配制和凍干臨床批次的P43疫苗。所述各批次通過(guò)質(zhì)量管理和質(zhì)量認(rèn)證(Quality Control and Quality Assurance)獲準(zhǔn)使用。各疫苗小瓶裝有下列組分活性成分P43株最少量105.8ffu賦形劑、穩(wěn)定劑蔗糖 9mg葡聚糖 18mg山梨糖醇 13.5mg氨基酸 9mg安慰劑制備并使用安慰劑小瓶。各安慰劑小瓶裝有下列組分賦形劑、穩(wěn)定劑蔗糖9mg葡聚糖 18mg山梨糖醇13.5mg氨基酸 9mg稀釋劑使用注射用水作為稀釋劑以重建疫苗和安慰劑。
給藥給予疫苗或安慰劑前約10-15分鐘，讓這兩組受試者口服10mlMylanta。Mylanta是經(jīng)注冊(cè)的抗酸藥。該抗酸藥能升高胃中的pH，以防止輪狀病毒經(jīng)過(guò)胃時(shí)失活。
兩小瓶裝有105.8ffu/小瓶的凍干P43，用1.5ml注射用稀釋水重建，配制疫苗。該疫苗得到的病毒滴度計(jì)算值為106.1ffu/劑。該重建疫苗迅速按一次口服劑量給予。
兩小瓶?jī)龈砂参縿┯?.5ml注射用水重建以配制安慰劑，以單劑口服給藥。
安全性和反應(yīng)原性采用下述安全性標(biāo)準(zhǔn)和反應(yīng)原性標(biāo)準(zhǔn)主訴一般癥狀為發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、惡心、腹痛和食欲減退。給藥后8天內(nèi)予以記錄。
給藥后30天內(nèi)，記錄非主訴癥狀。
在整個(gè)研究期間，記錄嚴(yán)重的不利事件。
給藥后8天內(nèi)，采集腹瀉樣品。
結(jié)果在各個(gè)觀察階段，無(wú)主訴癥狀、無(wú)非主訴癥狀、無(wú)嚴(yán)重不利事件的報(bào)告。
無(wú)腹瀉病例的報(bào)告。
結(jié)論SB生物學(xué)P43疫苗當(dāng)以雙盲形式讓18-44歲健康成年志愿者口服單劑106.1ffu劑量時(shí)，該疫苗相對(duì)于安慰劑而言是安全的。
實(shí)施例10-兩劑單價(jià)人輪狀病毒疫苗RotarixTM在預(yù)防G1輪狀病毒和非G1(G9)輪狀病毒所引起的胃腸炎中的功效進(jìn)行隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的II期試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)用于嬰幼兒免疫的來(lái)自G1P人89-12毒株疫苗的保護(hù)功效。
準(zhǔn)確地講，所用的疫苗稱(chēng)為RotarixTM，并包含作為輪狀病毒組分的、作為ECACC保藏材料99081301保藏的減毒人G1毒株。
2-4個(gè)月大的健康嬰兒中，493名接種兩劑病毒濃度(106ffu)的RotarixTM，504名接種安慰劑，同時(shí)接種DTPw-HBV和Hib疫苗，間隔兩周后給予OPV。檢測(cè)腹瀉樣品中存在的輪狀病毒(ELISA)，并測(cè)定陽(yáng)性樣品中的血清型(RT-PCR)。
第二劑后兩周起所報(bào)告的腹瀉發(fā)作用于功效分析。用20點(diǎn)等級(jí)(Ruuska和Vesikari，1990)確定嚴(yán)重程度。評(píng)分≥11定義為嚴(yán)重疾病。
結(jié)果在上述組中進(jìn)行了功效臨時(shí)性的分析，所分離的血清型為G1和G9，幾乎均勻分布。在6個(gè)月的觀察期間，安慰劑組總發(fā)病率從對(duì)于G1的4.8％到對(duì)于G9的3.6％不等。兩劑106ffu RotarixTM保護(hù)針對(duì)由G1所引起的腹瀉的所有型別，功效為83％[95％CI50.4-95.7]，針對(duì)嚴(yán)重胃腸炎的功效為92％[95％CI47.6-99.8]。如果腹瀉由G9引起，則針對(duì)腹瀉所有型別的保護(hù)率都為60％[95％CI0.2-86.0]，針對(duì)嚴(yán)重胃腸炎的保護(hù)率為81％[95％CI33.0-96.4]。對(duì)于每個(gè)功效終點(diǎn)，在HRV組中，腹瀉發(fā)作與安慰劑組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性降低(p＜0.05，雙側(cè)費(fèi)希爾恰當(dāng)檢驗(yàn)(two-sided Fisher′sexact test))。
結(jié)論這些結(jié)果非常支持，兩劑單價(jià)HRV疫苗RotarixTM在保護(hù)嬰幼兒期抵抗均一G1毒株中的功效，針對(duì)G9毒株也有交叉保護(hù)作用。
實(shí)施例11-兩劑單價(jià)人輪狀病毒疫苗RotarixTM按三種不同的病毒濃度給藥時(shí)在預(yù)防G1輪狀病毒和非G1(G2、G3、G4、G9)輪狀病毒所引起的胃腸炎中的功效進(jìn)行隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的II期試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)用于嬰幼兒免疫的來(lái)自G1P人89-12毒株疫苗的保護(hù)性功效，以及對(duì)住院期(hospitalization)疫苗的功效。
準(zhǔn)確地講，所用的疫苗稱(chēng)為RotarixTM，并包含作為輪狀病毒組分的、作為ECACC保藏材料99081301保藏的減毒人G1毒株。
2-4個(gè)月大的健康嬰兒接受兩劑三種不同病毒濃度的RotarixTM(468名接受104.7ffu；460名接受105.2ffu；464名接受105.8ffu)或安慰劑(454名)，同時(shí)接受DTPw-HBV和Hib疫苗，間隔兩周后給予OPV。檢測(cè)腹瀉樣品中存在的輪狀病毒(ELISA)，并測(cè)定陽(yáng)性樣品中的血清型(RT-PCR)。
第二劑后兩周起直到受試者一周歲，所報(bào)告的腹瀉發(fā)作用于功效分析。用20點(diǎn)等級(jí)(Ruuska和Vesikari，1990)測(cè)定嚴(yán)重程度，評(píng)分≥11定義為嚴(yán)重疾病。
結(jié)果結(jié)果見(jiàn)下表。疫苗組中嬰兒輪狀病毒胃腸炎的發(fā)作要比安慰劑組兒童的發(fā)作顯著性減少(p＜0.001，雙側(cè)費(fèi)希爾恰當(dāng)檢驗(yàn))。根據(jù)劑量，針對(duì)嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的保護(hù)功效達(dá)86％(95％CI63％-96％)，針對(duì)任何輪狀病毒胃腸炎的保護(hù)功效達(dá)70％(95％CI46％-84％)。對(duì)于所述各功效終點(diǎn)，在HRV組中，腹瀉發(fā)作與安慰劑組的相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性減少(p＜0.001，雙側(cè)費(fèi)希爾恰當(dāng)檢驗(yàn))。從胃腸炎大便中鑒定出多個(gè)輪狀病毒血清型(G1、G2、G3、G4和G9)(ELISA和RT-PCR)，也用于計(jì)算針對(duì)非G1血清型的疫苗功效。特別是從表19中可看出，對(duì)于非G1血清型(G2、G3、G4和G9)，根據(jù)劑量，針對(duì)嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的功效達(dá)83％(95％CI40％-97％)，為單價(jià)基于G1的G1P1A P[8]人輪狀病毒疫苗誘導(dǎo)針對(duì)異型(即非G1)毒株的交叉保護(hù)作用的概念提供了證據(jù)。
研究期間所報(bào)告的輪狀病毒胃腸炎發(fā)作的特征表17
兩劑RIX4414人輪狀病毒疫苗針對(duì)輪狀病毒胃腸炎的保護(hù)功效表18
*p＜0.001，根據(jù)雙側(cè)費(fèi)希爾恰當(dāng)檢驗(yàn)，疫苗組和安慰劑組間各組的比較(顯著性水平α＝005)p＝0.037，根據(jù)雙側(cè)費(fèi)希爾恰當(dāng)檢驗(yàn)，疫苗組和安慰劑組間的比較(顯著性水平α＝0.05)p＝0.007，根據(jù)雙側(cè)費(fèi)希爾恰當(dāng)檢驗(yàn)，疫苗組和安慰劑組間的比較(顯著性水平α＝0.05)N＝受試者人數(shù)n/％＝報(bào)告至少一次特定輪狀病毒胃腸炎發(fā)作的受試者人數(shù)顯示精確95％置信區(qū)間。
兩劑RIX4414人輪狀病毒疫苗針對(duì)血清型特定嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的保護(hù)功效表19
*雙例費(fèi)希爾恰當(dāng)檢驗(yàn)(顯著性水平α＝0.05)，用于疫苗組和安慰劑組間各組的比較。
N＝受試者人數(shù)n/％＝報(bào)告至少一次特定輪狀病毒胃腸炎發(fā)作的受試者人數(shù)顯示精確95％置信區(qū)間。
結(jié)論這些結(jié)果非常支持兩劑單價(jià)HRV疫苗RotarixTM，在保護(hù)嬰幼兒抵抗由均一G1毒株所引起的任何輪狀病毒胃腸炎及嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎中的功效，以及針對(duì)不均一毒株，即G2、G3、G4和G9廣泛的交叉保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)針對(duì)由一種輪狀病毒血清型引起的輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予受試者包含來(lái)自不同血清型的減毒輪狀病毒株的組合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述血清型由輪狀病毒G蛋白的序列限定。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述減毒輪狀病毒能夠誘導(dǎo)針對(duì)至少兩種其它輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述減毒輪狀病毒能夠誘導(dǎo)針對(duì)至少三種其它輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述減毒輪狀病毒能夠誘導(dǎo)針對(duì)至少四種其它輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述減毒輪狀病毒株為單一輪狀病毒變異株或基本單一輪狀病毒變異株，所述變異株由編碼至少一種被稱(chēng)為VP4和VP7、優(yōu)選VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包含具有VP4基因的輪狀病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含至少一個(gè)以下堿基從起始密碼子起788位的腺嘌呤堿基(A)、802位的腺嘌呤堿基(A)和501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述VP4基因的核苷酸序列中包含從起始密碼子起788位和802位的腺嘌呤堿基(A)和501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包含具有VP7基因的輪狀病毒，所述VP7基因在其核苷酸序列中包含至少一個(gè)以下堿基從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)、897位的腺嘌呤(A)和897位的鳥(niǎo)嘌呤(G)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述VP7基因的核苷酸序列中包含從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)或鳥(niǎo)嘌呤(G)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包含具有VP4基因的輪狀病毒，所述PV4基因在其核苷酸序列中包含從起始密碼子起788位和802位的腺嘌呤(A)和501位的胸腺嘧啶(T)；并且其中所述VP7基因在其核苷酸序列中包含從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包含G1輪狀病毒株，并且用于誘導(dǎo)針對(duì)G1血清型和至少一種非G1血清型的免疫應(yīng)答，所述非G1血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14血清型。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物包含G1輪狀病毒株，并且用于誘導(dǎo)針對(duì)G1血清型和至少兩種非G1血清型的免疫應(yīng)答，所述非G1血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14血清型。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述組合物包含G1輪狀病毒株，并且用于誘導(dǎo)針對(duì)G1血清型以及G2、G3、G4和G9血清型的免疫應(yīng)答。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物在接種個(gè)體的群體中，針對(duì)與所述組合物中存在的減毒輪狀病毒不同型別的輪狀病毒感染所引起的腹瀉的保護(hù)率高達(dá)60％。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物針對(duì)與所述組合物中存在的減毒輪狀病毒不同型別的輪狀病毒感染所引起的胃腸炎的保護(hù)率高達(dá)81％。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包含G1輪狀病毒株，所述G1輪狀病毒株在接種個(gè)體的群體中，針對(duì)由至少兩種非G1血清型輪狀病毒感染所引起的嚴(yán)重胃腸炎的保護(hù)率高達(dá)83％。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述胃腸炎由至少四種非G1血清型輪狀病毒感染所引起，所述非G1血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述胃腸炎由G2、G3、G4和G9血清型感染所引起。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述輪狀病毒株為歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)保藏材料99081301，或者可得自或來(lái)源于ECACC保藏材料99081301。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物按兩劑方案給予。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述減毒輪狀病毒株與合適的藥用載體或與抗酸緩沖液或與它們兩者配制在一起。
23.來(lái)自一種血清型的減毒輪狀病毒株在制備用于誘導(dǎo)針對(duì)由不同輪狀病毒血清型引起的輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述血清型由所述輪狀病毒G蛋白的序列限定。
25.權(quán)利要求23或24的用途，其中所述減毒輪狀病毒能夠誘導(dǎo)針對(duì)至少兩種其它輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
26.權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)的用途，其中所述減毒輪狀病毒能夠誘導(dǎo)針對(duì)至少三種其它輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
27.權(quán)利要求23-26中任一項(xiàng)的用途，其中所述減毒輪狀病毒能夠誘導(dǎo)針對(duì)至少四種其它輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
28.權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的用途，其中所述減毒輪狀病毒株為單一輪狀病毒變異株或基本單一輪狀病毒變異株，所述變異株由編碼至少一種被稱(chēng)為VP4和VP7、優(yōu)選VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定。
29.權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含具有VP4基因的輪狀病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含至少一個(gè)以下堿基從起始密碼子起788位的腺嘌呤堿基(A)、802位的腺嘌呤堿基(A)和501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
30.權(quán)利要求29的用途，其中所述VP4基因的核苷酸序列中包含從起始密碼子起788位和802位的腺嘌呤堿基(A)和501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
31.權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含具有VP7基因的輪狀病毒，所述VP7基因在其核苷酸序列中包含至少一個(gè)以下堿基從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)、897位的腺嘌呤(A)和897位的鳥(niǎo)嘌呤(G)。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述VP7基因的核苷酸序列中包含從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)或鳥(niǎo)嘌呤(G)。
33.權(quán)利要求30或32的用途，其中所述組合物包含具有VP4基因的輪狀病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含從起始密碼子起788位和802位的腺嘌呤(A)和501位的胸腺嘧啶(T)；其中所述VP7基因在其核苷酸序列中包含從起始密碼子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)。
34.權(quán)利要求23-33中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含G1輪狀病毒株，并且用于誘導(dǎo)針對(duì)G1血清型和至少一種非G1血清型的免疫應(yīng)答，所述非G1血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14血清型。
35.權(quán)利要求34的用途，其中所述組合物包含G1輪狀病毒株，并且用于誘導(dǎo)針對(duì)G1血清型和至少兩種非G1血清型的免疫應(yīng)答，所述非G1血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14血清型。
36.權(quán)利要求35的用途，其中所述組合物包含G1輪狀病毒株，并且用于誘導(dǎo)針對(duì)G1以及G2、G3、G4和G9血清型的免疫應(yīng)答。
37.權(quán)利要求23-36中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物在接種個(gè)體的群體中，針對(duì)與所述組合物中存在的減毒輪狀病毒不同型別輪狀病毒感染所引起的腹瀉的保護(hù)率高達(dá)60％。
38.權(quán)利要求23-37中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物針對(duì)與所述組合物中存在的減毒輪狀病毒不同型別的輪狀病毒感染所引起的胃腸炎的保護(hù)率高達(dá)81％。
39.權(quán)利要求23-38中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含G1輪狀病毒株，所述G1輪狀病毒株在接種個(gè)體的群體中，針對(duì)由至少兩種非G1血清型輪狀病毒感染所引起的嚴(yán)重胃腸炎的保護(hù)率高達(dá)83％。
40.權(quán)利要求38或39的用途，其中所述胃腸炎由至少四種非G1血清型輪狀病毒的感染所引起，所述非G1血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。
41.權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)的用途，其中所述胃腸炎由G2、G3、G4和G9血清型的感染所引起。
42.權(quán)利要求23-41中任一項(xiàng)的用途，其中所述輪狀病毒株為ECACC保藏材料99081301，或者可得自或來(lái)源于ECACC保藏材料99081301。
43.權(quán)利要求23-42中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物按兩劑方案給予。
44.權(quán)利要求23-43中任一項(xiàng)的用途，其中所述減毒輪狀病毒株與合適的藥用載體或與抗酸緩沖液或它們兩者配制在一起。
45.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述輪狀病毒株是G1血清型，能夠誘導(dǎo)針對(duì)不是G9血清型的非G1血清型的免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明提供誘導(dǎo)針對(duì)由一種輪狀病毒血清型引起的輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予受試者包含來(lái)自不同血清型的減毒輪狀病毒疫苗的組合物。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1871027SQ200480031559
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
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