專利名稱：新型質(zhì)粒及其利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于屬于紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物(以下稱為紅球菌屬菌)的新型質(zhì)粒及其利用。更具體地說，涉及質(zhì)粒及作為其一部分的DNA片段(以下簡稱DNA片段)，以及利用它們的穿梭載體、載體(vector)、轉(zhuǎn)化體、氨基酮不對稱還原酶的制造方法、以及光學(xué)活性氨基醇的制造方法。
背景技術(shù)：
紅球菌屬(Rhodococcus)菌，已知可以產(chǎn)生與腈類的代謝相關(guān)的酶，可以產(chǎn)生不對稱地還原氨基酮的酶。特別是紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)，已知具有極高的氨基酮不對稱還原活性。這樣的微生物和酶，作用于α-氨基酮，可以高收率且高選擇性地生產(chǎn)光學(xué)活性β-氨基醇(例如，專利文獻(xiàn)1和5)。因此，從以前就期待在紅球菌屬菌中，以有用的酶等的大量生產(chǎn)為目的的宿主載體系統(tǒng)的開發(fā)。但是，現(xiàn)狀是適合于以紅球菌屬菌為宿主的載體的開發(fā)緩慢。紅球菌屬菌中發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的微生物，僅有紅球菌屬sp.H13-A株(非專利文獻(xiàn)1)、紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC4276株(專利文獻(xiàn)2)、紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC4001株(專利文獻(xiàn)3)、和紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IFO12320株(專利文獻(xiàn)4)等幾株。
專利文獻(xiàn)1國際公開WO01/73100號公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本特開平4-148685號公報(bào)專利文獻(xiàn)3日本特開平4-330287號公報(bào)專利文獻(xiàn)4日本特開平9-28379號公報(bào)專利文獻(xiàn)5國際公開WO02/070714號公報(bào)非專利文獻(xiàn)1J.Bacteriol.，170，638，1988

發(fā)明內(nèi)容
如上所述人們希望由紅球菌屬菌開發(fā)用于育種、改良(突變株)在工業(yè)上可利用的菌株的新的載體。特別是，從重組DNA微生物和作為其產(chǎn)物的食品和添加物的安全性方面出發(fā)，希望通過自身克隆(selfcloning)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的目的在于，提供一種在此類宿主載體系統(tǒng)中作為載體利用的新型質(zhì)粒。
希望在具有氨基酮不對稱還原活性的紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)中，創(chuàng)造出工業(yè)上可利用的重組微生物。特別地，本發(fā)明的第一目的在于，提供一種在此類重組微生物的創(chuàng)造中可以利用的新型質(zhì)粒或作為其一部分的DNA片段。
如果得到上述的質(zhì)粒，也就容易構(gòu)建在其它微生物中可復(fù)制的穿梭載體。本發(fā)明的第二目的在于，提供此類穿梭載體構(gòu)建必要的DNA復(fù)制相關(guān)的堿基序列信息(復(fù)制區(qū)域等)。
本發(fā)明的第三目的在于，提供在紅球菌屬菌和大腸桿菌中都可以復(fù)制的穿梭載體。
再者，本發(fā)明的第四目的在于，上述穿梭載體在氨基酮不對稱還原酶中的應(yīng)用。
本發(fā)明者專心篩選了用于由紅球菌屬菌株制造載體的質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了可作為宿主載體系統(tǒng)中的載體利用的幾個新型質(zhì)粒。
此外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在上述質(zhì)粒中，通過導(dǎo)入耐藥基因、在大腸桿菌內(nèi)可復(fù)制的基因區(qū)域等，可以制造穿梭載體。這樣，得到完成上述課題的堿基序列信息、質(zhì)粒和穿梭載體，從而完成了本發(fā)明。
即，根據(jù)本發(fā)明，提供了在以下的(1)～(39)中記載的DNA片段、DNA、質(zhì)粒、穿梭載體、載體、轉(zhuǎn)化體、氨基酮不對稱還原酶的制造方法，以及光學(xué)活性氨基醇的制造方法。
(1)DNA片段，具有選自序列號35、序列號36和序列號37記錄的堿基序列的至少1個堿基序列。
(2)質(zhì)粒或作為其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有選自序列號35、序列號36和序列號37記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域。
(3)DNA片段，具有選自序列號1、序列號4、序列號14、序列號17和序列號22記錄的堿基序列的至少1個堿基序列。
(4)質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號1、序列號4、序列號14、序列號17和序列號22中記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域。
(5)質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號1、序列號4、序列號14、序列號17和序列號22記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，且包含具有選自序列號35、序列號36和序列號37記錄的堿基序列中的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域。
(6)DNA片段，具有序列號76記錄的堿基序列。
(7)質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有序列號76記錄的堿基序列的啟動子區(qū)域。
(8)質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號1、序列號4、序列號14、序列號17和序列號22記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，包含具有選自序列號35、序列號36和序列號37記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域，并且包含具有序列號76記錄的堿基序列的啟動子區(qū)域。
(9)環(huán)狀質(zhì)粒，其特征在于，具有(1)～(8)項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；駾NA片段，限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)數(shù)為，BamHI2，EcoRI2，KpnI1，PvuII1，SacI1，以及SmaI1，大小為約5.4kbp。
(10)質(zhì)粒，具有序列號73記錄的堿基序列。
(11)(1)～(10)中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；駾NA片段，其特征在于，來源于紅球菌屬菌。
(12)DNA片段，具有選自序列號70、序列號71和序列號72記錄的堿基序列的至少1個堿基序列。
(13)質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號70、序列號71和序列號72記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域。
(14)DNA片段，具有選自序列號40、序列號42、序列號44、序列號45、序列號53、序列號55、序列號56、序列號61、序列號62和序列號69記錄的堿基序列的至少1個堿基序列。
(15)質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號40、序列號42、序列號44、序列號45、序列號53、序列號55、序列號56、序列號61、序列號62和序列號69記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域。
(16)質(zhì)粒或作為其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有選自序列號40、序列號42、序列號44、序列號45、序列號53、序列號55、序列號56、序列號61、序列號62和序列號69記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，并且包含具有選自序列號70、序列號71和序列號72記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域。
(17)質(zhì)粒或作為其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有選自序列號40、序列號42、序列號44、序列號45、序列號53、序列號55、序列號56、序列號61、序列號62和序列號69記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，包含具有選自序列號70、序列號71和序列號72記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域，并且包含具有序列號76記錄的堿基序列的啟動子區(qū)域。
(18)DNA片段，具有選自序列號67和序列號47記錄的堿基序列的至少1個堿基序列。
(19)質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號67和序列號47記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的接合蛋白質(zhì)區(qū)域。
(20)DNA片段，具有序列號75記錄的堿基序列。
(21)質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含與具有序列號75記錄的堿基序列的接合相關(guān)的區(qū)域。
(22)環(huán)狀質(zhì)粒，其特征在于，具有(12)～(21)中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；駾NA片段，限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)數(shù)為，BamHI2，PvuII4，SacI3，和SmaI4，大小為約5.8kbp。
(23)質(zhì)粒具有序列號74記錄的堿基序列。
(24)如(12)～(23)中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；駾NA片段，其特征在于，來源于紅球菌屬菌。
(25)DNA片段，具有序列號77記錄的堿基序列。
(26)DNA片段，其特征在于，包含具有序列號77記錄的堿基序列的啟動子區(qū)域。
(27)在紅球菌屬菌和大腸桿菌內(nèi)可復(fù)制的穿梭載體，包含(1)～(26)中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，和在大腸桿菌內(nèi)可復(fù)制的DNA區(qū)域。
(28)載體，其特征在于，使用(27)所述的穿梭載體制造。
(29)載體，其特征在于，包含(6)、(7)、(25)或(26)中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；駾NA片段。
(30)如(28)或(29)所述的載體，其特征在于，插入有氨基酮不對稱還原酶基因。
(31)如(30)所述的載體，其特征在于，氨基酮不對稱還原酶基因，是編碼含有序列號78記錄的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸；或編碼具有序列號78的氨基酸序列中缺失、插入、取代或加成1個或多個氨基酸的氨基酸序列，且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)的核酸。
(32)如(30)所述的載體，其特征在于，氨基酮不對稱還原酶基因，是含有序列號79記錄的堿基序列的核酸；或編碼在嚴(yán)格條件下與含有與序列號79互補(bǔ)的堿基序列的核酸雜交、且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)的核酸。
(33)轉(zhuǎn)化體，包含(28)或(29)所述的載體。
(34)轉(zhuǎn)化體，包含(30)～(32)中任一項(xiàng)所述的載體。
(35)氨基酮不對稱還原酶的制造方法，包括，將(34)所述的轉(zhuǎn)化體在可增殖該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)工序，和由上述培養(yǎng)工序所得的該轉(zhuǎn)化體精制氨基酮不對稱還原酶的精制工序。
(36)光學(xué)活性氨基醇的制造方法，使得(35)所述的制造方法得到的氨基酮不對稱還原酶作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，生成通式(2)表示的、且具有期望的光學(xué)活性的光學(xué)活性氨基醇化合物，其中，
式中，X可以相同也可以不同，表示選自鹵原子、低級烷基、也可以由保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基和磺?；闹辽僖环N；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3可以相同也可以不同，表示選自氫原子和低級烷基的至少一種；*表示不對稱碳， 式中，X、n、R1、R2、R3和*與上述定義相同。
(37)光學(xué)活性氨基醇的制造方法，使得(34)所述的轉(zhuǎn)化體作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，可以生成通式(2)表示的、具有期望的光學(xué)活性的光學(xué)活性氨基醇化合物，其中， 式中，X可以相同也可以不同，表示選自鹵原子、低級烷基、也可以由保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基和磺酰基的至少一種；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3可以相同也可以不同，表示選自氫原子和低級烷基的至少一種；*表示不對稱碳，
式中，X、n、R1、R2、R3和*與上述定義相同。
(38)光學(xué)活性氨基醇的制造方法，在(37)所述的光學(xué)活性氨基醇的制造方法中，進(jìn)一步添加由通式(3)表示的化合物，或其制藥學(xué)上可接受的鹽或者溶劑合物，生成光學(xué)活性氨基醇，其中， 式中，A表示結(jié)構(gòu)式(Y)或(Z)， 這里，R4表示氫原子、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～3的烷基、與R8結(jié)合形成碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)或與R8結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架，
這里，R5表示氫原子、碳原子數(shù)1～3的烷基、或者與R6或R9結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架，R6表示氫原子、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～3的烷基、與R8結(jié)合形成碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)、與R5或R9結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架，R7表示氫原子、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基，R8表示氫原子、羧基、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基、與R4結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架、與R6結(jié)合形成碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)；R9表示氫原子、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷氧基羰基、也可以具有取代基的?；?、與R5或R6結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R10表示氫原子或也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基。
(39)(27)所述的穿梭載體，具有選自序列號89～序列號100記錄的堿基序列的堿基序列。
本發(fā)明的質(zhì)粒，是目前未知的新型質(zhì)粒，具有作為屬于工業(yè)上有用的紅球菌屬的宿主載體系統(tǒng)中的載體的價值。特別是，在創(chuàng)造可在工業(yè)上進(jìn)行的氨基酮的不對稱還原的重組微生物方面有用。作為這樣的微生物貢獻(xiàn)的氨基酮不對稱還原，可以舉出由1-2-甲基氨基-1-苯基-1-丙酮制造d-(1S，2S)-偽麻黃堿的反應(yīng)。
此外，本發(fā)明的質(zhì)粒，由于與單一的紅球菌屬細(xì)胞共存，所以除了利用復(fù)制功能的單獨(dú)使用以外，也可以分別作為相容性質(zhì)粒利用。即，通過將其它蛋白質(zhì)(酶等)基因插入于各個質(zhì)粒中，可以同時在同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)其它蛋白質(zhì)。
并且，本發(fā)明的穿梭載體，在紅球菌屬菌和大腸桿菌(埃希氏菌屬(Escherichia)菌)中，在創(chuàng)造工業(yè)上可利用的重組微生物方面有用。
由本發(fā)明的質(zhì)粒得到的DNA復(fù)制相關(guān)的堿基序列信息，基于此可構(gòu)建上述穿梭載體，具體提供載體的構(gòu)建要素的DNA片段等。


圖1是質(zhì)粒pRET1100的限制性內(nèi)切酶切割圖。
圖2是質(zhì)粒pRET1000的限制性內(nèi)切酶切割圖。
圖3是表示構(gòu)建穿梭載體pRET1101的概要圖。
圖4是表示構(gòu)建穿梭載體pRET1102的概要圖。
圖5是表示構(gòu)建穿梭載體pRET1103的概要圖。
具體實(shí)施例方式
以下按照優(yōu)選的實(shí)施方式說明本發(fā)明。
本發(fā)明的第一質(zhì)粒是由紅球菌屬菌分離的質(zhì)?；蚱溲苌铩＞唧w地說，例如，可以從紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IAM1400、IAM1503、JCM2893和JCM2894株等的菌株分離，其大小為約5.4kbp，并且是具有相對表1中所示的限制性內(nèi)切酶的分解特性的環(huán)狀質(zhì)粒。以下，將由各個菌株分離的質(zhì)粒分別稱為pRET1100、pRET1300、pRET1500和pRET1700。其中，對于由試樣菌株制備本發(fā)明的質(zhì)粒，可以采用公知的方法(例如，煮沸法、堿溶解法、氯化銫密度梯度超離心法實(shí)驗(yàn)室手冊(Lab-manul)基因工程，第3版，第10章，55-59頁，丸善株式會社)。
表1


在圖1中表示質(zhì)粒pRET1100的限制性內(nèi)切酶圖。關(guān)于該質(zhì)粒，用公知的方法(例如，熒光式自動定序器)定序時，可知其全堿基序列是序列表的序列號73所示的5444bp。
此外，本發(fā)明的第二質(zhì)粒也是由紅球菌屬菌分離的質(zhì)?；蚱溲苌铩＞唧w地說，例如，可以從椿象紅球菌(Rhodococcus rhodnii)JCM3203株分離，其大小為約5.8kbp，并且是具有相對表2所示的限制性內(nèi)切酶的分解特性的環(huán)狀質(zhì)粒。以下，將該質(zhì)粒稱為pRET1000。
表2


質(zhì)粒pRET1000的限制性內(nèi)切酶圖如圖2所示。關(guān)于該質(zhì)粒，用公知的方法定序時，可知具有序列表的序列號74所示的5813bp的堿基序列。
如上所述，本發(fā)明的質(zhì)粒類(天然型或野生型)，是可由表1或表2中所示的限制性內(nèi)切酶切割圖案特定的環(huán)狀質(zhì)粒。因此，本發(fā)明包含以下2種環(huán)狀質(zhì)粒。
(1)一種環(huán)狀質(zhì)粒，來自紅球菌屬菌，其特征在于，大小為約5.4kbp，限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)數(shù)為BamHI2，EcoRI2，KpnI1，PvuII1，SacI1和SmaI1。
(2)一種環(huán)狀質(zhì)粒，來自紅球菌屬菌，其特征在于，大小為約5.8kbp，限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)數(shù)為BamHI2，PvuII4，SacI3和SmaI4。
分析質(zhì)粒pRET1100和pRET1000的堿基序列(即，序列號73和序列號74)的結(jié)果是，可以推測存在編碼具有DNA復(fù)制或其它功能的蛋白質(zhì)的一組堿基序列(可讀框，以下稱為orf)。
在該技術(shù)領(lǐng)域中，“DNA復(fù)制”是指，DNA自身成為模板，形成與已有的雙鏈DNA(母鏈DNA)完全相同的2個雙鏈DNA。其復(fù)制機(jī)構(gòu)，由從復(fù)制開始點(diǎn)(復(fù)制起點(diǎn))的開始、DNA鏈的伸長、終結(jié)3個階段構(gòu)成。復(fù)制時，DNA雙鏈的一部分解開，分別合成與單鏈互補(bǔ)的新的DNA鏈。解開雙鏈的，是DNA解螺旋酶和螺旋不穩(wěn)定性蛋白(也稱為單鏈DNA結(jié)合蛋白)，被解開的部分稱為復(fù)制叉。朝向復(fù)制叉3’→5’方向的模板DNA稱為前導(dǎo)鏈(leading chain)，其相反的5’→3’方向稱為后隨鏈(lagging chain)。DNA聚合酶向著5’→3’逐漸延長DNA鏈。因此，當(dāng)前導(dǎo)鏈為模板時，DNA在復(fù)制叉的方向上合成。而當(dāng)相反側(cè)的后隨鏈為模板時，DNA鏈必須在復(fù)制叉的反方向上延伸。因此，后隨鏈的復(fù)制，以稱為岡崎片段的約每200個堿基的片段進(jìn)行。約每200個堿基的RNA引物以DNA為模板，在5’→3’的方向合成10堿基的RNA。將該RNA作為引物，以后隨鏈為模板，DNA聚合酶在5’→3’方向上合成DNA鏈。被復(fù)制的約200堿基的DNA片段，除去其后的RNA而結(jié)合為單鏈的DNA。在這樣的復(fù)制機(jī)構(gòu)中，DNA解螺旋酶、螺旋不穩(wěn)定性蛋白等的各種蛋白質(zhì)協(xié)同形成復(fù)制裝置。作為相關(guān)的其它蛋白質(zhì)，可以舉出DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(防止DNA復(fù)制時的扭曲)、復(fù)制開始蛋白和復(fù)制終了蛋白等。關(guān)于DNA復(fù)制機(jī)構(gòu)，例如，在“細(xì)胞的分子生物學(xué)，第3版，中村桂子等譯，251-262頁，教育社，1996年”中有詳細(xì)解說。
此外，進(jìn)一步分析質(zhì)粒pRET1100和pRET1000的堿基序列的結(jié)果是，在上述DNA復(fù)制相關(guān)的orf的附近，發(fā)現(xiàn)了具有富含AT的同源性或相似性的重復(fù)性的序列或被認(rèn)為具有DNA的二次結(jié)構(gòu)的序列，即，推測為DNA復(fù)制區(qū)域(識別DNA的復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)的堿基序列區(qū)域、或存在DNA復(fù)制開始點(diǎn)的區(qū)域)的堿基序列。
以上，在DNA復(fù)制中，DNA復(fù)制區(qū)域和編碼DNA復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)(以下，稱為DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì))的區(qū)域是必須的。根據(jù)本發(fā)明，可以取得pRET1100和pRET1000兩個質(zhì)粒的這些區(qū)域的堿基序列相關(guān)的信息。
首先，在質(zhì)粒pRET1100中，序列號35～37記錄的堿基序列被鑒定為DNA復(fù)制區(qū)域。此外，序列號1～3記錄的堿基序列(orf1)、序列號4記錄的堿基序列(orf2)、序列號5～16記錄的堿基序列(orf3)、序列號17～21記錄的堿基序列(orf4)、序列號22～26記錄的堿基序列(orf5)、序列號27或28記錄的堿基序列(orf6)、序列號29或30記錄的堿基序列(orf7)、序列號31或32記錄的堿基序列(orf8)、序列號33或34記錄的堿基序列(orf9)被鑒定為DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域。
為了從pRET1100制造可復(fù)制DNA的質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒，需要包括至少1個上述DNA復(fù)制區(qū)域和至少1個上述DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域(orf)。因此，本發(fā)明的質(zhì)粒(重組型)的特征在于，包括至少1個這樣的DNA復(fù)制區(qū)域和至少1個DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域。這里，DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，優(yōu)選具有選自序列號1、4、14、17和22記錄的堿基序列的堿基序列。
由此，可知序列號76記錄的堿基序列的區(qū)域是與關(guān)系到復(fù)制的蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)的啟動子，本發(fā)明的質(zhì)粒，優(yōu)選包含具有序列號76記錄的堿基序列的啟動子區(qū)域。
在制造質(zhì)粒時，基于上述的堿基序列信息，可以適當(dāng)選擇并構(gòu)建DNA片段。此外，本發(fā)明也包含該質(zhì)粒的衍生物或功能性的(DNA復(fù)制)片段。
接著，在質(zhì)粒pRET1000中，序列號70～72中記載的堿基序列被鑒定為DNA復(fù)制區(qū)域。此外，序列號38～41記錄的堿基序列(orf10)、序列號42或43記錄的堿基序列(orf11)、序列號44記錄的堿基序列(orf12)、序列號45或46記錄的堿基序列(orf13)、序列號48～50記錄的堿基序列(orf14)、序列號51或52記錄的堿基序列(orf15)、序列號53或54記錄的堿基序列(orf16)、序列號55記錄的堿基序列(orf17)、序列號56～60記錄的堿基序列(orf18)、序列號61記錄的堿基序列(orf19)、序列號62記錄的堿基序列(orf20)、序列號63～69記錄的堿基序列(orf21)被鑒定為DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域。
為了從pRET1000制造可復(fù)制DNA的質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒，必須包括至少1個上述DNA復(fù)制區(qū)域和至少1個上述DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域(orf)。因此，本發(fā)明的質(zhì)粒(重組型)的特征在于，包括至少1個這樣的DNA復(fù)制區(qū)域和至少1個DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域。這里，DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，優(yōu)選具有選自序列號40、42、44、45、53、55、56、61、62和69記錄的堿基序列的堿基序列。
由此，可知序列號67和47記錄的堿基序列的區(qū)域是與接合蛋白質(zhì)(mobilization protein)有同源性，與接合相關(guān)。此外，可知序列號75記錄的堿基序列的區(qū)域與接合蛋白質(zhì)基因的表達(dá)相關(guān)，或是表達(dá)蛋白質(zhì)的識別部位。因此，本發(fā)明的質(zhì)粒，優(yōu)選包含具有序列號67和47記錄的堿基序列的接合蛋白質(zhì)區(qū)域，或包含具有序列號75記錄的堿基序列的接合相關(guān)的區(qū)域。
在質(zhì)粒制造時，基于上述的堿基序列信息，可以適當(dāng)選擇并構(gòu)建DNA片段。此外，本發(fā)明也包含該質(zhì)粒的衍生物或功能性的(DNA復(fù)制)片段。
本發(fā)明的質(zhì)?；駾NA片段，在DNA復(fù)制區(qū)域、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域、接合蛋白質(zhì)區(qū)域、接合相關(guān)區(qū)域或其一部分中，只要不損害各個區(qū)域的功能，也可以具有包含1個或多個核苷酸的取代、缺失、或插入的堿基序列。
此外，本發(fā)明的穿梭載體，包含本發(fā)明的DNA復(fù)制區(qū)域、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域、接合蛋白質(zhì)區(qū)域、接合相關(guān)的區(qū)域的任一個記錄的質(zhì)?；駾NA片段、以及可在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制的DNA區(qū)域，可以是可在紅球菌屬菌和大腸桿菌內(nèi)復(fù)制的穿梭載體，例如，可以舉出具有序列號89～序列號100的堿基序列的穿梭載體。本發(fā)明的穿梭載體，只要是可在紅球菌屬菌和大腸桿菌內(nèi)復(fù)制的穿梭載體，也可以具有包含1個或多個核苷酸的取代、缺失、或插入的堿基序列。
上述“多個”，根據(jù)區(qū)域的種類而不同，但具體來說，為2～1100個，優(yōu)選2～800個，更優(yōu)選2～300個。進(jìn)一步優(yōu)選為2～100個，更進(jìn)一步優(yōu)選為2～20個，最優(yōu)選為2～10個。
此外，作為DNA復(fù)制區(qū)域、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域、接合蛋白質(zhì)區(qū)域、與接合相關(guān)的區(qū)域或其一部分、以及實(shí)際上具有相同的堿基序列的質(zhì)?；駾NA片段，具體地可以舉出，DNA復(fù)制區(qū)域、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域、接合蛋白質(zhì)區(qū)域、接合相關(guān)的區(qū)域或其一部分、以及在嚴(yán)格的條件下雜交的堿基序列?！皣?yán)格的條件”是指形成所謂的特異的雜種，而不形成非特異的雜種的條件。雖然難以明確的數(shù)值化此條件，但是如果示例，可以舉出同源性高的DNA之間，例如具有80％以上、優(yōu)選為90％、更優(yōu)選為95％以上的同源性的DNA之間雜交，而與此相比，同源性低的DNA之間不雜交的條件。更具體地說，可以舉出，在相當(dāng)于通常的DNA雜交(Southern hybridization)的清洗條件的60℃，1×SSC、0.1％SDS，優(yōu)選為0.1×SSC、0.1％SDS的鹽濃度下雜交的條件。當(dāng)DNA復(fù)制區(qū)域、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域、接合蛋白質(zhì)區(qū)域、接合相關(guān)的區(qū)域的一部分使用300bp左右的長度的DNA片段時，作為雜交的清洗條件，可以舉出，50℃、2×SSC、0.1％SDS。
如上所述，具有DNA復(fù)制區(qū)域、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域、接合蛋白質(zhì)區(qū)域、接合相關(guān)的區(qū)域或與其一部分實(shí)質(zhì)上相同的堿基序列的質(zhì)?；駾NA片段，例如，可以用位點(diǎn)專一突變法，通過以在特定的位點(diǎn)的核苷酸中包含取代、缺失或插入的方式，改變DNA復(fù)制區(qū)域、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域、接合蛋白質(zhì)區(qū)域、接合相關(guān)的區(qū)域或其一部分而取得。此外，如上所述被改變的DNA，也可以通過現(xiàn)有已知的突變處理而取得。作為突變處理，可以舉出，將含有DNA復(fù)制區(qū)域、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域、接合蛋白質(zhì)區(qū)域、接合相關(guān)的區(qū)域或其一部分的DNA用羥胺等進(jìn)行體外處理的方法，和將保持同DNA的微生物，例如，埃希氏菌(Escherichia)屬細(xì)菌，用紫外線或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或EMS等的通常用于突變處理的誘變劑處理的方法。
此外，在上述的核苷酸的取代、缺失或插入中，也包含由紅球菌屬菌的菌株的差異等的天然產(chǎn)生的變異(mutant或variant)。
本發(fā)明的穿梭載體，包含上述的質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段(A)和可在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制的DNA區(qū)域(B)。此外，該穿梭載體，根據(jù)情況也可以包含含耐藥性基因的DNA區(qū)域，且其是優(yōu)選的。在該技術(shù)領(lǐng)域中，一般地，“穿梭載體”是指包含2種細(xì)胞的DNA復(fù)制機(jī)構(gòu)，優(yōu)選進(jìn)一步包含作為選擇標(biāo)記的耐藥性基因等，并且可以在該二種細(xì)胞中自主復(fù)制的載體。質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段(A)，是可在紅球菌屬菌中復(fù)制的DNA區(qū)域?？稍诖竽c桿菌內(nèi)復(fù)制的DNA區(qū)域(B)，只要是可在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制增殖的質(zhì)粒，可以是質(zhì)粒整體，也可以是其一部分。作為上述可在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制的DNA區(qū)域，例如，可以使用pUC18、pHSG299、pHSG398等的質(zhì)粒。
本發(fā)明的穿梭質(zhì)粒包含耐藥性基因時，優(yōu)選使用耐氨芐青霉素(ampicillin)性基因、耐卡那霉素性基因、耐氯霉素性基因等，但只要是可以在作為宿主的紅球菌屬菌和大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，賦予宿主細(xì)胞耐藥性的，并且在兩種菌屬間，由耐藥性能可以確認(rèn)質(zhì)粒的存在的，就不限定藥劑的種類。此外，也可以使用多個這樣的耐藥性基因。
在穿梭載體中，優(yōu)選包含多個克隆位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))，該克隆位點(diǎn)和上述耐藥性基因，例如，可以從大腸桿菌質(zhì)粒衍生。即，將上述列舉的公知的大腸桿菌質(zhì)粒由適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割，制造包含克隆位點(diǎn)和耐藥性基因的DNA區(qū)域，與其它DNA片段(在紅球菌屬菌中可復(fù)制的DNA區(qū)域)連接。
作為實(shí)例，在圖3～5中表示穿梭載體的構(gòu)建的概略。穿梭載體，在用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理上述質(zhì)粒和來源于大腸桿菌的質(zhì)粒后，可以通過連接兩者而構(gòu)建。這樣，本發(fā)明者使用紅球菌屬菌的質(zhì)粒pRET1000、pRET1100和pRET1200和大腸桿菌的質(zhì)粒pUC18、pHSG299和pHSG398，制造了18種穿梭載體(表5)。
本發(fā)明的穿梭載體，可以以紅球菌屬菌或大腸桿菌為宿主，可以在它們的任一中復(fù)制，可以在工業(yè)上利用。由本發(fā)明的穿梭載體轉(zhuǎn)化的紅球菌屬菌或大腸桿菌，以及其它微生物的轉(zhuǎn)化體，也可這樣利用，這些轉(zhuǎn)化體也包含于本發(fā)明。
本發(fā)明的載體的特征在于，使用本發(fā)明的穿梭載體制造。即，要導(dǎo)入的目標(biāo)DNA被插入本發(fā)明的穿梭載體中形成的載體。在用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理要導(dǎo)入的DNA和本發(fā)明的穿梭載體后，可以通過連接兩者制造該載體。通過利用該載體，可以得到導(dǎo)入有期望的DNA的轉(zhuǎn)化體。
作為插入的DNA，例如，可以舉出氨基酮不對稱還原酶基因和輔酶再生類酶基因。氨基酮不對稱還原酶基因，是WO02/070714中記載的編碼氨基酮不對稱還原酶的基因，更具體地說，是編碼序列號78記錄的由氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)(來源于紅串紅球菌(R.erythropolis)MAK-34株的氨基酮不對稱還原酶)的DNA，特別是由序列號79記錄的堿基序列構(gòu)成的DNA。在本說明書中完全包含WO02/070714中記載的內(nèi)容。
氨基酮不對稱還原酶，只要具有WO02/070714中記載的性質(zhì)就可以，也包括具有序列表的序列號78記錄的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，和，具有在上述氨基酸序列中缺失、插入、取代或加成1個或多個氨基酸的氨基酸序列、并且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)。這里，氨基酮不對稱還原活性，是指以由上述通式(1)表示的α-氨基酮為底物生成由上述通式(2)表示的光學(xué)活性的氨基醇的活性。
作為實(shí)施此類缺失、插入、取代、加成的方法沒有特別限制，可以使用公知的方法。例如，可以舉出，日本生化學(xué)會編，《續(xù)生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1，基因研究法II》，p105(廣瀨進(jìn))，東京化學(xué)同人(1986)；日本生化學(xué)會編，《新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座2，核酸III(重組DNA技術(shù))》，p233(廣瀨進(jìn))，東京化學(xué)同人(1992)；R.Wu，L.Grossman編，《Methodsin Enzymology》，Vol.154，p.350&p.367，Academic Press，NewYork(1987)；R.Wu，L.Grossman編，《Methods in Enzymology》，Vol.100，p.457&p.468，Academic Press，New York(1983)；J.A.Wells等，《Gene》，Vol.34，p.315(1985)；T.Grundstroem等，《Nucleic Acids Res.》，Vol.13，p.3305(1985)；J.Taylor等，《Nucleic Acids Res.》，Vol.13，p.8765(1985)；R.Wu編，《Methods in Enzymology》，Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant等，《Gene》，Vol.44，p.177(1986)中記載的方法。具體地說，可以舉出，例如，利用合成低聚核苷酸等的位點(diǎn)專一突變導(dǎo)入法，Kunkel法，dNTP[αS]法(Eckstein)法，使用亞硫酸或亞硝酸等的區(qū)域指定變異導(dǎo)入法等的方法。
此外，在很多蛋白質(zhì)中存在糖鏈被加成的情況，通過取代1個或多個氨基酸可以調(diào)節(jié)糖鏈的加成。所以，序列表的序列號78記錄的氨基酸序列中，只要上述已調(diào)節(jié)糖鏈的蛋白質(zhì)也具有上述的氨基酮不對稱還原活性，也包含于本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶中。
并且，本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶，可以用化學(xué)的方法修飾其含有的氨基酸殘基，使用肽酶，例如，胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠羅蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽鏈端解酶等的酶修飾，或部分分解而改變?yōu)槠溲苌铩?br> 此外，在用基因重組法制造時，也可以變換、加工為作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)的、在生物體內(nèi)或生物體外與天然的氨基酮不對稱還原酶實(shí)質(zhì)上具有同等的生物學(xué)活性的物質(zhì)。此時，可以使用基因工程上常用的融合產(chǎn)生法，這樣的融合蛋白質(zhì)也可以利用其融合部以親和色譜法精制。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的修飾、改變等，可以參考例如日本生化學(xué)會編，《新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1，蛋白質(zhì)VII，蛋白質(zhì)工程》，東京化學(xué)同人(1993)，可以用那里記載的方法或在那里引用的文獻(xiàn)記載的方法、或者實(shí)質(zhì)上與它們同樣的方法進(jìn)行。
并且，本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶也可以是，1個以上的氨基酸殘基在同一性方面與天然的不同的物質(zhì)，1個以上的氨基酸殘基的位置與天然的不同的物質(zhì)。本發(fā)明也包含，在天然的氨基酮不對稱還原酶中特有的氨基酸殘基1個以上(例如，1～80個，優(yōu)選為1～60個，更優(yōu)選為1～40個，進(jìn)一步優(yōu)選為1～20個，特別優(yōu)選為1～10個等)缺失的缺失類似體，特有的氨基酸殘基的1個以上(例如，1～80個，優(yōu)選為1～60個，更優(yōu)選為1～40個，進(jìn)一步優(yōu)選為1～20個，特別優(yōu)選為1～10個等)被其它殘基取代的取代類似體，1個以上(例如，1～80個，優(yōu)選為1～60個，更優(yōu)選為1～40個，進(jìn)一步優(yōu)選為1～20個，特別優(yōu)選為1～10個等)的氨基酸殘基被加成的加成類似體。也可以包含具有天然的氨基酮不對稱還原酶的特征的域(domain)結(jié)構(gòu)的氨基酮不對稱還原酶。此外，還可以舉出具有相同性質(zhì)的氨基酮不對稱還原酶活性的氨基酮不對稱還原酶。
只要保持作為天然的氨基酮不對稱還原酶的特征的域結(jié)構(gòu)，如上述的突變體，全部包含于本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶中。此外，本發(fā)明人認(rèn)為，也可以含有具有與本發(fā)明的天然的氨基酮不對稱還原酶實(shí)質(zhì)上同等的一次結(jié)構(gòu)構(gòu)象或其一部分的氨基酮不對稱還原酶，并且也可以含有具有與天然的氨基酮不對稱還原酶實(shí)質(zhì)上同等的生物學(xué)活性的氨基酮不對稱還原酶。再者，也可以是天然產(chǎn)生的突變體的一個。這樣的本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶，可以如下述說明地被分離·精制處理。另一方面，本發(fā)明也包含，編碼上述的多肽的DNA片段，具有天然的特性的全部或一部分的氨基酮不對稱還原酶的多肽，以及編碼其類似體或衍生物的DNA片段。該氨基酮不對稱還原酶的核苷酸，也可以被修飾(例如，加成、除去、取代等)，也可以包含這樣被修飾的物質(zhì)。
本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶基因，是編碼上述氨基酮不對稱還原酶的核酸。代表性地可以舉出，編碼具有序列表的序列號78記錄的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸，特別是具有序列號79記錄的堿基序列的核酸，由于編碼一個氨基酸的堿基序列(密碼子)存在多個，所以編碼具有在序列號78記錄的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸存在許多。因此，本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶基因中也包含這樣的核酸。這里，“編碼蛋白質(zhì)”是指，當(dāng)DNA為雙鏈時，互補(bǔ)的雙鏈的任意一方包含具有編碼蛋白質(zhì)的堿基序列的物質(zhì)，因此在本發(fā)明的核酸中也包含，由直接編碼序列號78記錄的氨基酸序列的堿基序列構(gòu)成的核酸或由其的互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸。再者，本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶基因，也可以是編碼在嚴(yán)格的條件下，與含有與序列號79互補(bǔ)的堿基序列的核酸雜交，且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)的核酸。這里，“嚴(yán)格的條件”與上述定義相同。
輔酶再生類酶基因，可以舉出各種脫氫酶，即，葡萄糖脫氫酶、葡萄糖六磷酸脫氫酶、醛脫氫酶、醇脫氫酶、有機(jī)酸脫氫酶和氨基酸脫氫酶等。更具體地可以適宜使用乙醛脫氫酶、乙醇脫氫酶、丙醇脫氫酶、甘油脫氫酶、甲酸脫氫酶、乙酸脫氫酶、丁酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶等。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體特征為含有上述載體。轉(zhuǎn)化體，通過在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入上述載體而得到。載體的導(dǎo)入方法，可以用公知的方法，例如，磷酸鈣法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(lipofection)、電穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)進(jìn)行。
例如，包含插入有氨基酮不對稱還原酶基因的載體的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，具有氨基酮不對稱還原活性，可以應(yīng)用于下述的氨基酮不對稱還原酶的制造方法和光學(xué)活性氨基醇的制造方法中。
本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶的制造方法，其特征在于，包括，將包含插入有氨基酮不對稱還原酶基因的載體的轉(zhuǎn)化體在該轉(zhuǎn)化體可增殖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)工序，和，由在上述培養(yǎng)工序中得到的該轉(zhuǎn)化體精制氨基酮不對稱還原酶的精制工序。
作為上述培養(yǎng)的方法，只要是使用的菌體可生長的條件就可以沒有特別限制的使用公知的方法，通?？梢允褂煤刑荚?、氮源、其它養(yǎng)分的液體培養(yǎng)基。作為培養(yǎng)基的碳源，只要是上述菌體可利用的都可以使用。具體來說，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糊精、淀粉、山梨糖醇等的糖類，甲醇、乙醇、甘油等的醇類，富馬酸、檸檬酸、乙酸、丙酸等的有機(jī)酸類及其鹽，鏈烷烴等的烴類，或者它們的混合物等。作為氮源，只要是上述菌體可利用的任何氮源都可以使用。具體來說，可以使用氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等的無機(jī)酸的銨鹽；富馬酸銨、檸檬酸銨等的有機(jī)酸的銨鹽；硝酸鈉，硝酸鉀等的硝酸鹽；肉膏、酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨等的無機(jī)或有機(jī)含氮化合物，或者它們的混合物。此外，在培養(yǎng)基中，也可以適當(dāng)添加無機(jī)鹽、微量金屬鹽、維生素類等的用于通常的培養(yǎng)的營養(yǎng)源。此外，根據(jù)需要，也可以在培養(yǎng)基中添加促進(jìn)菌體增殖的物質(zhì)、有效用于培養(yǎng)基的pH保持的緩沖物質(zhì)等。
菌體的培養(yǎng)，可以在適宜生長的條件下進(jìn)行。具體來說，可以在培養(yǎng)基的pH為3～10，優(yōu)選為4～9，溫度0～50℃，優(yōu)選為20～40℃下進(jìn)行。菌體的培養(yǎng)，可以在好氧或厭氧的條件下進(jìn)行。培養(yǎng)時間優(yōu)選為10～150小時，應(yīng)該根據(jù)各個菌體而適當(dāng)確定。
將這樣培養(yǎng)的菌體的培養(yǎng)液過濾或離心分離，用水或緩沖液充分清洗其菌體。清洗后的菌體懸濁于適量的緩沖液中，破碎菌體。作為破碎的方法沒有特別限制，可以舉出，例如，研缽、戴諾研磨機(jī)(Dyno-millダイノミル)、弗式壓碎器(Frenchpress フレンチブレス)、超聲波破碎機(jī)等的機(jī)械破碎法。由所得的菌體的破碎液中，通過過濾或離心分離除去固體物質(zhì)而得到的無細(xì)胞提取液中的氨基酮不對稱還原酶，通過酶分離的通常方法取得。
作為這樣的酶分離的方法，沒有特別限制，可以使用公知的方法，但是可以通過以下方法精制，例如，硫酸銨沉淀法等的鹽析；由交聯(lián)葡聚糖等的凝膠過濾法；使用具有二乙基氨基乙基或羧甲基等的載體等的離子交換層析法；使用具有丁基、辛基、苯基等疏水性基團(tuán)的載體等的疏水性層析法；色素凝膠層析法；電泳法；透析；超濾法；親和層析法；高效液相色譜法等進(jìn)行精制。
并且，也可以將上述酶作為固定化酶使用。作為這樣的方法沒有特別限制，可以使用公知的方法，可以舉出固定化酶或酶產(chǎn)生細(xì)胞的方法，可以通過稱為共價鍵法或吸附法的載體結(jié)合法、交聯(lián)法、遮蓋法等進(jìn)行固定化。此外，也可以根據(jù)需要使用戊二醛、1，2-己二異氰酸酯、1，2-己二異硫氰酸酯(hexamethylene diisothiocyanate)等的縮合劑。此外，作為其它固定化法，可以舉出，例如，使單體由聚合反應(yīng)進(jìn)行凝膠化的單體法；使比通常的單體更大的分子聚合的預(yù)聚合物法；使聚合物進(jìn)行凝膠化的聚合物法；使用聚丙烯酰胺的固定化；使用褐藻酸、膠原、明膠、瓊脂、κ-角叉菜膠等的天然高分子的固定化；使用光固化性樹脂、聚氨酯聚合物等的合成高分子的固定化。
這樣被精制的酶，只要通過電泳(SDS-PAGE等)可以確認(rèn)單頻帶(band)，就可以判斷已充分進(jìn)行精制。
本發(fā)明的光學(xué)活性氨基醇的制造方法，其特征在于，使由本發(fā)明的制造方法所得的氨基酮不對稱還原酶作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，生成由通式(2)表示的、具有期望的光學(xué)活性的光學(xué)活性氨基醇化合物，其中， (式中，X可以相同也可以不同，表示選自鹵原子、低級烷基、也可以由保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基和磺?；闹辽僖环N；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3可以相同也可以不同，表示選自氫原子和低級烷基的至少一種；*表示不對稱碳)，
(式中，X、n、R1、R2、R3和*與上述定義相同)。
首先，說明本發(fā)明相關(guān)的由通式(1)表示的α-氨基酮。
說明取代基X。作為上述鹵原子，可以舉出氟原子、氯原子、溴原子和碘原子等。
此外，作為低級烷基，優(yōu)選碳原子數(shù)1～6的烷基，可以舉出，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基等。它們可以取直鏈狀或支鏈狀的任意的結(jié)構(gòu)。此外，作為取代基，也可以具有氟原子或氯原子等的鹵原子，羥基，烷基，氨基或烷氧基等。
作為也可以由保護(hù)基保護(hù)的羥基的保護(hù)基，可以舉出可用水處理除去的保護(hù)基，可用酸或弱堿除去的保護(hù)基，可通過加氫除去的保護(hù)基，可用路易斯酸催化劑和硫脲等除去的保護(hù)基，在上述保護(hù)基中，包含也可以具有取代基的?；⒁部梢跃哂腥〈募坠柰榛?、烷氧基烷基、也可以具有取代基的低級烷基、芐基、對甲氧基芐基、2，2，2-三氯乙酯基、烯丙氧基羰基和三苯甲基等。
其中，上述酰基包括，乙?；⒙纫阴；⒍纫阴；⑷谆阴；?、苯?；蛯ο趸锦；?。此外，作為取代基，也可以具有羥基、烷基、烷氧基、硝基和鹵原子等。上述甲硅烷基包括，三甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基等。此外，作為取代基，也可以具有烷基、芳基、羥基、烷氧基、硝基和鹵原子等的取代基。上述烷氧基烷基包括甲氧基甲基和2-甲氧基乙氧基甲基等。上述低級烷基包括碳原子數(shù)1～6的烷基，可以舉出，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基等。它們可以取直鏈狀或支鏈狀的任意的結(jié)構(gòu)。此外，作為取代基，也可以具有氟原子或氯原子等的鹵原子，羥基，烷基，氨基和烷氧基等。
此外，X也可以是硝基或磺?；?，具體可以舉出甲基磺酰基等。
再者，X的數(shù)n是0～3的整數(shù)，優(yōu)選為0。
此外，上述通式(1)中的R1表示低級烷基。作為這樣的低級烷基，優(yōu)選碳原子數(shù)1～6的烷基，可以舉出，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基等。它們可以取直鏈狀或支鏈狀的任意的結(jié)構(gòu)。
R2、R3表示氫原子或低級烷基。在上述低級烷基中，包括碳原子數(shù)1～6的烷基，可以舉出，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基等。它們可以取直鏈狀或支鏈狀的任意的結(jié)構(gòu)。
此外，作為上述α-氨基酮化合物的鹽，可以舉出鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽等的無機(jī)酸的鹽，或者，乙酸、檸檬酸等的有機(jī)酸的鹽。
上述α-氨基酮，可以鹵化對應(yīng)的1-二苯甲酮衍生物的α碳，例如，溴化后，將溴基等的鹵素取代為胺，由此可以容易地合成(Ger.(East)，11，332，Mar.12，1956)。
接著，說明本發(fā)明的由通式(2)表示的光學(xué)活性氨基醇。在上述通式(2)中的X、n、R1、R2、R3和*與上述通式(1)中的定義相同。并且，作為具有期望的光學(xué)活性的β-氨基醇，可以舉出(1S，2S)氨基醇。作為(1S，2S)氨基醇的具體例，可以舉出，d-蘇型-2-甲基氨基-1-苯基丙醇(d-偽麻黃堿)，d-蘇型-2-二甲基氨基-1-苯基丙醇(d-甲基偽麻黃堿)，(1S，2S)-α-(1-氨基乙基)-芐基醇(d-去甲假麻黃堿)，(1S，2S)-1-(對羥基苯基)-2-甲基氨基-1-丙醇，(1S，2S)-α-(1-氨基乙基)-2，5-二甲氧基-芐基醇，(1S，2S)-1-(間羥基苯基)-2-氨基-1-丙醇，(1S，2S)-1-(對羥基苯基)-2-氨基-1-丙醇，(1S，2S)-1-苯基-2-乙基氨基-1-丙醇，(1S，2S)-1-苯基-2-氨基-1-丁醇，(1S，2S)-1-苯基-2-甲基氨基-1-丁醇等。
只要生成具有期望的光學(xué)活性的由通式(2)表示的光學(xué)活性氨基醇，使氨基酮不對稱還原酶作用的條件沒有特別限定，但是由于該酶的最適pH是8.1，最適溫度是55℃，所以優(yōu)選在pH7～9和溫度30～65℃的條件下進(jìn)行。
再者，本發(fā)明的光學(xué)活性氨基醇的制造方法，其特征在于，使本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，生成由通式(2)表示的、具有期望的光學(xué)活性的氨基醇化合物，其中， 作為進(jìn)行上述反應(yīng)時的反應(yīng)條件，例如可以是在液體培養(yǎng)基中對振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體菌進(jìn)行集菌，在所得的菌體中加入氨基酮水溶液(0.1～10％濃度)，邊調(diào)整pH至6～8邊在溫度20～40℃下反應(yīng)幾個小時到1天。反應(yīng)結(jié)束后，分離菌體，通過分離反應(yīng)液中的生成物，可以得到光學(xué)活性氨基醇。這里，轉(zhuǎn)化體菌的處理菌體(干燥菌體和固定化菌體等)和從轉(zhuǎn)化體菌得到的酶、或固定化酶等也可以同樣進(jìn)行。
此外，在本發(fā)明的光學(xué)活性氨基醇的制造方法中，通過進(jìn)一步添加由通式(3)表示的化合物，或其在藥學(xué)上接受的鹽或溶劑合物進(jìn)行反應(yīng)，可更高效的進(jìn)行光學(xué)活性氨基醇的制造，其中，
(式中，A表示下述式(Y)或(Z)， (這里，R4表示氫原子、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～3的烷基、與R8結(jié)合形成碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)或與R8結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架)， (這里，R5表示氫原子、碳原子數(shù)1～3的烷基、或與R6或R9結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架，R6表示氫原子、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～3的烷基、與R8結(jié)合形成碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)、與R5或R9結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架，R7表示氫原子、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基)；R8表示氫原子、羧基、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基、與R4結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架、與R6結(jié)合形成碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)；R9表示氫原子、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷氧基羰基、也可以具有取代基的?；?、與R5或R6結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R10表示氫原子或也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基)在上述通式(3)中，作為碳原子數(shù)1～3的烷基，是直鏈狀、支鏈狀均可，具體可以舉出，甲基、乙基、正丙基、異丙基等。此外，作為碳原子數(shù)1～6的烷基，是直鏈狀、支鏈狀均可，具體可以舉出，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基等。作為碳原子數(shù)5～10的烴環(huán)，可以舉出環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基和環(huán)癸基等。
在包含1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架中，作為雜原子，可以舉出氮原子、氧原子、硫原子等，特別優(yōu)選氮原子、氧原子，作為5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架，可以舉出吡咯烷、哌啶、咪唑烷(imidazolidine)、哌嗪、四氫呋喃、四氫吡喃、四氫噻吩和嗎啉等。
此外，作為碳原子數(shù)1～6的烷氧基羰基，可以舉出，甲氧基羰基、乙氧基羰基、異丙氧基羰基、異丁氧基羰基和叔丁氧基羰基等。作為?；?，可以舉出甲酰基、乙酰基、丙?；?、丁?；?、異丁酰基、三甲基乙酰基、苯酰基和戊?；?。當(dāng)上述的碳原子數(shù)1～3或碳原子數(shù)1～6的烷基、碳原子數(shù)1～6的烷氧基羰基或?；哂腥〈鶗r，取代基的種類、取代位置以及取代基的數(shù)目沒有限定，作為取代基，可以舉出例如，氟原子或氯原子等的鹵原子、羥基、烷基、羧基、氨基、烷氧基、硝基和芳基等。并且，作為制藥學(xué)上可接受的鹽，可以舉出鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等的無機(jī)酸的鹽，乙酸、檸檬酸等的有機(jī)酸的鹽，Na、K、Mg、Ca、銨等的無機(jī)堿性的鹽和三乙基胺、環(huán)己基胺等的有機(jī)堿性的鹽。
作為這樣的由通式(3)表示的化合物，可以舉出例如，1-乙酰胺基-2-羥基丙烷、1-甲基氨基-2-羥基丙烷、1-氨基-2-羥基丙烷、1-氨基-2-羥基環(huán)戊烷、1-氨基-2，3-二羥基丙烷、L-蘇氨酸、4-氨基-3-羥基丁酸、1-氨基-2-氧環(huán)己烷、嗎啉、3-羥基吡咯烷、3-羥基哌啶、2-氨基甲基-四氫呋喃、1-(2-羥基丙基)氨基-2-羥基丙烷、1-叔丁氧基羰基氨基-2-羥基丙烷、2-氨基-3-羥基丁烷、DL-絲氨酸、1-氨基-2-羥基丙烷、1-氨基-2-羥基丁烷、1-氨基-2-羥基環(huán)己烷。其中，在具有不對稱碳原子的化合物中，只要沒有特別記載，可以是旋光體，也可以是外消旋體。
通過在培養(yǎng)基中添加這些活性誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)菌體的活性，可以比不添加時更有效的進(jìn)行其后的光學(xué)活性的β-氨基醇的生成。活性誘導(dǎo)劑可以分別單獨(dú)使用，也可以以多個誘導(dǎo)劑的混合物使用。這樣的活性誘導(dǎo)劑的添加量，優(yōu)選為相對于培養(yǎng)基0.01～10重量％。
作為本發(fā)明的β-氨基醇的制造中的反應(yīng)方法，只要是上述菌體或菌株得到的酶作用于上述通式(1)所示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，生成對應(yīng)的由通式(2)表示的光學(xué)活性β-氨基醇化合物的方法，就沒有特別限定，在原料α-氨基酮的水溶液中，將由緩沖液或水等清洗的菌體混合開始反應(yīng)。
此外，反應(yīng)條件可以在不損害由通式(2)表示的光學(xué)活性β-氨基醇化合物的生成的范圍內(nèi)選擇。菌體量，作為干燥菌體，相對于外消旋氨基酮，優(yōu)選為1/100～1000倍，更優(yōu)選為1/10～100倍。此外，作為底物的外消旋氨基酮的濃度優(yōu)選為0.01～20％，更優(yōu)選為0.1～10％。再者，反應(yīng)液的pH，優(yōu)選為5～9，更優(yōu)選為6～8，反應(yīng)溫度優(yōu)選為10～50℃，更優(yōu)選為20～40℃。此外，反應(yīng)時間優(yōu)選為5～150小時，可以根據(jù)各個菌體適當(dāng)確定。
此外，為了更高效地進(jìn)行反應(yīng)，可以添加葡萄糖等的糖類、乙酸等的有機(jī)酸、甘油等的能量物質(zhì)。它們可以分別單獨(dú)使用，也可以以它們的混合物使用。添加量相對于底物優(yōu)選為1/100～10倍的量。此外，可以添加輔酶等。作為輔酶，可以單獨(dú)或以混合物使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)等，添加量相對于外消旋氨基酮優(yōu)選為1/1000～1/5的量。此外，除了這些輔酶以外，還可以添加輔酶再生酶，例如，葡萄糖脫氫酶，添加量相對于外消旋氨基酮優(yōu)選為1/1000～1/5的量。此外，也可以添加輔酶再生酶的底物，例如葡萄糖，添加量相對于外消旋氨基酮優(yōu)選為1/100～10倍的量。此外，也可以分別組合使用葡萄糖等的糖類、乙酸等的有機(jī)酸、甘油等的能量物質(zhì)、輔酶、輔酶再生酶和輔酶再生酶的底物。雖然它們是本來就在菌體中蓄積的，但是通過根據(jù)需要添加這些物質(zhì)，可以提高反應(yīng)速度、收率等，可以適當(dāng)選擇。
此外，反應(yīng)液如上所述加入特定的鹽，在該條件下反應(yīng)時，可以促進(jìn)未反應(yīng)的α-氨基酮異構(gòu)體的外消旋化，可以有效地向菌體或菌體得到的酶的底物旋光異構(gòu)體變換。由此，有從原料以50％以上的高收率得到目的氨基醇的趨勢。
作為促進(jìn)未反應(yīng)的α-氨基酮的外消旋化的鹽，只要是乙酸鹽、酒石酸鹽、安息香酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、對硝基苯酚鹽、亞硫酸鹽和硼酸鹽等的弱酸的鹽就可以，但是優(yōu)選使用磷酸鹽(例如，磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨)、碳酸鹽(例如，碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸銨)、檸檬酸鹽(例如，檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸銨)等。此外，也可以使用它們的混合物，作為pH為6.0～8.0的緩沖液，優(yōu)選添加使得最終濃度為0.01～1M。例如，是磷酸鹽時，可以將磷酸二氫鈉和磷酸氫鈉以從9對1到5對95的比例混合。
由反應(yīng)生成的光學(xué)活性α-氨基醇，可以通過常用的分離精制方法精制。例如，從反應(yīng)液直接或分離菌體后，通過膜分離、由有機(jī)溶劑(例如，甲苯、三氯甲烷等)提取、柱層析、減壓濃縮、蒸餾、晶析、再結(jié)晶等的通常的精制方法，可以得到光學(xué)活性β-氨基醇。生成的光學(xué)活性β-氨基醇的光學(xué)純度，可以通過高效液相色譜(HPLC)測定。
實(shí)施例以下，通過實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但是下述實(shí)施例并不用于限定本發(fā)明的技術(shù)范圍。
(實(shí)施例1)質(zhì)粒的分離精制(1)方法將紅球菌屬菌在5mL的GPY培養(yǎng)基(1％葡萄糖、0.5％細(xì)菌蛋白胨(bacto-peptone)、0.3％酵母提取物)中植菌，在25℃下振蕩培養(yǎng)。在對數(shù)生長期添加250μL的100mg/mL的氨芐青霉素溶液，在25℃下振蕩培養(yǎng)2小時。用離心分離(12krpm，5分鐘)集菌，除去上清液后，用1mL的50mM Tris(pH7.5)懸濁，再次用離心分離(12krpm，5分鐘)集菌，除去上清液。以溶解于TE溶液(10mM Tris(pH7.5)、1mMEDTA)的250μL的10mg/mL溶菌酶溶液懸濁，在37℃放置30分鐘。然后，加入100μL的3M食鹽水和25μL的10％SDS，在-20℃下放置一夜。在離心分離(12krpm，5分鐘)后的上清液中分別加入0.5μL的50μg/mL蛋白酶K和50μg/mL核糖核酸酶A，在37℃下放置15分鐘。然后，添加等量的苯酚/氯仿/異戊醇溶液，進(jìn)行離心分離(12krpm，5分鐘)。在上清液中加入2.5倍量的乙醇，離心分離(12krpm，5分鐘)，在50μL的殺菌水中溶解沉淀。質(zhì)粒的確認(rèn)是由0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用溴化乙錠染色后，進(jìn)行UV照射。
(2)試樣菌株及結(jié)果在本實(shí)施例中，由紅球菌屬及其類似菌分枝桿菌屬(Mycobacterium)的各菌種可得到的菌株，按照上述(1)的方法，對質(zhì)粒的有無進(jìn)行篩選。
在表3中表示篩選的菌株中可以確認(rèn)質(zhì)粒的保持的菌株。即，在紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)(IAM1400、IAM1503、JCM2893、JCM2894以及JCM2895)和椿象紅球菌(Rhodococcusrhodnii)(JCM3203)中，可以確認(rèn)各約5.4kbp和約5.8kbp的質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒，如在表3中列舉的名稱，命名為pRET1100、pRET1200、pRET1300、pRET1400、pRET1500、pRET1600、pRET1700、pRET1800、pRET0500、pRET1000(表3)。
其中，紅串紅球菌(R.erythropolis)IAM1400和IAM1503，在東京大學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)研究所發(fā)行的《IAM Catalogue of Strains，ThirdEdition，2004》中已有記載，可以從該研究所得到。此外，紅串紅球菌(R.erythropolis)JCM2893和JCM2895、以及椿象紅球菌(R.rhodnii)JCM3203，在獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所發(fā)行的《JCM Catalogue ofStrains，Eighth Edition，2002》中已有記載，可以從該研究所得到。
表3


(實(shí)施例2)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的確定為了將表3中所示的質(zhì)粒分類，使用各種限制性內(nèi)切酶，研究限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。用實(shí)施例1記載的方法分離各質(zhì)粒后，由EcoRI、HindIII、PvuII、ScaI、SpHI、SmaI、SacI、BamHI及KpnI消化，通過由0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳而確認(rèn)DNA片段。大小標(biāo)記使用LoadingQuick DNA size Marker λ/EcoRI+HindIII double digest(東洋紡)。基于大小標(biāo)記，由限制性內(nèi)切酶確定切斷的位點(diǎn)的數(shù)目及其片段的大小。將結(jié)果匯總于表4。
表4


()內(nèi)為大小kbp上述分析的結(jié)果是，表3中的質(zhì)粒，被分類為保持與pRET1100同樣的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的質(zhì)粒類、保持與pRET1200同樣的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的質(zhì)粒類和pRET1000的3種。
(實(shí)施例3)質(zhì)粒的序列和同源性檢索由于由實(shí)施例2的結(jié)果，質(zhì)粒被分類為3種，即pRET1000、pRET1100和pRET1200，所以測試各質(zhì)粒的序列。
首先，為了確定堿基序列，進(jìn)行這些質(zhì)粒類的克隆。對于紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)(IAM1400)，分離質(zhì)粒(pRET1100、pRET1200)后，由SmaI和SacI消化。用0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，確認(rèn)DNA片段時，可以確認(rèn)約0.5kbp、約1.7kbp、約3.7kbp、約4.9kbp的DNA片段。使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Bioscience Co.Ltd.制)從瓊脂糖凝膠中回收這些DNA片段，作為插入DNA。另一方面，作為載體DNA，使用由SmaI單獨(dú)或由SmaI和SacI消化的pBluescript II KS(-)的產(chǎn)物。使用Ligation high(東洋紡)連接插入DNA和載體DNA，轉(zhuǎn)化為大腸桿菌JM109。使用GFX Micro Plasmid Prep Kit(Amersham Bioscience Co.Ltd.制)篩選所得的轉(zhuǎn)化體，得到各個克隆。
另一方面，對于椿象紅球菌(Rhodococcus rhodnii)(JCM3203)，分離質(zhì)粒(pRET1000)后，由BamHI消化。用0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳時，可以確認(rèn)約2.0kbp、約3.8kbp的DNA片段。使用上述的Kit從凝膠中回收這些DNA片段，作為插入DNA。載體DNA，使用由BamHI消化pBluescript II KS(-)的產(chǎn)物。
質(zhì)粒的插入的堿基序列確定，用引物步移法(Primer Walking)。使用的機(jī)器是ABI PRISMTM310NT Genetic Analyzer，使用的酶是BigDyeTerminator v3.1Cycle Sequencing Kit(ABI制)。
首先，使用P7(M13forward，東洋紡)引物和P8(M13reverse，東洋紡)引物譯碼插入的堿基序列的一部分。接著，在已譯碼的序列內(nèi)設(shè)計(jì)引物(使用序列分析軟件DNASIS Pro；日立軟件公司)，使用已設(shè)計(jì)引物(合成低聚DNA)進(jìn)一步譯碼堿基序列。重復(fù)該步驟，直到插入的堿基序列完全可以譯碼。插入的堿基序列譯碼結(jié)束后，為了分析這些插入物是怎樣連接的，在各插入物的末端，以在載體方向上進(jìn)行反應(yīng)的方式設(shè)計(jì)引物，以從紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)(IAM1400)中分離的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR(使用KOD Plus)。使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit精制其PCR產(chǎn)物，使用與在PCR中使用的引物相同的引物進(jìn)行測序，分析插入物的陣列。
由測序的結(jié)果得知，pRET1100是由5444bp構(gòu)成，其G+C含量為59％。在序列表的序列號73中表示確定了的全堿基序列。pRET1200是由5421bp構(gòu)成，其G+C含量為62％。pRET1000是由5813bp構(gòu)成，其G+C含量為67％。在序列表的序列號74中表示確定的全堿基序列。
使用DNASIS Pro進(jìn)行這些被確定的堿基序列的同源性檢索時，可以判斷pRET1000和pRET1100是新型質(zhì)粒。另一方面，pRET1200與pN30(Gene bank accession no.AF312210)有約99.6％(基于pRET1200計(jì)算)的同源性。
此外，對于pRET1000和pRET1100，基于被確定的堿基序列使用DNASIS Pro進(jìn)行與公知質(zhì)粒的比較。其結(jié)果是，兩種質(zhì)粒中，未檢測到全部的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)一致的質(zhì)粒。
(實(shí)施例4)堿基序列的分析分析pRET1100和pRET1000的堿基序列的結(jié)果如下所示。
在pRET1100中發(fā)現(xiàn)了以下的orf在序列號73記錄的堿基序列上，由從第202個、第238個或第337個到第480個堿基序列構(gòu)成的orf1(序列號1、序列號2或序列號3)；在序列號73記錄的堿基序列上，由從第477個到第758個堿基序列構(gòu)成的orf2(序列號4)；在序列號73記錄的堿基序列上，由從第862個、第1294個、第1450個、第1462個、第1486個、第1489個、第1513個、第1630個、第1645個、第1687個、第2224個或第2227個到第2409個堿基序列構(gòu)成的orf3(序列號5、序列號6、序列號7、序列號8、序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號14、序列號15或序列號16)；在序列號73記錄的堿基序列上，由與從第1875個、第1734個、第1701個、第1674個或第1581個到第1444個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的orf4(序列號17、序列號18、序列號19、序列號20或序列號21)；在序列號73記錄的堿基序列上，由與從第2828個、第2792個、第2747個、第2594個或第2540個到第2406個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的orf5(序列號22、序列號23、序列號24、序列號25或序列號26)；在序列號73記錄的堿基序列上，由從第2971個或第3049個到第3306個堿基序列構(gòu)成的orf6(序列號27或序列號28)；在序列號73記錄的堿基序列上，由與從第3577個或第3571個到第3053個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的orf7(序列號29或序列號30)；在序列號73記錄的堿基序列上，由從第3339個或第3648個分別到第3902個堿基序列構(gòu)成的orf8(序列號31或序列號32)；和在序列號73記錄的堿基序列上，由從第4366個或第4477個到第5034個堿基序列構(gòu)成的orf9(序列號33或序列號34)。
在pRET1000中發(fā)現(xiàn)了以下的orf在序列號74記錄的堿基序列上，由與從第3350個、第3251個、第2945個或第2849個到第2412個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的orf10(序列號38、序列號39、序列號40或序列號41)；在序列號74記錄的堿基序列上，由與從第2365個或第2332個到第2159個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的orf11(序列號42或序列號43)；在序列號74記錄的堿基序列上，由從第3197個到第3526個堿基構(gòu)成的orf12(序列號44)；在序列號74記錄的堿基序列上，由與從第4035個或第3996個到第3679個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的orf13(序列號45或序列號46)；在序列號74記錄的堿基序列上，由與從第4621個、第4654個、或第4666個到第4830個堿基序列構(gòu)成的orf14(序列號48、序列號49、或序列號50)；在序列號74記錄的堿基序列上，由與從第5161個或第5062個到第4709個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的orf15(序列號51或序列號52)；在序列號74記錄的堿基序列上，由從第2331個或第2334個到第2618個堿基序列構(gòu)成的orf16(序列號53或序列號54)；
在序列號74記錄的堿基序列上，由從第2907個到第3242個堿基序列構(gòu)成的orf17(序列號55)；在序列號74記錄的堿基序列上，由從第1650個、第1689個、第1713個、第1827個或第1875個到第2162個堿基序列構(gòu)成的orf18(序列號56、序列號57、序列號58、序列號59或序列號60)；在序列號74記錄的堿基序列上，由從第1906個到第2169個堿基序列構(gòu)成的orf19(序列號61)；在序列號74記錄的堿基序列上，由與從第810個到第553個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的orf20(序列號62)；在序列號74記錄的堿基序列上，由從第117個、第147個、第306個、第456個、第5144個、第5276個或第5534個到第656個堿基序列的orf21(序列號63、序列號64、序列號65、序列號66、序列號67、序列號68或序列號69)。
在pRET1100中的DNA復(fù)制區(qū)域，是由序列號35記錄的堿基序列(從第2410個到3200個)、序列號36記錄的堿基序列(從第1000個到1500個)、或序列號37記錄的堿基序列(從第5000個到500個)表示的區(qū)域。在pRET1000中的DNA復(fù)制區(qū)域，是由序列號70記錄的堿基序列(從第3355個到3507個)、序列號71記錄的堿基序列(從第4290個到4350個)、或序列號72記錄的堿基序列(從第3570個到3894個)表示的區(qū)域。
由此可知，pRET1000(序列號74)的堿基序列上，從第5144個到第656個堿基序列(序列號67)的區(qū)域和從第4381個到第4830個堿基序列(序列號47)的區(qū)域，是與mobilization protein(接合蛋白質(zhì))具有同源性，與接合相關(guān)的。
再者，pRET1000(序列號74)的堿基序列上，從第4260個到第4339個堿基序列(序列號75)的區(qū)域，可以推斷DNA的二次結(jié)構(gòu)，由此可知上述mobilization protein基因的表達(dá)和表達(dá)的蛋白質(zhì)的識別部位。
另一方面，由此可知，pRET1100(序列號73)的堿基序列上，從第761個到第868個堿基序列(序列號76)的區(qū)域是有關(guān)復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的啟動子。
(實(shí)施例5)穿梭載體的構(gòu)建為了構(gòu)建紅球菌屬菌與大腸桿菌間的穿梭載體，使用紅球菌屬菌的質(zhì)粒pRET1000、pRET1100和pRET1200與大腸桿菌的質(zhì)粒pUC 18、pHSG299和pHSG398進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。
首先，從紅串紅球菌(R.erythropolis)的質(zhì)粒制備DNA片段。即，從紅串紅球菌(R.erythropolis)(IAM1400)取得質(zhì)粒pRET1100和pRET1200后，通過使用Alw44I，在37℃下對pRET1100進(jìn)行2小時消化，使用Blunting high(東洋紡)平端化，另一方面，pRET1200使用BspLU11I在48℃下消化2小時，使用Blunting high平端化，得到紅串紅球菌(R.erythropolis)質(zhì)粒的DNA片段。在TE溶液中溶解各DNA片段。
另一方面，對于pRET1000，從椿象紅球菌(R.rhodnii)(JCM3203)取得質(zhì)粒pRET1000后，使用DrdI在37℃下對pRET1000進(jìn)行2個小時消化，使用Blunting high平端化，得到pRET1000的DNA，將其溶解于TE溶液中。
接著，從大腸肝菌(E.coli)質(zhì)粒制備DNA片段。即，pUC18(含有耐氨芐青霉素基因(Ampr))是通過使用SmaI在30℃下進(jìn)行2小時消化，pHSG299(含有耐卡那霉素基因(Kmr))和pHSG398(含有耐氯霉素基因(Cmr))是通過使用HincII在37℃下進(jìn)行2小時消化，而得到大腸肝菌(E.coli)的質(zhì)粒的DNA片段，溶解在TE中。
將如上述制備的來自紅球菌屬菌和大腸桿菌的質(zhì)粒的DNA片段連接后，轉(zhuǎn)化為大腸肝菌(E.coli)DH5α，涂布30μL的0.1M IPTG(異丙基-β-半乳糖苷)和4％的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)，在含有100μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨芐青霉素或30μg/mL的氯霉素的LB(1％色氨酸、0.5％酵母提取物、1％氯化鈉；pH7.2)瓊脂培養(yǎng)基中平板接種，在30℃下放置60小時。選擇出現(xiàn)的菌落中的白色菌落，在含有100μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨芐青霉素或30μg/mL的氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)60小時。使用GFXTMMicro Plasmid Prep Kit(Amersham Bioscience Co.Ltd.制，在商品所附資料的條件下精制)從所得的培養(yǎng)液中精制DNA。將所得的DNA用0.8％瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。在表5中表示所得的穿梭載體，在圖3～5中表示使用pRET1100的各穿梭載體的制作方法。
表5


將由pRET1100和pUC18、pHSG299或pHSG398構(gòu)建的穿梭載體分別命名為pRET1101(序列號89)、pRET1102(序列號90)或pRET1103(序列號91)。其中，pRET1101是顯示耐氨芐青霉素的穿梭載體，pRET1102是顯示耐卡那霉素性的穿梭載體，pRET1103是顯示耐氯霉素性的穿梭載體。此外，將pRET1101～1103的各大腸桿菌基因和pRET1100的結(jié)合方法相反(Rv)的穿梭載體分別命名為pRET1101Rv(序列號92)、pRET1102Rv(序列號93)和pRET1103Rv(序列號94)。
同樣，將使用pRET1000和pRET1200構(gòu)建的穿梭載體分別命名為pRET1001～pRET1003(序列號95～序列號97)和pRET1001Rv～pRET1003Rv(序列號98～序列號100)以及pRET1201～pRET1203和pRET1201Rv～pRET1203Rv(表5)。
(實(shí)施例6)對紅串紅球菌(R.erythropolis)的轉(zhuǎn)化方法的研究使用在實(shí)施例5中所得的紅球菌屬菌-大腸肝菌(E.coli)的穿梭載體，轉(zhuǎn)化紅串紅球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株(MAK-34；保藏號FERM BP-7451，在經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)省產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心)于平成13年2月15日保藏)。作為基因?qū)敕椒ǎ芯侩姶┛追ā?br> 首先，在5mL的GPY培養(yǎng)基中植菌紅串紅球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株，在30℃下振蕩培養(yǎng)36小時。將該培養(yǎng)液1mL移植到100mL的LB培養(yǎng)基中，在30℃下以200rpm培養(yǎng)10小時。通過離心分離(12krpm，5分鐘，4℃)回收培養(yǎng)的菌體，用超純水清洗回收的菌體2次。通過離心分離(12krpm，5分鐘，4℃)回收清洗完成的菌體，在2.4mL的10％甘油溶液中懸濁。將以每30μL分注懸濁液，在-80℃下凍結(jié)作為感受態(tài)細(xì)胞。
將制作的感受態(tài)細(xì)胞90μL和穿梭載體(pRET1001、pRET1002、pRET1003、pRET1101、pRET1102、pRET1103、pRET1201、pRET1202和pRET1203)5μL在冰上混合。將混合溶液在冰上冷卻，靜靜流入的0.1cm的比色皿中，置于Gene Pulser II Electroporation System(BIO-RAD制)。以20kV/cm、400Ω、25μF加脈沖，立即加入300μL的LB培養(yǎng)基，在25℃下放置3小時。
將該菌懸濁液的一部分在含有抗生素物質(zhì)的LB平板(100μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨芐青霉素或30μg/mL的氯霉素)上平板接種。其結(jié)果是，使用具有耐卡那霉素基因的pRET1002、pRET1102和pRET1202時，可以得到菌落。此外，為了確認(rèn)該得到的菌落是否保持質(zhì)粒，分離質(zhì)粒確認(rèn)，確認(rèn)保持全部穿梭載體。
由上可知，通過電穿孔可以轉(zhuǎn)化紅串紅球菌(R.erythropolis)，并且pRET1002、pRET1102和pRET1202作為穿梭載體發(fā)揮功能。
(實(shí)施例7)氨基酮不對稱還原酶基因(mak gene)的取得為了在表5中所示的穿梭載體中插入mak gene，從紅串紅球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株中分離mak gene。
最初時，進(jìn)行紅串紅球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株的基因組DNA的取得。在5mL的GPY培養(yǎng)基中進(jìn)行紅串紅球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株的植菌，在30℃下振蕩培養(yǎng)48小時后，移植該培養(yǎng)液到100mL的GPY培養(yǎng)基中，在30℃下以200rpm培養(yǎng)10小時。使用Genomic DNA Buffer set和Genomic-tip 500/G(QIAGEN)取得基因組DNA。
接著，以取得的基因組DNA為模板，使用KOD-plus-進(jìn)行PCR。引物是MAKF1(5’-GAATCTTCTCGTTGATGCAGATCAGGTC-3’；序列號80)和MAKR2(5’-CTGACTCCGTAGTGTTCTGCCAGTTC-3’；序列號81)，以退火溫度68℃、伸長反應(yīng)1分50秒進(jìn)行PCR。將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行苯酚/氯仿處理和乙醇沉淀后，使用SmaI在30℃下消化2小時，與pUC18混合，使用Ligation High進(jìn)行連接。使用Competent high(東洋紡)轉(zhuǎn)化大腸肝菌(E.coli)DH5α，在涂布30μL的0.1M IPTG和4％的X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)基(含有100μg/mL的氨芐青霉素)上進(jìn)行平板接種，在30℃下放置60小時。選擇出現(xiàn)的菌落中的白色菌落，在含有100μg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)60小時。使用GFXTMMicro Plasmid Prep Kit從所得的培養(yǎng)液中精制DNA。將所得的DNA用0.8％瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。將所得的克隆命名為pMAK-1。
(實(shí)施例8)表達(dá)載體的構(gòu)建-1在表5中所示的穿梭載體中插入啟動子和氨基酮不對稱還原酶基因(mak gene)。
首先，構(gòu)建含有mak gene的上游約400bp的表達(dá)載體(無外來啟動子)的質(zhì)粒。
使用SmaI在30℃下用2小時消化pMAK-1，進(jìn)一步使用PstI在37℃下用2小時消化。將該溶液以0.8％瓊脂糖凝膠供給電泳。DNA大小標(biāo)記使用Loading Quick DNA size Markerλ/EcoRI+HindIII doubledigest。電泳后，將約1.4kbp的DNA片段用GFXTMPCR DNA and GelBand Purification Kit精制，將其作為插入DNA使用。另一方面，載體是使用將pRET1102用HincII和PstI以37℃進(jìn)行2小時消化的產(chǎn)物。將這些DNA片段用Ligation High進(jìn)行連接，用Competent high轉(zhuǎn)化大腸肝菌(E.coli)DH5α。在含有100μg/mL的卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板接種，在30℃下放置60小時。
將出現(xiàn)的菌落用含有100μg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基在30℃下振蕩培養(yǎng)60小時。用GFXTMMicro Plasmid Prep Kit從所得的培養(yǎng)液精制DNA。將所得的DNA用0.8％瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。
篩選是將未經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理的所得的DNA和使用PstI在37℃消化2小時的所得的DNA供給0.8％瓊脂糖凝膠電泳，由所得的DNA的大小得到目的質(zhì)粒。此時，大小標(biāo)記使用Loading Quick DNA sizeMarkerλ/EcoRI+HindIII double digest，以及pRET1102和用PstI以37℃進(jìn)行2小時消化的pRET1102。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pRET1104。
(實(shí)施例9)表達(dá)載體的構(gòu)建-2由于載體的縮小在表達(dá)載體的改良、基因改變、轉(zhuǎn)化效率提高以及在菌體內(nèi)的復(fù)制等中有效，因此進(jìn)行穿梭載體的縮小。
首先，進(jìn)行穿梭載體pRET1102的縮小。將pRET1102用BamHI和HincII消化2小時后供給0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將約2.7kbp的DNA片段用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit回收，制備pRET1102的DNA片段。此時，大小標(biāo)記使用Loading Quick DNA sizeMarker λ/EcoRI+HindIII double digest。
另一方面，由大腸桿菌復(fù)制的DNA片段，是通過將pHSG299用BamHI和HincII消化2小時后供給0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將約2.7kbp的DNA片段用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit回收制備的。
將這些DNA片段用Ligation High進(jìn)行連接，用Competent high轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在涂布有30μL的0.1M IPTG和4％X-gal的含有100μg/mL的卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板接種，在30℃下放置48小時。
選擇出現(xiàn)的菌落中的白色菌落，用含有100μg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基在30℃下振蕩培養(yǎng)48小時。由所得的培養(yǎng)液用GFXTMMicro Plasmid Prep Kit精制DNA。將由此得到的pRET1102的縮小穿梭載體命名為pRET1123(約5.3kbp)。
接著，進(jìn)行穿梭載體pRET1202的縮小。來源于紅球菌屬菌的DNA片段，是通過將pRET1202用EcoRI消化2小時，進(jìn)一步用DraIII消化2小時后，用Blunting High平端化，供給0.8％瓊脂糖凝膠電泳后，將約3.7kbp的DNA片段用GFXTMPCR DNA and Gel Band PurificationKit回收而制備。此時，大小標(biāo)記使用Loading Quick DNA size Markerλ/EcoRI+HindIII double digest。將該DNA片段插入pHSG299的HincII位點(diǎn)。連接后，用Competent high轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在涂布有30μL的0.1M IPTG和4％X-gal的含有100μg/mL的卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板接種，在30℃下放置72小時。選擇出現(xiàn)的菌落中的白色的菌落，在含有100μg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃下振蕩培養(yǎng)72小時。由所得的培養(yǎng)液用GFXTMMicro Plasmid Prep Kit進(jìn)行DNA精制。將由篩選所得的質(zhì)粒用SacI、BamHI、PstI或EcoRI消化2小時，全部的克隆來源于紅球菌屬菌的區(qū)域中，EcoRI位點(diǎn)側(cè)約500bp被削除。將該質(zhì)粒命名為pRET1204(約5.9kbp)。其中，不能取得紅球菌屬菌復(fù)制區(qū)域未被削除的克隆。
同樣，進(jìn)行穿梭載體pRET1002的縮小，得到pRET1006(約4.9kbp)。
使用這3種的縮小質(zhì)粒pRET1006、pRET1123和pRET1204轉(zhuǎn)化紅串紅球菌，采用實(shí)施例6記載的方法確認(rèn)是否保持穿梭載體時，確認(rèn)保持有穿梭載體。由此可知，3種縮小質(zhì)粒pRET1006、pRET1123和pRET1204在紅串紅球菌中復(fù)制。
(實(shí)施例10)表達(dá)載體的構(gòu)建-3向在實(shí)施例9中構(gòu)建的穿梭載體插入mak gene，構(gòu)建表達(dá)載體。
為了在階段1中克隆啟動子，使在實(shí)施例9中構(gòu)建的pRET1123的PstI位點(diǎn)缺損。用PstI用2小時消化pRET1123后，用Blunting High平端化，用Ligation High進(jìn)行連接。將該溶液用Competent high轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上在30℃下培養(yǎng)36小時。將形成的菌落培植在含有100μg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)24小時后，用GFXTMMicro Plasmid PrepKit進(jìn)行DNA精制，作為pRET1132。
其中，取得的pRET1132，用PstI消化1小時后，供給0.8％瓊脂糖凝膠電泳，可以確認(rèn)pRET1132未被PstI切斷。此時，作為控制，使用未PstI處理的pRET1123和pRET1132、以及PstI處理過的pRET1123。
(實(shí)施例11)表達(dá)載體的構(gòu)建-4構(gòu)建在上述穿梭載體中插入有啟動子和mak gene的克隆。
為了插入啟動子，構(gòu)建在mak gene上游具有PstI位點(diǎn)的克隆。為了得到在氨基酮不對稱還原酶的C末端加成有His-Tag的克隆，進(jìn)行以下操作。以實(shí)施例7中得到的pMAK-1為模板，以MAKPstF(5’-GACCACTGCAGATCAATCAACTCTGATGAGGTCC-3’；序列號82)和MAKHisBglIIR(5’-CGCTTAGATCTCAGTTCGCCGAGCGCCATCGCCG-3’；序列號83)為引物，使用KOD-plus-，以退火溫度68℃、拉伸反應(yīng)1分50秒進(jìn)行PCR。將所得的PCR產(chǎn)物用BglII在37℃下消化2小時的PCR片段(插入)和pQE70(用SpHI在37℃下消化2小時，用Blunting High平端化，然后用BglII在37℃下消化2小時)，用Ligation High進(jìn)行連接，用Competent high轉(zhuǎn)化大腸肝菌(E.coli)DH5α，在含有100μg/mL的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板接種，在30℃下放置60小時。將出現(xiàn)的菌落用含有100μg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基在30℃下振蕩培養(yǎng)60小時。由所得的培養(yǎng)液用GFXTMMicro Plasmid Prep Kit進(jìn)行DNA精制。將所得的DNA用0.8％瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。
篩選是，將未經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理的所得的DNA以及使用PstI和BglII在37℃消化2小時的物質(zhì)供給0.8％瓊脂糖凝膠電泳，由所得的DNA的大小得到目的質(zhì)粒。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pMAK-2。大小標(biāo)記使用Loading Quick DNA size Marker λ/EcoRI+HindIII doubledigest，以及pQE70和用BglII以37℃消化2小時的pQE70。
其中，構(gòu)建在pMAK-2的EcoRI-PstI位點(diǎn)上插入有pRET1200的RepA啟動子(pRET1204中、被編碼為來源于紅球菌屬菌的DNA片段的repA的方向，以與被編碼為pHSG299的耐卡那霉素性基因相同方向的克隆為模板，以P1200rep-Pst5195(5’-AGCCGCTGCAGAAGCAACACCGCATCCGCCCATTG-3’；序列號84)和P7(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；序列號85)為引物，以退火溫度60℃、拉伸反應(yīng)1分鐘進(jìn)行PCR增幅后，用EcoRI和PstI在37℃下消化2小時的產(chǎn)物)的克隆(命名為pMAK-19)。
接著，以pMAK-19為模板，以pQE70F1(5’-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCACC-3’；序列號86)和pQE70R1135Bm(5’-GGTTGGATCCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAG-3’；序列號87)為引物，在PCR酶上使用KOD-plus-，以退火溫度60℃，拉伸反應(yīng)3分鐘進(jìn)行PCR。采用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification KiT從該反應(yīng)液精制PCR產(chǎn)物，將精制的PCR產(chǎn)物用EcoRI和BamHI進(jìn)行2小時消化后，供給0.8％瓊脂糖電泳，將DNA片段用GFXTMPCR DNA andGel Band Purification Kit精制。插入該DNA片段。
另一方面，表達(dá)穿梭載體用的載體，使用將用EcoRI和BamHI以2小時消化pRET1132的DNA片段供給0.8％瓊脂糖電泳，用GFXTMPCR DNA and Gel Band PuRificaTion Kit精制的DNA片段。將這些插入片段與載體混合，用Ligation High連接后，用Competent High轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)JM109，在含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上進(jìn)行平板接種。通過將所得的菌落用含有100μg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用GFXTMMicro Plasmid Prep Kit回收質(zhì)粒DNA，進(jìn)行0.8％瓊脂糖電泳進(jìn)行篩選。大小標(biāo)記使用Loading Quick DNA sizeMarkerλ/EcoRI+HindIII double digest和pRET1132。將這樣得到的表達(dá)載體命名為pRET1133。
此外，將pMAK-19用EcoRI和HindIII在37℃下進(jìn)行2小時消化后，用Blunting high平端化，供給0.8％瓊脂糖電泳，將約1.6kbp的DNA片段用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit精制。將該片段插入到pRET1102的HincII位點(diǎn)的克隆命名為pRET1114。
再者，進(jìn)行pRET1133的啟動子的改良。被編碼為pRET1133的MAK基因表達(dá)的啟動子，為在pRET1200的repA基因的啟動子中約800bp的長度，構(gòu)建該啟動子缺損約200bp的質(zhì)粒。在該克隆中使用的啟動子的制備用PCR進(jìn)行。以質(zhì)粒pRET1200為模板，對于引物使用P1204rep-Ec2958(5’-CGCGGAATTCGACCACCACGCACGCACACCGCAC-3’；序列號88)和P1200rep-Pst5195(5’-AGCCGCTGCAGAAGCAACACCGCATCCGCCCATTG-3’；序列號84)，對于PCR酶使用KOD-plus-，以退火溫度60℃、拉伸反應(yīng)50秒進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit精制，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI進(jìn)行2小時消化后，供給1.6％瓊脂糖電泳，將DNA片段用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit精制。將該DNA片段作為插入片段。在序列號77中表示了在該DNA片段中所含的啟動子區(qū)域的堿基序列。
另一方面，對于載體，將pRET1133用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI進(jìn)行2小時消化后，供給0.8％瓊脂糖電泳，將約7.2kbp的DNA片段用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit精制。大小標(biāo)記使用Loading Quick DNA size Markerλ/EcoRI+HindIII double digest。
將這樣得到的插入片段和載體用Ligation High連接，用CompetentHigh轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)JM109，在含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上進(jìn)行平板接種。通過將所得的菌落在含有100μg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用GFXTMMicro Plasmid Prep Kit回收質(zhì)粒DNA，進(jìn)行0.8％瓊脂糖電泳而進(jìn)行篩選。大小標(biāo)記使用Loading Quick DNA size Markerλ/EcoRI+HindIII double digest和pRET1133。
進(jìn)一步，將所得的DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI進(jìn)行2小時消化后，進(jìn)行1.6％瓊脂糖電泳，確認(rèn)了相當(dāng)約600bp的插入片段的DNA片段。大小標(biāo)記使用100bp DNA Ladder。將這樣所得的表達(dá)載體命名為pRET1138。
(實(shí)施例12)重組紅串紅球菌的轉(zhuǎn)化和活性測定使用上述的表達(dá)載體pRET1102、pRET1104、pRET1114和pRET1138轉(zhuǎn)化紅串紅球菌MAK-34菌株和R.erythropolis JCM2895(由獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所分售)，進(jìn)行活性測定。由MAK-34菌株精制的氨基酮不對稱還原酶，如國際公開WO02/070714所記載的，具有作用于1-2-甲基氨基-1-苯基-1-丙酮，生成d-(1S，2S)-偽麻黃堿的能力。其它可以確認(rèn)，作用于1-2-二甲基氨基苯丙酮、1-氨基-2-丁酮等，分別生成對應(yīng)的β-氨基醇。
活性測定是，制備菌量O.D.＝5、2％葡萄糖和0.2M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)的反應(yīng)液，使在該反應(yīng)中作為底物含有3％的(1S，2S)-2-(N-乙基氨基)-1-苯基-1-丙醇(EAM)。有關(guān)EAM，在J.Am.Chem.Soc.，vol.50，pp.2287-2292，1928中記載其合成方法。將反應(yīng)液在30℃下進(jìn)行16小時振蕩反應(yīng)。反應(yīng)生成物的β-氨基醇的(1S，2S)-2-(N-乙基氨基)-1-苯基-1-丙醇(EPE)的確認(rèn)用HPLC進(jìn)行。色譜柱為Inertsil PH-33.0×75mm，洗提液是7％乙腈水溶液和0.05M的磷酸鈉緩沖液(pH6.0)，檢測用UV(220nm)進(jìn)行。
在表6中表示該活性測定的結(jié)果。導(dǎo)入不具有外來啟動子區(qū)域的pRET1104的重組體，顯示與導(dǎo)入不具有作為對照的mak gene的pRET1102的重組體基本相同的活性，未發(fā)現(xiàn)重組酶的表達(dá)。
在MAK-34菌株中導(dǎo)入pRET1114時，確認(rèn)有高于pRET1104的比活性。這表示，在載體中插入的pRET1200的repA啟動子區(qū)域，作為啟動子發(fā)揮功能。
導(dǎo)入pRET1138時，重組紅串紅球菌MAK-34菌株的比活性為37.7μg/h·mL/O.D.，重組紅串紅球菌JCM2895菌株的比活性為34.9μg/h·mL/O.D.，可以確認(rèn)在紅串紅球菌株中的酶的表達(dá)。
表6


比活性(單位μg/h·mL/O.D.)(實(shí)施例13)酶的精制將在實(shí)施例12中所得的重組菌體在含有100μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基100mL中以30℃、4日培養(yǎng)，以12000rpm進(jìn)行5分鐘離心分離集菌，用The QIAexpressionist Kit(QIAGEN Company制)精制加成有His-tag的蛋白質(zhì)。具體來說，通過超聲波處理破碎菌體，通過離心分離得到其上清液，通過鎳螯合物(Nickel chelate)色譜柱精制蛋白質(zhì)。將所得的蛋白質(zhì)供給SDS-PAGE時，可以發(fā)現(xiàn)分子量約28000的蛋白質(zhì)帶。該分子量，與國際公開WO02/070714中記載的氨基酮不對稱還原酶的分子量基本相同，表示氨基酮不對稱還原酶在重組紅球菌中產(chǎn)生。
(實(shí)施例14)由酶制造β-氨基醇將含有在實(shí)施例13中所得的精制酶(0.5μg/mL)、5mM的NADPH、120mM Tris-HCl(pH7.5)和5mM EAM的反應(yīng)液0.5mL，在37℃下反應(yīng)16小時。底物和生成物(EPE)的分析用HPLC進(jìn)行。色譜柱是InertsilPH-3 3.0×75mm，洗提液是7％乙腈水溶液和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)，檢測用UV(220nm)進(jìn)行。其結(jié)果是，確認(rèn)有EPE生成。
同樣，將由精制酶或在實(shí)施例13中記載的培養(yǎng)所得的重組體的破碎酶粗提取液作用于1-2-二甲基氨基苯丙酮、1-氨基-2-丙酮等，確認(rèn)可以制造對應(yīng)的β-氨基醇。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性如上述說明，本發(fā)明的質(zhì)粒和穿梭載體，是來源于紅球菌屬菌(特別是，紅串紅球菌或椿象紅球菌)的物質(zhì)，利用其可以將同菌通過重組而改變，可以更有效地制造產(chǎn)生氨基酮不對稱還原酶的菌株。此外，可以在轉(zhuǎn)化體中大量生產(chǎn)含有氨基酮不對稱還原酶的有用酶。
序列表<110>第一精密化學(xué)股份有限公司<120>新型質(zhì)粒及其利用<130>FP04-0397<150>JP 2003-373476<151>2003-10-31<160>100<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>279<212>DNA<213>紅串紅球菌<220>
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gtcgccccag tggaagcgga tttcgcggta ggcccaggtg cgtgcggttt cgaacagggc 4380gcagtttcgg ccgaggccga tcgggttctc acggcgcgat cgggtttgcc gccagcgcgt 4440tggcggcatg tggatgccga gttccgcctc gagctcggcg agggatcgcc gctcggtgtg 4500cagccaatgg gtgtcccagt caccgtgagt cgggttcttg gtcatcaggc ccgaatagcc 4560cttgtccccc tggacggcgc gccggaggcc ttcggtgacg gcggccgcat aggcgagcgg 4620cttacgacgg gcgtactcgg tgcgggtgaa cggctctgcc agcgcccaca cagcgtgtgc 4680gtgcccgtta cgggggttct ccacgatcgc gttcggcaga ggatgattcc cggccgccga 4740cagcgcccgc agcgcggcgt ccgggtggtc aacgtccacg acgagcaggt tgctcaatgc 4800ctgcgggttc gactcgatgt agcggcgatc cagtgcgtct gatcgccgca tccggtagac 4860gccgtcgagg aaatcgtcgg ttgccagtgg ccacagcggt agccacagct gttcccaggc 4920gccgcctgtg tgctcttcca ccgcaaccat ggggaacaca ctcacacaca agatcgattt 4980attccggtac gacacgccag ccaagtcaga tgtttcggtt tctggagcgg tcctccagac 5040ctttgagatc cgctccagaa acgtccacaa attattgggg tacgtcgaac caagccttat 5100caggtatccc ggggttccgg gggtgaacac caccctccga ccggtccaga atccgtcgat 5160ctcacctatc cgctcgaagt ccttgagtca gtgacaggac cactgctggg ctcccagcgc 5220agaaggcaag tgaaggcaga cgactgcggg aggtaagtcg ggtacggcat gaggtccttc 5280agaagcggcg tcgacgccag gcccacacgc acaatccgct tcccacgagg gacaccaccg 5340gtagcgcccc ctgcaaccgg cgcagtgtca cgaggcgccg gtactgctcg tttgacagga 5400actgcagggt cggtgagctc gcgctgggcg gatcccacca gtagctcccc gtgccggtaa 5460ccgcttgggg ccaagcgaag acacccaccg cggcagcgat ggcaatgcac gtggatggga 5520acaccaccca gaaccaggga aatcctggtg ccggcccgag acgatcccgg cgcggtaaga 5580ccacaccggc caccatcgcc acggcccccg acgcaacaag caataaccac cccatgagcg 5640gacggtacaa gcgccgacgc cgggtggccg ttaggtgcgc gccagcccgt gaccggaccg 5700gcgaagcgtg ccgctgggcg gcccgccgtg gcgcccgtcc cgtgcccgtt ctgaccggtg 5760
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權(quán)利要求
1.DNA片段，具有選自序列號35、序列號36和序列號37記錄的堿基序列的至少1個堿基序列。
2.質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號35、序列號36和序列號37記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域。
3.DNA片段，具有選自序列號1、序列號4、序列號14、序列號17和序列號22記錄的堿基序列的至少1個堿基序列。
4.質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號1、序列號4、序列號14、序列號17和序列號22記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域。
5.質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號1、序列號4、序列號14、序列號17和序列號22記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，且包含具有選自序列號35、序列號36和序列號37記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域。
6.具有序列號76記錄的堿基序列的DNA片段。
7.質(zhì)粒或作為其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有序列號76記錄的堿基序列的啟動子區(qū)域。
8.質(zhì)粒或作為其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有選自序列號1、序列號4、序列號14、序列號17和序列號22記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，包含具有選自序列號35、序列號36和序列號37記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域，并且包含具有序列號76記錄的堿基序列的啟動子區(qū)域。
9.環(huán)狀質(zhì)粒，其特征在于，具有權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；駾NA片段，限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)數(shù)為BamHI2，EcoRI2，KpnI1，PvuII1，SacI1和SmaI1，大小為約5.4kbp。
10.具有序列號73記錄的堿基序列的質(zhì)粒。
11.如權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；駾NA片段，其特征在于，來源于紅球菌(Rhodococcus)屬菌。
12.DNA片段，具有選自序列號70、序列號71和序列號72記錄的堿基序列的至少1個堿基序列。
13.質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號70、序列號71和序列號72記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域。
14.DNA片段，具有選自序列號40、序列號42、序列號44、序列號45、序列號53、序列號55、序列號56、序列號61、序列號62和序列號69記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA片段。
15.質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號40、序列號42、序列號44、序列號45、序列號53、序列號55、序列號56、序列號61、序列號62和序列號69記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域。
16.質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號40、序列號42、序列號44、序列號45、序列號53、序列號55、序列號56、序列號61、序列號62和序列號69記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，并且包含具有選自序列號70、序列號71和序列號72記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域。
17.質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，包含具有選自序列號40、序列號42、序列號44、序列號45、序列號53、序列號55、序列號56、序列號61、序列號62和序列號69記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，包含具有選自序列號70、序列號71和序列號72記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的DNA復(fù)制區(qū)域，并且包含具有序列號76記錄的堿基序列的啟動子區(qū)域。
18.DNA片段，具有選自序列號67和序列號47記錄的堿基序列的至少1個堿基序列。
19.質(zhì)粒或作為其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有選自序列號67和序列號47記錄的堿基序列的至少1個堿基序列的接合蛋白質(zhì)區(qū)域。
20.具有序列號75記錄的堿基序列的DNA片段。
21.質(zhì)粒或作為其一部分的DNA片段，其特征在于，包含與具有序列號75記錄的堿基序列的接合相關(guān)的區(qū)域。
22.環(huán)狀質(zhì)粒，其特征在于，具有權(quán)利要求12～21中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；駾NA片段，限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)數(shù)為BamHI2，PvuII4，SacI3和SmaI4，大小為約5.8kbp。
23.具有序列號74記錄的堿基序列的質(zhì)粒。
24.如12～23中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，其特征在于，來源于紅球菌(Rhodococcus)屬菌。
25.具有序列號77記錄的堿基序列的DNA片段。
26.DNA片段，其特征在于，包含具有序列號77記錄的堿基序列的啟動子區(qū)域。
27.在紅球菌屬菌和大腸桿菌內(nèi)可復(fù)制的穿梭載體，包含權(quán)利要求1～26中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；蜃鳛槠湟徊糠值腄NA片段，和在大腸桿菌內(nèi)可復(fù)制的DNA區(qū)域。
28.載體，其特征在于，使用權(quán)利要求27所述的穿梭載體制造。
29.載體，其特征在于，包含權(quán)利要求6、7、25或26中任一項(xiàng)所述的質(zhì)?；駾NA片段。
30.如權(quán)利要求28或29中任一項(xiàng)所述的載體，其特征在于，插入有氨基酮不對稱還原酶基因。
31.如權(quán)利要求30所述的載體，其特征在于，氨基酮不對稱還原酶基因，是編碼含有序列號78記錄的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸；或編碼具有在序列號78的氨基酸序列中缺失、插入、取代或加成1個或多個氨基酸的氨基酸序列，且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)的核酸。
32.如權(quán)利要求30所述的載體，其特征在于，氨基酮不對稱還原酶基因，是含有序列號79記錄的堿基序列的核酸；或編碼在嚴(yán)格的條件下與含有和序列號79互補(bǔ)的堿基序列的核酸雜交、且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)的核酸。
33.包含權(quán)利要求28或29所述的載體的轉(zhuǎn)化體。
34.包含權(quán)利要求30～32中任一項(xiàng)所述的載體的轉(zhuǎn)化體。
35.一種氨基酮不對稱還原酶的制造方法，包括將權(quán)利要求34所述的轉(zhuǎn)化體在可增殖該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)工序，和由所述培養(yǎng)工序中所得的該轉(zhuǎn)化體精制氨基酮不對稱還原酶的精制工序。
36.一種光學(xué)活性氨基醇的制造方法，使由權(quán)利要求35所述的制造方法得到的氨基酮不對稱還原酶作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，生成具有期望光學(xué)活性的、由通式(2)表示的光學(xué)活性氨基醇化合物，其中， 式中，X可以相同也可以不同，表示選自鹵原子、低級烷基、可以由保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基和磺?；闹辽僖环N；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3可以相同也可以不同，表示選自氫原子和低級烷基的至少一種；*表示不對稱碳， 式中，X、n、R1、R2、R3和*與所述式(1)定義相同。
37.一種光學(xué)活性氨基醇的制造方法，使由權(quán)利要求34所述的轉(zhuǎn)化體作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，生成具有期望的光學(xué)活性、由通式(2)表示的光學(xué)活性氨基醇化合物，其中， 式中，X可以相同也可以不同，表示選自鹵原子、低級烷基、可以由保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基和磺?；闹辽僖环N；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3可以相同也可以不同，表示選自氫原子和低級烷基的至少一種；*表示不對稱碳， 式中，X、n、R1、R2、R3和*與所述式(1)定義相同。
38.一種光學(xué)活性氨基醇的制造方法，在權(quán)利要求37所述的光學(xué)活性氨基醇的制造方法中，進(jìn)一步添加由通式(3)表示的化合物、或其在制藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，生成光學(xué)活性氨基醇，其中， 式中，A表示結(jié)構(gòu)式(Y)或(Z)； 這里，R4表示氫原子、也可以具有取代基的碳原子數(shù)1～3的烷基、與R8結(jié)合形成碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)或與R8結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架， 這里，R5表示氫原子、碳原子數(shù)1～3的烷基、或與R6或R9結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架，R6表示氫原子、可以具有取代基的碳原子數(shù)1～3的烷基、與R8結(jié)合形成碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)、與R5或R9結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架，R7表示氫原子、可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基；R8表示氫原子、羧基、可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基、與R4結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架、與R6結(jié)合形成碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)；R9表示氫原子、可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基、可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷氧基羰基、可以具有取代基的?；⑴cR5或R6結(jié)合形成含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R10表示氫原子或可以具有取代基的碳原子數(shù)1～6的烷基。
全文摘要
本發(fā)明從來源于紅球菌屬菌的具有序列號73記錄的堿基序列的質(zhì)粒和具有序列號74記錄的堿基序列的質(zhì)?；蚱銬NA片段等，制備在紅球菌屬菌內(nèi)可復(fù)制的DNA區(qū)域，從來源于大腸桿菌的質(zhì)?；蚱銬NA片段，制備在大腸桿菌內(nèi)可復(fù)制的DNA區(qū)域，制作穿梭載體。在穿梭載體中插入氨基酮不對稱還原酶基因構(gòu)建載體，制作包含該載體的轉(zhuǎn)化體，制造氨基酮不對稱還原酶和光學(xué)活性氨基醇。
文檔編號C12N13/00GK1875102SQ20048003242
公開日2006年12月6日 申請日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者山村榮虎, 藤本升 申請人:第一精密化學(xué)股份有限公司