專利名稱：用于檢測(cè)基因座拷貝數(shù)改變的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景本發(fā)明涉及用于檢測(cè)基因座拷貝數(shù)異常(例如，擴(kuò)增)的方法和試劑盒，所述異常導(dǎo)致染色體異常，如三體性。
在其中遺傳成分相對(duì)于環(huán)境因素占優(yōu)勢(shì)的疾病狀態(tài)稱作遺傳病并且通常分成如下三類之一(i)特征是一個(gè)或多個(gè)染色體的缺失、過多或者異常排列的疾病；(ii)孟德爾或者簡(jiǎn)單遺傳的疾病，其主要由單個(gè)突變的基因?qū)е虏⑶壹?xì)分成常染色體顯性、常染色體隱性或者X-連鎖的類型；和(iii)多個(gè)基因和環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致的多因子疾病。
非整倍性(Aneploidias)是在50％以上流產(chǎn)兒中發(fā)現(xiàn)的最常見的染色體異常[McConnell HD，Carr DH.Recent advances in thecytogenetic study of human spontaneous abortions.Obstet Gynecol.1975May；45(5)547-52]。三體性在胎兒或者胚胎狀態(tài)是致命的，而常染色體三體性是允許胎兒在出生后存活的三體性。
唐氏綜合征也稱作第21對(duì)染色體三體性，是可以在產(chǎn)前診斷的最常見的遺傳病之一。它導(dǎo)致患有該疾病兒童中智力遲鈍和許多身體和生理異常。許多患者生下來就患有先天性心臟缺損和胃腸異常，其可以通過手術(shù)矯正。身體特征包括扁平后腦勺、和斜眼、鼻橋凹陷、手和腳小、出生時(shí)頸后部的過多皮膚、肌肉緊張度降低和手掌中猿褶[Down syndrome，(1994)National Down Syndrome Congress.Atlanta，GANDSC]。
唐氏綜合征的患病率占美國(guó)中每10,000個(gè)活產(chǎn)中的9.2例。盡管唐氏綜合征發(fā)生的原因仍然還未充分理解，但是已經(jīng)充分確定較高的母親年齡起一定作用。從而，對(duì)于35歲以上的母親，懷上具有第21對(duì)染色體三體性胚胎的危險(xiǎn)性呈指數(shù)上升。由于在美國(guó)生育的母親年齡增長(zhǎng)，所以有危險(xiǎn)懷有在子宮中診斷為唐氏綜合征的兒童的母親的患病率比以前更高。因此，認(rèn)為35歲以上的所有母親都可能具有唐氏綜合征的高度危險(xiǎn)并且應(yīng)該為其提供試驗(yàn)。
當(dāng)前唐氏綜合征的產(chǎn)前篩選方法是多樣的并且包括，血清篩選、超聲、侵入性試驗(yàn)、遺傳咨詢和染色體研究。已經(jīng)進(jìn)行了大量研究來改進(jìn)唐氏綜合征的產(chǎn)前診斷，特別是在首三月中的診斷，但是迄今還沒有被證明在唐氏綜合征的診斷中100％準(zhǔn)確的試驗(yàn)。
下面概述了當(dāng)前用于唐氏綜合征的產(chǎn)前篩選和診斷的方法。
非侵入性試驗(yàn)胎兒的超聲成像-該試驗(yàn)在妊娠的第12-18周進(jìn)行。它尋找頸項(xiàng)透明層(nucaltranslucency)(即，增加的頸項(xiàng)(nucal)增厚或者腫脹)、縮短的長(zhǎng)骨的長(zhǎng)度和第一和第二趾之間的趾間間隔明顯(sandalgap)。但是可以理解用于檢測(cè)胎兒三體性狀況的超聲檢查的靈敏性隨著染色體異常的類型、超聲檢查時(shí)孕齡、治療安排的理由、陽性超聲檢查發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)和超聲檢查的質(zhì)量而變。作為估計(jì)，可以在50％到70％具有第21對(duì)染色體三體性(唐氏綜合征)的胎兒中鑒定一個(gè)或多個(gè)超聲檢查發(fā)現(xiàn)。從而，超聲檢查標(biāo)記的存在或不存在可以顯著改變胎兒唐氏綜合征的危險(xiǎn)性并且是遺傳超聲圖的基礎(chǔ)。因?yàn)槟阁w生物化學(xué)和超聲檢查標(biāo)記在很大程度上是獨(dú)立的，所以組合的危險(xiǎn)估計(jì)導(dǎo)致比單獨(dú)的危險(xiǎn)估計(jì)更高的檢測(cè)率。
母體血清篩選-母體血清篩選也稱作多重標(biāo)記篩選測(cè)試，包括三重標(biāo)記測(cè)試，其檢查血清甲胎蛋白(AFP，其低水平表明唐氏綜合征)；人絨毛膜促性腺激素(hCG，其高水平表明唐氏綜合征)；和未綴合的雌三醇(uE3，其低水平表明唐氏綜合征)。最近已經(jīng)加入第四種標(biāo)記抑制素A，其高水平表明唐氏綜合征診斷[Wald，Watt，和Hackshaw，(1999)The New England Journal of Medicine，vol.341，no.7.461-469]?，F(xiàn)在三重標(biāo)記測(cè)試與抑制素A的加入得到了四重標(biāo)記測(cè)試。這些標(biāo)記與母親年齡參數(shù)可以用于診斷唐氏綜合征，其檢測(cè)率為約70％，假陽性率為約5％。這些標(biāo)記可以與在首三月中使用的AFP測(cè)試和超聲一起用于診斷妊娠期的次三月中的唐氏綜合征。
所述四重測(cè)試現(xiàn)在與頸項(xiàng)透明層超聲波檢查和測(cè)試妊娠有關(guān)的血漿蛋白質(zhì)-A(PAPP-A)一起使用。該方法可以增加檢測(cè)率到85％，具有5％假陽性率，從而提供了當(dāng)前可利用的對(duì)唐氏綜合征的最可靠的非侵入性檢測(cè)[Wald，Kennard，Hackshaw和McGuire，(1998)HealthTechnology Assessment，vol 2，no.1.1-124.]。然而，應(yīng)該指出，當(dāng)前可利用的血清標(biāo)記提供統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，其是不確定的并且通常難以解釋。
侵入性測(cè)試羊膜腔穿刺術(shù)-羊膜腔穿刺術(shù)是侵入性方法，其中在次三月中抽出羊水用于檢測(cè)胎兒異常。推薦該測(cè)試用于高母親年齡的婦女，她們懷有患有諸如唐氏綜合征的遺傳異常的孩子的危險(xiǎn)性更大。羊膜腔穿刺術(shù)的治療安排可以包括非常低或高水平的AFP。通常在次三月中進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)，但是其可以早在妊娠的第11周進(jìn)行。在妊娠的約16周取羊水樣品。由于僅20％羊水細(xì)胞適于測(cè)試，所以需要培養(yǎng)樣品以得到足夠的分裂細(xì)胞用于分裂中期分析。因此，1-3周后可以得到結(jié)果，其可以導(dǎo)致母親焦慮增加，和考慮次三月和第三個(gè)三月的終止。核型分析檢測(cè)染色體病而不是唐氏綜合征。然而，200個(gè)妊娠中的約1個(gè)由于羊膜腔穿刺術(shù)導(dǎo)致流產(chǎn)。
絨膜絨毛取樣-絨膜絨毛取樣包括采集絨膜樣品，其形成胎盤并且由胎兒形成，因此含有胎兒細(xì)胞。該測(cè)試可以在首三月結(jié)束時(shí)進(jìn)行(即10-12周)。經(jīng)子宮頸或者經(jīng)腹進(jìn)行該方法。兩種方法一樣安全和有效。該方法快速(在24小時(shí)以內(nèi)得到結(jié)果)并且有很小或無疼痛。然后在顯微鏡下分析樣品(即，未培養(yǎng)的樣品)，特別尋找染色體異常。CVS的優(yōu)點(diǎn)是在首三月內(nèi)早期檢測(cè)，和母親細(xì)胞污染的危險(xiǎn)減小。缺點(diǎn)是流產(chǎn)的危險(xiǎn)增加和成本。仍然重要的是查看母體血清標(biāo)記，盡管查看AFP時(shí)，太晚而不能進(jìn)行CVS。陽性結(jié)果以60-70％的比率檢測(cè)遺傳疾病，如唐氏綜合征。將明白1％CVS顯示出限制的胎盤鑲嵌性，其中從直接或培養(yǎng)的CVS得到的結(jié)果與胎兒的結(jié)果不同。所培養(yǎng)的CVS從比直接CVS更接近胎兒系的細(xì)胞生長(zhǎng)而來，所述直接CVS更接近胎盤。流產(chǎn)的危險(xiǎn)性高于羊膜腔穿刺術(shù)的危險(xiǎn)。此外，CVS期間腿和手截?cái)?ampotation)的危險(xiǎn)相對(duì)較高。
未培養(yǎng)的羊水細(xì)胞的分裂間期熒光原位雜交(FISH)-可以使用熒光原位雜交(FISH)分析羊水的載玻片。該測(cè)試對(duì)未培養(yǎng)的分裂間期細(xì)胞進(jìn)行并且可以檢測(cè)許多染色體異常。結(jié)果在24小時(shí)內(nèi)得到。來自染色體21標(biāo)準(zhǔn)區(qū)的探針用于診斷唐氏綜合征。另一種探針用于測(cè)試倍性。對(duì)于一些易位，由于兩種信號(hào)可以重疊，所以探針位置可以導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)診斷-該方法已經(jīng)經(jīng)證明可用于唐氏綜合征中不分離的研究。通常使用的是21號(hào)染色體內(nèi)的多態(tài)性(GT)n重復(fù)序列和Alu序列。[Petersen(1991)Am J Hum Genet，4865-71；Celi(1994)；Messari(1996)Hum Genet，97150-155]。從而，例如，可以使用通過子宮頸內(nèi)管沖洗從妊娠的7到9周得到的經(jīng)子宮頸細(xì)胞(TCC)樣品得到的胎兒DNA。滋養(yǎng)層回收對(duì)于Y染色體特異的DNA序列的PCR擴(kuò)增和父親-特異的微衛(wèi)星等位基因的檢測(cè)是足夠的。該方法準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)胎兒性別。使用超氧化物歧化酶-1(SOD1)的熒光原位雜交(FISH)和半定量PCR分析診斷TCC中的第21對(duì)染色體三體性胎兒。后來，闡明了使用定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)同時(shí)診斷第21對(duì)染色體和第18對(duì)染色體三體性以及檢測(cè)來自X和Y染色體的DNA序列。通過定量熒光PCR擴(kuò)增從羊水、胎兒血液或者組織提取的DNA樣品以檢測(cè)對(duì)21和18號(hào)染色體每一種上兩個(gè)等位基因特異的多態(tài)性小串聯(lián)重復(fù)序列(STR)。擴(kuò)增產(chǎn)物的定量分析允許診斷第21對(duì)染色體和第18對(duì)染色體三體性，而使用來自X和Y染色體的DNA序列的PCR擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行性別鑒定。使用用于檢測(cè)第21對(duì)染色體染色體三體性的兩組STR標(biāo)記證實(shí)了用于所選染色體異常的快速產(chǎn)前診斷的定量熒光多重PCR的有用性[PertlObstet Gynecol.(2001)Sep；98(3)483-90]。
在另一研究中，從過多的羊水提取DNA并在基于熒光的PCR反應(yīng)中擴(kuò)增，使用位于21號(hào)染色體上的三種小串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記。在DNA測(cè)序儀上分析反應(yīng)產(chǎn)物以鑒定21號(hào)染色體的兩個(gè)或三個(gè)拷貝的存在。使用該方法，用三種標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了共99.6％提供信息的結(jié)果(Verma1998)。還對(duì)非多態(tài)性靶基因通過熒光PCR產(chǎn)物進(jìn)行了染色體定量分析。Rahil等人(2002)設(shè)置了DSCR1(唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)1)、DCC(在結(jié)腸直腸癌中缺失)和RB1(成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤1)的部分的共同擴(kuò)增，分別允許21、18和13號(hào)染色體的非整倍性的分子檢測(cè)。在400種羊水的盲法前瞻性研究中進(jìn)行了定量分析。對(duì)所有樣品進(jìn)行隨訪核型分析，并且分子結(jié)果與細(xì)胞遺傳學(xué)數(shù)據(jù)一致，沒有假陽性或者假陰性結(jié)果。從而，使用PCR對(duì)胎兒DNA通過染色體定量進(jìn)行非整倍性診斷是有效且可靠的方法。然而，這些方法對(duì)胎兒DNA純度非常敏感，因?yàn)槟赣HDNA可能掩蓋染色體定量。
單個(gè)細(xì)胞中非整倍性的檢測(cè)-該方法用于植入前遺傳診斷。從裂解的單個(gè)細(xì)胞得到DNA并使用簡(jiǎn)并寡核苷酸引發(fā)的PCR(DOP-PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。將產(chǎn)物用切口平移進(jìn)行標(biāo)記并與正常參照基因組DNA一起雜交。用比較基因組雜交(CGH)熒光比率圖確定非整倍性，截?cái)嚅撝禐?.75和1.25。使用該技術(shù)分析已知對(duì)13、18或21號(hào)染色體為三倍性的單個(gè)細(xì)胞[Voullaire等人(1999)，Tabet(2001)，Rigola等人(2001)]。
指紋法系統(tǒng)是進(jìn)行植入前遺傳診斷的另一種方法。選擇具有高雜合性、已知的等位基因大小范圍和最小的PCR打滑假象的四核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記用于X、13、18和21號(hào)染色體并以多重?zé)晒?FL)-PCR形式最優(yōu)化[Katz等人(2002)Hum Reprod.17(3)752-9]。然而，這些方法對(duì)于體外受精受限，因?yàn)閺哪赣H血清分離胎兒細(xì)胞純的級(jí)分需要當(dāng)前還不可利用的技術(shù)方法。
母體循環(huán)中的胎兒細(xì)胞-該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是它是非侵入性的并且因此該方法本身對(duì)妊娠無危險(xiǎn)?？赡芸梢员菴VS更早進(jìn)行，因?yàn)樵诘?周就已經(jīng)檢測(cè)到胎兒DNA。
在母體循環(huán)中僅發(fā)現(xiàn)少許胎兒細(xì)胞(滋養(yǎng)層、淋巴細(xì)胞和具核紅細(xì)胞)，因此需要選擇和富集這些細(xì)胞。富集技術(shù)包括流式/磁分選，和雙密度離心。有約1-2個(gè)胎兒細(xì)胞/1千萬母體細(xì)胞，并且50％胎兒細(xì)胞將不適于核型分析。特別地，淋巴細(xì)胞不適于用于該技術(shù)，因?yàn)榇祟惣?xì)胞在母體循環(huán)中保持幾年的持續(xù)時(shí)間，并且因此結(jié)果可能受到以前妊娠的影響。與常規(guī)核型分析相比，該方法僅檢查單個(gè)染色體。
a)FISH可以用于檢查盡可能多細(xì)胞中的信號(hào)數(shù)/細(xì)胞以得到具有3種信號(hào)的細(xì)胞的比例。探針的雜交效率可以巨大地影響所見到的信號(hào)數(shù)(從而偏移結(jié)果)。
b)引發(fā)的原位標(biāo)記(PRINS)基于特定和未標(biāo)記的DNA引物與互補(bǔ)基因組位點(diǎn)的原位退火和隨后通過PCR摻入經(jīng)標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行的延伸。
診斷唐氏綜合征的其他方法包括在10周采集并且需要培養(yǎng)和核型分析和子宮腔灌洗/經(jīng)子宮頸細(xì)胞取樣的體腔液。后者比羊膜腔穿刺術(shù)或者CVS的侵入性低。它在7-9周進(jìn)行并且涉及收集從胎盤喪失的細(xì)胞，從而類似于直接CVS。然而，該方法使母親受到污染和感染。
從而，通常的和具體的唐氏綜合征中染色體異常(即，三體性)的產(chǎn)前診斷是復(fù)雜的，需要杰出的技術(shù)技能，不完全有效并且可能導(dǎo)致妊娠失敗。由于對(duì)于唐氏綜合征沒有確定的產(chǎn)前測(cè)試這一事實(shí)，所以結(jié)束健康胎兒妊娠的危險(xiǎn)很高。
因此廣泛認(rèn)識(shí)到需要檢測(cè)導(dǎo)致染色體異常的基因座擴(kuò)增并且沒有上面的局限的方法，并且擁有該方法將是非常有利的。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了鑒定基因座拷貝數(shù)改變的方法，該方法包括確定所述基因座中至少一種基因的甲基化狀態(tài)，其中與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明基因座拷貝數(shù)的改變。
根據(jù)在下述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中的其他特征，基因座拷貝數(shù)的改變由選自非整倍性和多倍性的染色體畸變導(dǎo)致。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了鑒定受試者中基因座拷貝數(shù)改變的方法，該方法包括(a)得到受試者的染色體DNA；和(b)確定所述染色體DNA的基因座上至少一種基因的甲基化狀態(tài)，其中與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明基因座拷貝數(shù)的改變，從而鑒定受試者中基因座拷貝數(shù)的改變。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了產(chǎn)前鑒定基因座拷貝數(shù)改變的方法，該方法包括(a)得到胎兒或者胚胎的包括所述基因座的染色體DNA，；和(b)確定胎兒或者胚胎的包括所述基因座的染色體DNA中至少一種基因的甲基化狀態(tài)，其中與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明基因座拷貝數(shù)的改變，從而產(chǎn)前鑒定基因座拷貝數(shù)的改變。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其他特征，得到胎兒或者胚胎染色體DNA通過(i)羊膜腔穿刺術(shù)；(ii)胎兒活組織檢查；(iii)絨膜絨毛取樣；和/或母體活組織檢查來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其他特征，確定至少一種基因的甲基化狀態(tài)通過(i)限制酶消化甲基化檢測(cè)；(ii)基于硫酸氫鹽的甲基化檢測(cè)；(iii)質(zhì)譜分析法分析；(iv)序列分析；和/或(v)微陣列分析來實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的方法，該方法包括(a)得到胎兒或者胚胎21號(hào)染色體；和(b)確定胎兒或者胚胎21號(hào)染色體中至少一種基因的甲基化狀態(tài)，其中選擇的所述至少一種基因不在唐氏綜合征中擴(kuò)增，而與預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明胎兒或者胚胎21號(hào)染色體的擴(kuò)增，從而產(chǎn)前診斷唐氏綜合征。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其他特征，所述至少一種基因選自APP和胱硫醚-β-合酶。
根據(jù)本發(fā)明的額外方面，提供了鑒定“與生命相容的”基因的方法，該方法包括(a)確定所擴(kuò)增的染色體序列區(qū)中多種基因的甲基化狀態(tài)；和(b)鑒定所述多種基因中顯示出與預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)的基因，從而鑒定“與生命相容的”基因。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)額外方面，提供了鑒定“與生命相容的”基因的方法，該方法包括(a)確定所擴(kuò)增的染色體序列區(qū)中多種基因的表達(dá)水平；和(b)鑒定所述多種基因中顯示出低于預(yù)定閾值的表達(dá)水平的基因，從而鑒定“與生命相容的”基因。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其他特征，在mRNA水平上實(shí)現(xiàn)確定多種基因的表達(dá)水平。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其他特征，在蛋白質(zhì)水平上實(shí)現(xiàn)確定多種基因的表達(dá)水平。
根據(jù)本發(fā)明的額外方面，提供了制成品，其包含包裝材料和所述包裝材料中含有的用于檢測(cè)基因座拷貝數(shù)改變的試劑，其中所述試劑能夠確定所述基因座中至少一種基因的甲基化狀態(tài)，而與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明基因座拷貝數(shù)的改變。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于鑒定基因座拷貝數(shù)改變的試劑盒，所述試劑盒包含用于確定所述基因座中至少一種基因的甲基化狀態(tài)的試劑，所述至少一種基因選自APP和胱硫醚-β-合酶，其中與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明基因座拷貝數(shù)的改變。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中其他特征，選自非整倍性和多倍性的染色體畸變導(dǎo)致基因座拷貝數(shù)的改變。本發(fā)明通過提供用于鑒定基因座擴(kuò)增的方法和試劑盒成功地解決了當(dāng)前已知的結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)。
除非另外定義，用于本文的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所述領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管類似或者等價(jià)于本文描述的方法和材料的方法和材料可以用于實(shí)踐或者檢驗(yàn)本發(fā)明，但是下面描述適宜的方法和材料。對(duì)于有沖突的情況，以本專利說明書，包括定義為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)施例僅用于闡明而不意在限制。
附圖簡(jiǎn)述僅通過實(shí)例，參考附圖描述本發(fā)明?，F(xiàn)在具體地詳細(xì)參考附圖，要強(qiáng)調(diào)的是所示細(xì)節(jié)作為實(shí)例并且僅用于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的闡明性討論的目的，并且是為了提供被認(rèn)為是對(duì)于本發(fā)明的原理和概念方面最有用和最容易理解的說明而提供的。在這點(diǎn)上，僅僅為了對(duì)本發(fā)明的基本理解所需要而更詳細(xì)地顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，說明書與附圖一起使得本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚怎樣可以在實(shí)踐中體現(xiàn)本發(fā)明的幾種形式。
在附圖中

圖1a是APP啟動(dòng)子的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，其從啟動(dòng)子區(qū)延伸到人APP區(qū)的第一個(gè)外顯子。+1指轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。用作引物1(SEQID NO1)和2(SEQ ID NO2)的序列加雙下劃線。9bp長(zhǎng)的富含GC的元件的6個(gè)拷貝加下劃線。C上的點(diǎn)指出所擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)(-251到+22)中CpG雙聯(lián)體中的胞嘧啶。
圖1b是用于檢測(cè)圖1a中給出的DNA序列的甲基化狀態(tài)的引物的核苷酸序列。引物1(a-b)-表示分別在磺化作用之后或之前的引物1(SEQ ID NO1，APP-F)的序列；引物2c-e-表示磺化作用后(c)，反義取向的(d)或者磺化作用前(e)引物2(SEQ ID NO2，APP-R)的序列。
圖2a-b是雄激素受體外顯子1的天然(圖2a)和亞硫酸氫鹽修飾的(圖2b)序列的核苷酸序列。圖2a-#表示正向引物的位置；##表示反向引物的位置；*表示HpaII位點(diǎn)；**表示HhaI位點(diǎn)。圖2b-綠色加亮區(qū)指出CpG島；粉紅色下劃線-指出CpG位點(diǎn)；(#)指出AR-F-1(SEQ ID NO60)的位置；(*)指出AR-F-34引物(SEQ IDNO61)的位置；(**)指出AR-R-282引物(SEQ ID NO62)的位置。
圖3是瓊脂糖凝膠照片，顯示了雄性、雌性和Kleinfelter綜合征侵襲的受試者中雄激素受體甲基化狀態(tài)的基于限制酶分析的產(chǎn)物。泳道1-DNA標(biāo)記；泳道2-陰性對(duì)照；泳道3-XX未切割的；泳道4-XY未切割的；泳道5-XY未切割的；泳道6-X染色體三體性未切割的；泳道7-XX切割的；泳道8-XY切割的；泳道9-XY切割的；泳道10-X染色體三體性切割的。
圖4a-b是天然的(圖4a)和亞硫酸氫鹽修飾的(圖4b)DSCAM啟動(dòng)子的核苷酸序列。(#)-表示正向引物的位置；($)表示反向引物的位置；綠色加亮區(qū)指出CpG島。
圖5a-b是天然的(圖5a)和亞硫酸氫鹽修飾的(圖5b)IFNAR1啟動(dòng)子的核苷酸序列。綠色加亮區(qū)指出CpG島。(*)指出IFNR-f4-bis(SEQ ID NO247)的位置；(**)指出IFNR-nes-f-bis(SEQ ID NO249)的位置；(***)指出IFNR-r4-bis(SEQ ID NO248)的位置。
優(yōu)選實(shí)施方案描述本發(fā)明為可以用于鑒定導(dǎo)致染色體異常的基因座拷貝數(shù)異常的方法和試劑盒。具體地，本發(fā)明可以用于產(chǎn)前檢測(cè)基因座擴(kuò)增，如三體性。
參考附圖和所附描述可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案前，將理解本發(fā)明的應(yīng)用不限于下面描述中給出或者通過實(shí)施例例證的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其他實(shí)施方案或者以多種方式實(shí)踐或者實(shí)施。而且，將理解本文所用的措詞和術(shù)語用于描述的目的并且不應(yīng)認(rèn)為是作為限定。
遺傳病是最通常由染色體數(shù)的變異，如非整倍性、整倍性和多倍性導(dǎo)致的病理狀況。染色體數(shù)或者其部分中此類變異通常對(duì)于胚胎或者胎兒是致死的。第21對(duì)染色體三體性(唐氏綜合征)、第18對(duì)染色體三體性(Edward氏綜合征)、第13對(duì)染色體三體性(Patau綜合征)和性染色體三體性是僅有的活產(chǎn)常染色體三體性。與第21對(duì)染色體三體性相反，第13對(duì)染色體和第18對(duì)染色體三體性疾病傾向于具有更嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)并且很少有患病的嬰兒活過一周歲。在患有三體性疾病的胎兒中存在多種異常，但是沒有給定三體性典型的單一異常。相反，存在一組提示特定診斷的特征性臨床發(fā)現(xiàn)。此外，因?yàn)檫@些患者的一些可能對(duì)于三體性細(xì)胞系是鑲嵌的，所以可能具有多種表型。
迄今為止，對(duì)于任何三體性疾病還沒有特定治療、療法或者治愈。由于這些原因，通常非常需要染色體異常，且尤其三體性的早期產(chǎn)前診斷。
用于三體性的產(chǎn)前診斷的當(dāng)前可利用的方法包括羊水細(xì)胞或者絨膜細(xì)胞的超聲檢查和細(xì)胞遺傳學(xué)分析。盡管超聲檢查受到高假陽性率的限制，但是侵入性測(cè)試不完全有效，需要高技術(shù)技能并且可能導(dǎo)致妊娠失敗。備選地，母體血漿中循環(huán)的胎兒DNA的診斷用途當(dāng)前限于在胎兒而不是母親中發(fā)現(xiàn)的基因或者突變。
如在下面的實(shí)施例部分中進(jìn)一步描述的，在尋找染色體畸變的新的診斷方式時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)由于某些基因的沉默，常染色體三體性或者單體性允許出生后存活，其中所述基因的超表達(dá)與生命不相容。
DNA甲基化是一種可逆機(jī)制，通過DNA甲基化，基因表達(dá)在原核和真核生物中沉默。通過甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基加到特別是啟動(dòng)子序列區(qū)中胞嘧啶嘧啶環(huán)的5位碳的能力，實(shí)現(xiàn)了該水平的基因表達(dá)控制[Adams(1995)Bioessays 17(2)139-45]。真核細(xì)胞中甲基化的序列通常是無活性的[Gold和Pedersen(1994)]。
已經(jīng)清楚地證明了異常DNA甲基化是癌癥中的普遍現(xiàn)象，并且可能是腫瘤發(fā)生期間發(fā)生的最早改變[Stirzaker(1997)Cancer Res.57(11)2229-37]。已經(jīng)表明DNA甲基化在基因印記、胚胎發(fā)育、X-染色體沉默和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用[Costello(2001)J.Med.Genet.38(5)285-303]。建立基因甲基化的正常模式的失敗是許多遺傳病的病因，所述遺傳病包括Rett綜合征(智力遲鈍的主要形式)、Prader-Willi綜合征、Angelman氏綜合征、ICF綜合征和Beckwith-Wiedmann綜合征。
考慮到DNA甲基化在基因沉默中的重要作用，很容易想象相同機(jī)制應(yīng)用于如下基因的沉默，所述基因的過表達(dá)是致死的(即不與生命相容)，從而提示確定基因甲基化狀態(tài)可以用于檢測(cè)基因座擴(kuò)增。
實(shí)際上，盡管負(fù)責(zé)唐氏綜合征(即，智力遲鈍、先天性心臟病等等)的臨床表型的21號(hào)染色體上的基因在DS患者中以三體性水平表達(dá)，但是如通過微陣列分析的，來自唐氏綜合征患者中21號(hào)染色體的基因的總體基因表達(dá)中沒有顯著差異[Gross SJ，F(xiàn)erreira JC，Morrow B，Dar P，F(xiàn)unke B，Khabele D，Merkatz I.Gene expressionprofile of trisomy 21 placentasa potential approach for designingnoninvasive techniques of prenatal diagnosis.Am J Obstet Gynecol.2002Aug；187(2)457-62]。
這些發(fā)現(xiàn)提示DNA甲基化沉默21號(hào)染色體上額外拷貝上的重要基因。Kuramitsu和同事的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了該假設(shè)，他們顯示唐氏綜合征患者中21號(hào)染色體的h2-鈣調(diào)理蛋白基因由于21號(hào)染色體的三個(gè)拷貝之一中甲基化而沒有超表達(dá)[Kuromitsu(1997)Mol.Cell Biol.2707-12]。
該新近鑒定的基因座拷貝數(shù)的改變和甲基化狀態(tài)之間的連鎖首次允許使用容易執(zhí)行、節(jié)省成本并且對(duì)個(gè)體受試者造成最小或者無危險(xiǎn)的分子生物學(xué)技術(shù)有效檢測(cè)染色體畸變。
從而，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了鑒定基因座拷貝數(shù)改變的方法。
本文所用術(shù)語“基因座”指染色體上基因的位置或定位。根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法可以檢測(cè)位于1-22號(hào)、X和Y染色體上的基因座的獲得、基因座擴(kuò)增或者基因座的喪失。
本文所用短語“基因座擴(kuò)增”指基因座拷貝數(shù)增加。根據(jù)本發(fā)明的該方面的基因座擴(kuò)增和基因座缺乏可以由染色體結(jié)構(gòu)的改變(例如，重復(fù)、倒位、易位、缺失、插入)和/或染色體數(shù)(＞2n)或者其部分(也稱作染色體標(biāo)記)的增加或減少引起。染色體數(shù)的改變可以是非整倍性性質(zhì)的，包括一個(gè)或多個(gè)染色體的獲得或喪失，但不是整個(gè)組的染色體的獲得或喪失(例如，三體性和四體性)。備選地，基因座擴(kuò)增可以由多倍性引起，其中存在三個(gè)或更多個(gè)完整的染色體組。
將明白僅在身體的某些細(xì)胞類型中發(fā)生的染色體數(shù)的改變(即，鑲嵌性)也可以根據(jù)本發(fā)明的該方面進(jìn)行檢測(cè)[Modi D，Berde P，Bhartiya D.Down syndromea study of chromosomalmosaicism.Reprod Biomed Online.2003Jun；6(4)499-503]。
通過確定基因座中至少一種基因的甲基化狀態(tài)(即，甲基化模式和/或水平)實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法。與至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明基因座拷貝數(shù)的改變。
本文所用的“預(yù)定的甲基化狀態(tài)”指從未擴(kuò)增的基因座得到的相同基因的甲基化狀態(tài)，優(yōu)選為相同發(fā)育狀態(tài)的。
從而，上述基因座中所述至少一種基因的至少一個(gè)等位基因的甲基化狀態(tài)的改變(即，模式和/或增加的水平)表明根據(jù)本發(fā)明的該方面的基因座拷貝數(shù)的改變。
通常，人DNA的甲基化在包括相鄰鳥嘌呤和胞嘧啶的二核苷酸序列上發(fā)生，其中胞嘧啶位于鳥嘌呤的5’(也稱作CpG二核苷酸序列)。CpG二核苷酸內(nèi)的大多數(shù)胞嘧啶在人基因組中甲基化，然而，一些在特定富含CpG二核苷酸的基因組區(qū)中保持未甲基化，稱作CpG島[見Antequera，E.等人，Cell 62503-514(1990)]?！癈pG島”是富含CpG二核苷酸的區(qū)，其中CpG二核苷酸組成DNA序列的至少50％。
因此，根據(jù)本發(fā)明的該方面的甲基化狀態(tài)通常在優(yōu)選啟動(dòng)子區(qū)的CpG島中確定。但是將明白人基因組中其他序列易受DNA甲基化，如CpA和CpT[見，Ramsahoye(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 975237-5242；Salmon和Kaye(1970)Biochim.Biophys.Acta.204340-351；Grafstrom(1985)Nucleic Acids Res.132827-2842；Nyce(1986)Nucleic Acids Res.144353-4367；Woodcock(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.145888-894]。
如上文提到的，確定基因座中至少一種基因的甲基化狀態(tài)。實(shí)施例部分的實(shí)施例1-4中列出了可以用于確定X、9和21號(hào)染色體的擴(kuò)增的許多基因。
優(yōu)選地，根據(jù)基因的表達(dá)模式選擇至少一種基因。從而，確定基因的甲基化，所述基因座經(jīng)擴(kuò)增但是沒有顯示出表達(dá)改變，即，與僅兩個(gè)基因拷貝相容的表達(dá)模式。此類基因的實(shí)例在下面的表1中列出。
表1
確定基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域公知的。實(shí)例包括但不限于基于RNA的方法，包括使用寡核苷酸的基于雜交的技術(shù)(例如，RNA印跡、PCR、RT-PCR、RNA酶保護(hù)、原位雜交、引物延伸、微陣列分析和斑點(diǎn)印跡分析)，或者基于蛋白質(zhì)的方法，如層析法，電泳，免疫檢測(cè)測(cè)定，如ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析、免疫組織化學(xué)等等，其可以使用特異抗體實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的技術(shù)細(xì)節(jié)見可以在http://www.protocol-online.org/得到的實(shí)驗(yàn)室參考書，和在下面的實(shí)施例部分引用的其他參考文獻(xiàn)。
用于確定基因甲基化的許多方法是本領(lǐng)域已知的，包括基于限制酶消化的甲基化檢測(cè)和基于硫酸氫鹽的甲基化檢測(cè)。一些此類方法在下文和在下面的實(shí)施例部分的實(shí)施例1中概述(關(guān)于用于檢測(cè)甲基化的進(jìn)一步的技術(shù)細(xì)節(jié)公開在Ahrendt(1999)J.Natl.Cancer Inst.91332-9；Belinsky(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9511891-96；Clark(1994)Nucleic Acids Res.222990-7；Herman(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 939821-26；Xiong和Laird(1997)Nuc.Acids Res.252532-2534)。
限制酶消化甲基化檢測(cè)測(cè)定法該測(cè)定法基于一些限制酶不能切割甲基化的DNA。通常使用的是成對(duì)酶HpaII-MspI，其包括識(shí)別基序CCGG，和SmaI-XmaI，其具有較不尋常的識(shí)別基序CCCGGG。從而，例如，當(dāng)內(nèi)部胞嘧啶甲基化時(shí)，HapII不能切割DNA，使得HpaII-MspI是快速甲基化分析的有用工具。該方法通常與DNA印跡分析結(jié)合進(jìn)行。采取措施分析基因序列，其將不會(huì)使得難以解釋結(jié)果。從而，首先選擇側(cè)翼是CG甲基化不敏感的酶(例如，BamHI)的限制位點(diǎn)的目的區(qū)域。選擇的此類序列不包括超過5-6個(gè)HpaII的位點(diǎn)。用于DNA印跡或者PCR的探針應(yīng)該位于該區(qū)域內(nèi)并且完全或者部分覆蓋該區(qū)域。該方法已經(jīng)由Buller和同事(1999)(Association between non random X-chromosome inactivation and BRCA1 mutation in germline DNA ofpatients with ovarian cancer J.Natl.CancerInst.91(4)339-46)成功地使用。
因?yàn)橥ㄟ^甲基化敏感酶(例如，HpaII)消化通常是部分的，所以優(yōu)選使用僅消化甲基化CpG位點(diǎn)的McrBC或者其他酶進(jìn)行補(bǔ)充分析[Yamada等人Genome Research 14 247-266 2004]以檢測(cè)多種甲基化模式。
基于硫酸氫鹽的甲基化檢測(cè)基因組測(cè)序-使用從小于100個(gè)細(xì)胞分離的DNA，基因組測(cè)序技術(shù)[Clark等人，(1994)上述]能夠檢測(cè)任意靶序列的兩條鏈上的每個(gè)甲基化胞嘧啶。在該方法中，在5-甲基胞嘧啶保持無反應(yīng)性的條件下，用亞硫酸氫鈉將單鏈DNA中的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化成尿嘧啶殘基。用特異引物擴(kuò)增所轉(zhuǎn)化的DNA并測(cè)序。序列中剩余的所有胞嘧啶殘基代表基因組中以前甲基化的胞嘧啶。該方法利用確定的步驟，其使變性、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增的效率最大化，以允許對(duì)容易從生殖細(xì)胞和早期發(fā)育階段得到的小量基因組DNA的單個(gè)基因進(jìn)行甲基化作圖。
甲基化-特異性PCR(MSP)-這是用于甲基化的靈敏檢測(cè)的最廣泛使用的測(cè)定法。簡(jiǎn)言之，擴(kuò)增前，將DNA用亞硫酸氫鈉處理將所有未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。該亞硫酸氫鹽反應(yīng)將甲基化信息有效轉(zhuǎn)化成序列差異。使用引物擴(kuò)增DNA，所述引物匹配DNA的一種特定甲基化狀態(tài)，如其中DNA在所有CpG都甲基化的狀態(tài)。如果該甲基化狀態(tài)存在于DNA樣品中，那么可以在凝膠上顯示所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。
然而，將明白該方法特異的引發(fā)需要引物結(jié)合位點(diǎn)中的所有CpG都被共同甲基化。從而，當(dāng)存在共同甲基化時(shí)，在凝膠上觀察到擴(kuò)增的產(chǎn)物。當(dāng)一個(gè)或多個(gè)CpG未被甲基化時(shí)，沒有產(chǎn)物。因此，該方法不能區(qū)分部分甲基化水平和完全沒有甲基化[見美國(guó)專利號(hào)5,786,146；Herman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 939821-9826(1996)]。用于檢測(cè)指示21號(hào)染色體擴(kuò)增的甲基化的示例性引物在下面的實(shí)施例部分的實(shí)施例2中提供。
實(shí)時(shí)熒光MSP(MethyLight)-利用熒光探針結(jié)合MSP，使用實(shí)時(shí)PCR允許更高通量的均相反應(yīng)。如果探針不含有CpG，那么該反應(yīng)基本上是MSP的定量形式。然而，通常設(shè)計(jì)熒光探針以與含有一個(gè)或多個(gè)CpG的位點(diǎn)退火，且該第三種寡核苷酸增加用于完全甲基化靶鏈的測(cè)定法的特異性。因?yàn)閷?shí)時(shí)發(fā)生擴(kuò)增的檢測(cè)，所以不需要其次的電泳步驟。因?yàn)闆]有PCR，后樣品的操作，所以減少了污染的危險(xiǎn)。MethyLight探針可以是任意形式的，包括但不限于Taqman探針或者LightCycler雜交探針對(duì)，且如果使用多種報(bào)導(dǎo)染料，那么可以同時(shí)進(jìn)行幾個(gè)探針[Eads(1999)Cancer Res.592302-2306；Eads(2000)Nucleic Acids Res.28E32；Lo(1999)Cancer Res.593899-390]。通過MethyLight定量分析的優(yōu)點(diǎn)在前列腺癌中用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)甲基化進(jìn)行證明[Jeronimo(2001)J.Natl.Cancer Inst.931747-1752]。使用該方法，可能顯示良性前列腺增生樣品、前列腺intraexpithelial腫瘤區(qū)和局部前列腺腺癌中的甲基化。
亞硫酸氫鹽修飾的DNA的限制性分析-該定量技術(shù)也稱作COBRA(Xiong等人，1997，上述)，可以用于確定小量基因組DNA中特定基因座中的DNA甲基化水平。用限制酶消化揭示亞硫酸氫鈉處理的DNA的PCR產(chǎn)物中甲基化依賴性的序列差異。最初DNA樣品中甲基化水平由消化和未消化的PCR產(chǎn)物的相對(duì)量表示，所述甲基化水平在寬范圍的DNA甲基化水平間為線性定量形式。該技術(shù)可以可靠地應(yīng)用于從顯微解剖的石蠟包埋的組織樣品得到的DNA。從而COBRA組合了容易使用、定量準(zhǔn)確和與石蠟切片相容的有力特征。
差別甲基化雜交(DMH)-DMH整合了高密度、基于微陣列的篩選策略來檢測(cè)甲基化CpG二核苷酸基因組片段的存在或不存在[見，Schena等人，Science 270467-470(1995)]。當(dāng)要分析單個(gè)區(qū)中許多(例如，＞3個(gè))甲基化位點(diǎn)時(shí)，使用基于陣列的技術(shù)。首先，從基因組文庫(kù)產(chǎn)生CpG二核苷酸核酸片段，將其擴(kuò)增并附著在固相支持體上以產(chǎn)生富含CpG二核苷酸的篩選陣列。通過用限制性內(nèi)切核酸酶消化來自樣品的DNA產(chǎn)生擴(kuò)增子，所述限制性內(nèi)切核酸酶將DNA消化成片段但是保留甲基化的CpG島完整。這些擴(kuò)增子用于探測(cè)附著在篩選陣列上的富含CpG二核苷酸的片段以鑒定DNA樣品的富含CpG二核苷酸區(qū)中的甲基化模式。不同于局限于一次分析一種基因的其他甲基化分析方法，如DNA雜交，亞硫酸氫鹽DNA測(cè)序和甲基化特異性PCR，DMH利用多種富含CpG二核苷酸的基因組片段，它們經(jīng)特別設(shè)計(jì)成允許同時(shí)分析基因組中多種甲基化相關(guān)的基因(進(jìn)一步細(xì)節(jié)見美國(guó)專利號(hào)6,605,432)。
關(guān)于分析DNA甲基化的其他細(xì)節(jié)和額外方法(例如，質(zhì)譜分析法分析)見Tost J，Schatz P，Schuster M，Berlin K，GutIG.Analysisand accurate quantification of CpG methylation by MALDI massspectrometry.Nucleic Acids Res.2003May 1；31(9)e50；Novik KL，Nimmrich I，Genc B，Maier S，Piepenbrock C，Olek A，Beck S.Epigenomicsgenome-wide study of methylation phenomena.CurrIssues Mol Biol.2002Oct；4(4)111-28.綜述；Beck S，Olek A，WalterJ.From genomics to epigenomicsa loftier view of life.Nat Biotechnol.1999Dec；17(12)1144；Fan(2002)Oncology Reports 9181-183；http://www.methods-online.net/methods/DNAmethylation.html；Shi(2003)J.Cell Biochem.88(1)138-43；Adoryian(2002)Nucleic AcidsRes.30(5)e21。
將明白可以用許多通過商業(yè)途徑可獲得的試劑盒檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)。實(shí)例包括，但不限于，EZ DNA methylation kitTM(可從ZymoResearch，625W Katella Ave，Orange，CA92867，美國(guó)得到)。
通常，根據(jù)所選技術(shù)設(shè)計(jì)用于上述基于硫酸氫鹽的甲基化檢測(cè)方法的寡核苷酸。
如本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA)的單鏈或者雙鏈寡聚體或者多聚體或者其模擬物。該術(shù)語包括由天然存在的堿基、糖和共價(jià)核苷間鍵(例如，主鏈)組成的寡核苷酸以及具有功能類似于各自天然存在的部分的非天然存在的部分的寡核苷酸。(見，公開在美國(guó)專利號(hào)4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321，131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519，126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050)。
從而，例如，影響甲基化特異性PCR的特異性的最關(guān)鍵的參數(shù)由引物設(shè)計(jì)決定。因?yàn)閬喠蛩釟潲}對(duì)DNA的修飾破壞鏈互補(bǔ)性，所以每條鏈都可以作為隨后PCR擴(kuò)增的模板，并且可以確定每條鏈的甲基化模式。然而，將明白在實(shí)踐中優(yōu)選擴(kuò)增一條鏈(例如，有義鏈)。設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增長(zhǎng)為80-250bp的區(qū)域，其在最初鏈中整合足夠的胞嘧啶以確保未經(jīng)修飾的DNA不作為引物的模板。此外，CpG二核苷酸內(nèi)胞嘧啶的數(shù)目和位置決定了用于甲基化和未甲基化模板的引物的特異性。通常，在每種引物中包括1-3個(gè)CpG位點(diǎn)，其在每條引物的3’區(qū)集中。這提供了最佳特異性并使由于錯(cuò)誤引發(fā)導(dǎo)致的假陽性最小化。為了促供同時(shí)分析相同熱循環(huán)儀(thermocycler)中給定基因的每條引物，調(diào)節(jié)引物的長(zhǎng)度以得到幾乎相同的解鏈/退火溫度。
此外，因?yàn)镸SP利用特異引物識(shí)別來區(qū)分甲基化和未甲基化的等位基因，所以在擴(kuò)增期間保持嚴(yán)格退火條件?；旧?，選擇最大退火溫度以允許退火和隨后擴(kuò)增。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)引物的退火溫度低于計(jì)算的解鏈溫度5-8℃。進(jìn)一步細(xì)節(jié)見Herman和Baylin(1998)Methylation Specific PCR，in Current Protocols in Human Genetics。
根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)設(shè)計(jì)的寡核苷酸可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任意寡核苷酸合成方法如酶促合成或固相合成來產(chǎn)生。用于進(jìn)行固相合成的設(shè)備和試劑可以通過商業(yè)途徑從例如，Applied Biosystems得到?？梢允褂糜糜诖祟惡铣傻娜我馄渌椒?；寡核苷酸的實(shí)際合成是完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)的，并且可以通過成熟的方法，使用固相化學(xué)，例如，氰乙基亞磷酰胺然后脫保護(hù)，脫鹽和通過例如，自動(dòng)化的含三苯甲基的方法或者HPLC純化來完成，所述成熟方法在例如“Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”卷I-III Ausubel，R.M.，編者(1994)；Ausubel等人，“Current Protocols in MolecularBiology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley & Sons，NewYork(1988)和“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，編著(1984)中詳述。
本文上述方法可以用于檢測(cè)與基因座拷貝數(shù)改變相關(guān)的病理(上述)。
此類病理的實(shí)例包括但不限于三體性，包括第1對(duì)染色體三體性、第2對(duì)染色體三體性、第3對(duì)染色體三體性、第4對(duì)染色體三體性、第5對(duì)染色體三體性、第6對(duì)染色體三體性、第7對(duì)染色體三體性、第8對(duì)染色體三體性、第9對(duì)染色體三體性、第10對(duì)染色體三體性、第11對(duì)染色體三體性、第12對(duì)染色體三體性、第13對(duì)染色體三體性(Patau氏綜合征)、第14對(duì)染色體三體性、第15對(duì)染色體三體性、第16對(duì)染色體三體性、第17對(duì)染色體三體性、第18對(duì)染色體三體性(Edward氏綜合征)、第19對(duì)染色體三體性、第20對(duì)染色體三體性、第21對(duì)染色體三體性(唐氏綜合征)、第22對(duì)染色體三體性、三X染色體綜合征(Kleinfelter綜合征)、三Y染色體綜合征、6q染色體部分三體性、9p染色體三體性、11q染色體三體性、鑲嵌性第14對(duì)染色體三體性、鑲嵌性第22對(duì)染色體三體性；單體性，如第1對(duì)染色體單體性和X染色體單體性(Turner綜合征)；四體性，如18p染色體四體性；三倍性，如三倍體綜合征(關(guān)于罕見疾病見國(guó)際組織http://www.rarediseases.org/，且關(guān)于染色體鑲嵌性見http://www.medgen.ubc.ca/wrobinson/mosaic/contents.htm)；和癌癥，如慢性髓細(xì)胞性白血病。
為了鑒定受試者中基因座拷貝數(shù)的改變，從個(gè)體受試者(即哺乳動(dòng)物)得到DNA樣品并如上文描述進(jìn)行分析。根據(jù)本發(fā)明的該方面的優(yōu)選受試者為任何發(fā)育階段的人(例如，植入前胚胎受試者、胚胎受試者、胎兒受試者、新生兒受試者和出生后受試者)。
通常進(jìn)行出生后檢查以排除經(jīng)典的染色體綜合征和對(duì)如下個(gè)體進(jìn)行基因型分析，所述個(gè)體為具有多發(fā)性先天性異常(MCA)的個(gè)體、具有染色體異常的個(gè)體的親代或者同胞、具有平衡的或者結(jié)構(gòu)染色體異常的個(gè)體的孩子、具有兩次或更多次胎兒?jiǎn)适Р∈返姆驄D、具有不育問題的夫婦、具有不確定生殖器的個(gè)體、具有原發(fā)性經(jīng)閉的女性、具有智力遲鈍的個(gè)體和具有青春期失敗(pubertal failure)的男性和女性。
從個(gè)體受試者(即，新生兒和出生后)的生物樣品得到DNA。如本文所用的，短語生物樣品指從個(gè)體分離的組織或者流體的樣品，包括但不限于，例如，血漿、血清、脊髓液、淋巴液、尿、皮膚、呼吸道、腸道和生殖泌尿道的外部切片、淚液、唾液、奶、血細(xì)胞、腫瘤、器官和體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)成分的樣品。優(yōu)選使用組織活組織檢查、血液或者骨髓樣品。
優(yōu)選在肝素鈉或者EDTA-涂覆的管中收集血液。新生兒需要最少1-2ml血液，兒童或者成人需要最少3-5ml血液。對(duì)于白細(xì)胞分析，細(xì)胞必須超過10,000，其具有10％未成熟細(xì)胞。
在骨髓運(yùn)送培養(yǎng)基或者肝素鈉管中收集骨髓(0.5-2cc骨髓)。
在無菌生理鹽水或者無菌組織培養(yǎng)基中收集組織活組織檢查[3mm樣品，例如，胎盤、帶、皮膚(通常用于測(cè)試鑲嵌性的程度)]。
通常使用的是來自外周血的DNA。由于正常循環(huán)的淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)條件下不分裂，所以得到淋巴細(xì)胞并使其受到外部刺激因子(即，促分裂原)刺激以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂(即，有絲分裂)?？梢栽跍赜?5-96小時(shí)后的任何時(shí)間收獲刺激的細(xì)胞。
一旦得到樣品，就優(yōu)選例如通過使用可以從Qiagen(28159AvenueStanford Valencia CA 91355)得到的QIAamp血液試劑盒提取基因組DNA并如上述進(jìn)行分析。
因?yàn)槿旧w異常是流產(chǎn)和出生缺陷的主要原因，所以優(yōu)選使用上述方法鑒定未出生的嬰兒中的基因座擴(kuò)增?？梢允褂脕喠蛩釟潲}修飾檢測(cè)從母親血液得到的胎兒DNA的甲基化是成熟的方法，從而允許在產(chǎn)前篩選中使用本發(fā)明的外遺傳標(biāo)記[見Poon等人(2002)Clin.Chem.4835-41]。
從胚胎(即，從受孕到發(fā)育8周的正發(fā)育的嬰兒)或者胎兒(即，從發(fā)育的第9周到出生的正發(fā)育的嬰兒)細(xì)胞得到DNA的方法是本領(lǐng)域公知的。實(shí)例包括例如但不限于母體活組織檢查(例如，子宮頸取樣、羊膜腔穿刺術(shù)取樣、血液取樣)、胎兒活組織檢查(例如，肝臟活組織檢查)和絨膜絨毛取樣(見，背景部分和美國(guó)專利號(hào)6,331,395)。
優(yōu)選使用根據(jù)本發(fā)明的該方面從母體血液分離胎兒DNA，因?yàn)樗欠乔秩胄苑椒?，其不?duì)正在發(fā)育的嬰兒造成任何危險(xiǎn)[見Lo(1998)Am.J.Hum.Genet.62(4)768-75]。
可以從母體循環(huán)收集無細(xì)胞的胎兒DNA并如上述進(jìn)行分析[見Bauer(2002)Am.J.Obstet.Gynecol.186117-20；Bauer(2001)Ann.NY Acad.Sci.945161-3；Pertl(2001)Obstet.Gynecol.98483-90；Samura(2000)Hum.Genet.10645-9]。
備選地，可以使用抗體捕獲技術(shù)從母體血液富集胎兒細(xì)胞，所述技術(shù)中固定化抗體結(jié)合胎兒細(xì)胞并捕獲胎兒細(xì)胞以促進(jìn)它們的富集[Mueller等人，“Isolation of fetal trophoblasts cells from peripheralblood of pregnant women”，The Lancet 336197-200(1990)；Ganshirt-Ahlert等人，“Magnetic cell sorting and the transferringreceptor as potential means of prenatal diagnosis from maternalblood”Am.J.Obstet.Gynecol.1661350-1355(1992)]。
還可以用抗體和其他特異結(jié)合部分標(biāo)記胎兒細(xì)胞以促進(jìn)細(xì)胞分選方法，如流式細(xì)胞術(shù)[Herzenberg等人，“Fetal cells in the blood ofpregnant womenDetection and enrichment by fluorescence-activatedcell sorting”，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)761453-1455(1979)；Bianchi等人，“Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes inmaternal blood”Proc.Natl Acad.Sci.(USA)873279-3283(1990)；Bruch等人，“Trophoblast-Like cells sorted from peripheralmaternal blood using flow cytometrya multiparametric studyinvolving transmission electron microscopy and fetal DNAamplification”Prenatal Diagnosis 11787-798(1991).Price等人“Prenatal diagnosis with fetal cells isolated from maternal blood bymultiparameter flow cytometry”Am.J.Obstet.Gynecol 1651731-1737(1991)]。
PCR技術(shù)通常結(jié)合使用以便增加胎兒DNA的相對(duì)量并從而允許分析[Bianchi等人，“Isolation of fetal DNA from nucleatederythrocytes in maternal blood”，Proc.Natl Acad.Sci(USA)873279-3283(1990)；Adkinson等人，“Improved detection of fetal cellsfrom maternal blood with polymerase chain reaction”，Am.J.Obstet.Gynecol.170952-955(1994)；Takabayashi等人，“Development ofnon-invasive fetal DNA diagnosis from maternal blood”PrenatalDiagnosis 1574-77(1995)]。
在美國(guó)專利號(hào)6,331,395中公開了使用母體循環(huán)中胎兒細(xì)胞的產(chǎn)前診斷的特定構(gòu)造。
例如，可以從8-20周妊娠的孕婦得到血液(50ml)。通過在Ficoll-hypaque上離心分離單核細(xì)胞(MNC)級(jí)分，并將其在具有10％FCS的α培養(yǎng)基中以5·106個(gè)/ml培養(yǎng)7天，其中使用SCF 100ng/ml，IL-3 100ng/ml，和IL-6 100u/ml。然后回收未貼壁細(xì)胞并在α培養(yǎng)基中以3·105個(gè)/ml再次鋪平板，所述培養(yǎng)基含有30％FCS、1％BSA、10-4M β-巰基乙醇，和青霉素和鏈霉素，以及SCF 100ng/ml，IL-3100ng/ml，和IL-6 100mu/ml。所有溫育都在具有5％CO2，和室內(nèi)空氣或者5％氧氣的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中進(jìn)行。21天后，回收細(xì)胞。離心細(xì)胞并使用標(biāo)準(zhǔn)方法提取DNA，用于如上述的甲基化分析。
用于從母體血液富集胎兒細(xì)胞的試劑盒可以從AVIVA BiosciencesCorporation(San Diego，CA.，http://www.avivabio.com/Technology/fetal_cell_isolation.html)得到。
將明白還可以在胎兒死亡或者流產(chǎn)后得到胚胎或者胎兒DNA。在該情況中，使用酶解離的細(xì)胞或者組織碎片(外植塊)從胚胎或者胎兒組織開始培養(yǎng)。當(dāng)將該組織置于合適的培養(yǎng)條件中時(shí)，細(xì)胞貼壁到表面并以單層生長(zhǎng)。
使用本方法所得染色體信息可以用本領(lǐng)域公知的許多細(xì)胞學(xué)(例如，吉姆薩染色)和基于雜交的技術(shù)(例如，F(xiàn)ISH)進(jìn)一步驗(yàn)證(見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,906,919和5,580,724)。
用于確定如上述的基因座擴(kuò)增的試劑可以在包裝或者分配器裝置，如診斷試劑盒中提供。包裝可以例如包含金屬或者塑料箔，如泡罩包裝(blister pack)。包裝或者分配器裝置可以附帶有用于診斷的說明書。
將明白本發(fā)明還可以用于檢測(cè)與異常DNA甲基化機(jī)制相關(guān)的病理，所述機(jī)制導(dǎo)致如上述的異常甲基化。實(shí)例包括，但不限于Pradi-Willi、Angelman、Beckwith-Wiedemann、Rett和ICF綜合征。例如，ICF綜合征由稱作Dnmt3b的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的異常功能導(dǎo)致。類似地，識(shí)別和結(jié)合mC(稱作MeCP2)的蛋白質(zhì)之一的異常導(dǎo)致Rett綜合征，其是影響年輕女性的一種形式的智力遲鈍。
將還明白通過本發(fā)明也可以預(yù)期進(jìn)行性別確定(例如，產(chǎn)前)，因?yàn)榕訶染色體的額外拷貝上的基因受到DNA甲基化抑制[Goto(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(2)362-78]。
將還明白本發(fā)明使得可以鑒定與生命相容的(重要的)基因。
從而，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了鑒定“與生命相容的”基因的方法。
通過如上述確定所擴(kuò)增的染色體序列區(qū)中多種基因的甲基化狀態(tài)可以實(shí)現(xiàn)所述方法。
隨后，鑒定多種基因中顯示處于與預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)的基因，從而鑒定“與生命相容的”基因。
可以有效使用此類方法來注釋基因和鑒定新的治療靶。
當(dāng)考察下面的實(shí)施例后，本發(fā)明的額外目的、優(yōu)點(diǎn)和新特征將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，所述實(shí)施例不意在作為限制。此外，如上述和如權(quán)利要求書中要求保護(hù)的本發(fā)明的多種實(shí)施方案和方面的每一種將在下面的實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例現(xiàn)在參考下面的實(shí)施例，這些實(shí)施例與上面的描述一起以非限定的方式闡明本發(fā)明。
通常，用于此處的命名法和用于本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中詳細(xì)解釋。見，例如，“Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”卷I-IIIAusubel，R.M.，編著(1994)；Ausubel等人，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley& Sons，New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific Amcrican Books，New York；Birren等人(eds)“GenomeAnalysisA Laboratory Manual Series”，卷1-4，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；如美國(guó)專利號(hào)4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中陳述的方法；“CellBiologyA Laboratory Handbook”，卷I-III Cellis，J.E.，編著(1994)；“Current Protocols in Immunology”Volumes I-III ColiganJ.E.，編著(1994)；Stites等人(eds)，“Basic and Clinical Immunology”(第八版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(編著)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman andCo.，New York(1980)；可利用的免疫測(cè)定法在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中詳細(xì)描述，見，例如，美國(guó)專利號(hào)3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，編著(1984)；“Nucleic AcidHybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，編著(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，編著(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，編著(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A PracticalGuide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods inEnzymology”卷1-317，Academic Press；“PCR ProtocolsA Guide ToMethods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；將所有這些參考文獻(xiàn)完整引入本文作為參考。在該文件全文提供了其他一般參考文獻(xiàn)。認(rèn)為其中提供的方法是本領(lǐng)域公知的并且為了讀者的方便而提供。其中包含的所有信息都引入作為參考。
材料和實(shí)驗(yàn)步驟DNA提取-使用QIAamp Blood試劑盒(Qiagen，28159 AvenueStanford Valencia CA 91355)從血漿和羊水樣品提取DNA。每個(gè)柱子用800μl血漿或者羊水進(jìn)行DNA提取。用50-110μl洗脫緩沖液洗脫DNA。用Nucleon DNA提取試劑盒(Scotlabs Woburn，MA)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書從白細(xì)胞的棕黃層提取DNA。
DNA的亞硫酸氫鹽處理-將DNA(最多2μg)在50μl蒸餾水中稀釋并向其中加入5.5μl 2M NaOH。然后向反應(yīng)混合物中加入5μg鮭精DNA。
將溶液在50℃溫育10分鐘以從而產(chǎn)生單鏈DNA。向每管加入氫醌[30μl 10mM氫醌(Sigma)，通過向50ml水中加入55mg氫醌新鮮配制]。之后，向該溶液加入520μl新鮮配制的3M亞硫酸氫鈉[SigmaS-8890，通過向每5ml水加入1.88gm亞硫酸氫鈉并用NaOH調(diào)節(jié)pH到5.0制備]。采取措施以確保DNA溶液均勻混合。將DNA溶液用礦物油分層并允許其在50℃溫育16小時(shí)或者在70℃溫育1-2小時(shí)。防止更長(zhǎng)的溫育時(shí)間以避免甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化成胸苷。一旦溫育結(jié)束，除去油。向每管加入1ml DNA Wizard cleanup(Promega A7280)溶液并將溶液應(yīng)用于試劑盒中的小量制備柱。應(yīng)用真空并將柱子用2ml 80％異丙醇洗滌。通過加入50μl溫水(即80℃)將DNA洗脫到清潔、標(biāo)記的1.5ml管中。將管離心1分鐘并向每管加入5.5μl 3MNaOH。在室溫溫育磺化DNA溶液5分鐘。
加入作為載體的1μl糖原(Boehringer Ingelheim GmbH，德國(guó))，33μl 10M NH4Ac，和3體積乙醇。將DNA在-20℃沉淀至少1小時(shí)至過夜，并用70％乙醇洗滌。將干燥的沉淀重懸浮在20μl水中并在-20℃保存。
擴(kuò)增反應(yīng)-向含有1×GC緩沖液2(TaKaRa，Shuzo，Kyoto，日本)、2.5mM每種dNTP、5U TaKaRa LA Taqe(TaKaRa，Shuzo，Kyoto，日本)和50pmol反義引物的50μl PCR反應(yīng)混合物中加入磺化DNA溶液的1μl等分試樣。使反應(yīng)混合物在94℃的溫度溫育5分鐘。
預(yù)熱后，將亞硫酸氫鹽處理的DNA的有義序列的互補(bǔ)鏈如下延伸2輪94℃1分鐘、60℃3分鐘和72℃3分鐘。
之后，將50pmol有義引物加入并加熱混合物到94℃。
將DNA在擴(kuò)增8輪，每輪為94℃1分鐘、60℃1.5分鐘和72℃2分鐘。
通過30輪的94℃1分鐘、55℃1.5分鐘和72℃2分鐘實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)增。
通過限制酶分析或者直接測(cè)序檢測(cè)所得PCR產(chǎn)物中的甲基化。
通過限制酶檢測(cè)甲基化位點(diǎn)-如上述甲基胞嘧啶向胸腺嘧啶的化學(xué)修飾改變HpaII和HahI限制酶的位點(diǎn)，從而這些酶不能在它們的各自位點(diǎn)消化DNA。胞嘧啶甲基化不允許甲基化敏感酶在這些位點(diǎn)消化，而甲基化耐受性的其他酶，如MspI將產(chǎn)生常規(guī)限制模式。對(duì)硫酸氫鹽處理的DNA使用這種酶允許使用特異性限制酶區(qū)分甲基化位點(diǎn)(進(jìn)一步細(xì)節(jié)見下面的實(shí)施例3)。
用McrBC進(jìn)行甲基化-從New England Biolabs得到McrBC。將該酶加入到5μg基因組DNA中并根據(jù)生產(chǎn)商的說明在37℃過夜溫育反應(yīng)物。通過在65℃溫育20分鐘滅活該酶。將50μg所消化的DNA用作PCR反應(yīng)的模板。使用啟動(dòng)子特異性引物。通過瓊脂糖凝膠分離分析產(chǎn)物。
PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序-使用通過商業(yè)途徑可得到的試劑盒(例如，Geneclean等)純化所得PCR產(chǎn)物并通過商業(yè)途徑可得到的自動(dòng)化測(cè)序儀測(cè)序。
等位基因特異的寡核苷酸雜交-在該測(cè)定中，擴(kuò)增含有目的基因上所有候選甲基化位點(diǎn)的大片段。PCR產(chǎn)物含有通過熒光素或者其他熒光團(tuán)(Cy3，Cy5)標(biāo)記的一個(gè)核苷酸。標(biāo)記產(chǎn)物的第二種方法是通過放射性核苷酸(32P、33P、35S、3H或14C)，其整合入PCR產(chǎn)物。然后將PCR產(chǎn)物與用于甲基化胞嘧啶(即，胸腺嘧啶)對(duì)胞嘧啶的特異寡核苷酸雜交。與寡核苷酸的雜交可以使用微陣列方法在玻璃或者硝化纖維素上進(jìn)行。
用于檢測(cè)突變(或者SNP)的商業(yè)試劑盒-可以通過商業(yè)途徑可得到的“Gamidagene”公司的“Pronto”試劑盒進(jìn)行甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)。設(shè)計(jì)這些試劑盒用于與特異性探針結(jié)合檢測(cè)突變和/或單核苷酸多態(tài)性(SNP)，所述探針經(jīng)設(shè)計(jì)和構(gòu)造成識(shí)別目的甲基化位點(diǎn)。類似地，也可以使用可以識(shí)別核苷酸序列中突變的其他方法。例如，擴(kuò)增失效突變系統(tǒng)-ARMS。在該方法中，使用兩種補(bǔ)充反應(yīng)，一種含有對(duì)正常等位基因特異的引物，另一種含有突變等位基因(兩種都具有公共的第二種引物)。因?yàn)镻CR引物與變體DNA完美匹配，所以鑒定完美匹配的等位基因基因型分析的優(yōu)先擴(kuò)增。如上面描述的，通過該方法可以檢測(cè)通過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶的甲基胞嘧啶。
實(shí)施例121號(hào)染色體的基因下面的表2列出了由Gardiner和Davisson Genome Biology20001(2)綜述0002.1-0002.9注釋的21號(hào)染色體的122種基因的給定功能。其大多數(shù)具有完整或者大概完整的cDNA序列?；谥苯訉?shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)或者基于從與其他蛋白質(zhì)的相似性的推斷給定功能注釋。具有僅部分結(jié)構(gòu)信息的基因注釋是基于其中的特定功能結(jié)構(gòu)域的，并且通過(*)指出(Gardiner K.http://genomebiology.com/2000/1/2/reviews/0002.1)。
選擇的功能類別將是概括地描述性的，每種基因僅在一種類別中出現(xiàn)。
表2
實(shí)施例2第21對(duì)染色體三體性的基因和可用于檢測(cè)其甲基化狀態(tài)的引物背景原纖維淀粉狀蛋白作為神經(jīng)原纖維纏結(jié)在神經(jīng)元內(nèi)的沉積、作為斑塊在細(xì)胞外以及在血管中的沉積是阿爾茨海默氏病(AD)和老年唐氏綜合征患者的特征。在這些沉積物中發(fā)現(xiàn)的主要蛋白質(zhì)是小的、不溶性和高度聚集的多肽a4，認(rèn)為其來自它的前體-淀粉狀蛋白前體的異常分解代謝，所述前體定位于21號(hào)染色體(21q21.2)。
實(shí)驗(yàn)步驟為了檢測(cè)APP(GenBank檢索號(hào)X127522)的擴(kuò)增，通過亞硫酸氫鹽測(cè)序確定APP啟動(dòng)子區(qū)的甲基化。
表3
下面表4列出了優(yōu)選的PCR條件。
表4
對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以鑒定胞嘧啶向胸苷的替代。從APP啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(使用引物APP-F和APP-R，圖1b)在圖1a中顯示。
備選地，所得PCR產(chǎn)物可以與寡核苷酸微陣列雜交。
下面的表5和6列出了一些寡核苷酸結(jié)構(gòu)，其可以用于鑒定用亞硫酸氫鹽處理DNA后，人21號(hào)染色體上甲基化的DNA部分，如上述。
表5-淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)(APP)基因(GenBank檢索號(hào)X127522)21號(hào)染色體
表6-H2-鈣調(diào)理蛋白基因(GenBank檢索號(hào)gi4758017)，21號(hào)染色體[Kuromitsu J，等人Mol Cell Biol.(1997)17(2)707-12]
實(shí)施例3X染色體三體性的基因和可用于檢測(cè)其甲基化狀態(tài)的引物在女性中，重復(fù)X染色體的多數(shù)基因的一組被沉默。通常通過此類基因的啟動(dòng)子的CpG甲基化發(fā)生沉默。幾種甲基化分析方法用于檢測(cè)男性、女性和Kleinfelter綜合征影響的受試者中雄激素受體(GenBank檢索號(hào)NM_00044)的甲基化狀態(tài)。
實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞-從Coriell Institute NJ得到男性、女性和Kleinfelter綜合征影響的胚胎的培養(yǎng)12天的羊水細(xì)胞。Kleinflter細(xì)胞目錄號(hào)GMO3102。正常細(xì)胞目錄號(hào)。
DNA提取-將細(xì)胞以2500rpm離心10分鐘。將細(xì)胞沉淀重懸浮在包括75mM NaCl和25mM EDTA的裂解緩沖液中并充分渦旋以分裂質(zhì)膜。之后，向混合物中加入10％SDS溶液(1/10終體積)并通過倒轉(zhuǎn)混合溶液。在蛋白酶K(10mg/ml，1/10終體積)存在下在55℃過夜溫育溶液。向溶液加入等體積酚∶氯仿(1∶1)，通過倒轉(zhuǎn)充分混合(5分鐘)并以14,000xg離心15分鐘以達(dá)到相分離。向上層相中加入氯仿，通過倒轉(zhuǎn)5分鐘充分混合溶液，以14,000xg離心5分鐘以達(dá)到相分離，收集上面的相，向其中加入3M乙酸鈉(1/10終體積)并通過倒轉(zhuǎn)充分混合。用乙醇(70％)過夜沉淀DNA并之后測(cè)定其濃度和純度。
基于限制酶的分析用HpaII(30單位，NEB Enzyme，New England Biolabs.Inc.Beverly MA 01915-5599美國(guó))消化0.5μg DNA分子(即，亞硫酸氫鹽處理的或者未處理的)。為了確保完全消化，允許溫育過夜進(jìn)行，包括溫育8小時(shí)后再次加入新鮮酶。
消化后，將來自消化混合物的2μl DNA用作PCR的模板，該P(yáng)CR使用下面表7中列出的引物并且在下面表8-9中描述的條件下進(jìn)行。
表7
*-PCR產(chǎn)物的大小取決于從患者回收的DNA中CAG重復(fù)序列數(shù)。
表8
*NEB酶-Taq DNA聚合酶目錄號(hào)M0267；New England Biolabs.Inc.Beverly MA 01915-5599美國(guó)表9
將所得約300bp的PCR產(chǎn)物在2.5％瓊脂糖凝膠上分離和顯現(xiàn)。
甲基化特異性PCR(MSP)如上文實(shí)驗(yàn)步驟中描述的用亞硫酸氫鹽處理DNA。
引物和PCR條件分別在表10、11和12中列出。
表10
表11
*緩沖液DS 10X-166mM硫酸銨，670mM Trizma；67mM氯化鎂；100mM巰基乙醇；1％DMSO；硫酸銨-Sigma A 4418；Trizma-SigmaT 5753；DMSO-Trizma D 8414；MgCl2-Sigma M-1028；巰基乙醇-Sigma M 3148。
表12
通過兩步嵌套PCR反應(yīng)證實(shí)產(chǎn)物同一性，其引物在下面的表13中列出，PCR條件在下面的表14-16中列出。第一次PCR的DNA模板用于亞硫酸氫鹽修飾(～50ng)。將PCR產(chǎn)物用作第二次PCR反應(yīng)的模板(1/20終體積)。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
表13
*PCR產(chǎn)物的大小與從患者所得DNA中CAG重復(fù)序列數(shù)線性相關(guān)。
表14-步驟I
*NEB酶在下面的表15和16中列出了用于從亞硫酸氫鹽修飾的DNA擴(kuò)增雄激素受體的外顯子1的PCR條件。
表15
表16-步驟II
*NEB酶將步驟II的PCR產(chǎn)物在2.5％瓊脂糖凝膠上分離并用通過商業(yè)途徑可獲得的試劑盒(Amersham Bioscience Piscataway Bioscience NJ08855-美國(guó)的GFX PCR目錄號(hào)27-9602-01)純化，然后亞克隆到pGEM質(zhì)粒(pGEM-T Easy Vector Vector System I目錄號(hào)A1360或者pGEM-T Vector Vector System I目錄號(hào)A3600 Promega CorporationMadison WI美國(guó))。通過對(duì)每種PCR產(chǎn)物的5-10個(gè)克隆測(cè)序進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)序。以ABI測(cè)序儀實(shí)現(xiàn)測(cè)序。
結(jié)果在圖2a中給出了雄激素受體的外顯子1的天然序列以及HapII和HhaI限制位點(diǎn)。亞硫酸氫鹽修飾后得到的推定序列在圖2b中顯示。
圖3和4描繪了如通過基于限制酶的分析和通過甲基化特異性PCR(MSP)確定的，男性、女性和Kleinfelter綜合征影響的受試者中雄激素受體甲基化狀態(tài)的結(jié)果。
如圖3中所示，從XY(即，男性)受試者得到的用HpaII處理的DNA樣品的PCR擴(kuò)增沒有得到產(chǎn)物。然而，使用從XX和XXY受試者得到的HpaII處理的DNA樣品的相同反應(yīng)產(chǎn)生清晰的280bp帶，其是雄激素受體外顯子1的產(chǎn)物exon1。
對(duì)男性和Kleinfelter綜合征影響的受試者的雄激素受體的外顯子1的甲基化狀態(tài)的MSP分析表明使用甲基化引物的DNA擴(kuò)增僅在Kleinfelter影響的受試者(即，46XXY)的DNA中發(fā)生。
這些結(jié)果一起顯然支持DNA甲基化介導(dǎo)Kleinfelter綜合征影響的受試者中雄激素受體的基因沉默并且提示它是該病理的有價(jià)值的診斷工具。
將明白因?yàn)镸SP不有效檢測(cè)部分甲基化(即，不是給定等位基因中的所有甲基化位點(diǎn)都實(shí)際上被甲基化)，所以使用寡核苷酸微陣列將是有利的。
可以有效用于此類微陣列中的寡核苷酸在下面的表17中列出。
表17
實(shí)施例4根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)鑒定的第21對(duì)染色體常染色體三體性的推定標(biāo)記如上所述，位于擴(kuò)增的染色體或染色體區(qū)的基因通?？赡苡捎谏嫌螁?dòng)子區(qū)域的甲基化而不超表達(dá)，所述甲基化導(dǎo)致特異性沉默。
下面的表18顯示了在來自唐氏綜合征影響的受試者的羊水細(xì)胞相對(duì)于從正常受試者得到的羊水細(xì)胞中21號(hào)染色體基因表達(dá)的比率。X＜1.5的比率表明基因沉默(www.hgu.mrc.ac.uk/Research/Cellgen/Supplements/Unigene/t21all.htm)。
表18
根據(jù)上面的表18，顯然在三體性狀態(tài)中21號(hào)染色體的基因的表達(dá)存在變化；一些基因高度超表達(dá)(即，比率X＝1.5；例如，PDXK)，而其他基因表達(dá)不足(即，比率X＜1；例如，DSCAM)。該變化的原因可以是甲基化的CpG位點(diǎn)數(shù)。從而，例如，1.2的比率提示過量等位基因中不是所有CpG位點(diǎn)都被甲基化，而那些仍被甲基化的位點(diǎn)防止了1.5倍超表達(dá)(即，三個(gè)等位基因的最大超表達(dá))。
實(shí)施例5在第21對(duì)染色體三體性中21號(hào)染色體的DSCAM和IFNAR1基因被部分甲基化實(shí)施例5aDSCAM
選擇唐氏綜合征細(xì)胞粘著分子(DSCAM)基因(GenBank檢索號(hào)AF217525)以顯示第21對(duì)染色體三體性中部分沉默的基因的甲基化模式(即，X＜1.5)。
假設(shè)DSCAM外顯子1上游的CpG島的甲基化可以抑制DS患者中該基因的超表達(dá)。在圖4a中給出了DSCAM啟動(dòng)子的天然序列。亞硫酸氫鹽處理后所得推定的序列在圖4b中顯示。
實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞-從Coriell Instiute NJ.得到來自健康和DS影響的胚胎的培養(yǎng)12天的羊水細(xì)胞。DS細(xì)胞目錄號(hào)GMO2067。正常細(xì)胞目錄號(hào)。
DNA提取-見上面的實(shí)施例3。
DSCAM甲基化的基于測(cè)序的分析-下面的表19-21列出了用于從來自健康受試者和唐氏綜合征影響的受試者的組織和細(xì)胞擴(kuò)增DSCAM的引物和PCR條件。
使用下面表19中列出的引物和上面表14中描述的反應(yīng)混合物試劑和濃度進(jìn)行PCR反應(yīng)。
表19
表20-步驟1
*使用引物DSCAM-nes-f1-bis和DSCAM-r1-bis在緩沖液B-DS中實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。
將所得PCR產(chǎn)物為142bp。
將PCR產(chǎn)物用作第二次PCR反應(yīng)的模板(1/20終體積)。
表21-步驟2
使用引物DSCAM-f1-bis和DSCAM-r1-bis在緩沖液NEB中實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。
所得PCR產(chǎn)物為135bp。將PCR反應(yīng)混合物加樣到3％瓊脂糖凝膠上并如上面實(shí)施例3中描述的純化135bp產(chǎn)物。通過測(cè)序證實(shí)產(chǎn)物的序列同一性也如上述進(jìn)行。
結(jié)果來自DS胚胎的羊水細(xì)胞中DSCAM甲基化狀態(tài)的序列分析表明兩種情況中25％的克隆顯示出CpG位點(diǎn)上的甲基化。這些結(jié)果表明DSCAM的僅部分甲基化，提示優(yōu)選使用寡核苷酸微陣列用于檢測(cè)DSCAM甲基化。適于檢測(cè)DSCAM甲基化的寡核苷酸在下面的表22中列出。
表22
實(shí)施例5bIFNAR1從上面的表18，顯然在第21對(duì)染色體三體性中，干擾素(α、β和ω)受體1(IFNAR1，GenBank檢索號(hào)AU137565)被部分沉默。如實(shí)施例5a中描述的檢查了細(xì)胞和組織中IFNAR1的甲基化模式。在圖5a中給出IFNAR1啟動(dòng)子的天然序列。在圖5b中顯示了亞硫酸氫鹽處理后得到的推定序列。
實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞-見上面。
DNA提取-見上面的實(shí)施例3。
DSCAM甲基化的基于測(cè)序的分析-下面的表23-25列出了用于從來自健康受試者和唐氏綜合征影響的受試者的組織和細(xì)胞擴(kuò)增IFNAR1的引物和PCR條件。
使用下面表23中列出的引物和上面表14中描述的反應(yīng)混合物試劑和濃度實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)。
表23
表24-步驟1
使用引物IFNR-f4-bis和IFNR-r4-bis在緩沖液B-DS中實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。
所得PCR產(chǎn)物為231bp。
將PCR產(chǎn)物用作第二次PCR反應(yīng)的模板(1/20終體積)。
表25-步驟2
使用引物IFNR-nes-f-bis和IFNR-r4-bis在緩沖液NEB中實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。
所得PCR產(chǎn)物為186bp。
將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2.5％瓊脂糖凝膠上分離并如上面實(shí)施例3中描述的純化186bp產(chǎn)物。通過如上文描述的測(cè)序證實(shí)產(chǎn)物的序列同一性。
結(jié)果看到DS樣品中IFNAR1等位基因的甲基化。
根據(jù)上面的描述，可以設(shè)想DSCAM和IFNAR1甲基化狀態(tài)可以作為第21對(duì)染色體三體性的有價(jià)值的診斷標(biāo)記。這些結(jié)果還表明在第21對(duì)染色體三體性中沒有上調(diào)的其他基因也可以作為染色體擴(kuò)增的標(biāo)記。
實(shí)施例6第13對(duì)染色體常染色體三體性的推定的標(biāo)記下面的表26顯示了從第13對(duì)染色體三體性基因型的受試者得到的羊水細(xì)胞相對(duì)于從正常受試者得到的羊水細(xì)胞中13號(hào)染色體基因表達(dá)的比率(www.hgu.mrc.ac.uk/Research/Cellgen/Supplements/Unigene/t13all.htm.)。有趣地，與第21對(duì)染色體三體性(其中多數(shù)基因被沉默(RNA為不穩(wěn)定狀態(tài)水平))相反，該基因表達(dá)譜不在13號(hào)染色體中發(fā)生，從而解釋了21號(hào)染色體擴(kuò)增的活力。
表26
實(shí)施例7第9對(duì)染色體三體性的基因和可以用于檢測(cè)其甲基化狀態(tài)的引物第9對(duì)染色體三體性是罕見的染色體疾病。特征性特征包括胎兒生長(zhǎng)延緩、出生時(shí)存在心臟缺陷、面部異常(例如，低位和/或畸形耳)、異常的小頭、腎和/或生殖器異常、骨骼異常(例如，固定和/或脫位的關(guān)節(jié))，和/或腦的畸形。
9號(hào)染色體上p16在細(xì)胞周期和許多病理(包括黑素瘤、膀胱癌和肺癌)中起重要作用。腫瘤抑制基因p16的表達(dá)在多種癌癥中受到阻遏，所述癌癥包括膀胱癌、結(jié)腸癌和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。已經(jīng)表明p16啟動(dòng)子中CpG島的甲基化負(fù)責(zé)某些情況中該基因的失活[Sharpless(2003)Oncogene.22(20)3092-8；Virmani(2003)Methods Mol Biol.2003；22297-115]。
將CpG WIZp16 Amplification Kit(Chemicon International，Inc.)用于通過甲基化特異性PCR(MSP)確定p16啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。該試劑盒含有靶定啟動(dòng)子區(qū)的引物，所述區(qū)中的序列在亞硫酸氫鹽處理后最趨異。已經(jīng)鑒定了PCR參數(shù)，從而使得試劑盒中的所有引物組都在相同條件下擴(kuò)增。還包括p16的對(duì)照基因組DNA樣品(甲基化的和未甲基化的)。
實(shí)驗(yàn)步驟使用CpGenome DNA Modification Kit(Intergen，New York，NY)進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦用亞硫酸氫鈉處理1μgDNA。轉(zhuǎn)化后，將亞硫酸氫鹽處理的DNA以25μl的總體積重懸浮。
下面的表27概述了用于檢測(cè)上述基因的甲基化狀態(tài)的方法。
表27
將理解本發(fā)明的某些特征為了清楚而在分開的實(shí)施方案的上下文中描述，但是所述特征也可以與單個(gè)實(shí)施方案組合提供。相反地，為了簡(jiǎn)明而在單個(gè)實(shí)施方案的上下文中描述的本發(fā)明的多種特征也可以分開或者以任意適宜的亞組合提供。
盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是顯然許多備選方案、修改和變形對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，意在包括所附權(quán)利要求的精神和寬范圍內(nèi)的所有此類備選方案、修改和變形。該說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖送暾氡菊f明書中作為參考，就像每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利和專利申請(qǐng)具體地且分別指出引入本文作為參考一樣。此外，不應(yīng)將本申請(qǐng)中對(duì)任何參考文獻(xiàn)的引用或者鑒別理解為承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)可以作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)得到。
序列表<110>Trisogen Biotechnology Limited Partnership<120>用于檢測(cè)基因座拷貝數(shù)改變的方法和試劑盒<130>
<160>249<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>1tggttttaga tttttttttt tattg<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>2acctaccact accaaaaaaa ctaac<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸
<400>3tattttttgg tgtta<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>4tatttttcgg tgtta<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>單鏈DNA寡核苷酸
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>40atatttgcgt tttgg<210>41<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>42tgtgtttcgg gttaa<210>43<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>43ggtgtggtgt gtgga
<210>44<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>44ggtgtggcgt gtgga<210>45<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>45tgtggcgtgt ggagt<210>46<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>單鏈DNA寡核苷酸
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>171gtgagttggg cgagtgaagt tg<210>172<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>172gtgagttggg tgagtgaagt cg<210>173<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>173gtgagttggg cgagtgaagt cg<210>174<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>174gtgagtcggg tgagtgaagt cg<210>175<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>175gcgagttggg tgagtgaagt cg
<210>176<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>176gtgagtcggg cgagtgaagt tg<210>177<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>177gcgagttggg cgagtgaagt tg<210>178<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>178gcgagtcggg cgagtgaagt cg<210>179<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸
<400>179gcgagtcggg tgagtgaagt tg<210>180<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>180gcgagtcggg cgagtgaagt tg<210>181<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>181gcgagtcggg tgagtgaagt cg<210>182<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>182gcgagttggg cgagtgaagt cg<210>183<211>22<212>DNA<213>人工序列
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>185cgagtgaagt tgagtgctgg ag<210>186<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>單鏈DNA寡核苷酸
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>199cgagtgaagt cgagcgcgga g<210>200<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>200tgaagttgag tgtggaggtg a<210>201<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸
<400>201tgaagtcgag tgctggaggt ga<210>202<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>202tgaagttgag cgtggaggtg a<210>203<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>203tgaagttgag tgtggaggcg a<210>204<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>204tgaagttgag tgcggaggcg a<210>205<211>21<212>DNA<213>人工序列
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>208tgaagtcgag tgcggaggtg a
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>210tgaagtcgag cgcggaggtg a<210>211<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>211tgaagtcgag cgtggaggcg a<210>212<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸
<400>212tgaagtcgag tgcggaggcg a<210>213<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>213tgaagttgag cgcggaggcg a<210>214<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>214tgaagtcgag cgcggaggcg a<210>215<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>215aagttgagtg tggaggtgag t<210>216<211>22<212>DNA<213>人工序列
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>216aagtcgagtg ctggaggtga gt<210>217<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>217aagt tgagcg tggaggtgag t<210>218<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>218aagttgagtg tggaggcgag t<210>219<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>219aagttgagtg cggaggcgag t
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>220aagttgagcg tggaggcgag t<210>221<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>221aagtcgagtg tggaggcgag t<210>222<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>222aagttgagcg cggaggtgag t<210>223<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸
<400>223aagtcgagtg cggaggtgag t<210>224<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>224aagtcgagcg tggaggtgag t<210>225<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>225aagtcgagcg cggaggtgag t<210>226<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>226aagtcgagcg tggaggcgag t<210>227<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>227aagtcgagtg cggaggcgag t<210>228<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>228aagttgagcg cggaggcgag t<210>229<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>229aagtcgagcg cggaggcgag t<210>230<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>230agtgtggagg tgagtaggga t
<210>231<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>231gtgcggaggt gagtagggat<210>232<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>232gcgtggaggt gagtagggat<210>233<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>233gtgtggaggc gagtagggat<210>234<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸
<400>234gtgcggaggc gagtagggat<210>235<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>235gcgtggaggc gagtagggat<210>236<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>236gcgcggaggt gagtagggat<210>237<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>237gcgcggaggc gagtagggat<210>238<211>21<212>DNA<213>人工序列
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>238tgtttttggt tgttggggtg t<210>239<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>239tgtttttggt cgttggggtg t<210>240<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>240tgtttttggt tgttggggcg t<210>241<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>241tgtttttggt cgttggggcg t
<210>242<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>242gttgttgggg tgttttgtag t<210>243<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>243gtcgttgggg tgttttgtag t<210>244<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>244gttgttgggg cgttttgtag t<210>245<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸
<400>245gtcgttgggg cgttttgtag t<210>246<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>246tttttgtttg tgagtcgggt g<210>247<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>247ttttagtttt atttggtttt taggt<210>248<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>248aaaaaacctt aaccttcaca aaatc<210>249<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>249attgtttaag attttagggt tagta
權(quán)利要求
1.鑒定基因座拷貝數(shù)的改變的方法，所述方法包括確定所述基因座中至少一種基因的甲基化狀態(tài)，其中與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明所述基因座拷貝數(shù)的改變。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述基因座拷貝數(shù)的改變由選自非整倍性和多倍性的染色體畸變引起。
3.權(quán)利要求1的方法，其中通過(i)限制酶消化甲基化檢測(cè)；(ii)基于硫酸氫鹽的甲基化檢測(cè)；(iii)質(zhì)譜分析法分析；(iv)序列分析；和/或(v)微陣列分析實(shí)現(xiàn)所述確定所述至少一種基因的甲基化狀態(tài)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述基因座位于選自1號(hào)染色體、2號(hào)染色體、3號(hào)染色體、4號(hào)染色體、5號(hào)染色體、6號(hào)染色體、7號(hào)染色體、8號(hào)染色體、9號(hào)染色體、10號(hào)染色體、11號(hào)染色體、12號(hào)染色體、13號(hào)染色體、14號(hào)染色體、15號(hào)染色體、16號(hào)染色體、17號(hào)染色體、18號(hào)染色體、19號(hào)染色體、20號(hào)染色體、21號(hào)染色體、22號(hào)染色體、X染色體和Y染色體的染色體上。
5.鑒定受試者中基因座拷貝數(shù)的改變的方法，所述方法包括(a)得到受試者的染色體DNA；和(b)確定所述染色體DNA的基因座上的至少一種基因的甲基化狀態(tài)，其中與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明所述基因座拷貝數(shù)的改變，從而鑒定所述受試者中基因座拷貝數(shù)的改變。
6.權(quán)利要求5的方法，其中通過(i)限制酶消化甲基化檢測(cè)；和(ii)基于硫酸氫鹽的甲基化檢測(cè)；(iii)序列分析；和/或(iv)微陣列分析實(shí)現(xiàn)所述確定所述至少一種基因的甲基化狀態(tài)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述基因座位于選自1號(hào)染色體、2號(hào)染色體、3號(hào)染色體、4號(hào)染色體、5號(hào)染色體、6號(hào)染色體、7號(hào)染色體、8號(hào)染色體、9號(hào)染色體、10號(hào)染色體、11號(hào)染色體、12號(hào)染色體、13號(hào)染色體、14號(hào)染色體、15號(hào)染色體、16號(hào)染色體、17號(hào)染色體、18號(hào)染色體、19號(hào)染色體、20號(hào)染色體、21號(hào)染色體、22號(hào)染色體、X染色體和Y染色體的染色體上。
8.產(chǎn)前鑒定基因座拷貝數(shù)改變的方法，該方法包括(a)得到胎兒或者胚胎的包括所述基因座的染色體DNA；和(b)確定所述胎兒或者胚胎的包括所述基因座的染色體DNA中至少一種基因的甲基化狀態(tài)，其中與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明所述基因座拷貝數(shù)的改變，從而產(chǎn)前鑒定所述基因座拷貝數(shù)的改變。
9.權(quán)利要求8的方法，其中通過(i)羊膜腔穿刺術(shù)；(ii)胎兒活組織檢查；(iii)絨膜絨毛取樣；和/或(iv)母體活組織檢查實(shí)現(xiàn)得到所述胎兒或者胚胎染色體DNA。
10.權(quán)利要求8的方法，其中通過(i)限制酶消化甲基化檢測(cè)；和(ii)基于硫酸氫鹽的甲基化檢測(cè)；(iii)質(zhì)譜分析法分析；(iv)序列分析；和/或(v)微陣列分析實(shí)現(xiàn)所述確定所述至少一種基因的甲基化狀態(tài)。
11.產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的方法，該方法包括(a)得到胎兒或者胚胎21號(hào)染色體；和(b)確定所述胎兒或者胚胎21號(hào)染色體中至少一種基因的甲基化狀態(tài)，其中選擇的所述至少一種基因不在唐氏綜合征中擴(kuò)增，而與預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的所述甲基化狀態(tài)表明所述胎兒或者胚胎21號(hào)染色體的擴(kuò)增，從而產(chǎn)前診斷唐氏綜合征。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種基因選自APP和胱硫醚-β-合酶。
13.權(quán)利要求11的方法，其中通過(i)羊膜腔穿刺術(shù)；(ii)胎兒活組織檢查；(iii)絨膜絨毛取樣；和/或(iv)母體活組織檢查實(shí)現(xiàn)得到所述胎兒或者胚胎21號(hào)染色體。
14.權(quán)利要求11的方法，其中通過(i)限制酶消化甲基化檢測(cè)；和(ii)基于硫酸氫鹽的甲基化檢測(cè)；(iii)質(zhì)譜分析法分析；(iv)序列分析；和/或(v)微陣列分析實(shí)現(xiàn)所述確定所述至少一種基因的甲基化狀態(tài)。
15.鑒定“與生命相容的”基因的方法，所述方法包括(a)確定所擴(kuò)增的染色體序列區(qū)中多種基因的甲基化狀態(tài)；和(b)鑒定所述多種基因中顯示出與預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)的基因，從而鑒定“與生命相容的”基因。
16.權(quán)利要求15的方法，其中通過(i)限制酶消化甲基化檢測(cè)；和(ii)基于硫酸氫鹽的甲基化檢測(cè)；(iii)質(zhì)譜分析法分析；(iv)序列分析；和/或(v)微陣列分析實(shí)現(xiàn)所述確定所述至少一種基因的甲基化狀態(tài)。
17.鑒定“與生命相容的”基因的方法，所述方法包括(a)確定所擴(kuò)增的染色體序列區(qū)中多種基因的表達(dá)水平；和(b)鑒定所述多種基因中顯示出低于預(yù)定閾值的表達(dá)水平的基因，從而鑒定“與生命相容的”基因。
18.權(quán)利要求17的方法，其中在mRNA水平上實(shí)現(xiàn)所述確定所述多種基因的表達(dá)水平。
19.權(quán)利要求17的方法，其中在蛋白質(zhì)水平上實(shí)現(xiàn)所述確定所述多種基因的表達(dá)水平。
20.制成品，其包含包裝材料和所述包裝材料中含有的用于檢測(cè)基因座拷貝數(shù)改變的試劑，其中所述試劑能夠確定所述基因座中至少一種基因的甲基化狀態(tài)，而與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明所述基因座拷貝數(shù)的所述改變。
21.權(quán)利要求20的制成品，其中所述基因座拷貝數(shù)的所述改變由選自非整倍性和多倍性的染色體畸變引起。
22.用于鑒定基因座拷貝數(shù)改變的試劑盒，所述試劑盒包含用于確定所述基因座中至少一種基因的甲基化狀態(tài)的試劑，所述至少一種基因選自APP和胱硫醚-β-合酶，其中與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明所述基因座拷貝數(shù)的改變。
23.權(quán)利要求22的試劑盒，其中所述基因座拷貝數(shù)的改變由選自非整倍性和多倍性的染色體畸變引起。
全文摘要
提供了鑒定基因座拷貝數(shù)改變的方法。通過測(cè)定該基因座中至少一種基因的甲基化狀態(tài)實(shí)現(xiàn)該方法，其中與所述至少一種基因的預(yù)定甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)表明所述基因座拷貝數(shù)的改變。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1882700SQ200480033877
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月22日
發(fā)明者D·哈勒 申請(qǐng)人:特萊索根生物科技有限合伙公司