專利名稱：生產(chǎn)二肽的微生物和使用該微生物制造二肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)二肽的微生物和使用該微生物制造二肽的方法。
背景技術(shù)：
二肽是食品、醫(yī)藥品、化妝品等中的重要化合物。
作為二肽的制造方法已知有從天然物提取的方法、化學(xué)合成法、酶法。從天然物提取的方法除了可生產(chǎn)的二肽的種類有局限外，天然物中含有的目的二肽的含量低，產(chǎn)率差。在通過(guò)化學(xué)合成法的二肽合成中，需要官能基的保護(hù)和脫保護(hù)等操作，另外由于也合成消旋體，所以化學(xué)合成法不能說(shuō)是一個(gè)經(jīng)濟(jì)的、高效的方法。另外，由于化學(xué)合成法使用大量的有機(jī)溶劑等，在環(huán)境衛(wèi)生上也不是一個(gè)理想的方法。
有關(guān)利用酶法的二肽合成，已知有利用蛋白質(zhì)分解酶(蛋白水解酶)的逆反應(yīng)的方法[J.Biol.Chem.，119，707-720(1937)]、利用耐熱性氨酰t-RNA合成酶的方法(特開(kāi)昭58-146539號(hào)公報(bào)、特開(kāi)昭58-209991號(hào)公報(bào)、特開(kāi)昭58-209992號(hào)公報(bào)、特開(kāi)昭59-106298號(hào)公報(bào))、利用非核糖體肽合成酶(以下稱為NRPS)的方法[Chem.Biol.，7，373-384(2000)、FEBS Lett.，498，42-45(2001)、美國(guó)專利第5795738號(hào)、美國(guó)專利第5652116號(hào)]、利用D-Ala-D-Ala連接酶的方法[Biochemistry，35，10464-10471(1996)]、利用桿菌溶素合成酶的方法[J.Ind.Microbiol.，2，201-208(1987)、Enzyme.Microbial.Technol.，29，400-406(2001)]、利用L-氨基酸酰胺水解酶或脯氨酸亞氨基肽酶的方法(國(guó)際公開(kāi)第WO 03/010307號(hào)小冊(cè)子)。
然而，在利用蛋白水解酶的逆反應(yīng)的方法中，需要對(duì)作為底物的氨基酸的官能基進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù)，存在著難于使肽形成反應(yīng)的效率提高和阻止肽分解反應(yīng)的問(wèn)題。在利用耐熱性氨酰t-RNA合成酶的方法中存在著酶的表達(dá)困難、難于阻止副生物的生成反應(yīng)的問(wèn)題。
另一方面，利用NRPS、D-Ala-D-Ala連接酶和桿菌溶素合成酶的方法不存在上述那樣的問(wèn)題，雖然是可以制造特定序列的二肽的方法，但由于是需要ATP等能量供給源的反應(yīng)，所以并不是一個(gè)效率高的方法。
在利用L-氨基酸酰胺水解酶或脯氨酸亞氨基肽酶的方法中，主要記載了生產(chǎn)該酶的微生物的培養(yǎng)物、從該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、使用該微生物菌體的處理物制造二肽，但利用該制造方法的二肽的產(chǎn)量并不充分。
活細(xì)胞進(jìn)行著將不需要的蛋白質(zhì)直至分解到組成氨基酸，將生成的氨基酸用于必要的蛋白質(zhì)合成的代謝。該功能由于對(duì)細(xì)胞的存活、增殖是必需的，所以生物中存在著多種蛋白酶和肽酶。
例如，已知大腸桿菌(Escherichiacoli)中除了至少存在的7種二肽酶之外，也存在著被其它蛋白酶和肽酶分解的二肽[FEMSMicrobial.Rev.，63，265-276(1989)]。另外，在谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomyces serevisiae)的染色體DNA上被鑒定為肽酶基因的基因分別存在著25個(gè)以上、14個(gè)以上、20個(gè)以上。
但是，還不清楚通過(guò)向生產(chǎn)二肽的微生物導(dǎo)入肽酶的缺失，以使二肽產(chǎn)量上升。
而已經(jīng)知道在活細(xì)胞中備有多個(gè)肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
例如，有報(bào)道稱在大腸桿菌中存在著3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)二肽的系統(tǒng)[Chem.Biol.，5，489-504(1998)、Microbiol.，145，2891-2901(1999)]。由基因組DNA情報(bào)也可以確認(rèn)在屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬和酵母屬的微生物中，無(wú)論那一種微生物都存在著3種或更多的肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
然而，還不清楚細(xì)胞內(nèi)合成的二肽是否排出細(xì)胞外，另外也不知道通過(guò)在生產(chǎn)二肽的微生物中導(dǎo)入?yún)⑴c肽轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)的缺失，二肽產(chǎn)量是否上升。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供生產(chǎn)二肽的微生物和使用該微生物的二肽制造方法。
本發(fā)明涉及到以下(1)～(21)內(nèi)容。
(1)微生物，該微生物為1種以上肽酶和1種以上的具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)(peptide-transporting)活性的蛋白質(zhì)(以下也稱為肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì))的活性降低或喪失，且具有生產(chǎn)二肽能力的微生物。
(2)微生物，該微生物為3種以上肽酶的活性降低或喪失，且具有生產(chǎn)二肽能力的微生物。
(3)上述(1)或(2)的微生物，其中肽酶是具有序列編號(hào)1～4中任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或具有與序列編號(hào)1～4中任一個(gè)所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，且具有肽酶活性的蛋白質(zhì)。
(4)上述(1)或(3)的微生物，其中肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是具有序列編號(hào)5～9中任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或與序列編號(hào)5～9中任一個(gè)所示的氨基酸序列有80％以上同源性，且具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)。
(5)上述(1)～(4)中的任一個(gè)微生物，其中具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是具有生產(chǎn)以下[1]～[4]任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)能力的微生物[1]具有序列編號(hào)19～25和68中任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)[2]由在序列編號(hào)19～25和68中任一個(gè)所示的氨基酸序列中缺失、置換或附加了1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)；[3]由與序列編號(hào)19～25和68中任一個(gè)序列表示的氨基酸序列有65％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)； 具有與序列編號(hào)33所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，且具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)。
(6)上述(1)～(4)中的任一個(gè)微生物，其中具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是具有以下[1]～[4]任一項(xiàng)所述的DNA的微生物[1]編碼上述(5)的[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的DNA；[2]具有序列編號(hào)26～32、64和65中任一個(gè)表示的堿基序列的DNA；[3]與具有序列編號(hào)26～32、64和65中任一個(gè)表示的堿基序列的DNA在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜交，同時(shí)編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA；[4]具有與序列編號(hào)34表示的堿基序列有80％以上同源性的堿基序列，同時(shí)編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA。
(7)上述(1)～(6)中的任一個(gè)微生物，其中具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是含有上述(6)的[1]～[4]任一項(xiàng)所述的DNA與載體DNA連接的重組體DNA的微生物。
(8)上述(1)～(7)中的任一個(gè)微生物，其中微生物是屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或酵母屬的微生物。
(9)上述(1)～(4)中的任一個(gè)微生物，其中具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物。
(10)上述(9)的微生物，其中具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物是生產(chǎn)脯氨酸亞氨基肽酶的微生物。
(11)上述(9)或(10)的微生物，其中具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽能力的微生物是含有編碼具有脯氨酸亞氨基肽酶活性的蛋白質(zhì)的DNA與載體DNA連接的重組體DNA的微生物。
(12)上述(9)～(11)中的任一個(gè)微生物，其中微生物是屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或酵母屬的微生物。
(13)上述(1)～(4)中的任一個(gè)微生物，其中具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物。
(14)上述(13)的微生物，其中具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物是生產(chǎn)具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)的微生物。
(15)上述(13)的微生物，其中具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物是含有連接了編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)的DNA和載體DNA的重組體DNA的微生物。
(16)上述(13)～(15)中的任一個(gè)微生物，其中微生物是屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或酵母屬的微生物。
(17)二肽的制造方法，該方法使用上述(1)～(8)中的任一個(gè)微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源、1種以上氨基酸存在于水性介質(zhì)中，使二肽在該水性介質(zhì)中生成、蓄積，從該介質(zhì)回收該二肽。
(18)上述(17)的制造方法，其中二肽是用下式(I)表示的二肽，R1-R2(I)(式中、R1和R2表示相同的或不同的氨基酸)。
(19)使用上述(9)～(12)中的任一個(gè)微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源、L-氨基酸酯和L-氨基酸存在于水性介質(zhì)中，使二肽在該水性介質(zhì)中生成、蓄積，從該介質(zhì)回收該二肽。
(20)二肽的制造方法，該方法使用上述(13)～(16)中的任一個(gè)微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源、L-氨基酸酰胺和L-氨基酸存在于水性介質(zhì)中，使二肽在該水性介質(zhì)中生成、蓄積，由該介質(zhì)回收該二肽。
(21)上述(17)～(20)中的任一個(gè)制造方法，其特征是培養(yǎng)物的處理物是培養(yǎng)物的濃縮物、培養(yǎng)物的干燥物、對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離得到的菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械磨碎處理物、該菌體的溶劑處理物、該菌體的酶處理物、或該菌體的固定化物。
以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
1.本發(fā)明的微生物本發(fā)明的微生物是1種以上的肽酶和1種以上具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)(以下略稱為肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì))的活性降低或喪失，且具有生產(chǎn)二肽能力的微生物、或3種以上的肽酶的活性降低或喪失，且具有生產(chǎn)二肽能力的微生物。
作為1種以上的肽酶和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物，只要是在該微生物能夠正常繁殖范圍內(nèi)，可舉任意的1種以上肽酶和任意1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物，優(yōu)選1種以上9種以下更優(yōu)選1種以上7種以下進(jìn)一步優(yōu)選1種以上4種以下的肽酶的活性降低或喪失，而且優(yōu)選1種以上5種以下更優(yōu)選1種以上3種以下進(jìn)一步優(yōu)選1種以上2種以下特別優(yōu)選1種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物。
作為該微生物，更具體來(lái)講，可例舉在存在于該微生物基因組DNA上的編碼肽酶的基因(以下略稱為肽酶基因)和編碼肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的基因(以下肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因)中的1種以上的肽酶基因堿基序列和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因堿基序列中，由于缺失該堿基序列的全部或一部，或由于在該堿基序列中存在置換或添加堿基，該肽酶和該肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物。
所謂肽酶的活性降低指的是與上述的沒(méi)有缺失、置換或添加堿基的肽酶相比，肽分解活性降低了。
微生物的肽分解活性通過(guò)使作為底物的肽和微生物菌體共存于水性介質(zhì)中，進(jìn)行肽分解反應(yīng)后，對(duì)殘存的肽量通過(guò)使用眾所周知的方法、例如使用HPLC等分析法進(jìn)行定量來(lái)測(cè)定。
作為上述肽酶，只要是具有肽分解活性的蛋白質(zhì)就可以，優(yōu)選二肽分解活性高的蛋白質(zhì)、更優(yōu)選二肽酶。
作為更具體的肽酶，例如存在于大腸桿菌的具有序列1所示的氨基酸序列的PepA、具有序列2所示的氨基酸序列的PepB、具有序列3所示的氨基酸序列的PepD、具有序列4所示的氨基酸序列的PepN、PepP[GenBank登錄號(hào)(以下略稱為GenBank)AAC75946]、PepQ(GenBank AAC76850)、PepE(GenBank AAC76991)、PepT(GenBankAAC74211)、Dcp(GenBank AAC74611)和IadA(GenBank AAC77284)等存在于枯草芽孢桿菌的AmpS(GenBank AF012285)、PepT(GenBankX99339)、YbaC(GenBank Z99104)、YcdD(GenBank Z99105)、YjbG(GenBank Z99110)、YkvY(GenBank Z99111)、YqjE(GenBank Z99116)、YwaD(GenBank Z99123)等存在于谷氨酸棒桿菌的具有BAB97732、BAB97858、BAB98080、BAB98880、BAB98892、BAB99013、BAB99598和BAB99819(都來(lái)自日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄編號(hào))所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)等，存在于釀酒酵母的OCT1(GenBank NC_001143)、SPC2(GenBank NC_003143)、SPY2[Saccharomyces基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.yeastgenome.org/)登錄號(hào)L0002875]和YIM1(GenBank NC_001145)等，作為二肽酶，可例舉具有序列1～4所示的氨基酸序列的PepA、PepB、PepD和PepN、以及PepQ、PepE、IadA。另外，作為二肽分解活性高的蛋白質(zhì)，可例舉具有與序列1～4中任一個(gè)氨基酸序列有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上同源性，且具有肽酶活性的蛋白質(zhì)。
氨基酸序列和堿基序列的同源性可以使用Karlin and Altschul的算法BLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)]和FASTA[Methods Enzymol.，183，63(1990)]來(lái)決定。根據(jù)該算法BLAST，已開(kāi)發(fā)出稱之為BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。根據(jù)BLAST，通過(guò)BLASTN解析堿基序列時(shí)，參數(shù)設(shè)定為例如Score＝100、wordlength＝12。還有，根據(jù)BLAST，通過(guò)BLASTX解析氨基酸序列時(shí)，參數(shù)設(shè)定為例如score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，使用各程序系統(tǒng)設(shè)定參數(shù)。對(duì)這些解析方法的具體手法眾所周知(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
而所謂肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低指的是與上述的沒(méi)有進(jìn)行堿基的缺失、置換或插入的DNA編碼的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)相比，肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性變低了。
微生物的肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性可以使作為底物的肽與微生物菌體在水性介質(zhì)中共存，進(jìn)行肽轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)后，通過(guò)眾所周知的方法、例如使用HPLC等的分析法對(duì)殘存在水性介質(zhì)中的肽量進(jìn)行定量來(lái)測(cè)定。
作為上述肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，是染色體DNA上形成操縱子的基因編碼的蛋白質(zhì)、在細(xì)胞膜上形成復(fù)合物后表達(dá)二肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)和作為單獨(dú)的蛋白質(zhì)具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)等，只要是參與微生物的肽轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)都可以，優(yōu)選肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性高的蛋白質(zhì)。
作為更具體的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，例如可例舉存在于大腸桿菌的具有序列編號(hào)5所示的氨基酸序列的DppA、具有序列編號(hào)6所示的氨基酸序列的DppB、具有序列編號(hào)7所示的氨基酸序列的DppC、具有序列編號(hào)8所示的氨基酸序列的DppD、具有序列編號(hào)9所示的氨基酸序列的DppF、OppA(GenBank AAC76569)、OppB(GenBank AAC76568)、OppC(GenBank AAC76567)、OppD(GenBank AAC76566)、OppF(GenBankAAC76565)、YddO(GenBank AAC74556)、YddP(GenBank AAC74557)、YddQ(GenBank AAC74558)、YddR(GenBank AAC74559)、YddS(GenBankAAC74560)、YbiK(GenBank AAC73915)、MppA(GenBank AAC74411)、SapA(GenBank AAC74376)、SapB(GenBank AAC74375)、SapC(GenBankAAC74374)、SapD(GenBank AAC74373)、和SapF(GenBank AAC74372)等，存在于枯草芽孢桿菌的DppA(GenBank CAA40002)、DppB(GenBankCAA40003)、DppC(GenBank CAA40004)、DppD(GenBank CAA40005)、DppE(GenBank CAA40006)、OppA(GenBank CAA39787)、OppB(GenBankCAA39788)、OppC(GenBank CAA39789)、OppD(GenBank CAA39790)、OppF(GenBank CAA39791)、AppA(GenBank CAA62358)、AppB(GenBankCAA62359)、AppC(GenBank CAA62360)、AppD(GenBank CAA62356)、AppF(GenBank CAA62357)、YclF(GenBank CAB12175)和YkfD(GenBankCAB13157)等，存在于谷氨酸棒桿菌的BAB99048、BAB99383、BAB99384、BAB99385、BAB99713、BAB99714、BAB99715、BAB99830、BAB99831、BAB99832(都是日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄編號(hào))所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)等，存在于釀酒酵母的OPT1(GenBank NP_012323)、OPT2(GenBankNP_015520)和PTR2(GenBank CAA82172)等，另外，作為肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性高的蛋白質(zhì)，可例舉具有序列編號(hào)5～9所示的氨基酸序列的DppA、DppB、DppC、DppD、DppF和與它們中任一個(gè)氨基酸序列有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上同源性的蛋白質(zhì)。
氨基酸序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序測(cè)定。
作為3種以上的肽酶活性降低或喪失的微生物，只要是該微生物能夠正常生長(zhǎng)，可例舉任意的3種以上肽酶活性降低或喪失的微生物，優(yōu)選3種以上9種以下更優(yōu)選3種以上6種以下特別優(yōu)選3種或4種的肽酶活性降低或喪失的微生物。
作為具體的肽酶，可例舉存在于上述的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌和釀酒酵母的肽酶和二肽酶。另外，作為二肽分解活性高的蛋白質(zhì)，可舉由與序列編號(hào)1～4中任一個(gè)氨基酸序列有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有肽酶活性的蛋白質(zhì)。
氨基酸序列的同源性可以用上述的BLAST或FASTA等程序測(cè)定。
作為具有生產(chǎn)二肽能力的微生物，只要是具有生產(chǎn)二肽能力的微生物，沒(méi)有特別限定，例如可例舉生產(chǎn)具有通過(guò)將1種以上氨基酸縮合、連接合成二肽的活性的蛋白質(zhì)的微生物、生產(chǎn)具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸合成二肽的活性的蛋白質(zhì)的微生物、生產(chǎn)具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸合成二肽的活性的蛋白質(zhì)的微生物等。
作為生產(chǎn)具有通過(guò)將1種以上氨基酸縮合、連接合成二肽的活性的蛋白質(zhì)的微生物，可例舉生產(chǎn)選自NRPS、D-Ala-D-Ala連接酶、桿菌溶素合成酶的蛋白質(zhì)的微生物。
作為生產(chǎn)NRPS的微生物，如以芽孢桿菌屬為首的原核生物、以青霉屬為首的真核生物、生產(chǎn)BacA、BacB和BacC(GenBank AF007865)的微生物、生產(chǎn)TycA、TycB和TycC(GenBank AF004835)的微生物、生產(chǎn)PcbAB(GenBank M57425)的微生物、和生產(chǎn)具有與BacA、BacB、BacC、TycA、TycB、TycC、PcbAB中任一個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上同源性，且具有NRPS活性的蛋白質(zhì)的微生物等。
作為生產(chǎn)D-Ala-D-Ala連接酶的微生物，如形成肽聚糖的原核微生物、生產(chǎn)DdlA(GenBank登錄號(hào)M58467)的微生物、生產(chǎn)DdlB(GenBank登錄號(hào)AE000118)的微生物、生產(chǎn)DdlC(GenBank登錄號(hào)D88151)的微生物和生產(chǎn)由在DdlA、DdlB、DdlC中任一個(gè)的氨基酸序列中缺失、置換或附加1以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，且具有D-Ala-D-Ala連接酶活性的蛋白質(zhì)的微生物等。
氨基酸序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序測(cè)定。
作為生產(chǎn)桿菌溶素合成酶的微生物，如屬于芽孢桿菌屬的微生物、優(yōu)選枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)和生產(chǎn)以下[1]～[4]中蛋白質(zhì)的微生物[1]具有序列編號(hào)19～25和68任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、[2]由在序列編號(hào)19～25和68任一個(gè)所示的氨基酸序列缺失、置換或附加了1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，而且具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)、[3]由與序列編號(hào)19～25和68任一個(gè)所示的氨基酸序列有65％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，而且具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)，或[4]具有與序列編號(hào)33所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，而且具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)。
作為生產(chǎn)具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸合成二肽的活性的蛋白質(zhì)的微生物，如生產(chǎn)脯氨酸亞氨基肽酶的微生物，具體來(lái)說(shuō)，如屬于芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或假單胞菌屬的微生物等。具體來(lái)說(shuō)，如枯草芽孢桿菌ATCC6633、凝結(jié)芽孢桿菌EK01[J.Bacteriol.，174，7919(1992)]、谷氨酸棒桿菌ATCC13286、惡臭假單胞菌AJ-2402(FERM BP-8101)、惡臭假單胞菌ATCC12633、惡臭假單胞菌AJ2048(FERM BP-8123)(以上為WO 03/010307所述的微生物)等。另外、煙草節(jié)桿菌[FEMS Microbiol.Lett.，78，191(1999)]、大腸桿菌(特開(kāi)平2-113887)、腦膜濃毒性金黃桿菌[Arch.Biochem.Biophys.，336，35(1996)]、哈夫尼腸桿菌[J.Biochem.，119，468(1996)]、德氏乳細(xì)菌[Microbiology，140，527(1994)]、凝結(jié)芽孢桿菌[J.Bacteriol.，174，7919(1994)]、溫和氣單胞菌[J.Biochem.，116，818(1994)]、野油菜桿菌(特開(kāi)平9-121860)、淋病奈瑟氏菌[Mol.Microbiol.，9，1203(1993)]、費(fèi)氏丙酸桿菌[Appl.Environ.Microbiol.，64，4736(1998)]、粘質(zhì)塞氏桿菌[J.Biochem.，122，601(1997)]、變異棒桿菌[J.Appl.Microbiol.，90，449(2001)]、嗜酸熱原體[FEBS Lett.，398，101(1996)]、綠膿桿菌[Nature，406，959(2000)]等作為生產(chǎn)脯氨酸亞氨基肽酶的微生物。
另外，作為生產(chǎn)脯氨酸亞氨基肽酶的微生物，如具有生產(chǎn)以下[1]～[3]中蛋白質(zhì)能力的微生物[1]WO 03/010307、FEMS Microbiol.Lett.，78，191(1999)、特開(kāi)平2-113887、Arch.Biochem.Biophys.，336，35(1996)、J.Biochem.，119，468(1996)、Microbiology，140，527(1994)、J.Bacteriol.，174，7919(1994)、J.Biochem.，116，818(1994)、特開(kāi)平9-121860、Mol.Microbiol.，9，1203(1993)、Appl.Environ.Microbiol.，64，4736(1998)、J.Biochem.，122，601(1997)、FEBS Lett.，398，101(1996)、Nature，406，959(2000)任一項(xiàng)所述的脯氨酸亞氨基肽酶、[2]由在上述[1]中任一個(gè)脯氨酸亞氨基肽酶的氨基酸序列中，缺失、置換或附加了1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、而且具有脯氨酸亞氨基肽酶活性的蛋白質(zhì)、[3]由與上述[1]中任一個(gè)脯氨酸亞氨基肽酶的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成、而且具有脯氨酸亞氨基肽酶活性的蛋白質(zhì)。
作為生產(chǎn)具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸合成二肽的活性的蛋白質(zhì)的微生物，如生產(chǎn)L-氨基酸酰胺水解酶的微生物，具體來(lái)說(shuō)，如屬于芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、歐文氏菌屬、紅球菌屬、金黃桿菌屬、微球菌屬、假單胞菌屬、隱球菌屬、Trichosporon屬、Rhodosporidium屬、Sporobolomyces屬、Tremella屬、Torulaspora屬、Sterigmatomyces屬、或Rhodotolura屬的微生物、優(yōu)選屬于芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或假單胞菌屬的微生物、更優(yōu)選巨大芽孢桿菌AJ3284(FERM BP-8090)、谷氨酸棒桿菌ATCC13286、藤黃微球菌ATCC9341、嗜糖假單胞菌ATCCl5946(以上為WO 03/010187所述的微生物)等。
而作為生產(chǎn)具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)的微生物，如具有生產(chǎn)以下[1]或[2]所述蛋白質(zhì)能力的微生物[1]由在WO 03/010187所述L-氨基酸酰胺水解酶的氨基酸序列中缺失、置換或附加了1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，而且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)[2]由與WO 03/010187所述的L-氨基酸酰胺水解酶的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，而且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)。
在上述中，由缺失、置換或附加1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列組成，具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)可通過(guò)使用Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)(以下略稱為Molecular Cloning第2版)、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997)(以下略稱為Current Protocols in MolecularBiology)、Nucleic Acids Research，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、NucleicAcids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等所述的特定部位的突變導(dǎo)入法，例如，在編碼由序列19～25和68所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)、具有脯氨酸亞氨基肽酶活性的蛋白質(zhì)和具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)中任一個(gè)蛋白質(zhì)的DNA導(dǎo)入特定部位的突變獲得。
缺失、置換或附加的氨基酸的數(shù)目沒(méi)有特別限定，可以是通過(guò)上述的特定部位的突變法等眾所周知的方法能夠缺失、置換或附加程度的數(shù)，如1個(gè)至數(shù)十個(gè)、優(yōu)選1～20個(gè)、更優(yōu)選1～10個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1～5個(gè)。
所謂在序列編號(hào)19～25和68所示的氨基酸序列、具有脯氨酸亞氨基肽酶活性的蛋白質(zhì)和具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的任一個(gè)序列中缺失、置換或附加1個(gè)以上氨基酸是指可以在同一序列中任意位置缺失、置換或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸。
缺失、置換或附加即使同時(shí)發(fā)生也可以，置換或附加的氨基酸不管天然型，還是非天然型都可以。作為天然型氨基酸，如L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸等。
以下給出了可相互置換的氨基酸的例子。同一組中含有的氨基酸可相互置換。
A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、0-甲基絲氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C組天冬酰胺、谷氨酰胺D組賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸F組絲氨酸、蘇氨酸、同型絲氨酸G組苯丙氨酸、酪氨酸另外，導(dǎo)入缺失、置換或附加上述的1個(gè)以上氨基酸的位置只要是具有導(dǎo)入該突變的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有二肽合成活性的，沒(méi)有特別限定，例如可例舉與序列編號(hào)19～25和68所示的氨基酸序列比較時(shí)，在該氨基酸序列中的1個(gè)以上氨基酸序列中沒(méi)有保存的氨基酸殘基。
而作為由缺失、置換或附加了上述的1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)，且具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)，如與序列編號(hào)19～25和68任一個(gè)所示的氨基酸序列的同源性通常具有65％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、特別優(yōu)選95％以上同源性的蛋白質(zhì)、與脯氨酸亞氨基肽酶的氨基酸序列或L-氨基酸酰胺水解酶的氨基酸序列任一個(gè)的氨基酸序列的同源性通常具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上同源性的蛋白質(zhì)。
氨基酸序列和堿基序列的同源性使用上述的BLAST或FASTA等程序測(cè)定。
序列編號(hào)33所示的氨基酸序列是保存在具有序列19～25所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)中間的區(qū)域，而且是對(duì)應(yīng)于各種微生物的具有Ala-Ala連接酶活性的蛋白質(zhì)的公有序列的區(qū)域。
生產(chǎn)作為與序列編號(hào)33所示的氨基酸序列有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，而且具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的微生物也是生產(chǎn)二肽的微生物。
具有與序列編號(hào)33所示的氨基酸序列有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)為了作為具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與序列編號(hào)19～25表示的任一個(gè)氨基酸序列的同源性至少具有80％以上、通常具有90％以上、特別是具有95％以上的同源性更好。
氨基酸序列的同源性使用上述的BLAST和FASTA等程序測(cè)定。
另外，含有編碼具有通過(guò)將一種以上氨基酸縮合、連接合成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA、編碼具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸合成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA、或編碼具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸合成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA與載體DNA連接后得到的重組體DNA的微生物也都是本發(fā)明的微生物。
作為該微生物，如屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或酵母屬的微生物。
作為編碼具有通過(guò)將一種以上氨基酸縮合、連接合成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA，如編碼NRPS、D-Ala-D-Ala連接酶或桿菌溶素合成酶的DNA等。
作為編碼NRPS的DNA，如編碼BacA、BacB、BacC、TycA、TycB、TycC和PcbAB中的任一種蛋白質(zhì)的DNA。
作為編碼D-Ala-D-Ala連接酶的DNA，如編碼DdlA、DdlB和DdlC中的任一種蛋白質(zhì)的DNA。
作為編碼桿菌溶素合成酶的DNA，如編碼以下[1]～[4]所述的蛋白質(zhì)的DNA，[1]具有序列編號(hào)19～25和68中任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、[2]由在序列編號(hào)19～25和68中任一個(gè)所示的氨基酸序列中缺失、置換或附加了1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，而且具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)、[3]由與序列編號(hào)19～25和68中任一個(gè)所示的氨基酸序列有65％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)、[4]具有與序列編號(hào)33所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，且具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)、和以下[5]～[7]所述的DNA，[5]具有序列編號(hào)26～32、64和65任一個(gè)表示的堿基序列的DNA、[6]與具有序列編號(hào)26～32、64和65任一個(gè)表示的堿基序列的DNA在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜交，而且編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA、[7]具有與序列編號(hào)34表示的堿基序列有80％以上同源性的堿基序列的DNA，而且編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA。
作為編碼具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸合成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA，如編碼以下[1]～[3]所述的蛋白質(zhì)的DNA，[1]WO 03/010307、FEMS Microbiol.Lett.，78，191(1999)、特開(kāi)平2-113887、Arch.Biochem.Biophys.，336，35(1996)、J.Biochem.，119，468(1996)、Microbiology，140，527(1994)、J.Bacteriol.，174，7919(1994)、J.Biochem.，116，818(1994)、特開(kāi)平9-121860、Mol.Microbiol.，9，1203(1993)、Appl.Environ.Microbiol.，64，4736(1998)、J.Biochem.，122，601(1997)、FEBSLett.，398，101(1996)、Nature，406，959(2000)任一項(xiàng)所述的脯氨酸亞氨基肽酶、[2]由在上述[1]中任一個(gè)脯氨酸亞氨基肽酶的氨基酸序列中，缺失、置換或附加了1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有脯氨酸亞氨基肽酶活性的蛋白質(zhì)、[3]由與上述[1]任一個(gè)脯氨酸亞氨基肽酶的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有脯氨酸亞氨基肽酶活性的蛋白質(zhì)、和以下[4]或[5]所述的DNA，[4]具有WO 03/010307、FEMS Microbiol.Lett.，78，191(1999)、特開(kāi)平2-113887、Arch.Biochem.Biophys.，336，35(1996)、J.Biochem.，119，468(1996)、Microbiology，140，527(1994)、J.Bacteriol.，174，7919(1994)、J.Biochem.，116，818(1994)、特開(kāi)平9-121860、Mol.Microbiol.，9，1203(1993)、Appl.Environ.Microbiol.，64，4736(1998)、J.Biochem.，122，601(1997)、FEBSLett.，398，101(1996)、Nature，406，959(2000)任一項(xiàng)所述的堿基序列的編碼脯氨酸亞氨基肽酶的DNA，[5]與編碼上述[4]任一個(gè)脯氨酸亞氨基肽酶的DNA在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有脯氨酸亞氨基肽酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
作為編碼具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸合成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA，如編碼以下[1]或[2]所述蛋白質(zhì)的DNA、[1]由在WO 03/010187所述的L-氨基酸酰胺水解酶的氨基酸序列中缺失、置換或附加了1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)、[2]由與WO 03/010187所述的L-氨基酸酰胺水解酶的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)、和以下[3]或[4]所述的DNA，[3]具有WO 03/010187所述的堿基序列的編碼L-氨基酸酰胺水解酶的DNA、[4]與由WO 03/010187所述的堿基序列構(gòu)成的編碼L-氨基酸酰胺水解酶的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交，且編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
上述所謂的在嚴(yán)格的條件下可雜交的DNA指的是以上述任一個(gè)DNA的一部分、或全部作為探針，通過(guò)使用菌落雜交法、噬斑雜交法或Southern blot雜交法等得到的DNA，具體來(lái)說(shuō)，使用固定了來(lái)自菌落或噬斑的DNA的濾膜，在0.7～1.0mol/l、優(yōu)選在0.9mol/l氯化鈉存在下、于65℃進(jìn)行雜交后、使用0.1～2倍濃度、優(yōu)選0.1倍濃度的SSC溶液(1倍濃度的SSC溶液組成是由150mmol/l的氯化鈉和15mmol/l的檸檬酸鈉構(gòu)成)，于65℃條件下將濾膜洗凈能夠鑒定的DNA。雜交可以根據(jù)分子克隆第2版、Current Protocols inMolecular Biology、DNA Cloning 1Core Techniques，A PracticalApproach，Second Edition，Oxford University(1995)等所述的方法進(jìn)行。作為可雜交的DNA，具體來(lái)說(shuō)如使用上述的BLAST和FASTA等程序，根據(jù)上述參數(shù)計(jì)算時(shí)，與上述的任一個(gè)DNA的堿基序列至少具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上同源性的DNA。
在嚴(yán)格的條件下與上述的DNA進(jìn)行雜交的DNA作為編碼具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)的DNA可以通過(guò)制作表達(dá)該DNA的重組DNA，用將該重組DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞后得到的微生物作為酶源，1)使該酶源和1種以上氨基酸存在于水性介質(zhì)中，通過(guò)HPLC等分析在該水性介質(zhì)中是否有二肽生成、蓄積的方法、2)使該酶源、L-氨基酸酯和L-氨基酸存在于水性介質(zhì)中，通過(guò)HPLC等分析在該水性介質(zhì)中是否有二肽生成、蓄積的方法、3)使該酶源、L-氨基酸酰胺和L-氨基酸存在于水性介質(zhì)中，通過(guò)HPLC等分析在該水性介質(zhì)中是否有二肽生成、蓄積的方法確認(rèn)。
堿基序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序測(cè)定。
2.本發(fā)明微生物的制造方法本發(fā)明的微生物可以通過(guò)1)對(duì)1種以上的肽酶和1種以上具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)的功能降低或喪失的微生物、或3種以上肽酶的功能降低或喪失的微生物賦予二肽生產(chǎn)能力的方法，或2)使具有生產(chǎn)二肽能力的微生物的a)1種以上肽酶和1種以上肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、或b)3種以上肽酶的功能降低或喪失的方法中任一種方法獲得。
(1)對(duì)1種以上肽酶和1種以上肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的功能降低或喪失的微生物、或3種以上的肽酶的功能降低或喪失的微生物賦予二肽生產(chǎn)能力的方法(i)制造肽酶、肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物肽酶、肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物只要是可獲得該微生物的方法，對(duì)其獲得方法沒(méi)有限制，例如，可以通過(guò)在以下所示的微生物染色體DNA的肽酶基因或肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因?qū)雺A基缺失、置換或附加的方法獲得。
作為向微生物的染色體DNA基因?qū)雺A基缺失、置換或附加的方法，如利用同源重組的方法。作為一般的利用同源重組的方法，如使用將導(dǎo)入了堿基缺失、置換或附加的變異基因與含有在希望導(dǎo)入堿基缺失等的宿主細(xì)胞內(nèi)不能自我復(fù)制的抗藥性基因的質(zhì)粒DNA連接制作的同源重組用質(zhì)粒的方法。
將該同源重組用質(zhì)粒通過(guò)常用方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，以抗藥性作為指標(biāo)，選擇通過(guò)同源重組在染色體DNA上轉(zhuǎn)運(yùn)了該同源重組用質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株。將得到的轉(zhuǎn)化株在不含有該藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)～1日培養(yǎng)后，涂布于含有該藥物瓊脂培養(yǎng)基和不含有該藥物的瓊脂培養(yǎng)基上，通過(guò)選擇在前者培養(yǎng)基中不繁殖，而在后者培養(yǎng)基中可以繁殖的菌株，可以獲得在染色體DNA上出現(xiàn)第2次同源重組的菌株。通過(guò)對(duì)染色體DNA上導(dǎo)入了缺失等的基因存在的區(qū)域的堿基序列進(jìn)行決定，能夠確認(rèn)染色體DNA上的目的基因?qū)雺A基的缺失、置換或附加。
作為通過(guò)上述方法，可以在染色體DNA上的目的基因中導(dǎo)入堿基缺失、置換或附加的微生物，如屬于希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、或酵母屬的微生物。
另外，作為利用對(duì)多個(gè)基因有效導(dǎo)入了堿基缺失、置換或附加的同源重組的方法，如使用直鏈DNA的方法。
具體來(lái)說(shuō)，是使含有希望導(dǎo)入的堿基缺失、置換或附加的基因的直鏈DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，在染色體DNA與導(dǎo)入了的直鏈DNA之間發(fā)生同源重組的方法。本方法只要是可有效轉(zhuǎn)運(yùn)直鏈DNA的微生物，可運(yùn)用任一種微生物，作為優(yōu)選的微生物，如使用埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬的微生物、更優(yōu)選大腸桿菌、特別優(yōu)選表達(dá)來(lái)自λ噬菌體的重組蛋白質(zhì)組(Red重組系統(tǒng))的大腸桿菌。
作為表達(dá)λRed重組系統(tǒng)的大腸桿菌，如保有作為含有λRed重組系統(tǒng)基因的質(zhì)粒DNA的pKD46[從大腸桿菌基因貯存中心(美國(guó)耶魯大學(xué))可獲得]的大腸桿菌JMl01株等。
作為在同源重組中使用的DNA，如(a)在抗藥性基因的兩端具有存在于作為堿基缺失、置換或附加導(dǎo)入對(duì)象的染色體DNA上區(qū)域的兩外側(cè)的DNA或具有與該DNA有同源性的DNA的直鏈DNA、(b)直接連接了存在于作為堿基缺失、置換或附加導(dǎo)入對(duì)象的染色體DNA上區(qū)域兩外側(cè)的DNA或與該DNA具有同源性的DNA的直鏈DNA、(c)在抗藥性基因和陰性篩選中能夠使用的基因的兩端具有存在于作為堿基缺失、置換或附加導(dǎo)入對(duì)象的染色體DNA上區(qū)域兩外側(cè)的DNA或與該DNA具有同源性的DNA的直鏈DNA、(d)在上述(a)的直鏈DNA，在存在于抗藥性基因和染色體DNA上的區(qū)域的兩外側(cè)的DNA或與該DNA有同源性的DNA之間，以及具有來(lái)自酵母的Flp重組酶[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，82，5875(1985)]識(shí)別的堿基序列的DNA。
作為抗藥性基因，只要是對(duì)于宿主微生物表現(xiàn)出敏感性的藥物賦予抗藥性的抗藥性基因，可以使用任一種抗藥性基因。宿主微生物使用大腸桿菌時(shí)，作為抗藥性基因，例如卡那霉素耐性基因、氯霉素耐性基因、慶大霉素耐性基因、特霉素耐性基因、四環(huán)素耐性基因和氨芐青霉素耐性基因等。
所謂陰性篩選中可使用的基因指的是使該基因在宿主微生物表達(dá)時(shí)，在一定培養(yǎng)條件下，導(dǎo)致該微生物致死的基因，作為該基因，例如來(lái)自屬于芽孢桿菌屬的微生物的sacB基因[Appl.Environ.Microbiol.，59，1361-1366(1993)]和來(lái)自屬于埃希氏菌屬的微生物的rpsL基因[Genomics，72，99-104(2001)]等。
存在于上述直鏈DNA的兩末端的位于成為染色體DNA上置換或缺失導(dǎo)入對(duì)象的區(qū)域兩端外側(cè)的DNA或與該DNA有同源性的DNA在直鏈DNA中在與染色體DNA上方向相同方向上配置，其長(zhǎng)度優(yōu)選10bp～100bp左右，更優(yōu)選20bp～50bp左右，再優(yōu)選30～40bp左右。
所謂來(lái)自酵母的Flp重組酶識(shí)別的堿基序列只要是該蛋白質(zhì)識(shí)別、催化同源重組的堿基序列，沒(méi)有特別限定，優(yōu)選具有序列編號(hào)39表示的堿基序列的DNA和具有在該DNA中缺失、置換或附加1個(gè)～數(shù)個(gè)堿基的堿基序列，而且具有來(lái)自酵母的Flp重組酶識(shí)別、催化同源重組的堿基序列的DNA。
所謂具有同源性的DNA，上述直鏈DNA是在染色體DNA上的目的區(qū)域中，同源重組發(fā)生程度具有同一性的DNA，作為具體的同源性，如具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、最優(yōu)選100％同源性的DNA。
上述堿基序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序測(cè)定。
上述直鏈DNA片段可以通過(guò)PCR制作。另外，將含有上述直鏈DNA的DNA在質(zhì)粒上構(gòu)建后，通過(guò)限制性內(nèi)切酶處理可以獲得目的直鏈DNA。
作為向微生物的染色體DNA導(dǎo)入堿基缺失、置換或附加的方法，如以下的方法1～4。
方法1將上述(a)或(d)的直鏈DNA導(dǎo)入宿主微生物，通過(guò)以抗藥性為指標(biāo)選擇該直鏈DNA通過(guò)同源重組插入到染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株的方法。
方法2向通過(guò)上述方法1得到的轉(zhuǎn)化株導(dǎo)入直接連接了存在于作為堿基的缺失、置換或附加的導(dǎo)入對(duì)象的染色體DNA上區(qū)域兩外側(cè)的DNA或與該DNA有同源性的DNA的DNA，通過(guò)消除利用該方法插入到染色體DNA上的藥物基因，使微生物的染色體DNA上的區(qū)域置換或缺失的方法。
方法3[1]將上述(c)的直鏈DNA導(dǎo)入宿主微生物，以抗藥性為指標(biāo)選擇該直鏈DNA通過(guò)同源重組插入到染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株，[2]合成在與染色體DNA上的方向同一方向上連接了與位于染色體DNA上的置換或缺失對(duì)象區(qū)域兩端外側(cè)的DNA有同源性的DNA的DNA，導(dǎo)入到上述[1]得到的轉(zhuǎn)化株，[3]在陰性篩選中可以使用的基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)進(jìn)行了上述[2]操作的轉(zhuǎn)化株，作為在抗藥性基因和陰性篩選中能夠使用的基因從染色體DNA上被削除的菌株，選擇在該培養(yǎng)中可繁殖的菌株的方法。
方法4[1]將上述(d)的直鏈DNA導(dǎo)入宿主微生物，以抗藥性為指標(biāo)，選擇該直鏈DNA通過(guò)同源重組插入到染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株，[2]將Flp重組酶基因表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到上述[1]得到的轉(zhuǎn)化株中，使該基因表達(dá)后，獲得對(duì)上述[1]使用的藥物具有敏感性的菌株的方法。
在上述方法中使用的將直鏈DNA導(dǎo)入宿主微生物的方法，只要是向該微生物導(dǎo)入DNA的方法，可以使用任一個(gè)方法，例如使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(特開(kāi)昭63-248394)、電穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]等。
可在方法2或方法3[2]使用的DNA中，通過(guò)使用在該DNA的中央部附近轉(zhuǎn)運(yùn)希望插入到染色體DNA上的任意基因的DNA，在消除抗藥性基因等的同時(shí)，可以將任意基因插入到染色體DNA上。
上述方法2～4，由于是在最終得到的轉(zhuǎn)化株的染色體DNA上不留下在抗藥性基因和陰性篩選中可以使用的基因等外來(lái)基因的方法，所以通過(guò)使用該方法，使用在同一的抗藥性基因和陰性篩選中使用的基因，通過(guò)反復(fù)進(jìn)行方法2、方法3[1]～[3]、和方法4[1][2]的操作，能夠容易制造在染色體DNA上位置不同的2個(gè)以上區(qū)域具有堿基缺失、置換或附加的微生物。
(ii)賦予生產(chǎn)二肽能力的方法作為賦予上述(i)中使用的微生物生產(chǎn)二肽能力的方法，例如可舉以下的方法。
(a)編碼具有合成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA的制備編碼上述的具有合成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA可以利用該DNA的堿基序列情報(bào)，通過(guò)以下所述方法獲得。
例如，作為獲得編碼桿菌溶素合成酶的DNA的方法，使用根據(jù)序列編號(hào)26～32、64和65任一個(gè)表示的堿基序列設(shè)計(jì)的探針，對(duì)屬于芽孢桿菌屬的微生物的染色體DNA文庫(kù)的Southern雜交法、或使用根據(jù)序列編號(hào)26～32、64和65任一個(gè)表示的堿基序列設(shè)計(jì)的引物DNA，以屬于芽孢桿菌屬的微生物的染色體DNA作為模板的PCR[PCRProtocols，Academic Press(1990)]等。
另外，對(duì)于各種基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)與編碼序列編號(hào)19～25、33和68任一個(gè)所示的氨基酸序列的DNA堿基序列有65％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、再優(yōu)選95％以上同源性的序列進(jìn)行檢索，通過(guò)該檢索得到的堿基序列，利用上述方法由具有該堿基序列的生物的染色體DNA、cDNA文庫(kù)等也可以獲得編碼具有合成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA。
取得的DNA可以直接、或用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶等切斷后，通過(guò)常用方法轉(zhuǎn)運(yùn)到載體，獲得重組體DNA，由將該重組體DNA導(dǎo)入大腸桿菌得到的轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)通常使用的堿基序列解析方法、例如雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463(1977)]或373A·DNA測(cè)序儀(Perkin-Elmer公司制)等堿基序列分析儀器進(jìn)行分析，可以決定該DNA的堿基序列。
當(dāng)決定堿基序列的結(jié)果獲得的DNA是部分長(zhǎng)度時(shí)，通過(guò)使用該部分長(zhǎng)度DNA作為探針的對(duì)染色體DNA文庫(kù)的Southern雜交法，可以獲得全長(zhǎng)DNA。
另外，根據(jù)決定的DNA的堿基序列，使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成儀器等，通過(guò)化學(xué)合成也可以制備目的DNA。
作為像上述那樣獲得的DNA，例如可舉具有序列26～32、64和65表示的堿基序列的DNA。
作為轉(zhuǎn)運(yùn)了該DNA的載體，如pBluescript II KS(+)(Stratagene公司制)、pDIRECT[Nucleic Acids Res.，18，6069(1990)]、pCR-ScriptAmp SK(+)(Stratagene公司制)、pT7Blue(Novagen公司制)、pCR II(Invitrogen公司制)和pCR-TRAP(Genhunter公司制)等。
作為大腸桿菌，例如可舉大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM101、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、大腸桿菌ME8415等。
作為重組體DNA的導(dǎo)入方法，只要是向上述宿主細(xì)胞導(dǎo)入DNA的方法可以使用任一種方法，例如使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(特開(kāi)昭63-248394)、電穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]等。
作為保有通過(guò)上述方法得到的編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA的微生物，如下面敘述的保有含具有序列編號(hào)19表示的序列的DNA的重組體DNA的微生物大腸桿菌NM522/pPE43。
(b)具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)使用分子克隆第2版、CurrentProtocols in Molecular Biology等所述的方法等，可以通過(guò)例如以下的方法，使利用上述(a)方法得到的DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)、生產(chǎn)。
以利用上述(a)方法得到的DNA作為基礎(chǔ)，根據(jù)需要，制備含有編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)部分的適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片段。另外、通過(guò)將編碼該蛋白質(zhì)的部分堿基序列按照變成最適合宿主表達(dá)的密碼子那樣進(jìn)行堿基置換，可以使該蛋白質(zhì)的產(chǎn)率提高。
通過(guò)將該DNA片段插入到適當(dāng)表達(dá)載體的啟動(dòng)子的下游，制作重組體DNA。
通過(guò)將該重組體DNA導(dǎo)入到適合該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，可以得到生產(chǎn)具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體。
作為宿主細(xì)胞，細(xì)菌和酵母等，只要是可以表達(dá)目的基因的微生物都可以使用。
作為表達(dá)載體，可以使用可在上述宿主細(xì)胞自我復(fù)制或可轉(zhuǎn)運(yùn)到染色體中，在可轉(zhuǎn)錄編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA的位置含有啟動(dòng)子的載體。
使用細(xì)菌等原核生物作為宿主細(xì)胞時(shí)，具有編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA的重組體DNA最好是在原核生物中可自我復(fù)制的同時(shí)，由啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成的重組體DNA。也可以含有控制啟動(dòng)子的基因。
作為表達(dá)載體，例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(都是BoehringerMannheim公司制)、pHelix1(Roche Diagnostics公司制)、pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotech公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(Qiagen公司制)、pET-3(Novagen公司制)、pKYP10(特開(kāi)昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pBluescript II SK(+)、pBluescript II KS(-)(Stratagene公司制)、pTrS30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制備]、pTrS32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制備]、pPAC31(WO98/12343)、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pSTV28(寶酒造公司制)、pUC118(寶酒造公司制)、pPA1(特開(kāi)昭63-233798)等。
作為啟動(dòng)子，只要是在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中可發(fā)揮作用的，無(wú)論什么樣的啟動(dòng)子都可以。例如可例舉trp啟動(dòng)子(Ptrp)、lac啟動(dòng)子(Plac)、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子、PSE啟動(dòng)子等來(lái)自大腸桿菌和噬菌體等的啟動(dòng)子、SPO1啟動(dòng)子、SPO2啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等。也可以使用使兩個(gè)Ptrp串聯(lián)(直列)的啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、lacT7啟動(dòng)子、let I啟動(dòng)子那樣人為設(shè)計(jì)改變的啟動(dòng)子等。
作為啟動(dòng)子，也可以使用用于在芽孢桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的xylA啟動(dòng)子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，35，594-599(1991)]和用于在棒桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的P54-6啟動(dòng)子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，674-679(2000)]等。
使用將作為核糖體結(jié)合序列的S-D(Shine-Dalgarno)序列與起始密碼子的間距調(diào)節(jié)到適當(dāng)距離(例如6～18核酸)的質(zhì)粒最好。
在使編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合于表達(dá)載體的重組體DNA中，不一定需要轉(zhuǎn)錄終止序列，但最好是緊接在結(jié)構(gòu)基因的下面配置終止序列。
作為這樣的重組體DNA，例如下面提到的pPE43。
作為宿主細(xì)胞使用的原核生物，如使用埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、或棒桿菌屬等的微生物、例如大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM101、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、枯草芽孢桿菌ATCC33712、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、球形芽孢桿菌(Bacillussp.)FERM BP-6030、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、谷氨酸棒桿菌ATCC13032、谷氨酸棒桿菌ATCC14297等。
作為導(dǎo)入重組體DNA的方法，只要是向上述宿主細(xì)胞導(dǎo)入DNA的方法，可以使用任一個(gè)方法，例如使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(特開(kāi)昭63-248394)、電穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]等。
作為宿主細(xì)胞使用屬于酵母屬的菌株時(shí)，作為表達(dá)載體，例如可以使用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作為啟動(dòng)子，只要是在屬于酵母屬的菌株中發(fā)揮作用的，可以使用任一個(gè)，例如PHO5啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、gal 1啟動(dòng)子、gal 10啟動(dòng)子、熱休克多肽啟動(dòng)子、MFα1啟動(dòng)子、CUP 1啟動(dòng)子等啟動(dòng)子。
作為宿主細(xì)胞，如屬于酵母屬等的菌株，具體來(lái)說(shuō)，如釀酒酵母等。
作為重組體DNA的導(dǎo)入方法，只要是可向酵母導(dǎo)入DNA的方法都可以使用，例如電穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1990)]、spheroplast法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，4889(1984)]、醋酸鋰法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]等。
(2)使具有生產(chǎn)二肽能力的微生物的a)1個(gè)以上肽酶和1個(gè)以上肽轉(zhuǎn)運(yùn)系蛋白質(zhì)、或b)3個(gè)以上肽酶的功能降低或喪失的方法由于通過(guò)使用任意微生物作為宿主細(xì)胞，實(shí)施上述(1)中(ii)的方法，可以制造具有生產(chǎn)二肽能力的微生物，通過(guò)使用該微生物，實(shí)施上述(1)中(i)的方法，可以制造作為1個(gè)以上肽酶和1個(gè)以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)系蛋白質(zhì)、或3個(gè)以上的肽酶的功能降低或喪失的微生物，而且具有生產(chǎn)二肽能力的微生物。
另外，作為本來(lái)的性質(zhì)具有生產(chǎn)二肽能力的微生物，通過(guò)對(duì)該微生物實(shí)施上述(1)中(i)的方法，可以制造本發(fā)明的微生物。
作為上述微生物，如屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或酵母屬的微生物等，更優(yōu)選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌和釀酒酵母等。
3.本發(fā)明制造二肽的方法作為本發(fā)明的制造方法，如(i)使用本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)物或培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源和1種以上的氨基酸在水性介質(zhì)中存在，使二肽生成、蓄積在該介質(zhì)中，由該介質(zhì)回收該二肽來(lái)制造該二肽的方法、(ii)使用本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)物或培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源、L-氨基酸酯和L-氨基酸在水性介質(zhì)中存在，使二肽生成、蓄積在該介質(zhì)中，由該介質(zhì)回收該二肽來(lái)制造該二肽的方法，和(iii)使用本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)物或培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源、L-氨基酸酰胺和L-氨基酸在水性介質(zhì)中存在，使二肽生成、蓄積在該介質(zhì)中，由該介質(zhì)回收該二肽來(lái)制造該二肽的方法等。
在上述(i)的制造方法中，作為可用作底物的1種以上的氨基酸、優(yōu)選1種或2種的氨基酸，如氨基酸、優(yōu)選是選自L-氨基酸、甘氨酸(Gly)和β-丙氨酸(βAla)中的氨基酸，也可以將選出的任意的氨基酸進(jìn)行任意組合后使用。作為L(zhǎng)-氨基酸，例如L-丙氨酸(L-Ala)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-纈氨酸(L-Val)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-異亮氨酸(L-Ile)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-色氨酸(L-Trp)、L-蛋氨酸(L-Met)、L-絲氨酸(L-Ser)、L-蘇氨酸(L-Thr)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-賴氨酸(L-Lys)、L-精氨酸(L-Ar g)、L-組氨酸(L-His)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-α-氨基丁酸(L-α-AB)、L-偶氮絲氨酸(L-Azaserine)、L-茶氨酸(L-theanine)、L-4-羥基脯氨酸(L-4-HYP)、L-3-羥基脯氨酸(L-3-HYP)、L-鳥(niǎo)氨酸(L-Orn)、L-瓜氨酸(L-Cit)和L-6-重氮-5-氧-正亮氨酸(L-6-diazo-5-oxo-norleucine)等。
作為可在上述(i)的制造方法使用的更優(yōu)選的氨基酸，如從L-Ala、Gly、L-Met、L-Ser、L-Thr和β-Ala中選出的1種氨基酸與從L-Ala、L-Gln、L-Glu、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、β-Ala、L-Azaserine、L-theanine、L-4-HYP、L-3-HYP、L-Orn、L-Cit和L-6-diazo-5-oxo-norleucine中選出的1種氨基酸的組合，L-Gln與L-Phe的組合，和L-α-AB與L-Gln、L-Arg或L-α-AB的組合、最好是L-Ala與從L-Ala、L-Gln、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB、L-Azaserine、L-Cit和L-theanine選出的1種氨基酸的組合、Gly與從L-Gln、Gly、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-α-AB和L-Cit選出的1種氨基酸的組合、L-Met與從L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Tyr、L-Lys和L-His中選出的1種氨基酸的組合、L-Ser與從L-Gln、L-Phe、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-His和L-α-AB中選出的1種氨基酸的組合、L-Thr與從L-Gln、L-Phe、L-Leu、L-Thr和L-α-AB中選出的1種氨基酸的組合中選出的1種氨基酸的組合、和L-α-AB與L-Gln、L-Arg或L-α-AB的組合。
在上述(i)的制造方法中，作為底物使用的氨基酸按照終濃度為0.1～500g/L、優(yōu)選為0.2～200g/L濃度那樣開(kāi)始或反應(yīng)過(guò)程中添加到水性介質(zhì)中。
作為用上述(i)的制造方法制造的二肽，如下式(I)表示的二肽R1-R2(I)(式中、R1和R2表示相同或不同的氨基酸)優(yōu)選上述式(I)中R1和R2相同或不同，是從L-Ala、L-Gln、L-Glu、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、β-Ala、L-Azaserine、L-theanine、L-4-HYP、L-3-HYP、L-Orn和L-6-diazo-5-oxo-norleucine選出的氨基酸的二肽，更優(yōu)選R1為L(zhǎng)-Ala、Gly、L-Met、L-Ser、L-Thr或β-Ala時(shí)，R2為L(zhǎng)-Gln、L-Glu、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、β-Ala、L-Azaserine、L-theanine、L-4-HYP、L-3-HYP、L-Orn或L-6-diazo-5-oxo-norleucine的二肽，再優(yōu)選R1為L(zhǎng)-Ala時(shí)、R2是L-Gln、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB、L-Azaserine或L-theanine的二肽、R1為Gly時(shí)，R2是L-Gln、Gly、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Tyr、L-Lys、L-Arg或L-α-AB的二肽、R1為L(zhǎng)-Met時(shí)、R2是L-Phe、L-Met、L-Cys、L-Tyr、L-Lys或L-His的二肽，R1為L(zhǎng)-Ser時(shí)、R2是L-Gln、Gly、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-His或L-α-AB的二肽，R1為L(zhǎng)-Thr時(shí)、R2是L-Gln、L-Gly、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr或L-α-AB的二肽，R1為L(zhǎng)-Gln時(shí)、R2是L-Phe或L-α-AB的二肽，R1為L(zhǎng)-Phe時(shí)、R2是L-Gln的二肽、R1為L(zhǎng)-Trp時(shí)，R2是Gly的二肽，R1為L(zhǎng)-Cys時(shí)、R2是L-Ala、L-Gln、Gly、或L-Met的二肽、R1為L(zhǎng)-Lys時(shí)，R2是L-Ala、Gly或L-Met的二肽，R1為L(zhǎng)-Arg時(shí)、R2是L-α-AB的二肽、R1為L(zhǎng)-His時(shí)、R2是L-Met的二肽、和R1為L(zhǎng)-α-AB時(shí)、R2是L-Ala、L-Gln、Gly、L-Ser、L-Thr、L-Arg或L-α-AB的二肽。
另外，在上述制造方法中，根據(jù)需要，作為ATP的供給源可以將本發(fā)明微生物代謝可生產(chǎn)ATP的化合物、例如象葡萄糖那樣的糖類、象乙醇那樣的醇類、象醋酸那樣的有機(jī)酸類等加到水性介質(zhì)中。
在上述(ii)的制造方法中，作為可用作底物的L-氨基酸酯和L-氨基酸，只要是本發(fā)明的微生物可用作底物，生成二肽的L-氨基酸酯和L-氨基酸，可以使用任意的L-氨基酸酯與L-氨基酸任意組合，優(yōu)選L-氨基酸酯為從L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲基酯和L-谷氨酰胺-γ-酯選出的L-氨基酸酯，而L-氨基酸是從L-Gln、L-Asn、Gly、L-Ala、L-Leu、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His和L-Glu選出的L-氨基酸。
在上述(ii)的制造方法中，作為底物使用的L-氨基酸酯和L-氨基酸按照終濃度0.1～500g/L、優(yōu)選0.2～200g/L濃度那樣開(kāi)始或在反應(yīng)過(guò)程中添加到水性介質(zhì)中。
在上述(iii)的制造方法，作為底物使用的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸，只要是本發(fā)明的微生物可用作底物，生成二肽的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸，可以使用任意的L-氨基酸酰胺與L-氨基酸任意組合，優(yōu)選L-氨基酸酰胺是從L-丙氨酸酰胺、甘氨酸酰胺和L-天冬氨酸酰胺選出的L-氨基酸酰胺，L-氨基酸是從L-Gln、L-Asn、Gly、L-Ala、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His和L-Glu選出的L-氨基酸。
在上述(iii)的制造方法中，作為底物使用的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸按照終濃度0.1～500g/L、優(yōu)選0.2～200g/L濃度那樣開(kāi)始或在反應(yīng)過(guò)程中添加到水性介質(zhì)中。
作為在本發(fā)明的制造方法中使用的水性介質(zhì)，只要是不抑制二肽的生成反應(yīng)，可以是任何成分、組成的水性介質(zhì)，例如水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液等。另外也可以含有甲醇、乙醇等醇類、乙酸乙酯等酯類、丙酮等酮類、乙酰胺等酰胺類。
二肽的生成反應(yīng)在水性介質(zhì)中、于pH5～11、優(yōu)選pH6～10、20～60℃、更優(yōu)選25～45℃的條件下進(jìn)行2～150小時(shí)、優(yōu)選6～120小時(shí)。
另外，根據(jù)需要，在水性介質(zhì)中也可以添加表面活性劑或有機(jī)溶劑。
作為表面活性劑，聚氧乙烯十八烷基胺(例如Nymeen S-215、日本油脂公司制)等非離子表面活性劑、十六烷基三甲溴化銨和烷基二甲基芐基氯化銨(例如陽(yáng)離子F2-40E、日本油脂公司制)等陽(yáng)離子系表面活性劑、月桂酰肌氨酸等陰離子系表面活性劑、烷基二甲基胺(例如叔胺FB、日本油脂公司制)等叔胺類等只要是促進(jìn)二肽生成的都可以，可以1種或?qū)?shù)種混合后使用。表面活性劑通常使用0.1～50g/l濃度。作為有機(jī)溶劑，如二甲苯、甲苯、脂肪族醇、丙酮、乙酸乙酯等，通常使用0.1～50ml/l的濃度。
作為培養(yǎng)物的處理物，如培養(yǎng)物的濃縮物、培養(yǎng)物的干燥物、培養(yǎng)物經(jīng)離心分離得到的菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械磨碎處理物、該菌體的溶劑處理物、該菌體的酶處理物、和該菌體的固定化物等。另外，在本發(fā)明的培養(yǎng)物的處理物中也包括從對(duì)上述菌體進(jìn)行表面活性劑處理、超聲波處理、機(jī)械磨碎處理、溶劑處理或酶處理等得到的處理物除去不溶物等得到的蛋白質(zhì)的粗提取物。
當(dāng)使用培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源時(shí)，該酶源的量由于該酶源的比活性等不同而不同，例如作為底物的氨基酸、每1mgL-氨基酸酯或L-氨基酸酰胺添加5～1000mg、優(yōu)選10～400mg。
在水性介質(zhì)中生成、蓄積的二肽的采取可以通過(guò)使用活性碳或離子交換樹(shù)脂等通常的方法或通過(guò)利用有機(jī)溶劑的萃取、結(jié)晶、薄層層析、高效液相層析等進(jìn)行。
此外，上述(ii)和(iii)的制造方法可以根據(jù)WO 03/010189或WO03/010187的記載進(jìn)行。
以下給出了本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)例。
實(shí)驗(yàn)例1 來(lái)自枯草芽孢桿菌的ywfE基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建象以下所述取得枯草芽孢桿菌的ywfE基因片段。
使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成儀，合成具有序列編號(hào)35和序列編號(hào)36表示的堿基序列的DNA(以下分別稱為引物A、引物B)。引物A是含有將ywfE基因的起始密碼子(atg)置換為NcoI識(shí)別序列(ccatgg)的區(qū)域的堿基序列。引物B是含有將ywfE的終止密碼子置換為BamHI識(shí)別序列(ggatcc)的區(qū)域的堿基序列。
以枯草芽孢桿菌的染色體DNA作為模板，使用上述引物A和引物B作為引物組，進(jìn)行PCR。制備含有0.1μg染色體DNA、0.5μmol/L各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μLPfuDNA聚合酶用×10緩沖液、200μmol/L的各dNTP的反應(yīng)液40μL，通過(guò)反復(fù)進(jìn)行30次94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃3分鐘的循環(huán)步驟來(lái)進(jìn)行PCR。
就該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)相當(dāng)于ywfE基因片段的約1.4kb的片段擴(kuò)增后，添加與余下的反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿溶液，并混合。將該混合液離心分離后、向得到的上層加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分鐘。該溶液經(jīng)離心分離得到DNA的沉淀。將該DNA沉淀溶解于20μL的TE中。
使用5μL該溶解液，將擴(kuò)增的DNA用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI切斷，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段后，利用GENECLEAN II Kit(BIO 101公司制)回收含有ywfE基因的1.4kb的DNA片段。
將C末端His-tag標(biāo)記的附加型重組體表達(dá)載體pQE60(Qiagen公司制)0.2μg用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI切斷后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，通過(guò)與上述同樣的方法回收3.4kb的DNA片段。
使用連接試劑盒(寶酒造公司制)使上述得到的含有ywfE基因的1.4kb DNA片段與3.4kb DNA片段，于16℃下反應(yīng)16小時(shí)，進(jìn)行連接。
使用該連接反應(yīng)液通過(guò)使用鈣離子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)〕轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522株(Stratagene公司制)，將該轉(zhuǎn)化體涂布在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基后，于30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
根據(jù)眾所周知的方法從能夠繁殖的轉(zhuǎn)化體的菌落提取質(zhì)粒，得到C末端His-tag標(biāo)記的附加型ywfE基因表達(dá)載體pQE60ywfE。通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化確認(rèn)了該載體的結(jié)構(gòu)(圖1)。
實(shí)驗(yàn)例2ywfE基因產(chǎn)物的取得將保有pQE60ywfE的大腸桿菌NM522/pQE60ywfE株接種到加入了含有50μg/ml的氨芐青霉素的8ml LB培養(yǎng)基的粗試管，于28℃下培養(yǎng)17小時(shí)。將該培養(yǎng)液接種在加入了含有50μg/ml氨芐青霉素的50ml LB培養(yǎng)基的250ml容量三角燒瓶中，于30℃下3培養(yǎng)小時(shí)后，按照終濃度達(dá)到1mmol/L那樣添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，再于30℃下培養(yǎng)4小時(shí)。將該培養(yǎng)液離心分離，取得濕菌體。使用HisTrap(His-tag標(biāo)記的附加蛋白質(zhì)純化試劑盒、AmershamPharmasia Biotech公司制)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)從該濕菌體純化附加His-tag標(biāo)記的重組型酶。
實(shí)驗(yàn)例3 使用His-tag標(biāo)記的附加重組型酶生產(chǎn)二肽(1)(i)制備由實(shí)驗(yàn)例2取得的純化的His-tag標(biāo)記的附加重組型酶0.04mg、100mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、60mmol/L氯化鎂、60mmol/L的ATP、30mmol/L的L-Ala、30mmol/L的L-Gln組成的反應(yīng)液0.1ml，于37℃反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)生成物用二硝基苯酚化法衍生物化后，通過(guò)HPLC法進(jìn)行分析。利用HPLC法的分析，分離柱使用關(guān)東化學(xué)公司制的Lichrosorb-RP-18柱，作為洗脫液使用1％(v/v)磷酸、25％(v/v)乙腈，以0.7mL/分鐘的流速進(jìn)行分析。確認(rèn)反應(yīng)液中3.7g/L的L-Ala-L-Gln和0.3g/L的L-丙氨酰-L-丙氨酸(L-Ala-L-Ala)生成、蓄積。
(ii)除了酶取0.01mg、取代L-Gln含有L-Phe、L-Met、L-Leu或L-Val以外，制備與上述(i)反應(yīng)液的組成相同的反應(yīng)液，在上述(i)的反應(yīng)條件下反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)與上述(i)同樣分方法分析反應(yīng)生成物，確認(rèn)反應(yīng)液中分別有單獨(dú)7.0g/L的L-丙氨酰-L-苯丙氨酸(L-Ala-L-Phe)；7.0g/L的L-丙氨酰-L-蛋氨酸(L-Ala-L-Met)和0.03g/L的L-Ala-L-Ala；5.0g/L的L-丙氨酰-L-亮氨酸(L-Ala-L-Leu)和0.2g/L的L-Ala-L-Ala；或1.6g/L的L-丙氨酰-L-纈氨酸(L-Ala-L-Val)和0.3g/L的L-Ala-L-Ala生成、蓄積。
(iii)除了酶取0.01mg、取代L-Ala含有Gly、取代L-Gln含有L-Phe或L-Met以外，制備與上述(i)反應(yīng)液的組成相同的反應(yīng)液，在上述(i)的反應(yīng)條件下反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)與上述(i)同樣的方法分析反應(yīng)生成物，確認(rèn)反應(yīng)液中各有5.2g/L的甘氨酰-L-苯丙氨酸(Gly-L-Phe)或1.1g/L的甘氨酰-L-蛋氨酸(Gly-L-Met)生成、蓄積。
如果從上述反應(yīng)液組成除去ATP，二肽完全不能生成。
以上結(jié)果表明ywfE基因產(chǎn)物在ATP存在下，具有由L-Ala和L-Gln、L-Phe、L-Met、L-Leu或L-Val，生成L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala、L-Ala-L-Phe、L-Ala-L-Met和L-Ala-L-Ala、L-Ala-L-Leu和L-Ala-L-Ala、或L-Ala-L-Val和L-Ala-L-Ala的活性；由Gly和L-Phe或L-Met生成Gly-L-Phe或Gly-L-Met的活性。
實(shí)驗(yàn)例4 使用附加His-tag標(biāo)記的重組型酶的二肽的生產(chǎn)(2)制備由實(shí)驗(yàn)例2中得到的純化的附加His-tag標(biāo)記的重組型酶0.04mg、100mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、60mmol/L的氯化鎂、60mmol/L的ATP組成的0.1ml反應(yīng)液，向反應(yīng)液中按照終濃度30mmol/L那樣添加由表1的第1行與最左列的氨基酸組合構(gòu)成的各種L-氨基酸、Gly或β-Ala，于37℃下反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后、對(duì)反應(yīng)生成物進(jìn)行HPLC分析，確認(rèn)生成了表1所示的二肽。
表1-1
表1-2
表1-3 表內(nèi)給出了當(dāng)將表1的第1行與最左列的2種(或1種)L-氨基酸、Gly或β-Ala作為底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)生成的二肽?！鸨硎旧啥模蛄形创_定，×表示不能確認(rèn)二肽的生成，和空欄表示未實(shí)施。
實(shí)驗(yàn)例5 使用附加His-tag標(biāo)記的重組型酶表達(dá)株的二肽的生產(chǎn)將實(shí)驗(yàn)例1中得到的大腸桿菌NM522/pQE60ywfE株接種到加入了含有50μg/ml氨芐青霉素的8ml LB培養(yǎng)基的粗型試管中，于28℃下培養(yǎng)17小時(shí)。將該培養(yǎng)液接種到加入了含有50μg/ml氨芐青霉素的50ml LB培養(yǎng)基的250ml容量三角燒瓶，于30℃下培養(yǎng)3小時(shí)后，按照終濃度達(dá)到1mmol/L那樣添加IPTG，再于30℃下培養(yǎng)4小時(shí)。將該培養(yǎng)液離心分離，取得濕菌體。
將由200g/L的濕菌體、50g/L葡萄糖、5g/L植酸(用33％濃氫氧化鈉溶液稀釋成中性)、15g/L的磷酸二氫鉀、5g/L硫酸鎂·七水合物、4g/L Nymeen S-215、10ml/L二甲苯、200mmol/L的L-Ala、200mmol/L的L-Gln組成的20ml反應(yīng)液(pH7.2)加入到50ml容量的燒杯中，于32℃、900rpm的條件下進(jìn)行2小時(shí)反應(yīng)。反應(yīng)中使用2mol/L的氫氧化鉀將反應(yīng)液的pH保持在7.2。
當(dāng)用與實(shí)驗(yàn)例3所述方法同樣的方法分析反應(yīng)生成物時(shí)，確認(rèn)25mg/L的L-Ala-L-Gln蓄積。
實(shí)驗(yàn)例6 從屬于芽孢桿菌屬的各種微生物克隆和解析相當(dāng)于ywfE基因的基因根據(jù)序列編號(hào)26表示的堿基序列，象以下所述取得存在于枯草芽孢桿菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、淀粉液化芽孢桿菌IFO3022、和短小芽孢桿菌NRRLB-12025的相當(dāng)于ywfE基因的基因。
首先，將枯草芽孢桿菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、解淀粉芽孢桿菌IFO3022、和短小芽孢桿菌NRRL B-12025分別接種在LB培養(yǎng)基，于30℃下靜置培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)后通過(guò)使用Current Protocols in Molecular Biology所述的飽和苯酚的方法，分別分離純化該微生物的染色體DNA。
使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成儀，合成具有序列編號(hào)37和編號(hào)38表示的堿基序列的DNA(以下分別稱為引物C、引物D)。引物C是包括從枯草芽孢桿菌168株的染色體DNA的ywfE基因的起始密碼子開(kāi)始的上游區(qū)域的序列。引物D是與包括從ywfE基因的終止密碼子開(kāi)始的下游序列互補(bǔ)的序列。
以枯草芽孢桿菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、或解淀粉芽孢桿菌IFO3022的染色體DNA作為模板，作為引物組使用上述引物C和引物D進(jìn)行PCR。通過(guò)制備含有0.1μg的染色體DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10緩沖液、200μmol/L的各dNTP的反應(yīng)液40μL，反復(fù)進(jìn)行30次94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃3分鐘的循環(huán)步驟進(jìn)行PCR。
將該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)相當(dāng)于ywfE基因片段的約1.4kb的片段擴(kuò)增后，添加與余下反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿溶液，并混合。向?qū)⒃撊芤弘x心分離得到的上層加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分鐘。將該溶液經(jīng)離心分離得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE中。
使用連接試劑盒，對(duì)上述得到的來(lái)自各菌株染色體DNA的1.4kb片段與pCR-blunt(Invitrogen公司制)在16℃反應(yīng)16小時(shí)，進(jìn)行連接。
使用該反應(yīng)液通過(guò)使用鈣離子的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，于30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
通過(guò)眾所周知的方法從繁殖的轉(zhuǎn)化體的菌落提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶解析各個(gè)結(jié)構(gòu)，確認(rèn)取得了含有相當(dāng)于ywfE基因的基因的質(zhì)粒pYWFE1(來(lái)自ATCC15245株，具有序列編號(hào)65表示的堿基序列的DNA)、pYWFE2(來(lái)自ATCC6633株，具有序列編號(hào)27表示的堿基序列的DNA)、pYWFE3(來(lái)自IAM1213株，具有序列編號(hào)28表示的堿基序列的DNA)、pYWFE4(來(lái)自IAM1107株，具有序列編號(hào)29表示的堿基序列的DNA)、pYWFE5(來(lái)自IAM1214株，具有序列編號(hào)30表示的堿基序列的DNA)、pYWFE6(來(lái)自ATCC9466株，具有序列編號(hào)26表示的堿基序列的DNA)、pYWFE7(來(lái)自IAM1033株，具有序列編號(hào)65表示的堿基序列的DNA)、pYWFE8(來(lái)自ATCC21555株，具有序列編號(hào)31表示的堿基序列的DNA)、pYWFE9(來(lái)自IFO3022株，具有序列編號(hào)32表示的堿基序列的DNA)。
另外，來(lái)自短小芽孢桿菌NRRL B-12025相當(dāng)于ywfE基因的基因(具有序列編號(hào)64表示的堿基序列的DNA)象以下所述取得。
以上述制備的NRRL B-12025株的染色體DNA作為模板，作為引物組使用由序列編號(hào)66和67表示的堿基序列組成的DNA，進(jìn)行PCR。通過(guò)制備含有0.1μg的染色體DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Z-taq聚合酶(Takara Bio公司制)、5μL的Z-taq聚合酶用×10緩沖液(Takara Bio公司制)、200μmol/L的各dNTP的反應(yīng)液50μL，反復(fù)進(jìn)行30次98℃5秒鐘、55℃30秒鐘、72℃1分鐘的循環(huán)步驟進(jìn)行PCR。
將該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)約0.8kb的片段擴(kuò)增后，添加與余下反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿溶液，并混合。向?qū)⒃撊芤弘x心分離得到的上層加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分鐘。將該溶液經(jīng)離心分離得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE中。
使用連接試劑盒，對(duì)上述得到的來(lái)自各菌株染色體DNA的0.8kb片段和pGEM T-easy(Promega公司制)在16℃反應(yīng)16小時(shí)，進(jìn)行連接。
使用該反應(yīng)液通過(guò)使用鈣離子的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株后，涂布于含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，于30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
從上述得到的轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒，當(dāng)決定約0.8kb的插入DNA片段的堿基序列時(shí)，確認(rèn)了由序列編號(hào)64表示的堿基序列中的358～1160堿基構(gòu)成的堿基序列。
然后將該質(zhì)粒用EcoRI切斷后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段。使用GENECLEAN II Kit純化該DNA片段。將約0.5μg的該純化DNA片段用DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter KitI(Roche Diagnostics公司制)進(jìn)行DIG標(biāo)記。DIG標(biāo)記按照該試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
使用上述得到的DIG標(biāo)記的DNA，進(jìn)行NRRL B-12025株的染色體DNA的Southern解析。
分別使用BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、SalI和SphI將NRRL B-12025株的染色體DNA完全消化，通過(guò)瓊脂糖電泳分離DNA片段后，按照常規(guī)方法，轉(zhuǎn)移到nylon membrane plus charge(Roche Diagnostics公司制)上。
通過(guò)照射UV，將DNA片段固定在該尼龍膜后，使用上述探針DNA和該尼龍膜進(jìn)行Southern雜交。
使該探針DNA和該尼龍膜在65℃下接觸16小時(shí)，然后將該尼龍膜用由0.1％SDS和2×SSC組成的溶液在室溫下5分鐘、洗2次，再使用由0.1％SDS和0.5×SSC組成的溶液，于65℃下15分鐘、洗2次來(lái)進(jìn)行雜交，其它的操作、條件和雜交的DNA的檢測(cè)按照上述的DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
其結(jié)果在HindIII和PstI的完全消化片段的3.5kbp附近看到發(fā)色。
然后，分別使用HindIII和PstI將NRRL B-12025株的染色體DNA完全消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段。使用GENECLEAN IIKit從各個(gè)限制性內(nèi)切酶消化DNA純化3-4kbp片段，使用連接試劑盒，使其自環(huán)化。
根據(jù)上述決定的0.8kb DNA片段的堿基序列，設(shè)計(jì)、合成序列編號(hào)71和72表示的堿基序列，使用上述取得的環(huán)化DNA作為模板進(jìn)行PCR。通過(guò)制備含有10ng環(huán)化DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的pyrobest聚合酶(Takara Bio公司制)、5μL的pyrobest聚合酶用×10緩沖液(Takara Bio公司制)、200μmol/L的各dNTP的反應(yīng)液50μL，反復(fù)進(jìn)行30次98℃5秒鐘、55℃30秒鐘、72℃3分30秒鐘的循環(huán)步驟進(jìn)行PCR。
將該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)約3.0kb的片段擴(kuò)增確認(rèn)后，添加與余下的反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿溶液，并混合。向?qū)⒃摶旌弦弘x心分離得到的上層加2倍容量的冷乙醇，并進(jìn)行混合，于-80℃下放置30分鐘。將該溶液經(jīng)離心分離得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE中。
使用連接試劑盒對(duì)上述得到的DNA片段和Zero Blunt PCRCloning Kit(Invitrogen公司制)進(jìn)行連接。
使用該反應(yīng)液通過(guò)使用鈣離子的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，于30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
通過(guò)眾所周知的方法從繁殖的轉(zhuǎn)化體的菌落提取質(zhì)粒，通過(guò)使用限制性內(nèi)切酶解析其結(jié)構(gòu)，確認(rèn)得到了含有相當(dāng)于ywfE基因的基因的質(zhì)粒pYWFE10(來(lái)自NRRL B-12025株，含有序列編號(hào)64表示的堿基序列的DNA)。
使用堿基序列分析儀器373A·DNA測(cè)序儀決定相當(dāng)于上述得到的pYWFE1～pYWFE10中含有的ywfE基因的各基因的堿基序列。
由pYWFE1、pYWFE6和pYWFE7含有的基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與ywfE基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同，由pYWFE2、pYWFE3、pYWFE4、pYWFE5、pYWFE8、pYWFE9和pYWFE10含有的基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與ywfE基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同。
序列編號(hào)20～25、68和19分別表示pYWFE2、pYWFE3、pYWFE4、pYWFE5、pYWFE8、pYWFE9、pYWFE10、以及pYWFE1和pYWFE7含有相當(dāng)于ywfE基因的基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，序列27～32、65和26分別表示該基因的堿基序列。
實(shí)驗(yàn)例7 C末端附加His-tag標(biāo)記的重組型二肽合成酶的純化以枯草芽孢桿菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、或解淀粉芽孢桿菌IFO3022的染色體DNA作為模板，用實(shí)驗(yàn)例1所述的引物A和引物B作為引物組進(jìn)行PCR。通過(guò)制備含有0.1μg染色體DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10緩沖液、200μmol/L的各dNTP的反應(yīng)液40μL，反復(fù)進(jìn)行30次的94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃3分鐘的循環(huán)步驟進(jìn)行PCR。
當(dāng)以短小芽孢桿菌NRRL B-12025的染色體DNA作為模板時(shí)，作為引物組使用具有序列編號(hào)69和70表示的堿基序列的DNA，在與上述同樣的條件下進(jìn)行PCR。
將該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)相當(dāng)于ywfE片段的約1.4kb的DNA片段分別擴(kuò)增后，添加與余下反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿溶液，并進(jìn)行混合。將該混合液離心分離后，在得到的上層上加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分鐘。將該溶液離心分離得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE中。
將使用該溶解液各5μL擴(kuò)增的DNA用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI切斷，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段后，使用GENECLEAN II Kit，回收含有相當(dāng)于ywfE基因的基因的1.4kb的DNA片段。
然后將0.2μg的C末端His-tag標(biāo)記的附加型重組體表達(dá)載體pQE60用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI切斷后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，通過(guò)與上述同樣的方法回收3.4kb的DNA片段。
使用連接試劑盒將上述得到的含有相當(dāng)于枯草芽孢桿菌168株的ywfE基因的基因的1.4kb的DNA片段和3.4kb的DNA片段，于16℃下進(jìn)行16小時(shí)反應(yīng)，對(duì)各個(gè)進(jìn)行連接。通過(guò)使用鈣離子的方法用該反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
按照眾所周知的方法從能夠繁殖的轉(zhuǎn)化體的菌落提取質(zhì)粒，通過(guò)使用限制性內(nèi)切酶對(duì)它們的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，確認(rèn)取得了作為C末端His-tag標(biāo)記的附加型基因表達(dá)載體的pQE60ywfE1(含有來(lái)自ATCC15245的基因的載體)、pQE60ywfE2(含有來(lái)自ATCC6633的基因的載體)、pQE60ywfE3(含有來(lái)自IAM1213的基因的載體)、pQE60ywfE4(含有來(lái)自IAM1107的基因的載體)、pQE60ywfE5(含有來(lái)自IAM1214的基因的載體)、pQE60ywfE6(含有來(lái)自ATCC9466的基因的載體)、pQE60ywfE7(含有來(lái)自IAM1033的基因的載體)、pQE60ywfE8(含有來(lái)自ATCC21555的基因的載體)、pQE60ywfE9(含有來(lái)自IFO3022的基因的載體)、和pQE60ywfE10(含有來(lái)自NRRL B-12025的基因的載體)。
將上述得到的大腸桿菌NM522/pQE60ywfE1～NM522/pQE60ywfE10株分別接種到加入了含有50μg/ml的芐青霉素的8ml LB培養(yǎng)基的試管，于28℃下培養(yǎng)17小時(shí)。將該培養(yǎng)液接種到加入了含有50μg/ml的氨芐青霉素的50ml LB培養(yǎng)基的250ml容量的三角燒瓶中，于30℃下培養(yǎng)3小時(shí)后，按照終濃度達(dá)到1mmol/L那樣添加IPTG，再于30℃下培養(yǎng)4小時(shí)。從將該培養(yǎng)液離心分離后得到的濕菌體使用HisTrap，按照其使用說(shuō)明書(shū)純化His-tag標(biāo)記的附加重組型酶。
實(shí)驗(yàn)例8 使用純化酶生產(chǎn)二肽制備由實(shí)驗(yàn)例7得到的重組型酶0.04mg、100mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、60mmol/L的氯化鎂、60mmol/L的ATP、30mmol/L的L-Ala和30mmol/L的L-Gln構(gòu)成的0.1ml反應(yīng)液，于37℃下進(jìn)行16小時(shí)反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)實(shí)驗(yàn)例3所述方法對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分析，結(jié)果確認(rèn)分別有3.0～3.5g/L的L-Ala-L-Gln和0.25～0.3g/L的L-Ala-L-Ala生成、蓄積。
另外，如果將ATP從上述反應(yīng)液組成中除去，完全不能生成L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala。
以上結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)例7得到的基因產(chǎn)物無(wú)論那一個(gè)都具有在ATP存在下由L-Ala和L-Gln生成L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala的活性。
實(shí)驗(yàn)例9 強(qiáng)化ywfE基因表達(dá)的大腸菌的生成使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成儀，合成分別具有序列編號(hào)60～63表示的序列的DNA(以下分別稱為引物E、引物F、引物G、引物H)。序列編號(hào)60的序列是在質(zhì)粒pQE60ywfE的ywfE的含有核糖體結(jié)合序列的Shine-Dalgarno序列區(qū)域5′附加了含有XhoI識(shí)別序列的序列。序列編號(hào)61的序列是在與含有ywfE的終止密碼子的序列互補(bǔ)序列的5′附加含有BamHI識(shí)別序列的序列。而序列編號(hào)62的序列是在含有trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體pTrS30的trp啟動(dòng)子區(qū)域序列的5′端附加了含有EcoRI識(shí)別序列的序列。序列編號(hào)63的序列是在與含有trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體pTrS30的trp啟動(dòng)子區(qū)域序列互補(bǔ)的序列的5′附加了含有XhoI識(shí)別序列的序列。
以質(zhì)粒pQE60ywfE作為模板，在ywfE片段的擴(kuò)增中，作為引物組使用上述的引物E和引物F，在trp啟動(dòng)子區(qū)域片段的擴(kuò)增中作為引物組使用引物G和引物H進(jìn)行PCR。通過(guò)制備含有10ng的pQE60ywfE、0.5μmol/l的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μl的PfuDNA聚合酶用×10緩沖液、200μmol/l的各dNTP的40μl的反應(yīng)液，反復(fù)進(jìn)行30次94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃3分鐘的循環(huán)步驟進(jìn)行PCR。
將該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)在使用引物E和引物F的PCR中，相當(dāng)于ywfE基因片段的約1.4kb擴(kuò)增，在使用引物G和引物H的反應(yīng)中相當(dāng)于trp啟動(dòng)子區(qū)域的片段的約0.3kb片段擴(kuò)增后，添加與余下的反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿溶液，并混合。向?qū)⒃撊芤弘x心分離后得到的上層加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分鐘。將該溶液離心分離后得到的DNA溶解于20μl的TE中。
將使用上述得到的各DNA溶液5μl通過(guò)引物E和引物F擴(kuò)增的DNA用限制性內(nèi)切酶XhoI和BamHI切斷，另外就將通過(guò)引物G和引物H擴(kuò)增的DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI切斷，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段后，通過(guò)GENECLEAN II Kit分別回收含有ywfE基因的1.4kb和含有trp啟動(dòng)子區(qū)域的0.3kb DNA片段。
將0.2μg的含有trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體pTrS30用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI切斷后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣回收4.5kb的DNA片段。
使用連接試劑盒對(duì)上述得到的含有ywfE基因的1.4kb片段、含有trp啟動(dòng)子區(qū)域的0.3kb片段以及4.5kb片段于16℃下進(jìn)行16小時(shí)連接反應(yīng)。
使用該反應(yīng)液按照使用鈣離子的方法轉(zhuǎn)化大腸菌NM522株，將該轉(zhuǎn)化體涂布于含有氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基后，于30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
按照眾所周知的方法從繁殖的轉(zhuǎn)化體的菌落提取質(zhì)粒，得到在trp啟動(dòng)子下游含有ywfE因的表達(dá)載體pPE56。將該載體的結(jié)構(gòu)通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化進(jìn)行了確認(rèn)(圖2)。


第1圖是表示His-tag標(biāo)記的附加型ywfE基因表達(dá)載體pQE60ywfE的構(gòu)建過(guò)程的圖。
第2圖是表示ywfE基因表達(dá)強(qiáng)化型載體pPE56的構(gòu)建過(guò)程的圖。
各圖中符號(hào)的意思如下。
PT5；T5啟動(dòng)子Ptrp；色氨酸啟動(dòng)子具體實(shí)施方式
以下給出本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的范圍并不受下面實(shí)施例限制。
實(shí)施例1pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA因和dpp操縱子缺失株的制作大腸桿菌染色體DNA上的特定基因缺失的菌株根據(jù)利用λ噬菌體的同源重組系的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6641-6645(2000)]制作。
以下所述的質(zhì)粒pKD46、pKD3和pCP20使用從大腸桿菌基因貯存中心(美國(guó)Yale大學(xué))獲得保持該質(zhì)粒的大腸桿菌株，從該大腸菌提取的質(zhì)粒。
(1)基因缺失用DNA片段的克隆為了使存在于大腸桿菌K12株染色體DNA上的具有序列編號(hào)10表示的堿基序列的pepD基因、具有序列編號(hào)11表示的堿基序列的pepN基因、具有序列編號(hào)12表示的堿基序列的pepB基因、具有序列編號(hào)13表示的堿基序列的pepA基因和具有序列編號(hào)14表示的堿基序列的dppA基因、具有序列編號(hào)15表示的堿基序列的dppB基因、具有序列編號(hào)16表示的堿基序列的dppC基因、具有序列編號(hào)17表示的堿基序列的dppD基因和具有序列編號(hào)18表示的堿基序列的dppF基因缺失，使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成儀，合成與位于大腸桿菌K12株的染色體DNA上的各個(gè)缺失靶基因的上游和下游的36bp構(gòu)成的堿基序列相同的堿基序列、和具有序列編號(hào)39表示的來(lái)自酵母的Flp重組酶識(shí)別的堿基序列的DNA。但是，dppA基因、dppB基因、dppC基因、dppD基因和dppF基因由于形成操縱子，所以合成具有與位于該操縱子的上游和下游的堿基序列相同的堿基序列的DNA。
即、分別合成作為缺失pepD基因用DNA片段擴(kuò)增用引物組使用由序列編號(hào)40和41構(gòu)成的DNA、作為缺失pepN基因用DNA片段擴(kuò)增用引物組使用由序列編號(hào)42和43構(gòu)成的DNA、作為缺失pepA基因用DNA片段擴(kuò)增用引物組使用由序列編號(hào)44和45構(gòu)成的DNA、作為缺失pepB基因用DNA片段擴(kuò)增用引物組使用由序列編號(hào)46和47構(gòu)成的DNA、作為缺失dpp操縱子用DNA片段擴(kuò)增用引物組使用序列編號(hào)48和49表示的堿基序列構(gòu)成的DNA。
然后，使用上述合成DNA作為引物組，以pKD3DNA為模板進(jìn)行PCR。使用含有10ng質(zhì)粒DNA、0.5μmol/l各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶(Stratagene公司制)、4μlPfuDNA聚合酶用×10緩沖液(Stratagene公司制)、200μmol/l的各deoxyNTP(dATP、dGTP、dCTP和TTP)的40μl反應(yīng)液，通過(guò)反復(fù)進(jìn)行30次94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃3分鐘的步驟循環(huán)進(jìn)行PCR。
將各個(gè)反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目的片段擴(kuò)增后，添加與余下的反應(yīng)液等量的TE〔10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/l EDTA〕飽和苯酚/氯仿(1vol/1vol)，并進(jìn)行混合。
將該混合液離心分離后，向得到的上層加2倍容量的冷乙醇，進(jìn)行混合，于-80℃下放置30分鐘。對(duì)該溶液進(jìn)行離心分離，獲得含有pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操縱子缺失用氯霉素耐性基因DNA片段。
(2)pepD基因缺失大腸桿菌JM101的制作用pKD46轉(zhuǎn)化大腸菌JM101株，涂布在含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，通過(guò)于30℃下培養(yǎng)進(jìn)行選擇。
在質(zhì)粒pKD46上插入λRed重組酶基因，而其表達(dá)設(shè)計(jì)為可通過(guò)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)。因此使用直鏈狀DNA轉(zhuǎn)化在L-阿拉伯糖存在下繁殖的大腸菌，會(huì)以高頻率發(fā)生同源重組。另外由于pKD46具有溫度感受性的復(fù)制起點(diǎn)，所以通過(guò)在42℃下使其繁殖，容易使質(zhì)粒脫落。
通過(guò)電脈沖法向添加10mmol/l的L-阿拉伯糖和50μg/ml氨芐青霉素后培養(yǎng)得到的大腸菌JM101/pKD46導(dǎo)入上述取得的含有pepD基因缺失用氯霉素耐性基因的DNA片段，將通過(guò)同源重組在大腸菌JM101的染色體DNA上轉(zhuǎn)運(yùn)了pepD基因缺失用氯霉素耐性基因含有DNA片段的轉(zhuǎn)化株涂布在含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g/l、細(xì)菌用酵母提取液5g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂15g/l)上，通過(guò)于30℃培養(yǎng)進(jìn)行選擇。
經(jīng)選擇的氯霉素耐性株接種在含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，于42℃下培養(yǎng)14小時(shí)后，分離單菌落。將得到的各菌落復(fù)制在含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基、以及含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃下培養(yǎng)，通過(guò)選擇表現(xiàn)出氯霉素耐性且氨芐青霉素感受性的菌落，取得pKD46脫落株。
然后使用pCP20轉(zhuǎn)化上述得到的pKD46脫落株，通過(guò)在含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇，取得保持pCP20的pKD46脫落株。
在質(zhì)粒pCP20中插入來(lái)自酵母的Flp重組酶基因，設(shè)計(jì)成在42℃可誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。
另外，由于在上述制作的含有pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因以及dpp操縱子缺失用氯霉素耐性基因DNA片段的氯霉素耐性基因的兩端存在Flp重組酶識(shí)別的堿基序列，通過(guò)Flp重組酶催化的同源重組容易使該耐性基因脫落。
另外，pCP20由于含有溫度感受性的復(fù)制起點(diǎn)，通過(guò)使pCP20保持株在42℃下繁殖，可以同時(shí)誘導(dǎo)Flp重組酶的表達(dá)和pCP20的脫落。
將上述取得的保有pCP20的pKD46脫落株接種在沒(méi)有添加藥物的LB瓊脂培養(yǎng)基，于42℃下培養(yǎng)14小時(shí)后、分離單菌落。將得到的各菌落復(fù)制在沒(méi)有添加藥物的LB瓊脂培養(yǎng)基、含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基和含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，于30℃下培養(yǎng)，選擇表現(xiàn)出氯霉素感受性且氨芐青霉素敏感性的菌落。
按照常用方法(生物工學(xué)實(shí)驗(yàn)書(shū)、日本生物工學(xué)會(huì)編97～98頁(yè)、培風(fēng)館、1992年)從上述選擇的各株制備各個(gè)染色體DNA。使用具有根據(jù)缺失的靶基因pepD基因的內(nèi)部堿基序列設(shè)計(jì)的序列編號(hào)50和51表示的堿基序列的DNA作為引物組，以染色體DNA為模板進(jìn)行PCR。使用含有0.1μg染色體DNA、0.5μmol/l的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μlPfuDNA聚合酶用×10緩沖液、200μmol/l的各deoxyNTP的40μl反應(yīng)液，通過(guò)反復(fù)進(jìn)行30次由94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃3分鐘構(gòu)成的步驟循環(huán)進(jìn)行PCR。
在上述PCR中，把沒(méi)有檢測(cè)到擴(kuò)增DNA片段的菌株作為pepD基因缺失株，取名為大腸桿菌JPD1株。
(3)大腸桿菌JM101的染色體DNA上的pepD基因和pepN基因缺失的菌株的制作pKD46轉(zhuǎn)化上述(2)得到的大腸桿菌JPD1株，涂布在含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，通過(guò)在30℃下培養(yǎng)進(jìn)行選擇。通過(guò)電脈沖法向得到的轉(zhuǎn)化株(大腸桿菌JPD1/pKD46)導(dǎo)入pepN基因缺失用氯霉素耐性基因含有DNA片段，取得通過(guò)同源重組在大腸桿菌JPD1/pKD46的染色體DNA上轉(zhuǎn)運(yùn)了pepN基因缺失用氯霉素耐性基因含有DNA片段的轉(zhuǎn)化株。
然后，通過(guò)進(jìn)行與上述(2)同樣的操作，取得從染色體DNA上脫落了氯霉素耐性基因的菌株，將該株命名為大腸桿菌JPDN2。
(4)缺失了大腸桿菌JM101的染色體DNA上的pepN基因、pepA基因、pepB基因或dpp操縱子的菌株和多重基因缺失株的制作pepN基因、pepA基因、pepB基因或dpp操縱子的缺失株使用上述(1)制作的含有各基因或操縱子缺失用氯霉素耐性基因的DNA片段，通過(guò)與上述(2)同樣的方法制作。
通過(guò)上述方法取得的各個(gè)基因缺失株可以通過(guò)使用根據(jù)各個(gè)缺失基因的內(nèi)部堿基序列設(shè)計(jì)、合成的具有序列編號(hào)52～59表示的堿基序列的DNA作為引物組，通過(guò)與上述(2)同樣的PCR來(lái)得到確認(rèn)。其中，由序列編號(hào)52和53表示的堿基序列構(gòu)成的DNA是pepN基因缺失確認(rèn)用的引物組、由序列編號(hào)54和55表示的堿基序列構(gòu)成的DNA是pepA基因缺失確認(rèn)用引物組、由序列編號(hào)56和57表示的堿基序列構(gòu)成的DNA是pepB基因缺失確認(rèn)用引物組、由序列編號(hào)58和59表示的堿基序列構(gòu)成的DNA是dpp操縱子缺失確認(rèn)用引物組。
將用上述方法取得的dpp操縱子缺失株命名為大腸桿菌JDPP1株、將pepN基因缺失株命名為大腸桿菌JPN1株、將pepA基因缺失株命名為大腸桿菌JPA1株、將pepB基因缺失株命名為大腸桿菌JPB7株。
另外，根據(jù)上述(3)方法，制作由pepD基因、pepN基因、pepA基因、pepB基因和dpp操縱子中選擇2個(gè)以上基因或操縱子的多重缺失株。取得多重缺失株的確認(rèn)通過(guò)與上述(2)同樣的PCR進(jìn)行確認(rèn)。通過(guò)上述方法取得的缺失了pepD基因和dpp操縱子的二重基因缺失株命名為大腸桿菌JPDP49株；缺失了pepB基因、pepD基因和pepN基因的三重基因缺失株命名為大腸桿菌JPDNB43株；缺失了pepD基因、pepN基因和dpp操縱子的三重基因缺失株命名為大腸桿菌JPNDDP36株；缺失了pepA基因、pepD基因、pepN基因和dpp操縱子的四重基因缺失株命名為大腸桿菌JPNDAP5株；缺失了pepB基因、pepD基因、pepN基因和dpp操縱子的四重基因缺失株命名為大腸桿菌JPNDBP7株。表2給出了各基因缺失株中的缺失基因名。
表2

實(shí)施例2 使用肽酶和肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性喪失的大腸菌株生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(以下稱為AlaGln)和L-丙氨酰-L-丙氨酸(以下稱為AlaAla)的生產(chǎn)性的評(píng)價(jià)對(duì)于編碼實(shí)施例1中得到的各種肽酶基因和二肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的操縱子的缺失株用實(shí)驗(yàn)例8制作的質(zhì)粒pPE56進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得表現(xiàn)出氨芐青霉素耐性的轉(zhuǎn)化株。
將得到的轉(zhuǎn)化株接種到加入了含有50μg/ml氨芐青霉素的8mlLB培養(yǎng)基的試管，于28℃下培養(yǎng)17小時(shí)。將該培養(yǎng)液以1％接種到加入了含有100μg/ml氨芐青霉素的8ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(磷酸氫二鉀16g/l、磷酸二氫鉀14g/l、硫酸銨5g/L、檸檬酸(無(wú)水)1g/l、酪蛋白氨基酸(Difco公司制)0.5g/l、L-Pro 1g/l、L-Ala 2.5g/l、L-Gln 2.5g/l、葡萄糖10g/l、維生素B110mg/L、硫酸鎂·七水合物25mg/l、硫酸鐵七水合物50mg/l、使用10mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)整到pH7.2。其中L-Gln，10倍濃縮液經(jīng)膜過(guò)濾滅菌后添加，而葡萄糖、維生素B1、硫酸鎂·七水合物、硫酸鐵·七水合物分別蒸煮后添加)的試管，于30℃下培養(yǎng)24小時(shí)。將該培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離獲得培養(yǎng)上清。
將培養(yǎng)上清中的生產(chǎn)物用F-moc化法進(jìn)行衍生物化后，通過(guò)HPLC法進(jìn)行分析。通過(guò)HPLC法的分析對(duì)于分離柱使用ODS-HG5(野村化學(xué)公司制)，作為洗脫液，使用A液(醋酸6ml/l、20％(v/v)乙腈、三乙胺，調(diào)整到pH4.8)和B液(醋酸6ml/l、70％(v/v)乙腈、三乙胺，調(diào)整到pH4.8)，在0～5分鐘，A液∶B液＝8∶2、在5～20分鐘，于20分鐘時(shí)達(dá)到A液∶B液＝1∶1那樣進(jìn)行線性梯度洗脫的條件下進(jìn)行分析。分析結(jié)果如表3所示。
表3

由表3可知在缺失了2種以下肽酶基因的微生物、只缺失1種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因的微生物中，二肽的生成、蓄積量低，而在缺失了1種以上肽酶基因和1種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因的微生物、或缺失了3種以上肽酶基因的微生物中，二肽的生成、蓄積量大幅度增加。
實(shí)施例3 使用肽酶和肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性喪失的大腸菌株生產(chǎn)L-丙氨酰-L-纈氨酸(以下稱為AlaVal)的生產(chǎn)性的評(píng)價(jià)與實(shí)施例2同樣，將編碼各種肽酶基因和肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的操縱子缺失大腸菌株用pPE56進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將得到的轉(zhuǎn)化株接種到加入了含有50μg/ml氨芐青霉素的8ml LB培養(yǎng)基的試管中，于28℃下培養(yǎng)17小時(shí)。將該培養(yǎng)液以1％接種到加入了含有100μg/ml氨芐青霉素的8ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(磷酸氫二鉀16g/l、磷酸二氫鉀14g/l、硫酸銨5g/l、檸檬酸(無(wú)水)1g/l、酪蛋白氨基酸(Difco公司制)0.5g/l、L-Pro 1g/l、L-Ala 2.5g/l、L-Val 2.5g/l、葡萄糖10g/l、維生素B110mg/l、硫酸鎂·七水合物25mg/l、硫酸鐵·七水合物50mg/l、用10mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)整到pH7.2。葡萄糖、維生素B1、硫酸鎂·七水合物、硫酸鐵·七水合物分別蒸煮后添加)的試管，于30℃下培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)該培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，獲得培養(yǎng)上清。
通過(guò)實(shí)施例2所述的方法對(duì)培養(yǎng)上清中的生成物進(jìn)行分析。結(jié)果如表4所示。
表4

由表4可知，2種以下的肽酶基因缺失的微生物、和只有1種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因缺失的微生物不生產(chǎn)二肽，3種以上的肽酶基因缺失的微生物、或1種以上肽酶基因和1種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因缺失的微生物生產(chǎn)二肽。
實(shí)施例4 使用肽酶和肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性喪失的大腸菌株生產(chǎn)甘氨酰-L-谷氨酰胺(以下稱為GlyGln)的生產(chǎn)性的評(píng)價(jià)與實(shí)施例2同樣，將編碼各種肽酶基因和肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的操縱子的缺失株用pPE56進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將得到的轉(zhuǎn)化株接種到加入了含有50μg/ml氨芐青霉素的8ml LB培養(yǎng)基的試管，于28℃下培養(yǎng)17小時(shí)。
將該培養(yǎng)液以1％接種到加入了含有100μg/ml氨芐青霉素的8ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(磷酸氫二鉀16g/l、磷酸二氫鉀14g/l、硫酸銨5g/L、檸檬酸(無(wú)水)1g/L、酪蛋白氨基酸(Difco公司制)0.5g/l、L-Pro 1g/l、Gly 2.5g/l、L-Gln 2.5g/l、葡萄糖10g/l、維生素B110mg/L、硫酸鎂·七水合物25mg/l、硫酸鐵七水合物50mg/l、用10mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整到pH7.2。L-Gln的10倍濃縮液經(jīng)膜過(guò)濾滅菌后添加；葡萄糖、維生素B1、硫酸鎂·七水合物、硫酸鐵·七水合物分別經(jīng)蒸煮后添加)的試管，于30℃下培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)該培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，可得到培養(yǎng)上清。
通過(guò)實(shí)施例2所述的方法對(duì)培養(yǎng)上清中的生成物進(jìn)行分析。結(jié)果如表5所示。
表5

由表5可知，2種以下的肽酶基因缺失的微生物、和只有1種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因缺失的微生物不生產(chǎn)二肽，而3種以上肽酶基因缺失的微生物、和2種以上肽酶基因和1種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因缺失的微生物生產(chǎn)二肽。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性根據(jù)本發(fā)明可以提供生產(chǎn)二肽的微生物和使用該微生物制造二肽的方法。
「序列表FREE TEXT」序列編號(hào)35-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)36-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)37-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)38-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)39-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)40-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)41-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)42-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)43-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)44-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)45-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)46-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)47-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)48-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)49-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)50-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)51-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)52-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)53-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)54-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)55-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)56-人工序列的說(shuō)明；合成DNA
序列編號(hào)57-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)58-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)59-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)60-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)61-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)62-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)63-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)66-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)67-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)69-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)70-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)71-人工序列的說(shuō)明；合成DNA序列編號(hào)72-人工序列的說(shuō)明；合成DNA
序列表<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)公司<120>生產(chǎn)二肽的微生物和使用該微生物制造二肽的方法<130>11632<150>JP2003-375823<151>2003-11-5<150>JP2004-189010<151>2004-06-25<160>72<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>503<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1Met Glu Phe Ser Val Lys Ser Gly Ser Pro Glu Lys Gln Arg Ser Ala1 5 10 15Cys Ile Val Val Gly Val Phe Glu Pro Arg Arg Leu Ser Pro Ile Ala20 25 30Glu Gln Leu Asp Lys Ile Ser Asp Gly Tyr Ile Ser Ala Leu Leu Arg35 40 45Arg Gly Glu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Gln Thr Leu Leu Leu His His50 55 60Val Pro Asn Val Leu Ser Glu Arg Ile Leu Leu Ile Gly Cys Gly Lys65 70 75 80Glu Arg Glu Leu Asp Glu Arg Gln Tyr Lys Gln Val Ile Gln Lys Thr85 90 95Ile Asn Thr Leu Asn Asp Thr Gly Ser Met Glu Ala Val Cys Phe Leu100 105 110
Thr Glu Leu His Val Lys Gly Arg Asn Asn Tyr Trp Lys Val Arg Gln115 120 125Ala Val Glu Thr Ala Lys Glu Thr Leu Tyr Ser Phe Asp Gln Leu Lys130 135 140Thr Asn Lys Ser Glu Pro Arg Arg Pro Leu Arg Lys Met Val Phe Asn145 150 155 160Val Pro Thr Arg Arg Glu Leu Thr Ser Gly Glu Arg Ala Ile Gln His165 170 175Gly Leu Ala Ile Ala Ala Gly Ile Lys Ala Ala Lys Asp Leu Gly Asn180 185 190Met Pro Pro Asn Ile Cys Asn Ala Ala Tyr Leu Ala Ser Gln Ala Arg195 200 205Gln Leu Ala Asp Ser Tyr Ser Lys Asn Val Ile Thr Arg Val Ile Gly210 215 220Glu Gln Gln Met Lys Glu Leu Gly Met His Ser Tyr Leu Ala Val Gly225 230 235 240Gln Gly Ser Gln Asn Glu Ser Leu Met Ser Val Ile Glu Tyr Lys Gly245 250 255Asn Ala Ser Glu Asp Ala Arg Pro Ile Val Leu Val Gly Lys Gly Leu260 265 270Thr Phe Asp Ser Gly Gly Ile Ser Ile Lys Pro Ser Glu Gly Met Asp275 280 285Glu Met Lys Tyr Asp Met Cys Gly Ala Ala Ala Val Tyr Gly Val Met290 295 300Arg Met Val Ala Glu Leu Gln Leu Pro Ile Asn Val Ile Gly Val Leu305 3l0 315 320Ala Gly Cys Glu Asn Met Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Arg Pro Gly Asp325 330 335Val Leu Thr Thr Met Ser Gly Gln Thr Val Glu Val Leu Asn Thr Asp
340 345 350Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Cys Asp Val Leu Thr Tyr Val Glu Arg355 360 365Phe Glu Pro Glu Ala Val Ile Asp Val Ala Thr Leu Thr Gly Ala Cys370 375 380Val Ile Ala Leu Gly His His Ile Thr Gly Leu Met Ala Asn His Asn385 390 395 400Pro Leu Ala His Glu Leu Ile Ala Ala Ser Glu Gln Ser Gly Asp Arg405 410 415Ala Trp Arg Leu Pro Leu Gly Asp Glu Tyr Gln Glu Gln Leu Glu Ser420 425 430Asn Phe Ala Asp Met Ala Asn Ile Gly Gly Arg Pro Gly Gly Ala Ile435 440 445Thr Ala Gly Cys Phe Leu Ser Arg Phe Thr Arg Lys Tyr Asn Trp Ala450 455 460His Leu Asp Ile Ala Gly Thr Ala Trp Arg Ser Gly Lys Ala Lys Gly465 470 475 480Ala Thr Gly Arg Pro Val Ala Leu Leu Ala Gln Phe Leu Leu Asn Arg485 490 495Ala Gly Phe Asn Gly Glu Glu500<210>2<211>427<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Thr Gla Ala Met Lys Ile Thr Leu Ser Thr Gln Pro Ala Asp Ala1 5 10 15Arg Trp Gly Glu Lys Ala Thr Tyr Ser Ile Asn Asn Asp Gly Ile Thr20 25 30
Leu His Leu Asn Gly Ala Asp Asp Leu Gly Leu Ile Gln Arg Ala Ala35 40 45Arg Lys Ile Asp Gly Leu Gly Ile Lys His Val Gln Leu Ser Gly Glu50 55 60Gly Trp Asp Ala Asp Arg Cys Trp Ala Phe Trp Gln Gly Tyr Lys Ala65 70 75 80Pro Lys Gly Thr Arg Lys Val Val Trp Pro Asp Leu Asp Asp Ala Gln85 90 95Arg Gln Glu Leu Asp Asn Arg Leu Met Ile Ile Asp Trp Val Arg Asp100 105 110Thr Ile Asn Ala Pro Ala Glu Glu Leu Gly Pro Ser Gln Leu Ala Gln115 120 125Arg Ala Val Asp Leu Ile Ser Asn Val Ala Gly Asp Arg Val Thr Tyr130 135 140Arg Ile Thr Lys Gly Glu Asp Leu Arg Glu Gln Gly Tyr Met Gly Leu145 150 155 160His Thr Val Gly Arg Gly Ser Glu Arg Ser Pro Val Leu Leu Ala Leu165 170 175Asp Tyr Asn Pro Thr Gly Asp Lys Glu Ala Pro Val Tyr Ala Cys Leu180 185 190Val Gly Lys Gly Ile Thr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Ser Ile Lys Gln195 200 205Thr Ala Phe Met Asp Ser Met Lys Ser Asp Met Gly Gly Ala Ala Thr210 215 220Val Thr Gly Ala Leu Ala Phe Ala Ile Thr Arg Gly Leu Asn Lys Arg225 230 235 240Val Lys Leu Phe Leu Cys Cys Ala Asp Asn Leu Ile Ser Gly Asn Ala245 250 255Phe Lys Leu Gly Asp Ile Ile Thr Tyr Arg Asn Gly Lys Lys Val Glu
260 265 270Val Met Asn Thr Asp Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Ala Asp Gly Leu275 280 285Ile Asp Ala Ser Ala Gln Lys Pro Glu Met Ile Ile Asp Ala Ala Thr290 295 300Leu Thr Gly Ala Ala Lys Thr Ala Leu Gly Asn Asp Tyr His Ala Leu305 310 315 320Phe Ser Phe Asp Asp Ala Leu Ala Gly Arg Leu Leu Ala Ser Ala Ala325 330 335Gln Glu Asn Gro Pro Phe Trp Arg Leu Pro Leu Ala Glu Phe His Arg340 345 350Ser Gln Leu Pro Ser Asn Phe Ala Glu Leu Asn Asn lhr Gly Ser Ala355 360 365Ala Tyr Pro Ala Gly Ala Ser Thr Ala Ala Gly Phe Leu Ser His Phe370 375 380Val Glu Asn Tyr Gln Gln Gly Trp Leu His Ile Asp Cys Ser Ala Thr385 390 395 400Tyr Arg Lys Ala Pro Val Glu Gln Trp Ser Ala Gly Ala Thr Gly Leu405 410 415Gly Val Arg Thr Ile Ala Asn Leu Leu Thr Ala420 425<210>3<211>485<212>PRT<213>大腸桿菌<400>3Met Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Pro Gln Pro Leu Trp Asp Ile Phe1 5 10 15Ala Lys Ile Cys Ser Ile Pro His Pro Ser Tyr His Glu Glu Gln Leu20 25 30
Ala Glu Tyr Ile Val Gly Trp Ala Lys Glu Lys Gly Phe His Val Glu35 40 45Arg Asp Gln Val Gly Asn Ile Leu Ile Arg Lys Pro Ala Thr Ala Gly50 55 60Met Glu Asn Arg Lys Pro Val Val Leu Gln Ala His Leu Asp Met Val65 70 75 80Pro Gln Lys Asn Asn Asp Thr Val His Asp Phe Thr Lys Asp Pro Ile85 90 95Gln Pro Tyr Ile Asp Gly Glu Trp Val Lys Ala Arg Gly Thr Thr Leu100 105 110Gly Ala Asp Asn Gly Ile Gly Met Ala Ser Ala Leu Ala Val Leu Ala115 120 125Asp Glu Asn Val Val His Gly Pro Leu Glu Val Leu Leu Thr Met Thr130 135 140Glu Glu Ala Gly Met Asp Gly Ala Phe Gly Leu Gln Gly Asn Trp Leu145 150 155 160Gln Ala Asp Ile Leu Ile Asn Thr Asp Ser Glu Glu Glu Gly Glu Ile165 170 175Tyr Met Gly Cys Ala Gly Gly Ile Asp Phe Thr Ser Asn Leu His Leu180 185 190Asp Arg Glu Ala Val Pro Ala Gly Phe Glu Thr Phe Lys Leu Thr Leu195 200 205Lys Gly Leu Lys Gly Gly His Ser Gly Gly Glu Ile His Val Gly Leu210 215 220Gly Asn Ala Asn Lys Leu Leu Val Arg Phe Leu Ala Gly His Ala Glu225 230 235 240Glu Leu Asp Leu Arg Leu Ile Asp Phe Asn Gly Gly Thr Leu Arg Asn245 250 255Ala Ile Pro Arg Glu Ala Phe Ala Thr Ile Ala Val Ala Ala Asp Lys
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<210>4<211>870<212>PRT<213>大腸桿菌<400>4Met Thr Gln Gln Pro Gln Ala Lys Tyr Arg His Asp Tyr Arg Ala Pro1 5 10 15Asp Tyr Gln Ile Thr Asp Ile Asp Leu Thr Phe Asp Leu Asp Ala Gln20 25 30Lys Thr Val Val Thr Ala Val Ser Gln Ala Val Arg His Gly Ala Ser35 40 45Asp Ala Pro Leu Arg Leu Asn Gly Glu Asp Leu Lys Leu Val Ser Val50 55 60His Ile Asn Asp Glu Pro Trp Thr Ala Trp Lys Glu Glu Glu Gly Ala65 70 75 80Leu Val Ile Ser Asn Leu Pro Glu Arg Phe Thr Leu Lys Ile Ile Asn85 90 95Glu Ile Ser Pro Ala Ala Asn Thr Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Gln Ser100 105 110Gly Asp Ala Leu Cys Thr Gln Cys Glu Ala Glu Gly Phe Arg His Ile115 120 125Thr Tyr Tyr Leu Asp Arg Pro Asp Val Leu Ala Arg Phe Thr Thr Lys130 135 140Ile Ile Ala Asp Lys Ile Lys Tyr Pro Phe Leu Leu Ser Asn Gly Asn145 150 155 160Arg Val Ala Gln Gly Glu Leu Glu Asn Gly Arg His Trp Val Gln Trp165 170 175Gln Asp Pro Phe Pro Lys Pro Cys Tyr Leu Phe Ala Leu Val Ala Gly180 185 190Asp Phe Asp Val Leu Arg Asp Thr Phe Thr Thr Arg Ser Gly Arg Glu195 200 205
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35 40 45gag cta atc gaa aaa tac tcc att gcc gtc atc aaa gac cgt gat tat 192Glu Leu Ile Glu Lys Tyr Ser Ile Ala Val Ile Lys Asp Arg Asp Tyr50 55 60ttt gag aca cac cct tct ttt gaa cac cct gat tct att tac tgg gca 240Phe Glu Thr His Pro Ser Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala65 70 75 80cat gat gat tat cca aaa tca gaa gaa gaa gtt gtg gaa gac ttc att 288His Asp Asp Tyr Pro Lys Ser Glu Glu Glu Val Val Glu Asp Phe Ile85 90 95cga gta gct tcc ttt ttc aaa gca gat gca atc acg acc aat aat gaa 336Arg Val Ala Ser Phe Phe Lys Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu100 105 110tta ttc att gca ccg atg gca aag gcc gct gaa cgt ctt ggg cta cga 384Leu Phe Ile Ala Pro Met Ala Lys Ala Ala Glu Arg Leu Gly Leu Arg115 120 125ggt gcc ggt gtc aag gca gcc gaa atg gcg cgt gat aaa agc caa atg 432Gly Ala Gly Val Lys Ala Ala Glu Met Ala Arg Asp Lys Ser Gln Met130 135 140agg gct gca ttc aat gcc tct ggc gtc aaa gcg gtg aaa act cag cct 480Arg Ala Ala Phe Asn Ala Ser Gly Val Lys Ala Val Lys Thr Gln Pro145 150 155 160gtc acg act tta tct gat ttc caa caa gcc att gag tct atc gga aca 528Val Thr Thr Leu Ser Asp Phe Gln Gln Ala Ile Glu Ser Ile Gly Thr165 170 175ccg ctc att tta aag cct aca tat tta gcc agt tct att ggc gtc acc 576Pro Leu Ile Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr180 185 190ttg ttt cat gac aaa gcc gga agt gat gac ttg ttt tta caa gta caa 624Leu Phe His Asp Lys Ala Gly Ser Asp Asp Leu Phe Leu Gln Val Gln195 200 205tcg tat ttg gaa acc ata cca gtc cca gac gct gtc acg tat gaa gca 672Ser Tyr Leu Glu Thr Ile Pro Val Pro Asp Ala Val Thr Tyr Glu Ala
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<223>人工序列的描述合成性DNA<400>69catgccatgg agaaaaaaac tgtacttgtc attgctgact tagg 44<210>70<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成性DNA<400>70cgcggatccc ttcactaatt catccattaa ctgaatcg 38<210>71<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成性DNA<400>71gctaggtctt gaacattgtg caaccc 26<210>72<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成性DNA<400>72ggtgttccga tagactcaat ggc 2權(quán)利要求
1.微生物，該微生物為1種以上肽酶和1種以上的具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)(以下也稱為肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì))的活性降低或喪失，且具有生產(chǎn)二肽能力的微生物。
2.微生物，該微生物為3種以上肽酶的活性降低或喪失，且具有生產(chǎn)二肽能力的微生物。
3.權(quán)利要求1或2所述的微生物，其中，肽酶是具有序列編號(hào)1～4中任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或具有與序列編號(hào)1～4中任一個(gè)所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，且具有肽酶活性的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1或3所述的微生物，其中，肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是具有序列編號(hào)5～9中任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或與序列編號(hào)5～9中任一個(gè)所示的氨基酸序列有80％以上同源性，且具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的微生物，其中具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是具有生產(chǎn)以下[1]～[4]任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)能力的微生物[1]具有序列編號(hào)19～25和68中任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；[2]由在序列編號(hào)19～25和68中任一個(gè)所示的氨基酸序列中缺失、置換或附加了1個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)；[3]由與序列編號(hào)19～25和68中任一個(gè)序列表示的氨基酸序列有65％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)；[4]具有與序列編號(hào)33所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，且具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是具有以下[1]～[4]任一項(xiàng)所述的DNA的微生物[1]編碼權(quán)利要求5的[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的DNA；[2]具有序列編號(hào)26～32、64和65中任一個(gè)表示的堿基序列的DNA；[3]與具有序列編號(hào)26～32、64和65中任一個(gè)表示的堿基序列的DNA在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜交，同時(shí)編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA；[4]具有與序列編號(hào)34表示的堿基序列有80％以上同源性的堿基序列，同時(shí)編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA。
7.權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是含有權(quán)利要求6的[1]～[4]任一項(xiàng)所述的DNA與載體DNA連接的重組體DNA的微生物。
8.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，微生物是屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或酵母屬的微生物。
9.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽能力的微生物。
10.權(quán)利要求9所述的微生物，其中，具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽能力的微生物是生產(chǎn)脯氨酸亞氨基肽酶的微生物。
11.權(quán)利要求9或10所述的微生物，其中，具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽能力的微生物是含有編碼具有脯氨酸亞氨基肽酶活性的蛋白質(zhì)的DNA與載體DNA連接的重組體DNA的微生物。
12.權(quán)利要求9～11中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，微生物是屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或酵母屬的微生物。
13.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，具有生產(chǎn)二肽能力的微生物是具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生成二肽能力的微生物。
14.權(quán)利要求13所述的微生物，其中，具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生成二肽能力的微生物是生產(chǎn)具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)的微生物。
15.權(quán)利要求13所述的微生物，其中，具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生成二肽能力的微生物是含有編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)的DNA和載體DNA連接的重組體DNA的微生物。
16.權(quán)利要求13～15中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，微生物是屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬或酵母屬的微生物。
17.二肽的制造方法，該方法使用權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源、1種以上氨基酸存在于水性介質(zhì)中，使二肽在該水性介質(zhì)中生成、蓄積，從該介質(zhì)回收該二肽。
18.權(quán)利要求17所述的制造方法，其中，二肽是用下式(I)表示的二肽R1-R2(I)式中、R1和R2表示相同的或不同的氨基酸。
19.二肽的制造方法，該方法使用權(quán)利要求9～12中任一項(xiàng)所述的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源、L-氨基酸酯和L-氨基酸存在于水性介質(zhì)中，使二肽在該水性介質(zhì)中生成、蓄積，從該介質(zhì)回收該二肽。
20.二肽的制造方法，該方法使用權(quán)利要求13～16中任一項(xiàng)所述的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源、L-氨基酸酰胺和L-氨基酸存在于水性介質(zhì)中，使二肽在該水性介質(zhì)中生成、蓄積，從該介質(zhì)回收該二肽。
21.權(quán)利要求17～20中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征是培養(yǎng)物的處理物是培養(yǎng)物的濃縮物、培養(yǎng)物的干燥物、對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離得到的菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械磨碎處理物、該菌體的溶劑處理物、該菌體的酶處理物、或該菌體的固定化物。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明可以提供1種以上肽酶和1種以上具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)的活性降低或喪失，且具有生產(chǎn)二肽能力的微生物、3種以上肽酶的活性降低或喪失，且具有生產(chǎn)二肽能力的微生物和使用該微生物制造二肽的方法。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1882683SQ20048003395
公開(kāi)日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月5日
發(fā)明者橋本信一, 田畑和彥 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社