專利名稱：抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異結(jié)合載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)C末端片段的抗體。本發(fā)明還提供了獲得該多肽的方法以及該多肽在診斷和治療阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、系統(tǒng)性淀粉樣變性病和其它淀粉樣變性病中的使用方法。

背景技術(shù)：
淀粉樣變性病是病因未知的，逐漸惡化的，難以治愈的代謝性疾病，其特征在于蛋白質(zhì)在一個(gè)或多個(gè)器官或身體系統(tǒng)中異常沉積。淀粉樣蛋白可通過(guò)如使骨髓功能異常獲得。在累積的淀粉樣沉積損傷到機(jī)體的正常功能時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)淀粉樣變性病，該病會(huì)導(dǎo)致器官失去功能或死亡。這是一種罕見(jiàn)的病變，在每一百萬(wàn)人中會(huì)出現(xiàn)大約八例。它對(duì)男性和女性的影響是均等的，通常在四十歲后逐步顯示出來(lái)。已經(jīng)鑒定出至少15種淀粉樣變性病，每一種與不同種類的蛋白質(zhì)沉積相關(guān)。
淀粉樣變性病的主要形式是原發(fā)性系統(tǒng)性、繼發(fā)性和家族性或遺傳性淀粉樣變性病。還有另外一種與阿耳茨海默氏病相關(guān)的淀粉樣變性病。原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病一般在五十歲和六十歲時(shí)逐步顯示出來(lái)。在美國(guó)原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病是該病最為常見(jiàn)的形式，每年被診斷出2000個(gè)新病例。它又被稱為與輕鏈相關(guān)的淀粉樣變性病，也會(huì)與多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma)(骨髓癌)同時(shí)發(fā)病。繼發(fā)性淀粉樣變性病是由于慢性感染或炎癥疾病產(chǎn)生的。通常與下列病癥相關(guān)家族性地中海熱(Familial Mediterranean fever，一種細(xì)菌感染的疾病，其特征在于寒戰(zhàn)、虛弱、頭疼和反復(fù)發(fā)燒)、肉芽腫回腸炎(Granulomatous ileitis，小腸發(fā)炎)、霍吉金氏病(Hodgkins Disease)、麻風(fēng)病(Leprosy)、骨髓炎(Osteomyelitis)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)。
家族性或遺傳性淀粉樣變性病是此病唯一的遺傳形式。它在絕大部分種族中出現(xiàn)，并且每個(gè)家族的癥狀和所涉及器官具有區(qū)別性特點(diǎn)。遺傳性淀粉樣變性病被認(rèn)為是常染色體顯性，這意味著只需要一個(gè)缺陷基因的拷貝就可產(chǎn)生該病。父母患家族性淀粉樣變性病的子女患該病的機(jī)率為50％。
淀粉樣變性病可出現(xiàn)在機(jī)體的任何器官或系統(tǒng)中。最常累及的是心臟、腎臟、胃腸道系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。淀粉樣蛋白累積的其它常見(jiàn)部位是大腦、關(guān)節(jié)、肝臟、脾臟、胰腺、呼吸系統(tǒng)和皮膚。
阿耳茨海默氏病(AD)是癡呆最為常見(jiàn)的形式，是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特征在于智力的喪失嚴(yán)重到干擾到日常生活的正常活動(dòng)，其持續(xù)至少六個(gè)月，但并非從出生就存在。AD疾病一般出現(xiàn)在老年，其特征在于諸如記憶、推理和計(jì)劃的認(rèn)知功能的退化。
有2～4×106美國(guó)人患AD疾病，該數(shù)字到21世紀(jì)中葉在所有年齡段的人群中有望達(dá)到1.4×107。AD疾病主要影響到老年人，但是也有少數(shù)人在四十多歲和五十多歲患該病。AD疾病影響大約3％年齡在65歲到75歲間的人群，大約20％年齡在75歲到84歲間的人群，大約50％大于85歲的人群。即使在考慮到女性壽命較長(zhǎng)，因此在大部分受到影響的年齡組中女性的比率更高這點(diǎn)，感染AD疾病的女性還是較男性略多一些。
AD疾病涉及了幾個(gè)基因，包括編碼淀粉樣前體蛋白(APP，其合成淀粉樣蛋白)的基因。該基因的突變與相對(duì)罕見(jiàn)的AD疾病早發(fā)形式的某些病例相關(guān)。其它早發(fā)AD疾病的病例是由早老素(presenilin)基因PS-1和PS-2的突變所導(dǎo)致。與AD疾病相似的癡呆最終會(huì)影響到患唐氏綜合癥(Downs Syndrome)的每一位病人，唐氏綜合癥是由染色體21的額外拷貝所導(dǎo)致的。其它染色體上的其它突變和其它早發(fā)病例相關(guān)。
在二十世紀(jì)九十年代早期，在染色體19上發(fā)現(xiàn)了最為重要的基因連鎖。該染色體上的基因apoE，編碼將脂質(zhì)輸送到神經(jīng)元的蛋白。
載脂蛋白E(ApoE)是34kD的糖基化蛋白。ApoE合成的主要部位是肝臟和大腦。ApoE是極低密度脂蛋白(VLDL)的組成部分，該VLDL為高密度脂蛋白和乳糜微粒的亞類。脂質(zhì)復(fù)合物的細(xì)胞攝入通過(guò)ApoE與低密度脂蛋白(LDL)受體和其它相關(guān)受體的結(jié)合介導(dǎo)。
在人體中有三種主要的ApoE同工型apoE2、apoE3和apoE4，其為三個(gè)等位基因ε2、ε3和ε4的產(chǎn)物。在正常人群中，等位基因ε3最為常見(jiàn)，占所有apoE等位基因的78％。在遲發(fā)性、散發(fā)性病人和家族性阿耳茨海默氏病(AD)病人中，等位基因ε4的頻率顯著提高。
ApoE含有由無(wú)規(guī)則線團(tuán)區(qū)連接的C端結(jié)構(gòu)域(ApoE-CTD)和N端結(jié)構(gòu)域(ApoE-NTD)。C端結(jié)構(gòu)域包括脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合脂蛋白受體。在ApoE的所有三種同工型中CTD氨基酸序列是相同的。CTD和NTD可用凝血酶通過(guò)剪切相分離。
已在體外證實(shí)了ApoE和淀粉樣蛋白β(Aβ)間的直接相互作用。ApoE同樣出現(xiàn)在AD斑塊中。已報(bào)道ApoE的N端結(jié)構(gòu)域(ApoE-NTD)介導(dǎo)apoE與Aβ的結(jié)合(Golabek et al.，(2000)Biophysical Journal 791008-1015)。但是，發(fā)現(xiàn)含ApoE的AD斑塊在斑塊中央含全長(zhǎng)ApoE，在斑塊外周含ApoE的C端結(jié)構(gòu)域片段(ApoE-CTD)(Cho et al.，(2001) J.Neuropathology and Expt.Neurology 60342-349)。已發(fā)現(xiàn)在斑塊成熟中，Aβ1-42在斑塊中沉積后，才出現(xiàn)ApoE沉積，而Aβ1-40沉積晚于ApoE沉積(Terai et al.，(2001)，Brain Research 90048-56)。
并不被認(rèn)為大腦中ApoE的功能是AD特異的。ApoE似乎在影響急性大腦損傷的康復(fù)上起著重要的作用。特別地，來(lái)自臨床和動(dòng)物研究的證據(jù)表明ApoE4同工型的出現(xiàn)與各種急性大腦損傷的神經(jīng)系統(tǒng)難以康復(fù)相關(guān)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人開發(fā)了針對(duì)載脂蛋白E(ApoE)某個(gè)區(qū)域的治療用抗體，該區(qū)域在包括阿耳茨海默氏病斑塊的淀粉樣沉積的蛋白聚集物中是暴露的，但在其它形式如血液中的脂蛋白顆粒中的ApoE中無(wú)法接近或僅能受限接近。
因此，本發(fā)明提供 一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段 (i)結(jié)合一種多肽，該多肽具有載脂蛋白E的C端結(jié)構(gòu)域(ApoE-CTD)的氨基酸序列(見(jiàn)SEQ ID NO1)或其部分的氨基酸序列；并且 (ii)結(jié)合人斑塊； 一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段 (i)結(jié)合一種多肽，該多肽具有ApoE-CTD的氨基酸序列(見(jiàn)SEQ ID NO1)或其部分的氨基酸序列；并且 (ii)包含重鏈CDR3區(qū)，該區(qū)包含序列SEQ ID NO20、SEQ IDNO512、SEQ ID NO513、SEQ ID NO514、SEQ ID NO515、SEQ IDNO516或SEQ ID NO517； 一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段 (i)結(jié)合一種多肽，該多肽具有ApoE-CTD的氨基酸序列(見(jiàn)SEQ ID NO1)或其部分的氨基酸序列；并且 (ii)包含重鏈CDR3區(qū)，該區(qū)包含選自下列序列的氨基酸序列SEQ ID NO29、SEQ ID NO47、SEQ ID NO50、SEQ ID NO53、SEQID NO56、SEQ ID NO59、SEQ ID NO62、SEQ ID NO65、SEQ IDNO68、SEQ ID NO71、SEQ ID NO74、SEQ ID NO77、SEQ IDNO80、SEQ ID NO83、SEQ ID NO86和SEQ ID NO89； 一種人抗體或抗體片段，在VLDL存在時(shí)，該抗體或片段結(jié)合一種多肽，該多肽具有ApoE-CTD的氨基酸序列(見(jiàn)SEQ ID NO1)或其部分的氨基酸序列； 一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段 (i)結(jié)合人斑塊；并且 (ii)包含重鏈CDR3區(qū)，該區(qū)包含選自下列序列的氨基酸序列SEQ ID NO20、SEQ ID NO512、SEQ ID NO513、SEQ ID NO514、SEQ ID NO515、SEQ ID NO516或SEQ ID NO517； 一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段 (i)結(jié)合人斑塊；并且 (ii)包含重鏈CDR3區(qū)，該區(qū)包含選自下列序列的氨基酸序列SEQ ID NO29、SEQ ID NO47、SEQ ID NO50、SEQ ID NO53、SEQID NO56、SEQ ID NO59、SEQ ID NO62、SEQ ID NO65、SEQ IDNO68、SEQ ID NO71、SEQ ID NO74、SEQ ID NO77、SEQ IDNO80、SEQ ID NO83、SEQ ID NO86和SEQ ID NO89； 一種抗體或抗體片段，其包括SEQ ID NO136中所示的重鏈序列和SEQ ID NOS521和522所示的輕鏈序列； 一種抗體或抗體片段，其包括SEQ ID NO142所示的重鏈序列和SEQ ID NO523所示的輕鏈序列； 一種抗體或抗體片段，其包括SEQ ID NO40所示的重鏈序列和SEQ ID NO517和/或518所示的輕鏈序列； 一種抗體或抗體片段，其包括SEQ ID NO40所示的重鏈序列和SEQ ID NO519和/或520所示的輕鏈序列； 一種抗體或抗體片段，其包括SEQ ID NO24所示的重鏈CDR1序列，SEQ ID NO25所示的重鏈CDR2序列和SEQ ID NOS207、209和210任一序列所示的重鏈CDR3序列； 一種抗體或抗體片段，其包括SEQ ID NO48所示的重鏈CDR1序列，SEQ ID NO49所示的重鏈CDR2序列和和SEQ ID NOS320、322和323任一序列所示的重鏈CDR3序列； 一種抗體或抗體片段，其包括SEQ ID NO66所示的重鏈CDR1序列，SEQ ID NO67所示的重鏈CDR2序列和SEQ ID NOS373所示的重鏈CDR3序列； 上述任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其為單克隆抗體； 本發(fā)明的抗體或抗體片段，其用于治療人體或動(dòng)物體的治療方法，或在人體或動(dòng)物體上所進(jìn)行的診斷方法； 本發(fā)明的抗體或抗體片段在用于治療或預(yù)防淀粉樣變性病的藥物的制備中的用途； 一種藥物組合物，包含本發(fā)明的抗體或抗體片段和可藥用的載體或稀釋劑； 一種治療患淀粉樣變性病的受試者的方法，包括將治療有效量的本發(fā)明的抗體或抗體片段給藥給所述受試者； 一種診斷受試者是否患淀粉樣變性病的方法，包括 (i)將本發(fā)明的抗體或抗體片段給藥給所述受試者；和 (ii)測(cè)定所述抗體或抗體片段是否結(jié)合所述受試者的斑塊，其中所述抗體或抗體片段與斑塊的結(jié)合是淀粉樣變性病的指標(biāo)，由此可測(cè)定是否受試者患淀粉樣變性病； 一種多核苷酸，其編碼本發(fā)明的抗體或抗體片段； 一種載體，其包括本發(fā)明的多核苷酸； 一種宿主細(xì)胞，其表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸； 一種病毒，其編碼本發(fā)明的多核苷酸； 一種檢測(cè)ApoE-CTD的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明的抗體或抗體片段和檢測(cè)所述抗體或抗體片段的手段；和 一種檢測(cè)來(lái)自受試者的樣本中ApoE-CTD存在的方法，該方法包括 (i)在允許抗體或抗體片段與ApoE-CTD結(jié)合的條件下，將來(lái)自受試者的樣本與本發(fā)明的抗體或抗體片段相接觸；并 (ii)檢測(cè)抗體或抗體片段是否與樣本結(jié)合，由此檢測(cè)樣本中是否存在任何ApoE-CTD。



圖1示出在ELISA中已知單克隆抗體與生物素化CTD(bCTD)和VLDL的結(jié)合。
圖2示出噬菌體與bCTD(本底＝0.05)和VLDL(本底＝0.1)的結(jié)合。
圖3示出在203個(gè)噬菌體克隆上的bCTD(A)和VLDL(B)ELISA的實(shí)例。
圖4示出包被在bCTD上的sFab抗體M27E11(A)、M28B02(B)和M26F05(C)的Biacore親和力分析，以及用Fab M27E11包被傳感芯片(D)的Biacore親和力分析。
圖5示出將Fab轉(zhuǎn)移到pBh1的方法示意圖。
圖6示出抗體807A-M0028-B02(M28B02)(A)、807A-M0026-F05(M26F05)(B)和807A-M0027-E11(M27E11)(C)與人CTD、鼠CTD和靈長(zhǎng)類CTD的結(jié)合。
圖7示出對(duì)照抗體PH1(A)和807A-M0028-B02(M28B02)(B)與bCTD和bNTD的結(jié)合。
圖8示出對(duì)照抗體PH1(A)和807A-M0028-B02(M28B02)(B)與包被VLDL的結(jié)合。
圖9示出包被bCTD(0.05μg/ml)和溶液中過(guò)量VLDL或CTD在競(jìng)爭(zhēng)性ELISA中的抗體結(jié)合的結(jié)果。
圖10示出807A-M0026-F05(M26F05)為可溶性Fab(上圖)和IgG(下圖)時(shí)在CTD-對(duì)照芯片上的Biacore親和力分析。
圖11示出807A-M0027-E11(A)和807A-M0028-B02(B)為可溶性Fab(上圖)和IgG(下圖)時(shí)在CTD-包被芯片上的Biacore親和力分析。
圖12示出溶液中bCTD與間接偶聯(lián)到Biaeore傳感芯片上的Fab807A-M0027-E11(M27E11)的結(jié)合。
圖14為將pBh1的V區(qū)轉(zhuǎn)移到pRmk2a的方法示意圖。
圖15示出CTD肽的序列。
圖16示出實(shí)例21的選擇過(guò)程。
圖17示出實(shí)例22的選擇過(guò)程。
圖18示出實(shí)例23的選擇過(guò)程。
圖19示出“剪切和粘貼”抗體重構(gòu)方法。
圖20示出AD病人腦切片中的斑塊與807A-M0028-B02的結(jié)合在VLDL存在時(shí)不能被阻斷。807A-M0028-B02與體外人淀粉樣斑塊的結(jié)合不受到VLDL存在的影響，表明相對(duì)于斑塊中的CTD，抗體對(duì)VLDL中的CTD具有極低的親和力。
圖21示出在AD病人腦切片上對(duì)sFab抗體的體外免疫組織化學(xué)(IHC)篩選的結(jié)果。通過(guò)免疫組織化學(xué)識(shí)別到來(lái)自不同選擇的幾種抗體(Fab克隆)，該抗體結(jié)合AD斑塊。需要注意的是單個(gè)克隆可具有相同縮寫，如E11，但是來(lái)自不同選擇，并不是相同的(C11＝807B-M0004-H03；(組織切片A)E11＝807A-M0027-E11；B2＝807A-M0028-B02；(組織切片B)E11＝807B-M0083-E11；D10＝807B-M0079D10；A3＝807B-M0004-A03；A12＝807B-M0013-A12)。
圖22示出807A-M0028-B02、807A-M0028-B02.1和807A-M0028-B02.2與人、靈長(zhǎng)類和鼠ApoE-CTD的濃度依賴的結(jié)合的代表性結(jié)果(兩個(gè)樣本)。
圖23示出807A-M0028-B02、807A-M0028-B02.1、807A-M0028-B02.2、807B-M0004-H03、807B-M0004-H03.1、807B-M0004-A03和807B-M0004-A03.1與人VLDL濃度依賴的結(jié)合的代表性結(jié)果(兩個(gè)樣本)。
圖24示出在APP/PS1小鼠的腦切片中807A-M0028-B02與斑塊結(jié)合的檢測(cè)。
(a)在注射4日后807A-M0028-B02的在體結(jié)合。
(b)在注射7日后807A-M0028-B02的在體結(jié)合。
圖25示出807B M0004H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10和807B-M0009-F06的體內(nèi)斑塊結(jié)合能力的篩選結(jié)果。示出體內(nèi)給藥后，在APP/PS1小鼠腦切片中抗-CTD hIgG克隆B807B-M0004H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10和807B-M0009-F06的免疫組織化學(xué)表達(dá)方式。
圖26示出在AD病人腦切片中親和力成熟的Fab-克隆的斑塊結(jié)合能力的體外篩選結(jié)果。野生型克隆807B-M0004-A03(wt A03)與親和力成熟的克隆807B-M0118-B09(BO9)、807B-M0117-F05(F05)、807B-M0117-G01(G01)和807B-M0118-F03(F03)相比較。AD病人腦切片上的淀粉樣斑塊通過(guò)抗-CTD結(jié)合抗體(Fab克隆)顯示。
圖27示出807A-M0028-B02、807B-M0004-H03、807B-M004-A03、807B-M0079-D10和07B-M0009-F06的親和力成熟的方法。
序列說(shuō)明 SEQ ID NO1是ApoE-CTD的氨基酸序列。
SEQ ID NO2是肽1(ApoE-CTD的1到16個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是肽2(ApoE-CTD的17到32個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO4是肽3(ApoE-CTD的33到48個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO5是肽4(ApoE-CTD的49到64個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO6是肽5(ApoE-CTD的65到80個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO7是肽6(ApoE-CTD的9到24個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO8是肽7(ApoE-CTD的25到40個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO9是肽8(ApoE-CTD的41到56個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO10是肽9(ApoE-CTD的57到72個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO11是肽10(ApoE-CTD的73到84個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO12是肽4中表位(ApoE-CTD的53到60個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO13是肽4和9中表位(ApoE-CTD的57到64個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO14是肽9中表位(ApoE-CTD的61到68個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO15是肽1和6中表位(ApoE-CTD的9到16個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO16是肽4和8中表位(ApoE-CTD的49到56個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO17是肽3和8中表位(ApoE-CTD的41到48個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO18是肽1和6(ApoE-CTD的1到24個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO19是肽8和9(ApoE-CTD的41到72個(gè)氨基酸)的氨基酸序列。
SEQ ID NO20是抗體807A-M0027-Ell和807A-M0028-B02的共有CDR3序列的氨基酸序列。
SEQ ID NOS21到164在表8中描述。
SEQ ID NO165是人ApoE4的氨基酸序列。
SEQ ID NO166是人ApoE3的氨基酸序列。
SEQ ID NO167是人ApoE2的氨基酸序列。
SEQ ID NO168是人ApoE4的成熟形式的氨基酸序列。
SEQ ID NO169是人ApoE3的成熟形式的氨基酸序列。
SEQ ID NO170是人ApoE2的成熟形式的氨基酸序列。
SEQ ID NOS171到206在表8中描述。
SEQ ID NOS207到511在表38到42中描述。
SEQ ID NO512是親和力成熟克隆807A-M0028-B02的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO513是親和力成熟克隆807B-M0004-A03的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO514是親和力成熟克隆807B-M0004-H03的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO515是親和力成熟克隆807B-M0009-F06的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO516是被選親和力成熟克隆807A-M0028-B02的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO517是被選親和力成熟克隆807B-M0004-A03的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO518到527在表21中定義。

具體實(shí)施例方式 A.多肽 本發(fā)明提供結(jié)合載脂蛋白E(ApoE)的某個(gè)區(qū)域的抗體，該區(qū)域在諸如阿耳茨海默氏病斑塊的淀粉樣沉積的蛋白聚集物中是暴露的，但它在其它ApoE形式如血液中的脂蛋白顆粒中不存在或不可接近。
基于本發(fā)明的目的，除非另外指明，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括抗體片段。
一般地，本發(fā)明的抗體結(jié)合載脂蛋白E的C端結(jié)構(gòu)域(ApoE-CTD)，也就是說(shuō)與ApoE-CTD反應(yīng)。本發(fā)明的抗體不與載脂蛋白E的N端結(jié)構(gòu)域(ApoE-NTD)結(jié)合。一般地，抗體優(yōu)先于VLDL中的ApoE形式結(jié)合人斑塊中的ApoE形式。一般地，人斑塊中的ApoE形式是ApoE-CTD。優(yōu)選地，在極低密度脂蛋白(VLDL)存在時(shí)，本發(fā)明的抗體結(jié)合ApoE-CTD。本發(fā)明的抗體可為結(jié)合ApoE-CTD的表位的抗體，該表位在與VLDL相關(guān)的ApoE中不存在。例如，在ApoE與VLDL相關(guān)時(shí)，表位可以是抗體無(wú)法接近或未暴露于抗體?？贵w結(jié)合的表位一般在VLDL的全長(zhǎng)ApoE中是隱藏的，因此，抗體對(duì)ApoE的親和力基本低于抗體對(duì)ApoE-CTD的親和力。結(jié)合抗體的表位僅存在于ApoE-CTD中，而不在ApoE-NTD中，因此抗體一般都缺乏結(jié)合ApoE-NTD的能力。與抗體和ApoE-CTD之間的特異性結(jié)合相比，抗體與ApoE-NTD的任何結(jié)合一般均為親和力顯著較低的非特異性結(jié)合。顯著較低的親和力一般指親和力至少低二倍、三倍、五倍、十倍、五十倍或一百倍。
因此，本發(fā)明的抗體優(yōu)先結(jié)合或特異結(jié)合ApoE-CTD。抗體“優(yōu)先結(jié)合”或“特異結(jié)合”ApoE-CTD是指，抗體以優(yōu)先的或較高的親和力結(jié)合ApoE-CTD，但是基本不結(jié)合、不結(jié)合或以較低親和力結(jié)合其它多肽。測(cè)定抗體特異性結(jié)合的結(jié)合分析、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析或免疫放射分析(immuno-radiometric assays)的各種方法已為本領(lǐng)域所熟知(見(jiàn)如Maddox et al，J.Exp.Med.158，1211-1226，1993)。一般地，這種免疫分析包括特異蛋白和其抗體間的復(fù)合物的形成以及復(fù)合物形成的檢測(cè)。一般地，本發(fā)明的抗體能以至少為107M-1，優(yōu)選至少為108M-1、109M-1或1010M-1的親和常數(shù)結(jié)合具有SEQ ID NO1所示出序列的ApoE-CTD。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體能優(yōu)先結(jié)合ApoE-CTD，該結(jié)合的親和力為該抗體結(jié)合非特異性多肽如BSA、酪蛋白、VLDL、ApoE-NTD或VLDL中的ApoE的親和力的至少二倍、十倍、五十倍、一百倍或更高。
在固定ApoE-CTD的ELISA中，特異性結(jié)合ApoE-CTD的抗體一般顯示出至少2×本底值的結(jié)合，但是與諸如ApoE-NTD或鏈霉親和素的對(duì)照蛋白的結(jié)合低于2×本底值，一般為1×本底值。
本發(fā)明的抗體一般結(jié)合人斑塊。術(shù)語(yǔ)“人斑塊”旨在包括任何淀粉樣沉積，其包括具有至少一種由人基因編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，人斑塊存在于或來(lái)源于人組織。更優(yōu)選地，人斑塊存在于來(lái)自受試人的樣本。受試人可患諸如系統(tǒng)性淀粉樣變性病或阿耳茨海默氏病的淀粉樣變性病。樣本可取自含淀粉樣斑塊的任何組織或器官。合適的組織和器官包括腦、舌、小腸、骨骼肌、平滑肌、神經(jīng)、皮膚、韌帶、心臟、肝臟、脾臟和腎臟。若受試者患阿耳茨海默氏病，樣本一般為腦切片。腦切片一般在死后獲得。從任何這些樣本中制備得到的纖維(Fibrils)也包括在術(shù)語(yǔ)“人斑塊”中。
人斑塊可存在于或來(lái)源于除人類以外的動(dòng)物，該動(dòng)物含有一種或多種，例如兩種或三種發(fā)現(xiàn)于淀粉樣沉積的人蛋白的轉(zhuǎn)基因。優(yōu)選地，人蛋白為ApoE，但可為淀粉樣前體蛋白(APP)(一般包括瑞典型突變(Swedish mutation)或早老素。
可使用任何合適的方法測(cè)定與人斑塊的結(jié)合。例如在IHC分析中，在首次檢測(cè)的兩個(gè)淀粉樣沉積樣本中用＜20μg/ml抗體染色后均獲得了陽(yáng)性盲法計(jì)數(shù)IHC信號(hào)，或若在首次檢測(cè)中其中一個(gè)樣本為陰性，而在隨后的檢測(cè)中至少三分之二的樣本表明抗體結(jié)合人斑塊上，則認(rèn)為抗體結(jié)合人斑塊。優(yōu)選地，樣本來(lái)自不同個(gè)體，并切自經(jīng)組織學(xué)證明含淀粉樣沉積的組織樣本，該沉積用諸如Aβ的淀粉樣標(biāo)記顯示出IHC陽(yáng)性。
可使用患阿耳茨海默氏病或系統(tǒng)性淀粉樣變性病的小鼠或其它除人類以外的動(dòng)物模型，如嚙齒類或靈長(zhǎng)類，在體測(cè)定抗體結(jié)合人斑塊的能力。
在此分析中，可使用IHC分析檢測(cè)抗體對(duì)斑塊的結(jié)合。在檢測(cè)前可將抗體標(biāo)記。與斑塊的結(jié)合被定義為在至少三分之二的待測(cè)小鼠中，單劑量或多劑量注射≤1mg的抗體后，淀粉樣蛋白為陽(yáng)性盲法計(jì)數(shù)IHC染色。一般地，該信號(hào)與來(lái)自陰性同種型匹配的對(duì)照抗體注射的小鼠的解剖、性別和年齡匹配的染色組織的信號(hào)比較。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“表位”指與特定結(jié)合多肽相接觸的分子的部分。表位可為線性的，包括抗原的基本為線性的氨基酸序列，或?yàn)橐欢?gòu)象的，包括被其它序列分隔、但在結(jié)構(gòu)上聚集在一起形成多肽的結(jié)合位點(diǎn)的序列。
在結(jié)合抗體的ApoE-CTD中的表位可出現(xiàn)在剪切全長(zhǎng)ApoE后的ApoE-CTD上。或者，表位可在ApoE-CTD與淀粉樣斑塊相互作用后出現(xiàn)，比如在ApoE-CTD與Aβ相結(jié)合后出現(xiàn)。ApoE的剪切和/或ApoE-CTD與淀粉樣斑塊的結(jié)合可導(dǎo)致新的線性(肽)表位的暴露和/或新構(gòu)象的表位的暴露或形成。由于ApoE與VLDL的其它組分的相互作用，本發(fā)明的多肽所結(jié)合的表位在VLDL相關(guān)的ApoE中可以是隱藏的。多肽可特異性結(jié)合由ApoE-CTD和Aβ形成的復(fù)合物。
ApoE-CTD的氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID NO1。因此，ApoE-CTD表位可由SEQ ID NO1的ApoE-CTD序列內(nèi)的線性或構(gòu)象序列形成。與ApoE-CTD結(jié)合的抗體一般結(jié)合具有SEQ ID NO1所示全部序列的ApoE-CTD多肽，也可結(jié)合SEQ ID NO1所示部分氨基酸序列，如結(jié)合具有SEQ ID NOS2到19所示任一氨基酸序列的肽。優(yōu)選地，抗體與SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16或SEQ ID NO17所示的一個(gè)或多個(gè)肽結(jié)合。與抗體結(jié)合的ApoE-CTD部分為至少具有SEQ ID NO1的三個(gè)氨基酸的片段，優(yōu)選至少五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)或八個(gè)氨基酸的片段，更優(yōu)選10、12或16個(gè)氨基酸的片段。
與抗體結(jié)合的多肽(或肽)可為重組多肽。多肽可溶于溶液，或者，更為優(yōu)選地，可附著在固體表面上。例如，多肽可附著在諸如磁珠的微珠上。
可將多肽生物素化。通過(guò)將生物素偶聯(lián)到固體表面的鏈霉親和素上，使用綴合肽的生物素分子將多肽固定在固體表面上。
適合用于治療或預(yù)防阿耳茨海默氏病和/或系統(tǒng)性淀粉樣變性病的本發(fā)明的抗體在來(lái)自體內(nèi)的巨噬細(xì)胞分析中一般檢測(cè)為陽(yáng)性。陽(yáng)性巨噬細(xì)胞分析定義如下加入≤20μg/ml抗體后在淀粉樣組織上共同培養(yǎng)，通過(guò)陽(yáng)性盲法計(jì)數(shù)共聚焦顯微檢測(cè)在至少三分之二的待測(cè)培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)含有淀粉樣蛋白的巨噬細(xì)胞。一般將該信號(hào)與來(lái)自同一共培養(yǎng)物的信號(hào)相比較，而該共培養(yǎng)物含相同濃度的陰性對(duì)照抗體。陽(yáng)性巨噬細(xì)胞分析一般也會(huì)引起淀粉樣蛋白的降解，例如，與來(lái)自含有相同濃度陰性對(duì)照抗體的同一共培養(yǎng)物的點(diǎn)相比，在共培養(yǎng)達(dá)到三天時(shí)，Western blot顯示保留了低于Aβ密度的三分之一。
用于治療的抗體和其它肽類通常對(duì)ApoE-CTD具有較高的親和力，優(yōu)選具有＜1nM的親和力，該親和力能使其在大腦中即使?jié)舛容^低也能發(fā)揮最佳功能，該濃度在全身注射后會(huì)得到累加。
術(shù)語(yǔ)“抗體”指含至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)重鏈可變區(qū)(VH)和/或至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)輕鏈可變區(qū)(VL)的蛋白。VH區(qū)和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)(hypervariability)，又稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)，其分布在更為保守的區(qū)域內(nèi)，后者稱為“骨架區(qū)”(FR)。FR和CDRs的范圍已被精確定義(見(jiàn)Kabat，et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，F(xiàn)ifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242；Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196901-917，其在此通過(guò)引用全文納入本文中)。每個(gè)VH和VL均由三個(gè)CDRs和四個(gè)FRs構(gòu)成，其按照如下順序從N端到C端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗體的VH鏈或VL鏈可進(jìn)一步包括全部重鏈或輕鏈恒定區(qū)或其中一部分，因此分別形成重鏈或輕鏈免疫球蛋白鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是兩條重鏈和兩條輕鏈的四聚體，其中，重鏈和輕鏈通過(guò)諸如二硫鍵相互連接。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)。抗體的恒定區(qū)一般介導(dǎo)抗體與宿主組織和因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)中的第一組分)的結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的免疫球蛋白IgA、IgG、IgE、IgD、IgM及其亞型。優(yōu)選地免疫球蛋白為IgG。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”指由一個(gè)或多個(gè)多肽(基本由免疫球蛋白基因編碼)組成的蛋白。已識(shí)別的人免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)(IgA1和IgA2)、γ(gamma)(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ(delta)、ε(epsilon)和μ(mu)恒定區(qū)基因以及許多免疫球蛋白可變區(qū)基因。全長(zhǎng)免疫球蛋白輕鏈(大約25kD或214個(gè)氨基酸)由N端的可變區(qū)(大約110個(gè)氨基酸)基因和C端的κ(kappa)或λ(lambda)恒定區(qū)編碼。全長(zhǎng)免疫球蛋白重鏈(大約50kD或446個(gè)氨基酸)由N端(大約116個(gè)氨基酸)的可變區(qū)基因和C端其它的上述恒定區(qū)基因其中的一種(如γ(gamma)，編碼大約330個(gè)氨基酸)編碼。
本發(fā)明的抗體片段一般為抗原結(jié)合片段。術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”指能特異性結(jié)合ApoE-CTD的全長(zhǎng)抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段(由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的一價(jià)片段)；(ii)F(ab’)2片段(含有兩個(gè)Fab片段，并由二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的二價(jià)片段)；(iii)Fd片段(由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成)；(iv)Fv片段(由抗體單臂的VH和VL結(jié)構(gòu)域組成)；(v)dAb片段(由VH結(jié)構(gòu)域組成)；(vi)分離CDR；(vii)單鏈Fv(scFv)(由抗體的單臂的VH和VL結(jié)構(gòu)域組成，該抗體通過(guò)合成接頭使用重組方法連接，從而將VH和VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)以形成一價(jià)分子)；(viii)雙體(由兩個(gè)scFvs組成，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域連接起來(lái)，因此它們不會(huì)配對(duì)形成一價(jià)分子；每個(gè)scFv的VH與另一scFv的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)形成二價(jià)分子)；(ix)雙特異性抗體(由至少兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)組成，每個(gè)區(qū)域結(jié)合一個(gè)不同的表位)。優(yōu)選地，抗體片段為Fab片段或單鏈抗體(scFv)。
優(yōu)選的CDR1結(jié)構(gòu)域的序列見(jiàn)SEQ ID NOS21、24、27、30、33、36、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、93、111、117和123。其它優(yōu)選的CDR1結(jié)構(gòu)域?yàn)檫@些序列的變體，其中序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失或，更為優(yōu)選地，被置換。其它優(yōu)選的CDR1結(jié)構(gòu)域是下列序列中任一序列的變體SEQ ID NOS21、24、27、30、33、36、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、93、111、117和123，其中插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，變體CDR1結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)或多個(gè)，例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)置換，優(yōu)選保守置換。該CDR1變體序列的實(shí)例為L(zhǎng)V-CDR1序列，見(jiàn)表38、39、40、41和42。優(yōu)選地CDR1序列包括SEQ ID NOS33、219、226、218、326、93、325、391和394。
優(yōu)選的CDR2結(jié)構(gòu)域的序列見(jiàn)SEQ ID NOS22、25、28、31、34、37、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、94、112、118和124。其它優(yōu)選的CDR2結(jié)構(gòu)域是這些序列的變體，其中序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失，或者，更為優(yōu)選地，被置換。其它優(yōu)選的CDR2結(jié)構(gòu)域是下列序列中任一序列的變體SEQ IDNOS22、25、28、31、34、37、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、94、112、118和124，其中插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，變體CDR2結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)或多個(gè)，例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)置換，優(yōu)選保守置換。該CDR2變體序列的實(shí)例為L(zhǎng)V-CDR2序列，見(jiàn)表38、39、40、41和42。優(yōu)選的CDR2序列包括SEQ ID NOS382、386、333、334、34、247和252。
優(yōu)選的CDR3結(jié)構(gòu)域的序列見(jiàn)SEQ ID NOS23、26、29、32、35、38、47、50、53、56、59、62、65、65、68、71、74、77、80、83、86、89、95、113、119和125。其它優(yōu)選的CDR3結(jié)構(gòu)域是這些序列的變體，其中序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失，或者，更為優(yōu)選地，被置換。其它優(yōu)選的CDR3結(jié)構(gòu)域是下列序列中任一序列的變體SEQID NOS23、26、29、32、35、38、47、50、53、56、59、62、65、65、68、71、74、77、80、83、86、89、95、113、119和125，其中插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，變體CDR3結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)或多個(gè)，例如兩個(gè)或三個(gè)保守置換。
保守置換見(jiàn)下表。在第二列中同一格的氨基酸可以彼此置換，優(yōu)選第三列中同一行中的氨基酸彼此置換。
變體CDR3序列的實(shí)例是HV-CDR3和LV-CDR3序列，見(jiàn)表38、39、40、41和42。優(yōu)選的變體CDR3序列見(jiàn)SEQ ID NOS207、209、210、35、269、252、34、322、323、320、341、373和378。
優(yōu)選的抗體包括(i)SEQ ID NO39示出的VH序列或其變體，和SEQ ID NO42示出的VL序列或其變體；(ii)SEQ ID NO40示出的VH序列或其變體，和SEQ ID NO43示出的VL序列或其變體；(iii)SEQ ID NO41示出的VH序列或其變體，和SEQ ID NO44示出的VL序列或其變體。
其它優(yōu)選的抗體包括選自SEQ ID NOS317、318、319、369、370、371、372和397所示出序列的重鏈序列和可選的選自SEQ ID NOS43、295、294、304、347、348、357、362、406和418的輕鏈序列。更優(yōu)選的抗體包括具有如下重鏈和輕鏈序列組合的抗體SEQ ID NOS319和43、SEQ ID NOS318和295、SEQ ID NOS318和294、SEQ ID NOS317和304、SEQ ID NOS370和347、SEQ ID NOS370和348、SEQID NOS371和348、SEQ ID NOS372和348、SEQ ID NOS369和357、SEQ ID NOS370和362、SEQ ID NOS397和406、SEQ ID NOS397和418。
可通過(guò)任何合適的方法獲得變體抗體。一般地，通過(guò)親和力成熟方法選擇具有改良結(jié)合特征的變體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是重組或經(jīng)修飾的抗-ApoE-CTD抗體，如嵌合抗體、人源化抗體、去免疫力抗體或體外形成的抗體。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“重組”或“經(jīng)修飾”的抗體旨在包括通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、形成或分離得到的所有抗體，諸如(i)使用被轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體所表達(dá)的抗體；(ii)分離自重組、組合抗體文庫(kù)的抗體；(iii)分離自轉(zhuǎn)入人免疫球蛋白基因的動(dòng)物(如小鼠)的抗體；或(iv)通過(guò)其它方法制備、表達(dá)、形成或分離得到的抗體，這些方法包括將人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列。這種重組抗體包括人源化抗體、CDR嫁接抗體、嵌合抗體、去免疫力抗體、體外形成的抗體，并且視情況還可包括來(lái)源于人種系的免疫球蛋白序列的恒定區(qū)。
本發(fā)明的抗體為人抗體。該抗體可為嵌合抗體、重組抗體、人源化抗體、單克隆抗體或多克隆抗體。優(yōu)選地，該抗體為單克隆抗體。
抗體可綴合功能部分，如藥物、檢測(cè)部分或固體支持物。
本發(fā)明還包括含有兩種或多種結(jié)合ApoE-CTD不同表位的抗體的組合物。組合物中的抗體可結(jié)合重疊表位(overlapping epitope)。結(jié)合重疊表位的抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制彼此與ApoE-CTD的結(jié)合。
優(yōu)選地，抗體為單特異性的，如單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。也提供雙特異性抗體或多價(jià)抗體，其結(jié)合ApoE-CTD的兩個(gè)或多個(gè)不同表位。
本發(fā)明的抗體可連接諸如生物素的結(jié)合部分。例如，抗體，優(yōu)選IgG，可通過(guò)與磺基琥珀酰-2-(生物素氨基)乙基-1，3-二硫代丙酸酯(sulfosuccinimidyl-2-(biotinamido)ethyl-1，3-dithiopropionate)孵育生物素化。生物素化IgG優(yōu)選包含1個(gè)到5個(gè)，如2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)生物素基團(tuán)。
本發(fā)明的抗體可為基本分離的形式。它們可與不影響其預(yù)定的用途的載體或稀釋劑混合，并仍被視為基本分離的。它們也可為基本純化的形式，在此情況下它們一般包括至少90％的多肽或制品干物質(zhì)，如至少95％、98％或99％。
B.鑒定抗體的方法 本發(fā)明還提供鑒定本發(fā)明的抗體的方法。一般地，該方法包括鑒定結(jié)合一種多肽的抗體，該多肽具有SEQ ID NO1示出的氨基酸序列，或其部分的氨基酸序列；該方法也包括鑒定結(jié)合人斑塊的抗體。在VLDL存在時(shí)對(duì)兩者之一或者兩者進(jìn)行結(jié)合分析。該方法一般包括提供展示文庫(kù)，并篩選該文庫(kù)，以鑒定編碼結(jié)合ApoE-CTD或其片段和/或人斑塊的抗體的成員，優(yōu)選在VLDL存在時(shí)進(jìn)行。展示文庫(kù)是所有實(shí)體的集合，每一個(gè)實(shí)體均包括一個(gè)可接近的抗體組分和編碼或識(shí)別抗體組分的可回收組分?？贵w組分可為任何長(zhǎng)度，如三個(gè)氨基酸到超過(guò)三百個(gè)氨基酸，例如30、100或200個(gè)氨基酸；并且抗體組分一般為抗體片段，優(yōu)選Fab片段。在選擇中，文庫(kù)中每個(gè)成員的抗體組分均可用ApoE-CTD探測(cè)，如果抗體組分結(jié)合ApoE-CTD或其片段，一般通過(guò)支持物上的保留可鑒定展示文庫(kù)成員。一般也可檢測(cè)結(jié)合ApoE-CTD的展示文庫(kù)成員與ApoE-NTD的結(jié)合(負(fù)選擇)。
從支持物上獲得并分析保留的展示文庫(kù)成員。該分析包括在相似的或不同的條件下進(jìn)行擴(kuò)增，隨后進(jìn)行選擇。例如，可改變正選擇和負(fù)選擇。該分析也可包括測(cè)定抗體組分的氨基酸序列和純化抗體組分，以進(jìn)行詳細(xì)表征。
許多形式均可用于展示文庫(kù)，任何合適的形式可均用于本發(fā)明的方法中。優(yōu)選的形式為噬菌體展示和基于細(xì)胞的展示，例如酵母展示。
在噬菌體展示中，候選抗體一般共價(jià)連接到噬菌體外殼蛋白上。連接產(chǎn)生的原因是由于編碼融合到外殼蛋白的候選抗體其核酸的翻譯。連接可包括柔性肽接頭、蛋白酶位點(diǎn)或由于終止密碼子的抑制所摻入的氨基酸。噬菌體展示的介紹參見(jiàn)Ladner et al.，U.S.Patent No.5,223,409；Smith(1985)Science 2281315-1317；WO 92/18619；WO91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/02809；WO 90/09690；de Haard et al.(1999)J.Biol.Chem.27418218-30；Hoogenboom et al.(1998)Immunotechnology 41-20；Hoogenboom et al.(2000)Immunol.Today 2371-8；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 381-85；Huse et al.(1989)Science 2461275-1281；Griffithset al.(1993)EMBO J.12725-734；Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.226889-896；Clackson et al.(1991)Nature 352624-628；Gram et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893576-3580；Garrard et al.(1991)Bio/Technology 91373-1377；Rebar et al.(1996)Methods Enzymol.267129-49；Hoogenboom et al.(1991)Nuc.Acids Res.194133-4137；Barbas et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887978-7982和Lee et al.(2003)Trends In Biotechnology 2145-52。
噬菌體展示系統(tǒng)已在絲狀噬菌體(噬菌體fl、fd和M13)以及其它細(xì)菌噬菌體(如T7細(xì)菌噬菌體和λ噬菌體；見(jiàn)如Santini(1998)J.Mol.Biol.282125-135；Rosenberg et al.(1996)Innovations 61-6；Houshmetet al.(1999)Anal.Biochem.268363-370)中開發(fā)。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般使用與次要外殼蛋白如基因III蛋白和主要外殼蛋白基因VIII蛋白的融合物，同時(shí)也可使用與其它外殼蛋白，如基因VI蛋白、基因VII蛋白、基因IX蛋白或者其結(jié)構(gòu)域的融合物(參見(jiàn)，例如WO00/71694)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合物是與基因III蛋白的結(jié)構(gòu)域如錨定結(jié)構(gòu)域(anchor domain)或“殘干(stump)”的融合物(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利No.5,658,727對(duì)基因III蛋白錨定結(jié)構(gòu)域的描述)。
也可控制候選多肽的價(jià)數(shù)。將編碼多肽組分的序列克隆到完整噬菌體基因組，可產(chǎn)生多變體展示(multivariant display)，這是由于基因III蛋白的所有復(fù)本都融合到多肽組分上。為降低價(jià)數(shù)，可使用噬菌粒系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，編碼融合到基因III的多肽組分的核酸位于質(zhì)粒中，一般長(zhǎng)度小于700個(gè)核苷酸。該質(zhì)粒包括噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)，因此在含質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞被諸如M13K07的輔助噬菌體感染時(shí)，該質(zhì)?？蓳饺爰?xì)菌噬菌體顆粒中。輔助噬菌體提供基因III的完整拷貝，以及其它用于噬菌體復(fù)制和裝配的噬菌體基因。輔助噬菌體復(fù)制起點(diǎn)缺失，因此，相對(duì)于具有野生型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒，輔助噬菌體基因組不能有效摻入噬菌體顆粒中。
可使用標(biāo)準(zhǔn)噬菌體制備方法，如生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PEG沉淀法，培養(yǎng)和獲取展示候選抗體的細(xì)菌噬菌體。
在選擇單個(gè)展示噬菌體后，可通過(guò)使用所選噬菌體感染細(xì)胞，獲得編碼所選候選抗體的核酸?？商羧蝹€(gè)菌落或噬菌斑、分離核酸并對(duì)其測(cè)序。
在獲得本發(fā)明的ApoE-CTD結(jié)合物的篩選方法中，展示文庫(kù)與靶ApoE-CTD分子(一般固定在固體支持物上)相接觸并結(jié)合。將未結(jié)合物和結(jié)合物分離。在許多方法中，已結(jié)合的噬菌體從ApoE-CTD中釋放、收集和擴(kuò)增。由于噬菌體可通過(guò)感染細(xì)菌細(xì)胞擴(kuò)增，因此即使少量的結(jié)合噬菌體也足以揭示編碼結(jié)合實(shí)體的基因序列。采用這些技術(shù)，可以回收占群體大約兩千萬(wàn)分之一的結(jié)合噬菌體。一個(gè)或多個(gè)文庫(kù)，其中每個(gè)文庫(kù)展示1-2×107或更多可能的結(jié)合多肽，可被快速篩選以發(fā)現(xiàn)較高親和力ApoE-CTD結(jié)合物。在進(jìn)行選擇時(shí)，群體多樣性隨篩選輪次增加而降低，直至僅保留好的結(jié)合物，即該過(guò)程的結(jié)果是匯集。一般地，噬菌體展示文庫(kù)包含幾個(gè)緊密相關(guān)的結(jié)合物(在1×107中的10到50個(gè)結(jié)合物)。匯集的指標(biāo)包括緊密相關(guān)序列的結(jié)合(由噬菌體滴定測(cè)定)增加和回收增加。
在細(xì)胞展示文庫(kù)中，候選抗體在諸如真核細(xì)胞或原核細(xì)胞的細(xì)胞表面展示。原核細(xì)胞的實(shí)例包括大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)細(xì)胞和孢子(見(jiàn)如Lu et al.(1995)Biotechnology13366)。真核細(xì)胞的實(shí)例包括酵母(如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharmyces pombe)、漢遜酵母(Hanseulla)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))。酵母表面展示可參見(jiàn)例如Boder and Wittrup(1997)Nature Biotech.15553-557。可使用酵母展示系統(tǒng)展示諸如Fab片段的免疫球蛋白，并用酵母交配方法(yeast mating)形成重鏈和輕鏈的組合。
在用于抗ApoE-CTD抗體的親和力成熟上，酵母展示較噬菌體展示有著明顯的優(yōu)點(diǎn)。最為重要的優(yōu)點(diǎn)是FACS選擇可就其抗原結(jié)合定量分選每種酵母細(xì)胞。也可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化選擇，因此在展示水平上的變異可得到糾正，這樣可避免以親合力為基礎(chǔ)的選擇。這點(diǎn)在使用多價(jià)靶抗原時(shí)尤為重要。
展示文庫(kù)可為核糖體展示文庫(kù)。在核糖體展示文庫(kù)中，mRNA和該RNA所編碼的候選抗體可由固定的核糖體以物理方式聯(lián)合，該核糖體正在翻譯mRNA，并還附著新合成的多肽。一般地，使用較高濃度的二價(jià)Mg2+和較低溫度。參見(jiàn)，例如Mattheakis at al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919022和Hanes at al.(2000).181287-92；Hans at al.(2000)Methods Enzymol.328-404-30和Schaffitzel et al.(1999)J.Immunol.Methods 231119-35。
另外一種展示文庫(kù)形式使用肽-核酸融合物?？审w外翻譯mRNA形成多肽-核酸融合物，該mRNA包括共價(jià)附著的嘌呤霉素基團(tuán)(puromycin group)，如在Roberts and Szostak(1997)Proc.Acad.Sci.USA 9412297-12302和美國(guó)專利No.6,207,446中的描述。然后，mRNA可被反轉(zhuǎn)錄形成DNA并與多肽交聯(lián)。
另外一種可使用的展示文庫(kù)形式是非生物性展示，其中抗體組分附著在識(shí)別抗體的非核酸標(biāo)記上。例如，標(biāo)記可為附著在微珠上的化學(xué)標(biāo)記，該微珠展示抗體或射頻標(biāo)記(見(jiàn)如美國(guó)專利No.5,874,214)。
選擇親本結(jié)合結(jié)構(gòu)域(parental binding domain)作為候選抗體的結(jié)構(gòu)模板。結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為天然存在的或合成的蛋白，或諸如免疫球蛋白的蛋白的某個(gè)區(qū)域或結(jié)構(gòu)域?？苫谟H本結(jié)合結(jié)構(gòu)域和ApoE-CTD之間已知的相互作用的知識(shí)選擇親本結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但是這并非關(guān)鍵性的。事實(shí)上，親本結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)poE-CTD具有親和力根本沒(méi)有必要親本結(jié)構(gòu)域的目的是提供可形成文庫(kù)的結(jié)構(gòu)，該文庫(kù)包括一個(gè)或多個(gè)特異性結(jié)合ApoE-CTD的候選抗體。
候選抗體可為Fab片段、單鏈Fv分子(scFV)、單域抗體、駱駝抗體(camelid antibody)和駱駝化抗體(camelized antibody)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親本結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括具有抗原結(jié)合活性的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，如scFv、Fab和IgG。一個(gè)典型的展示文庫(kù)展示包括VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的候選多肽。在為Fab和其它形式的情況下，所展示的抗體可包括作為重鏈或輕鏈一部分的恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，每條鏈均包括一個(gè)恒定區(qū)，如在Fab中。在其它的實(shí)施方案中，可展示其它恒定區(qū)。
展示文庫(kù)特別有用，如用于鑒定識(shí)別人抗原的人抗體或“人源化”抗體。體外展示選擇方法克服了正常人免疫系統(tǒng)不能針對(duì)自身抗原形成抗體的困難。
許多方法可構(gòu)建抗體文庫(kù)(見(jiàn)如de Haard et al(1999)J.Biol.Chem.27418218-30；Hoogenboom et al(1998)Immunotechnology 41-20和Hoogenboom et al(2000)Immunol.Today 21371-8)。另外，每種方法中的要素可與其它方法中的要素結(jié)合?？墒褂眠@些方法，藉此改變單個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(如VH或VL)或改變多個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(VH和VL)。還可改變免疫球蛋白可變區(qū)，如一個(gè)或多個(gè)CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4區(qū)，可以是重鏈和輕鏈的兩者或之一的這些區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，改變指定可變區(qū)的所有三個(gè)CDRs。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，改變諸如重鏈可變區(qū)的CDR1和CDR2。任何組合均可。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親本結(jié)構(gòu)域包括在下列任一序列中示出的CDR3序列SEQ ID NOS23、26、29、32、35、38、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、95、113、119和125。在候選抗體中，SEQ ID NO23或26的位置2和3中其中一個(gè)或者兩者共同進(jìn)行氨基酸置換為優(yōu)選的改變。通過(guò)摻加抗體方法(antibody spiking)所形成的變體VH-CDR3序列的實(shí)例見(jiàn)表38、39、40、41和42。優(yōu)選的CDR3序列在SEQ ID NOS207、209、210、320、322、323和373中示出。優(yōu)選的CDR3序列的共有序列見(jiàn)SEQ IDNOS512、513、514、515、516、517和20。
由輕鏈替換所形成的變體VL-CDR3序列的實(shí)例見(jiàn)表38、39、40、41和42。優(yōu)選的VL-CDR3序列見(jiàn)SEQ ID NOS35、269、275、268、341和378。
優(yōu)選地，親本結(jié)構(gòu)域還包含VH鏈的其它組分，并視情況而定可包含VL鏈或VL鏈的其它組分，并視情況而定還可包含VH鏈。
第二優(yōu)選的親本結(jié)構(gòu)域包含CDR1和/或CDR2結(jié)構(gòu)域，其序列在下列任一序列中示出SEQ ID NOS21、24、27、30、33、36、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、93、111、117和123或在SEQ ID NOS22、25、28、31、34、37、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、94、112、118和124中示出。DNA替換CDR1和/或CDR2結(jié)構(gòu)域可形成候選多肽。變體VL-CDR1和VL-CDR2序列的實(shí)例見(jiàn)表38、39、40、41和42。優(yōu)選的CDR1序列在SEQ ID NOS33、219、226、218、93、325、326、391和394中示出。優(yōu)選的CDR2序列在SEQ ID NOS34、247、252、333、334、382和386中示出。
第三優(yōu)選的親本結(jié)構(gòu)域包括在下列序列中示出的任一VL序列SEQ ID NOS42、43、44、151、157、159和161。一般地，通過(guò)DNA替換整個(gè)VL序列可形成候選多肽。替換的輕鏈序列的實(shí)例見(jiàn)表38、39、40、41和42。優(yōu)選的替換輕鏈序列在SEQ ID NOS43、295、294、304、347、348、357、362、406和418中示出。
在一種方法中，通過(guò)將編碼CDR的各種寡核苷酸插入核酸的相應(yīng)區(qū)域可構(gòu)建抗體文庫(kù)。使用單體核苷酸或三核苷酸可合成寡核苷酸。例如，Knappik et al((2000)J.Mol.Biol.29657-86)描述了采用三核苷酸合成法和模板(具有通過(guò)基因工程所獲得的可接受寡核苷酸的限制性酶切位點(diǎn))構(gòu)建編碼CDR的寡核苷酸的方法。
在另外一種方法中，動(dòng)物如嚙齒類動(dòng)物，用ApoE-CTD免疫。視情況可對(duì)該動(dòng)物追加抗原劑量以進(jìn)一步刺激免疫應(yīng)答。然后從動(dòng)物體內(nèi)分離脾臟細(xì)胞，將編碼VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的核酸擴(kuò)增、克隆，用于在展示文庫(kù)中表達(dá)。
然而，在另外一種方法中，由原生種系免疫球蛋白基因擴(kuò)增的核酸可構(gòu)建抗體文庫(kù)。所擴(kuò)增的核酸包括編碼VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的核酸。編碼免疫球蛋白的核酸的來(lái)源在下面描述。擴(kuò)增方法可包括PCR法，如使用退火到保守恒定區(qū)的引物的PCR，或者其它擴(kuò)增方法。
編碼免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的核酸可從諸如人、靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、駱駝或嚙齒類動(dòng)物的免疫細(xì)胞中獲得。在一個(gè)實(shí)施例中，就其特定性質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇?？蛇x擇在成熟過(guò)程中各個(gè)時(shí)期的B細(xì)胞。在另外一個(gè)實(shí)施例中，B細(xì)胞是原生的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用熒光激活的細(xì)胞分選方法(FACS)分選表達(dá)表面結(jié)合IgM、IgD或IgG分子的B細(xì)胞。另外，可分離表達(dá)不同同種型的B細(xì)胞。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，體外培養(yǎng)B細(xì)胞或T細(xì)胞?？稍隗w外刺激該細(xì)胞，如通過(guò)與滋養(yǎng)層細(xì)胞共同培養(yǎng)或加入分裂素或其它調(diào)節(jié)劑，如抗CD40、CD40配體或CD20的抗體、乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristate acetate)、細(xì)菌脂多糖(bacteriallipopolysaccharide)、刀豆素A(concanavalin A)、植物凝集素(phytohemagglutinin)或商路分裂素(pokeweed mitogen)。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，從患免疫系統(tǒng)疾病的受試者分離細(xì)胞，所述疾病如全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、血管炎(vasculitis)、干燥綜合征(sjogren syndrome)、系統(tǒng)性硬化癥(Systemic Sclerosis，SSC)或抗磷脂綜合征(anti-phospholipid syndrome)。受試者可為人或動(dòng)物，如人疾病的動(dòng)物模型，或具有相似病癥的動(dòng)物。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，從轉(zhuǎn)基因除人類以外的動(dòng)物中分離細(xì)胞，該動(dòng)物含有人免疫球蛋白基因座。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該細(xì)胞激活了體細(xì)胞超突變程序?？纱碳ぜ?xì)胞使其進(jìn)行免疫球蛋白基因的體細(xì)胞突變，例如用抗-免疫球蛋白、抗-CD40抗體和抗-CD38抗體處理(見(jiàn)如Bergthorsdottir et al(2001)J.Immunol.1662228)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是原生的。
編碼免疫球蛋白可變區(qū)的核酸可通過(guò)下述示例方法從天然存在的抗體庫(kù)中分離得到。首先，從免疫細(xì)胞分離RNA。分離全長(zhǎng)(如加帽的)mRNA(如通過(guò)使用小牛小腸磷酸酶降解未加帽RNA)。用煙草酸焦磷酸酶去掉帽，然后用反轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA。
可用任何合適的引物，以任何方式將第一條鏈(反義鏈)反轉(zhuǎn)錄。參見(jiàn)，例如de Haard et al(1999)J.Biol.Chem.27418218-30。在不同免疫球蛋白間引物結(jié)合區(qū)可恒定不變，如方便將免疫球蛋白的不同同種型反轉(zhuǎn)錄。引物結(jié)合區(qū)也可與免疫球蛋白的特定同種型是特異性的。一般地，引物與編碼至少1個(gè)CDR的序列的3’端的某一區(qū)域是特異性的。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，可使用聚脫氧胸腺嘧啶核苷(poly-dT)引物(并且可優(yōu)選針對(duì)重鏈基因)。
合成序列可連接到被反轉(zhuǎn)錄的鏈的3’末端。在反轉(zhuǎn)錄后的PCR擴(kuò)增過(guò)程中，可將合成序列作為結(jié)合正向引物的引物結(jié)合位點(diǎn)使用。使用合成序列無(wú)需使用很多不同的正向引物以完全檢測(cè)可能的多樣性。
然后擴(kuò)增編碼可變區(qū)的基因，如進(jìn)行一輪或多輪擴(kuò)增。若使用多輪擴(kuò)增，可使用嵌套引物(nested primers)以提高保真度。然后將所擴(kuò)增的核酸克隆到展示文庫(kù)的載體中。
可使用任何用于擴(kuò)增核酸序列的方法進(jìn)行擴(kuò)增。優(yōu)選保持最高程度多樣性，同時(shí)沒(méi)有偏向的方法。用于核酸擴(kuò)增的合適的技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、基于轉(zhuǎn)錄的方法(該方法采用RNA聚合酶，利用RNA合成以擴(kuò)增核酸)(Sarker et al(1989)Science 244331-34)、NASBA(該方法利用轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄和基于RnaseH的降解的循環(huán)以擴(kuò)增DNA樣本(美國(guó)專利Nos.5,130,238、5,409,818和5,554,517))、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA；美國(guó)專利No.6,143,495)和鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)(SDA；美國(guó)專利No.5,624,825)。
在鑒定了第一組結(jié)合抗體后，可使用其序列信息來(lái)設(shè)計(jì)其它文庫(kù)，其中具有其它所需性質(zhì)的成員占優(yōu)勢(shì)，所述性質(zhì)如ApoE-CTD和全長(zhǎng)ApoE，優(yōu)選與VLDL相關(guān)的ApoE間的區(qū)分。這類技術(shù)不僅可篩選大量可能的結(jié)合抗體，還可實(shí)現(xiàn)重復(fù)結(jié)合/洗脫循環(huán)，并可實(shí)現(xiàn)建立用于篩選滿足最初原則的類似展示包裝的二級(jí)偏向文庫(kù)(biased library)。使用這些技術(shù)，可篩選偏向文庫(kù)，檢測(cè)在篩選條件下緊密結(jié)合(也就是具有較高親和力)的成員。
因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，展示文庫(kù)技術(shù)可反復(fù)使用。可用一級(jí)展示文庫(kù)識(shí)別一個(gè)或多個(gè)結(jié)合ApoE-CTD和/或人斑塊的抗體。然后用突變方法改變所識(shí)別的抗體，以形成二級(jí)展示文庫(kù)。然后，通過(guò)更高嚴(yán)格條件或更有競(jìng)爭(zhēng)力的結(jié)合和洗滌條件從二級(jí)文庫(kù)中篩選較高親和力的多肽。
在親和力成熟方法中，優(yōu)選通過(guò)氨基酸置換進(jìn)行改變，但也可通過(guò)缺失或插入氨基酸進(jìn)行改變。
至少對(duì)大多數(shù)置換而言，氨基酸置換被期待僅改變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合性質(zhì)，但不顯著改變其結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，被選擇用于改變的氨基酸位置(可變氨基酸位置)為表面氨基酸位置，也就是說(shuō)，當(dāng)結(jié)構(gòu)域?yàn)樽顬榉€(wěn)定的構(gòu)象時(shí)，結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的位置出現(xiàn)在結(jié)構(gòu)域的外表面(即暴露在溶液的表面)。最為優(yōu)選地，有待改變的氨基酸位置彼此相鄰或靠近，以使置換效果最佳化。另外，其它氨基酸可被加入親本結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)中。
在操作過(guò)程中，突變發(fā)生在已知或可能為結(jié)合界面(bindinginterface)的區(qū)域。突變可發(fā)生在本文所描述的重鏈或輕鏈的CDR區(qū)。另外，突變可發(fā)生在接近或鄰近CDR的骨架區(qū)。突變也可限定在一個(gè)或幾個(gè)CDR，比如為了進(jìn)行精確的分步改進(jìn)。
有效的親和力成熟要求4個(gè)步驟(i)再次將主要抗體基因多樣化；(ii)在噬菌體或酵母上展示；(iii)親和力選擇；(iv)就提高的親和力篩選克隆。
具有所需結(jié)合性質(zhì)的Fab的比對(duì)，例如使用BLAST算法(如Karlin and Altschul(1993)PNAS USA 905873-5787)，可用于識(shí)別CDR結(jié)構(gòu)域中的保守殘基。在CDR環(huán)中的序列相似性為預(yù)測(cè)直接參與抗體親和力或特異性的氨基酸提供了可能。
例如，抗體807A-M0028-B02和807A-M0027-E11(SEQ ID NOS23和26)的VH-CDR3環(huán)顯示出驚人的相似性，并顯示出在超過(guò)4/6個(gè)氨基酸(SEQ ID NO20)的一致性。這表明VH-CDR3在抗體親和力和特異性上起作用。
最佳抗體突變方法在與功能相關(guān)的位置上引入最少突變。其通過(guò)靶向突變和非靶向突變方法實(shí)現(xiàn)。非靶向突變方法包括鏈替換方法，該方法通過(guò)再次將整個(gè)VL基因或VH CDRl-2片段多樣化，向抗體中引入大區(qū)段變化。一般，不改變VH-CDR3環(huán)，因?yàn)樗赡軐?duì)結(jié)合親和力和特異性有著顯著影響。鏈替換方法的實(shí)例在如下文獻(xiàn)中描述Marks et al.，(1992)Nature Biotech 10779-783，Schier et al.，(1996)J.Mol Biol.255，28-43，Park et al.，(2000)BBRC.275.553-557和Chameset al.，(2002)J.Immunol.1110-1118。盡管鏈替換方法是效果頗佳的技術(shù)(特別是對(duì)具有較低起始親和力的抗體)，一個(gè)可能的缺點(diǎn)在于通過(guò)在抗體分子中進(jìn)行如此大區(qū)段變化，可能會(huì)增加干擾許多有利接觸的機(jī)會(huì)。但是，可通過(guò)降低不利接觸或形成新接觸進(jìn)行補(bǔ)償。
其它示例性的非靶向突變技術(shù)包括錯(cuò)配PCR(error-prone PCR)(Leung et al.(1989)Technique 111-15)、重組、隨機(jī)剪切的DNA替換(Stemmer(1994)Nature 389-391；termed“nucleic acid shuffling”，稱為《核酸替換》)、RACHITTTM(Coco at al.(2001)Nature Biotech.19354)、定點(diǎn)突變(Zooler et al.(1987)Nucl.Acids Res.106487-6504)、盒式誘變(cassette mutagenesis)(Reidhaar-Olson(1991)MethodsEnzymol.208564-586)和簡(jiǎn)并寡核苷酸摻入法(incorporation ofdegenerate oligonucleotides)(Griffiths at al.(1994)EMBO J.133245)。
靶向突變方法包括熱點(diǎn)突變(hot spot mutagenesis)、限定性突變(parsimonious mutagenesis)、飽和突變(saturation mutagenesis)、 結(jié)構(gòu)域隨機(jī)化(domain randomisation)和結(jié)構(gòu)域游走(domainwalking)。CDR突變可以分步的方式進(jìn)行，即打靶CDR1，篩選最佳環(huán)，然后打靶CDR2等。在自然界中最為多變的單環(huán)是VH-CDR3，一般認(rèn)為該環(huán)位于抗體結(jié)合位點(diǎn)的中央，該位點(diǎn)被認(rèn)為是抗體特異性和親和力的關(guān)鍵性決定因子。這意味著特異性打靶該環(huán)的理由很充分。
在一個(gè)迭代選擇(iterative selection)的實(shí)例中，使用本文中所描述的方法首次識(shí)別了來(lái)自展示文庫(kù)的抗體，該抗體對(duì)靶標(biāo)以至少最小結(jié)合特異性，或最小活性，如高于1nM、10nM或100nM的結(jié)合平衡解離常數(shù)結(jié)合ApoE-CTD；該抗體還結(jié)合人斑塊，并且/或者在與VLDL相關(guān)的ApoE存在時(shí)保持結(jié)合活性。編碼最初鑒定的抗體的核酸序列可作為引入改變的模板核酸，如鑒定相對(duì)于第一抗體，具有改進(jìn)性質(zhì)(如結(jié)合親和力、動(dòng)力學(xué)或穩(wěn)定性)的第二多肽。
本發(fā)明的抗體可使用展示技術(shù)，以識(shí)別結(jié)合ApoE-CTD的抗體的方式進(jìn)行分離，該抗體表現(xiàn)出結(jié)合和釋放的特定預(yù)篩選性質(zhì)。根據(jù)本方法學(xué)，可預(yù)選擇兩種溶液環(huán)境，即結(jié)合環(huán)境和釋放環(huán)境。結(jié)合環(huán)境可為一組溶液環(huán)境，在此環(huán)境下需要所檢測(cè)到的抗體與靶ApoE-CTD結(jié)合；釋放環(huán)境是一組溶液環(huán)境，在此環(huán)境下所檢測(cè)到的抗體不與ApoE-CTD結(jié)合(即從ApoE-CTD解離)?？蛇x擇兩種環(huán)境，以滿足操作者的任何要求標(biāo)準(zhǔn)，如簡(jiǎn)化獲得環(huán)境、與其它純化步驟相容、與其它親和溶液相比降低兩種環(huán)境間轉(zhuǎn)化的成本，等等。優(yōu)選地，篩選兩種溶液環(huán)境，以對(duì)靶蛋白ApoE-CTD的穩(wěn)定性或活性不產(chǎn)生負(fù)面影響，并至少就一個(gè)溶液參數(shù)而言顯著不同。例如，在對(duì)本文所述的合適的結(jié)合肽進(jìn)行篩選中，在含乙二醇的緩沖液，或較低pH(如pH2)的環(huán)境，或兩種環(huán)境的組合(三者均不同于為結(jié)合所采用的環(huán)境)下，選擇與靶標(biāo)解離的結(jié)合物。可優(yōu)先改變的另外一個(gè)參數(shù)是結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液中的鹽濃度，如NaCl。
結(jié)合ApoE-CTD的抗體一般對(duì)ApoE-CTD具有最小結(jié)合特異性，例如大于1nM、10nM或100nM的結(jié)合平衡常數(shù)。
由于較為緩慢的解離速率預(yù)示著較高的親和力，特別是就抗體與其靶標(biāo)之間的相互作用而言，因此可使用解離速率(off-rate)選擇的方法分離對(duì)ApoE-CTD的結(jié)合相互作用具有所需動(dòng)態(tài)解離速率(即已降低的動(dòng)態(tài)解離速率)的抗體。
為從展示文庫(kù)中選擇緩慢解離的抗體，可將文庫(kù)與固定靶標(biāo)，優(yōu)選ApoE-CTD相接觸。然后用第一溶液洗滌固定靶標(biāo)，該溶液可去除非特異性結(jié)合或微弱結(jié)合的抗體。然后用第二溶液洗脫固定靶標(biāo)，該溶液含飽和濃度的游離靶標(biāo)，即未附著在顆粒上的靶標(biāo)復(fù)本。游離靶標(biāo)結(jié)合從靶標(biāo)解離的抗體。相對(duì)于較低濃度的固定靶標(biāo)，飽和濃度的游離靶標(biāo)可有效阻止固定靶標(biāo)與抗體的再次結(jié)合。
第二溶液可具有基本為生理的或嚴(yán)格的溶液環(huán)境。一般地，第二溶液的溶液環(huán)境與第一溶液的溶液環(huán)境是相同的。以時(shí)間順序收集第二溶液級(jí)分，以區(qū)分早期級(jí)分和晚期級(jí)分。與早期部分中的生物分子相比，晚期級(jí)分含以較低速率從靶標(biāo)解離的生物分子。
另外，還可回收即使在進(jìn)一步孵育后仍然結(jié)合靶標(biāo)的展示文庫(kù)成員。可使用離液序列高的環(huán)境(chaotropic conditions)解離這些抗體，或在附著在靶標(biāo)上時(shí)擴(kuò)增這些抗體。例如，結(jié)合靶標(biāo)的噬菌體可與細(xì)菌細(xì)胞相接觸。
本發(fā)明的方法中所使用的ApoE-CTD可為任何合適形式。一般地，ApoE-CTD具有SEQ ID NO.1所示出的氨基酸序列或具有其片段的氨基酸序列。ApoE-CTD片段一般至少長(zhǎng)三個(gè)氨基酸，優(yōu)選長(zhǎng)至少五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)或八個(gè)氨基酸，更優(yōu)選長(zhǎng)至少10、12或16個(gè)氨基酸。在SEQ ID NOS2到19中列出合適片段的實(shí)例。優(yōu)選的片段為具有在如下任一序列中示出的序列的片段SEQ ID NOs2、5、7、9、10、12、13、14、15、16和17。本發(fā)明的篩選分析中可使用一個(gè)或多個(gè)ApoE-CTD肽。
ApoE-CTD多肽一般通過(guò)重組方式合成。本發(fā)明的方法中可使用尿素變性的ApoE-CTD，其通過(guò)重組合成或天然形成。另外或作為另外一種選擇，可就與聚合形式的CTD(ApoE-CTD結(jié)合纖維)的結(jié)合篩選候選多肽。也可監(jiān)測(cè)與ApoE-CTD和Aβ復(fù)合物的結(jié)合。
可從重組合成的或天然存在的ApoE中剪切ApoE-CTD，如通過(guò)凝血酶的作用。
ApoE-CTD多肽或肽可固定在支持物上。一般可通過(guò)標(biāo)記多肽或多肽生物素化捕捉到表面上從而實(shí)現(xiàn)固定。例如，ApoE-CTD可包含一個(gè)與鏈霉親和素附著的S-S生物素基團(tuán)(如在鏈霉親和素包被的磁珠上)?；蛘逜poE-CTD可包括用于偶聯(lián)用于固定的BSA載體(如在塑料上)的半胱氨酸殘基。通過(guò)這種方式可制備“CTD包被的傳感芯片”?？捎肂IACORE分析對(duì)候選多肽與CTD包被的傳感芯片的結(jié)合進(jìn)行分析。
也可就與人斑塊的結(jié)合篩選展示文庫(kù)成員。
本文中所描述的展示文庫(kù)篩選方法優(yōu)選包括去除結(jié)合非靶標(biāo)分子的展示文庫(kù)成員的選擇或篩選過(guò)程。非靶標(biāo)分子的實(shí)例包括鏈霉親和素和(ii)ApoE-NTD。
操作過(guò)程中，使用稱為“負(fù)選擇”的步驟以區(qū)分靶分子、相關(guān)非靶分子，以及相關(guān)但具有明顯特征的非靶分子。將展示文庫(kù)或其合并物與非靶分子相接觸。收集不與非靶分子相接觸的樣本成員，并用于隨后與靶分子結(jié)合的選擇中，或甚至用于隨后的負(fù)選擇中。負(fù)選擇步驟可在選擇結(jié)合靶分子的文庫(kù)成員之前或之后進(jìn)行。
在另外一個(gè)操作中，使用篩選步驟。展示文庫(kù)成員在就其與靶分子的結(jié)合進(jìn)行分離后，檢測(cè)每個(gè)分離的文庫(kù)成員結(jié)合非靶分子(如上面列出的非靶分子)的能力。例如，可使用高通量ELISA篩選獲得這些數(shù)據(jù)。也可使用ELISA篩選獲得每種文庫(kù)成員與靶分子的結(jié)合的定量數(shù)據(jù)。比較非靶分子和靶分子的結(jié)合的數(shù)據(jù)(如使用計(jì)算機(jī)和軟件)，以鑒定特異性結(jié)合靶標(biāo)MHC-肽復(fù)合物的文庫(kù)成員。
本發(fā)明的抗體或抗體片段在VLDL或其它脂蛋白顆粒存在時(shí)可結(jié)合ApoE。本發(fā)明的抗體一般可以在VLDL存在時(shí)結(jié)合對(duì)ApoE-CTD具有最小結(jié)合特異性結(jié)合ApoE，如高于1nM或100nM的結(jié)合平衡常數(shù)。VLDL可為任何合適形式。例如，在結(jié)合分析中可加入人血漿。結(jié)合分析中可加入小于等于50％的人血漿，例如可包含小于等于10％、小于等于20％、小于等于30％或小于等于40％的人血漿。
也可就與ApoE-NTD的結(jié)合篩選候選多肽?？赏ㄟ^(guò)重組合成ApoE-NTD，或剪切(如在凝血酶的作用下)通過(guò)重組得到或天然存在的ApoE。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可就與星形膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)合篩選候選多肽。優(yōu)選地但非必需地，與結(jié)合ApoE-CTD相比，所選多肽不結(jié)合星形膠質(zhì)細(xì)胞，或者以較低親和力結(jié)合星形膠質(zhì)細(xì)胞，例如親和力低二倍、五倍、十倍、二十倍或五十倍。
在選擇完結(jié)合ApoE-CTD的候選展示文庫(kù)成員后，可進(jìn)一步分析每種候選展示文庫(kù)成員，如進(jìn)一步表征其結(jié)合靶標(biāo)的特征?？蓪?duì)每種候選展示文庫(kù)成員進(jìn)行一次或多次二次篩選分析。分析可針對(duì)其結(jié)合性質(zhì)、催化性質(zhì)、生理性質(zhì)(如細(xì)胞毒性、腎清除率、免疫原性)、結(jié)構(gòu)性質(zhì)(如穩(wěn)定性、構(gòu)象、低聚狀態(tài))或其它功能性特征。也可重復(fù)使用同樣分析，但是改變條件，例如測(cè)定pH、離子或熱靈敏度。
如若合適，分析可直接使用展示文庫(kù)成員，一種重組抗體，其由編碼展示抗體的核酸合成，或者一種合成抗體，其基于展示抗體的序列合成。分析優(yōu)選包括測(cè)定結(jié)合ApoE-CTD的抗體是否可結(jié)合人斑塊，或者在VLDL存在時(shí)是否結(jié)合ApoE-CTD。就結(jié)合性質(zhì)所進(jìn)行的示例性分析包括ELISA、均一結(jié)合分析(homogeneous binding assay)，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)和α篩選(alpha-screen)、表面等離子體共振(surface plasmonresonance，SPR)、蛋白分析和細(xì)胞分析。
展示文庫(kù)編碼的抗體也可使用ELISA就其結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行篩選。例如，將每種結(jié)合ApoE-CTD的候選抗體加入底表面被ApoE-CTD、VLDL或ApoE-NTD所包被的微量滴定板。用緩沖液洗滌微量滴定板以除去非特異性結(jié)合的多肽。然后通過(guò)可識(shí)別多肽(如多肽的標(biāo)記或不變部分)的抗體檢測(cè)微量滴定板，以測(cè)定結(jié)合微量滴定板上的多肽含量。將抗體連接到諸如堿性磷酸酶的酶上，該酶在提供合適的底物時(shí)可生成顯色產(chǎn)物。多肽如作為與絲狀噬菌體外殼的融合物可從細(xì)胞中純化或以展示文庫(kù)形式進(jìn)行分析。在另一種ELISA中，多樣鏈文庫(kù)(diversity strand library)的每種多肽均可用于包被微量滴定板的不同孔。然后使用相同的靶分子進(jìn)行ELISA，以檢測(cè)每個(gè)孔。若多肽與ApoE-CTD的結(jié)合顯示出至少2×本底值，但與諸如ApoE-NTD或鏈霉親和素的陰性對(duì)照蛋白的結(jié)合低于1×本底值，則多肽在ELISA中特異性結(jié)合ApoE-CTD。
均一結(jié)合分析可在加入所有分析組分后分析候選抗體和靶標(biāo)的結(jié)合相互作用，無(wú)需其它液體操控。例如，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作為均一分析使用(見(jiàn)，例如，Lakowicz et al，美國(guó)專利No.5,631,169)。另外一個(gè)均一分析的實(shí)例是α篩選(Packard Bioscience，Meriden，Connecticut，USA)。
在候選多肽附著在展示文庫(kù)載體，如噬菌體上時(shí)，可進(jìn)行均一分析。
使用表面等離子共振(SPR)可分析從展示文庫(kù)分離的分子與靶標(biāo)之間的結(jié)合相互作用。SPR或生物分子相互作用分析(BiomolecularInteraction Analysis，BIA)實(shí)時(shí)檢測(cè)生物特異的相互作用，不用對(duì)任何相互作用物進(jìn)行標(biāo)記。在BIA芯片的結(jié)合表面上含量的改變(結(jié)合事件的指標(biāo))導(dǎo)致表面附近光的折射率的改變(表面等離子共振(SPR)的光學(xué)現(xiàn)象)。折射率的改變可形成可檢測(cè)的信號(hào)，其可作為生物分子間的實(shí)時(shí)反應(yīng)指標(biāo)被檢測(cè)。使用SPR的方法已被描述，如在Szabo etal(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705和在BIAcore InternationalAB(Uppsala，Sweden)所提供的網(wǎng)絡(luò)資源中。
從SPR所獲得的信息可用于提供生物分子與靶標(biāo)的結(jié)合的平衡解離常數(shù)(KD)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括Kon和Koff的準(zhǔn)確的和定量的測(cè)量值。這些數(shù)據(jù)可用于比較不同生物分子。例如，可比較選自多樣鏈文庫(kù)的核酸所編碼的蛋白，以鑒定對(duì)靶標(biāo)具有高親和力的個(gè)體或具有較低Koff的個(gè)體。該信息也可用于形成構(gòu)效關(guān)系(structure-activityrelationships，SAR)。例如，成熟形式的親本蛋白其動(dòng)力學(xué)和平衡結(jié)合參數(shù)可與親代蛋白的參數(shù)進(jìn)行比較?？设b定在指定位置的各種氨基酸，其與特定結(jié)合參數(shù)相關(guān)，如高親和力和緩慢Koff。這些信息可與結(jié)構(gòu)建模(structural modelling)相結(jié)合(如使用同源建模(homologymodelling)、能量最小化(energy minimisation)或通過(guò)晶體學(xué)(crystallography)或NMR所進(jìn)行的結(jié)構(gòu)測(cè)定)。因此，可闡明蛋白和其靶標(biāo)之間的物理相互作用，并將其用于指導(dǎo)其它設(shè)計(jì)方法。
從展示文庫(kù)識(shí)別的抗體可固定在固體支持物上，如微珠或陣列上。就蛋白陣列而言，每種多肽被固定在支持物特定的位置上。一般地。該位置為二維空間的位置。后文描述了蛋白陣列(參見(jiàn)例如“診斷”)。
通過(guò)將編碼抗體的載體核酸序列轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中(藉此抗體可在細(xì)胞中合成，從細(xì)胞中分泌，或附著在細(xì)胞表面)，可篩選被鑒定為結(jié)合ApoE-CTD的候選抗體，。可就結(jié)合ApoE-CTD的抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，例如通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表型或細(xì)胞介導(dǎo)活性的改變。例如，活性可為細(xì)胞或補(bǔ)體所介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞文庫(kù)為細(xì)胞陣列的形式。同樣地，可就任何合適的可檢測(cè)活性對(duì)細(xì)胞陣列進(jìn)行篩選。
C.制備抗體 可使用標(biāo)準(zhǔn)重組核酸方法表達(dá)本發(fā)明的抗體。一般地，編碼抗體的核酸序列被克隆到核酸表達(dá)載體中。當(dāng)然，若抗體包括多條多肽鏈，每條鏈均須克隆到表達(dá)載體中，如相同載體或不同載體，它們可在相同或不同細(xì)胞中表達(dá)。若抗體片段足夠小，即小于50個(gè)氨基酸，可使用自動(dòng)有機(jī)合成方法合成。制備抗體的方法在下文中描述。
除了編碼多肽配體或其片段的區(qū)段外，表達(dá)抗體配體的表達(dá)載體還包括調(diào)節(jié)序列，包括例如啟動(dòng)子，其有效連接到目標(biāo)核酸。許多合適的載體和啟動(dòng)子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，并且可商購(gòu)以制備本發(fā)明的重組構(gòu)建體。以實(shí)例的方式提供下列載體。細(xì)菌載體pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，California，USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核生物載體pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXTI、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。優(yōu)選的文庫(kù)中一個(gè)優(yōu)選類為展示文庫(kù)，如下文所述。
可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的方法構(gòu)建含本發(fā)明的抗體和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控信號(hào)的載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳重組。對(duì)這些技術(shù)的描述參見(jiàn)，例如Sambrook & Russell，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(2001)和Ausubel et al，Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience，NY(1989))?？墒褂镁哂羞x擇標(biāo)記的CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它載體從所需基因中選擇啟動(dòng)子區(qū)。兩個(gè)合適的載體為pKK232-8和pCM7。具體列出的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、lambda P和trc。真核生物啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs、小鼠金屬硫蛋白-I和各種已知的組織特異的啟動(dòng)子。
一般地，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記，如大腸桿菌(E.coli)的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母(S.cerevisiae)的營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記(如URA3、LEI2、HIS3和TRPl基因)，和來(lái)源于高度表達(dá)的基因、指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可來(lái)源于編碼糖酵解的酶的操縱子，如3-磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、a-因子、酸性磷酸酶或熱激蛋白等等。本發(fā)明的多肽在合適的狀態(tài)下與翻譯起始和終止序列，并優(yōu)選前導(dǎo)序列一起裝配，該前導(dǎo)序列能指導(dǎo)所翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)空間或細(xì)胞外液。視情況而定，本發(fā)明的核酸可編碼含N-端識(shí)別肽的融合蛋白，該識(shí)別肽攜帶所需特征，如可穩(wěn)定所表達(dá)的重組產(chǎn)物或使其純化簡(jiǎn)化。可插入本發(fā)明的多肽和合適的翻譯起始和終止信號(hào)，并視情況而定，可在可操作閱讀期插入功能性啟動(dòng)子，構(gòu)建有用的細(xì)菌表達(dá)載體。載體包括一個(gè)或多個(gè)表型選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，以確保維持載體，并且如果需要，可在宿主中擴(kuò)增。用于轉(zhuǎn)化的合適原核生物宿主包括大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)和假單胞菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬中的各個(gè)物種，盡管其它物種也可作為選擇。
作為代表性而非限定性的實(shí)例，用于細(xì)菌的有用表達(dá)載體可包括選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，其來(lái)源于商購(gòu)的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括大家已熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件。這種商購(gòu)的載體包括，例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEMI(Promega，Madison，Wisconsin，USA)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞，其中使用已知的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)染方法或感染方法將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。例如，宿主細(xì)胞可包括由多樣鏈所構(gòu)建的文庫(kù)成員。宿主細(xì)胞可為真核生物宿主細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、低等真核生物宿主細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞也可為原核生物細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。重組構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞通過(guò)如鈣磷酸轉(zhuǎn)染、DEAE、葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔而實(shí)現(xiàn)(Davis，L.et al，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。
可使用任何宿主/載體系統(tǒng)鑒定本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)靶因子。這些宿主/載體系統(tǒng)包括但不限于真核生物宿主細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS細(xì)胞、Sf9細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞；以及原核生物宿主細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)和枯草桿菌(B.subtilis)。最優(yōu)選的細(xì)胞為不正常表達(dá)特定報(bào)道多肽或蛋白，或以較低正常水平表達(dá)報(bào)道多肽或蛋白的細(xì)胞。
本發(fā)明的宿主也可為酵母或其它真菌。在酵母中，可使用許多含組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體。參見(jiàn)綜述Current Protocols inMolecular Biology，Vol，2，Ed.Ausubel et al，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience，Ch.13(1988)；Grant et al(1987)“Expression andSecretion Vectors for Yeast”，Methods Enzymol.153516-544(1987)和The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Eds.Strathern et al，Cold Spring Harbor Press，Vols.I and II(1982)。
本發(fā)明的宿主也可為原核生物細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)、其它腸桿菌科，如粘質(zhì)沙雷菌(serratia marcescens)、桿菌、各種假單胞菌，或其它可被轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和/或感染的原核生物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供通過(guò)基因工程所獲得含本發(fā)明的抗體的宿主細(xì)胞。例如，這種宿主細(xì)胞可含本發(fā)明的核酸，該核酸使用已知的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)染方法和感染方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞。本發(fā)明還進(jìn)一步提供通過(guò)基因工程所獲得的表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中該多核苷酸與調(diào)節(jié)序列有效關(guān)聯(lián)，該調(diào)節(jié)序列對(duì)宿主細(xì)胞而言是異源的，它驅(qū)動(dòng)細(xì)胞中抗體表達(dá)。
宿主細(xì)胞可為高等真核生物宿主細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，低等真核生物宿主細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞也可為原核生物細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。
重組構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞通過(guò)如鈣磷酸轉(zhuǎn)染、DEAE、葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔而實(shí)現(xiàn)(Davis，L.et al，(1986)Basic Methods inMolecular Biology)?？梢猿Ｒ?guī)方式使用含本發(fā)明的一種多核苷酸的宿主細(xì)胞，以合成由分離片段所編碼的基因產(chǎn)物(在ORF的情況下)。
可使用任何合適的宿主/載體系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的多種抗體的一種或多種?？墒褂酶鞣N哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組抗體。
可在諸如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞合成抗體，如Fab。例如，若Fab由噬菌體展示載體中的序列所編碼-該噬菌體展示載體在展示實(shí)體和噬菌體蛋白(或其片段)間含有抑制性終止子，那么可將載體核酸替換到不能抑制終止子的細(xì)菌細(xì)胞中。在這種情況下，F(xiàn)ab不融合到基因III蛋白，而是分泌到培養(yǎng)液中。
可在真核細(xì)胞中合成抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體(如scFV)在酵母細(xì)胞中表達(dá)，如畢赤酵母屬(Pichia)(參見(jiàn)例如Powers et al(2001)J.Immunol.Methods.251123-35)、漢遜酵母屬(Hanseula)或酵母屬(Saccharomyce)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成抗體。表達(dá)克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)(包括dhfr-CHO細(xì)胞，在Urlaub & Chasin((1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220中描述，其與DHFR選擇標(biāo)記一起使用，如在Kaufman & Sharp((1982)Mol.Biol.159601-621中描述)、淋巴細(xì)胞系，如NS0骨髓瘤細(xì)胞和SP2細(xì)胞、COS細(xì)胞和諸如轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞，例如，細(xì)胞為乳腺上皮細(xì)胞。
除了編碼各種免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的核酸序列外，重組表達(dá)載體可含其它序列，如調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中載體復(fù)制的序列(如復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因有助于選擇被導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞(參見(jiàn)例如美國(guó)專利Nos.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，一般地，選擇標(biāo)記基因賦予被導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞以抗藥性，如G418、潮霉素或氨甲喋呤。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于氨甲喋呤選擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞中)和neo基因(用于G418選擇)。
在重組表達(dá)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的示例性系統(tǒng)中，通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，可將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達(dá)載體導(dǎo)入dhfr-CHO細(xì)胞。在重組表達(dá)載體中，抗體重鏈和輕鏈基因均有效連接到增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件(如來(lái)源于SV40、CMV、腺病毒等等，如CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件或SV40增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件)，以驅(qū)動(dòng)這些基因的高水平轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)載體也可含DHFR基因，這為選擇通過(guò)氨甲喋呤篩選/擴(kuò)增方法轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞提供了可能。培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以表達(dá)抗體重鏈和輕鏈，并從細(xì)胞培養(yǎng)基中回收完整的抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)制備重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞、培養(yǎng)宿主細(xì)胞并從細(xì)胞培養(yǎng)基中回收抗體。例如一些抗體可使用蛋白A或蛋白G，通過(guò)親和層析分離。
對(duì)含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的抗體而言，抗體生產(chǎn)系統(tǒng)優(yōu)選合成Fc區(qū)被糖基化的抗體。例如，IgG分子的Fc結(jié)構(gòu)域在CH2結(jié)構(gòu)域的297天門冬酰胺被糖基化。天門冬酰胺是二觸角型(biantennary-type)低聚糖修飾的位點(diǎn)。已經(jīng)證實(shí)需要該糖基化作用起效應(yīng)子功能，其由Fc受體和補(bǔ)體Clq所介導(dǎo)(Burton & Woof(1992)Adv.Immunol.511-84；Jefferiset al(1998)Immunol.Rev.16359-76)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中合成了Fc結(jié)構(gòu)域，該系統(tǒng)恰當(dāng)?shù)貙?duì)相應(yīng)于297天門冬酰胺的殘基進(jìn)行了糖基化。Fc結(jié)構(gòu)域也可包括其它真核生物的翻譯后修飾。
也可由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物合成抗體。例如，美國(guó)專利No.5,849,992描述了在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺中表達(dá)抗體的方法。構(gòu)建含泌奶特異啟動(dòng)子、編碼目的抗體的核酸以及指導(dǎo)分泌的信號(hào)序列的轉(zhuǎn)基因。這種雌性轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物所產(chǎn)的奶中含有分泌于其中的目標(biāo)抗體?？杉兓Ｄ讨械目贵w，或者，在某些應(yīng)用上，可直接使用。
可從展示文庫(kù)中分離本發(fā)明的ApoE-CTD抗體，并可對(duì)其序列和/或結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。使用已知方法可以任何所需含量生產(chǎn)抗體。例如，可通過(guò)化學(xué)合成，隨后在適于獲得天然構(gòu)象如正確的二硫鍵連接的氧化條件下處理，可便利地合成抗體?？刹捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的方法學(xué)進(jìn)行合成(參見(jiàn)Kelley et al.，in Genetic EngineeringPrinciples and Methods，(Setlow，J.K.，ed.)，Plenum Press，NY.，(1990)vol.12，pp.1-19；Stewart et al.，Solid-Phase Peptide Synthesis(1989)，W.H.Freeman Co.，San Francisco)。本發(fā)明的多肽也可由提供多肽合成服務(wù)的公司以商業(yè)形式制備(參見(jiàn)BACHEM Bioscience，Inc.，Kingof Prussia，Pa.；Quality Controlled Biochemicals，Inc.，Hopkinton，Mass) D.診斷方法 結(jié)合ApoE-CTD的抗體、由本文所描述的方法所鑒定的抗體和/或本文詳細(xì)描述的抗體可用于體外和體內(nèi)診斷、治療和預(yù)防用途。
一方面，本發(fā)明提供體外(如生物樣本，諸如活組織樣本)或體內(nèi)(如在受試者體內(nèi)成像)檢測(cè)ApoE-CTD的診斷方法。
該方法包括(i)將樣本與本發(fā)明的抗體相接觸；(ii)檢測(cè)抗體和樣本間復(fù)合物的形成。該方法還包括將參照樣本(即對(duì)照樣本)與抗體相接觸，并測(cè)定相對(duì)于相同抗體與參照樣本，抗體和樣本之間復(fù)合物的形成程度。相對(duì)于對(duì)照樣本或受試者，在樣本或受試者中復(fù)合物形成中的變化，如在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著的變化，可指示樣本中存在ApoE-CTD。
另外一種方法包括(i)將本發(fā)明的抗體給藥給受試者；(ii)檢測(cè)抗體和受試者間復(fù)合物的形成。檢測(cè)步驟可包括檢測(cè)復(fù)合物形成的位置和時(shí)間。
抗體配體可用檢測(cè)物直接或間接標(biāo)記，以輔助檢測(cè)結(jié)合抗體和未結(jié)合抗體。合適的檢測(cè)物包括各種酶類、輔基、熒光材料、發(fā)光材料和放射材料。
可通過(guò)測(cè)定或顯示結(jié)合ApoE-CTD的抗體或未結(jié)合的抗體，以檢測(cè)本發(fā)明的抗體和ApoE-CTD的復(fù)合物的形成?？墒褂贸Ｒ?guī)檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或組織免疫化學(xué)。為進(jìn)一步標(biāo)記抗體，可使用由檢測(cè)物標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品和未標(biāo)記抗體，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析，檢測(cè)樣本中的ApoE-CTD。在本分析的一個(gè)實(shí)例中，組合了生物樣本、標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品和抗體，并測(cè)定了結(jié)合未標(biāo)記配體上的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品的含量。樣本中ApoE-CTD的含量與結(jié)合抗體的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品的含量成反比。
可制備熒光團(tuán)和發(fā)光團(tuán)標(biāo)記的抗體。由于抗體吸收波長(zhǎng)小于等于大約310nm的光，應(yīng)選擇基本吸收波長(zhǎng)大于310nm、優(yōu)選大于400nm的熒光部分。對(duì)許多合適的熒光團(tuán)和發(fā)光團(tuán)的描述參見(jiàn)Stryer(1968)Science 162526和Brand，L.at al.(1972)Annual Review of Biochemistry41843-868?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)方法，如在美國(guó)專利Nos.3,940,475、4,289,747和4,376,110公布的方法，用熒光發(fā)色團(tuán)標(biāo)記抗體。具有許多上述所需性質(zhì)的一組熒光劑為呫噸染料(xanthene dye)，其包括熒光素(fluorescein)和羅丹明(rhodamine)。另外一組熒光化合物是萘胺。一旦抗體用熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)標(biāo)記，便可檢測(cè)樣本中ApoE-CTD的存在或位置，如使用熒光顯微術(shù)(如共聚焦顯微術(shù)(confocal microscopy)或反卷積顯微術(shù)(deconvolution microscopy))。
可使用本文所描述的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)。例如，可合成具有標(biāo)記(如純化標(biāo)記或表位標(biāo)記)的抗體，或通過(guò)綴合標(biāo)記或結(jié)合標(biāo)記的基團(tuán)對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)性標(biāo)記。例如可將螯合劑附著在抗體上。然后將抗體加入組織學(xué)制備物，如用于顯微鏡的載玻片上的固定組織切片。在結(jié)合孵育后，洗滌制備物，去除未結(jié)合抗體。然后對(duì)制備物進(jìn)行分析，如使用顯微術(shù)，以鑒定是否抗體結(jié)合標(biāo)本上。
當(dāng)然，在結(jié)合時(shí)抗體可為未標(biāo)記抗體，在結(jié)合和洗滌后，可標(biāo)記抗體，使之可被檢測(cè)。
也可將抗體固定在蛋白陣列上?？蓪⒌鞍钻嚵凶鳛樵\斷工具使用，如用于篩選醫(yī)學(xué)樣本(如分離的細(xì)胞、血樣、血清、活組織等等)。當(dāng)然，蛋白陣列也可包括其它配體，如結(jié)合ApoE-CTD的配體。
制備多肽陣列的方法已被描述，如在De Wildt et al.(2000)NatureBiotech.18989-994；Lueking et al.(1999)Anal.Biochem.270103-111；Ge(2000)Nuc.Acids Res.28e3；MacBeath & Schreiber(2000)Science2891760-1763；WO 01/40803 & WO 99/51773A1中描述。用于陣列的多肽可被高速點(diǎn)樣，如使用可商購(gòu)的機(jī)器人裝置，如從GeneticMicroSystems & Affymetrix(Santa Clara，California，USA)或BioRobotics(Cambridge，UK)購(gòu)買。陣列底物可為，例如硝酸纖維素、塑料、玻璃，如表面經(jīng)修飾的玻璃。陣列也可包括多孔基質(zhì)，如丙烯酰胺、瓊脂糖或其它聚合物。
例如，陣列可為抗體陣列，如在上文De Wildt文獻(xiàn)中的描述。產(chǎn)生多肽配體的細(xì)胞可在陣列形式的濾器(filter)上生長(zhǎng)。誘導(dǎo)多肽合成，并將所表達(dá)的多肽固定在濾器上細(xì)胞所在的位置上。
可將抗體陣列與標(biāo)記靶標(biāo)相接觸，以測(cè)定靶標(biāo)與多樣鏈文庫(kù)的每一種固定抗體的結(jié)合程度。如果靶標(biāo)未標(biāo)記，可采用夾心方法，如使用標(biāo)記探針，檢測(cè)未標(biāo)記靶標(biāo)的結(jié)合。
關(guān)于陣列每個(gè)位置的結(jié)合程度的信息可作為分布圖被儲(chǔ)存在如計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中?？啥啻沃苽淇贵w陣列，并將其用于比較諸如靶標(biāo)和非靶標(biāo)的結(jié)合分布圖。因此，抗體陣列可用于鑒定多樣鏈文庫(kù)的個(gè)體成員，就一個(gè)或多個(gè)分子而論，該個(gè)體成員具有所需結(jié)合性質(zhì)。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在體檢測(cè)含ApoE-CTD的斑塊存在與否的方法。本方法包括(i)將本發(fā)明的抗體給藥給受試者(如患阿耳茨海默氏病或系統(tǒng)性淀粉樣變性病的病人)，該抗體綴合檢測(cè)標(biāo)記；(ii)將受試者暴置于檢測(cè)所述檢測(cè)標(biāo)記的裝置中，該標(biāo)記結(jié)合含ApoE-CTD的斑塊。例如，用NMR或其它斷層掃描(tomographic)裝置對(duì)受試者進(jìn)行成像。
用于本發(fā)明的診斷成像方法中的標(biāo)記的實(shí)例包括放射性標(biāo)記，如131I、111In、123I、99mTc、32P、125I、3H、14C和188Rh，熒光標(biāo)記，如熒光素和羅丹明，核磁共振活性標(biāo)記，可由正電子發(fā)射斷層成像(positronemission tomography，PET)掃描儀檢測(cè)的正電子發(fā)射性同位素(positron emitting isotope)，化學(xué)發(fā)光物，如螢光素(luciferin)和酶標(biāo)記，如過(guò)氧化物酶或磷酸酶。也可使用短程輻射發(fā)射體(Short-rangeradiation emitter)，如可使用由短程檢測(cè)探針檢測(cè)的同位素?？墒褂靡阎夹g(shù)，用這些試劑標(biāo)記多肽配體。例如，見(jiàn)Wensel & Meares(1983)Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy，Elsevier，New York中與抗體的放射標(biāo)記相關(guān)的技術(shù)和D.Colcher et al.(1986)Methods Enzymol.121802-816。
也可將本發(fā)明的放射標(biāo)記配體用于體外診斷檢測(cè)中。放射性標(biāo)記配體的比活性(specific activity)取決于放射性標(biāo)記的半衰期、同位素純度，以及標(biāo)記摻合到抗體中的方式。
用放射性同位素(如14C、3H、35S、125I、32P、131I)標(biāo)記多肽的方法已廣為人知。例如，在美國(guó)專利No.4,302,438中描述了氚標(biāo)方法。碘標(biāo)、氚標(biāo)和35S標(biāo)記的方法，如為用于鼠類單克隆抗體進(jìn)行了改進(jìn)的方法，由例如Goding，J.W.(Monoclonal AntibodiesPrinciples AndPracticeProduction And Application Of Monoclonal Antibodies In CellBiology，Biochemistry，And Immunology 2nd ed.，London，Orlando，Academic Press(1986)polypeptide.124-126)和在此所引用的文獻(xiàn)進(jìn)行描述。其它碘標(biāo)諸如抗體的多肽的方法在Hunter & Greenwood(1962)Nature 144945；David et al.(1974)Biochemistry 131014-1021和美國(guó)專利Nos.3,867,517和4,376,110中描述。用于成像的放射元素包括例如123I、131I、111In和99mTc。碘標(biāo)抗體的方法在Greenwood，E.et al.(1963)Biochem.J.89114-123；Marchalonis，J.(1969)Biochem.J.113299-305；和Morrison，M.et al.(1971)Immunochemistry 8289-297中描述。99mTc標(biāo)記的方法在Rhodes，B.et al.in Burchiel，S.et al.(eds.)，Tumor ImagingThe Radioimmunichemical Detection of Cancer，NewYorkMasson 111-123(1982)和在此引用的參考文獻(xiàn)中描述。用于111In標(biāo)記抗體的方法在Hnatowich，D.J.et al.(1983)J.Immun.Methods65147-157；Hnatowich，D.et al.(1984)J.Applied Radiation 35554-557和Buckley，R.G.et al.(1984)F.E.B.S.Lett.66202-204中描述。
對(duì)放射性標(biāo)記抗體而論，可將抗體給藥給患者，其局限于與抗體作用的斑塊中，并使用已知技術(shù)對(duì)其進(jìn)行在體檢測(cè)或“成像”，這些技術(shù)包括使用如γ攝像機(jī)(gamma camera)或發(fā)射斷層成像的放射性同位素掃描(radionuclear scanning)?；蛘撸墒褂枚ㄎ话l(fā)射軸向斷層成像掃描儀(position emission transaxial tomography scanner)，如Brookhaven National Laboratory的Pet VI，在此，放射標(biāo)記發(fā)射出正電子(如11C、18F、15O和13N)。
磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)使用NMR來(lái)檢測(cè)活體受試者其內(nèi)部特征，且可用于預(yù)防、診斷、治療和外科手術(shù)中。MRI最明顯的好處是其不使用放射性示蹤化合物。一些MRI技術(shù)在已公開的歐洲專利申請(qǐng)EP-A-0 502 814中總結(jié)。一般地，可利用與在不同環(huán)境下水質(zhì)子的弛豫時(shí)間常數(shù)(relaxation time constant)T1和T2相關(guān)的差別形成圖像。但是，這些差別不足以提供極高分辨率的圖像。
造影劑(contrast agents)可提高這些弛豫時(shí)間常數(shù)之間的差異。該造影劑的實(shí)例包括許多磁性劑(magnetic agent)、順磁劑(paramagnetic agent，主要改變T1)和鐵磁劑(ferromagnetic)或超順磁劑(superparamagnetic agent，主要改變T2反應(yīng))。可將螯合劑(如EDTA、DTPA和NTS螯合劑)附著到一些順磁物質(zhì)(如Fe+3、Mn+2、Gd+3)(并降低其毒性)。其它試劑可為顆粒形式，如直徑小于10μm到大約10nM。顆?？删哂需F磁性、反鐵磁性(antiferromagnetic)或超順磁性性質(zhì)。顆?？砂?，如磁性(Fe3O4)，-Fe2O3、鐵酸鹽(ferrite)和其它過(guò)渡態(tài)元素的磁性礦物質(zhì)的化合物。磁性顆粒可包括一種或多種磁性晶體(含和不含非磁性材料)。非磁性材料可包括合成聚合物或天然聚合物，如瓊脂糖、葡聚糖、糊精，淀粉等等。
本發(fā)明的抗體也可用含具有NMR活性的19F原子的指示基團(tuán)標(biāo)記，或用多種原子標(biāo)記，因?yàn)?i)基本上所有氟原子天然豐度都是19F同位素，因此基本上所有含氟化合物具有NMR活性；(ii)任何具有化學(xué)活性的多氟化合物，如三氟醋酸酐(trifluoracetic anhydride)，可以相對(duì)低廉的價(jià)格購(gòu)得；(iii)已發(fā)現(xiàn)許多氟化物用于人體時(shí)在醫(yī)學(xué)上是可接受的，如代替血紅蛋白攜氧的全氟聚醚(perfluorinatedpolyether)。在孵育一段時(shí)間后，使用諸如在Pykett(1982)ScientificAmerican 24678-88中描述的其中一種儀器進(jìn)行MRI掃描。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的還有試劑盒，其含有本發(fā)明的抗體和用于診斷的使用說(shuō)明書，如使用抗體體外(如在樣本中，如患系統(tǒng)性淀粉樣變性病的病人的活組織樣本)或體內(nèi)(如在受試者體內(nèi)成像)檢測(cè)ApoE-CTD的使用方法。試劑盒還可包括至少一種其它試劑，如標(biāo)記物或其它診斷試劑。就在體使用而言，抗體可制成藥物組合物。
E.治療方法 結(jié)合ApoE-CTD的多肽、被本文所述的方法所鑒定的多肽，和/或在此詳細(xì)描述的多肽可用于治療和預(yù)防疾病。例如，這些配體可加入如體外的或來(lái)自體內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞中，或如體內(nèi)給藥給受試者，以治療、預(yù)防和/或診斷許多疾病，如阿耳茨海默氏病或系統(tǒng)性淀粉樣變性病。
本文中所使用的“治療”或“治療方法”被定義為單獨(dú)或與第二試劑一起將抗-ApoE-CTD的抗體應(yīng)用到或給藥給受試者，如患者，其患有疾病(如本文中所描述的病癥)、具有疾病癥狀或具有易患病體質(zhì)，其目的在于治愈、治療、減輕、緩解、補(bǔ)救、改善、提高或影響疾病、疾病癥狀或易患病體質(zhì)。
本文中所使用的有效治療疾病的抗ApoE-CTD多肽的含量，或“治療有效量”指配體的量，其在單劑量或多劑量給予受試者時(shí)是有效的，或者與在沒(méi)有進(jìn)行該治療相比，其在對(duì)延長(zhǎng)治療、減輕、緩解或改進(jìn)患本文所述疾病的受試者上是有效的。
本文中所使用的有效預(yù)防疾病的抗ApoE-CTD多肽的含量，或多肽的“預(yù)防有效量”指抗-ApoE-CTD多肽的含量，例如本文中所描述的ApoE-CTD抗體的含量，其在對(duì)預(yù)防或延緩發(fā)病或疾病如阿耳茨海默氏病復(fù)發(fā)上，單劑量或多劑量給予受試者是有效的。
術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)”、“抑制”、“加強(qiáng)”、“提高”、“升高”、“降低”等等，例如指兩種狀態(tài)間的定量差異，是指在兩種狀態(tài)之間的差異，例如在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。
本文中所使用的“受試者”旨在包括人類和除人類以外的動(dòng)物。優(yōu)選的人類動(dòng)物包括患疾病的病人，該疾病的特征在于非正常的細(xì)胞增殖或細(xì)胞分化。本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“除人類以外的動(dòng)物”包括所有的脊椎動(dòng)物，如非哺乳動(dòng)物(如雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物)和哺乳動(dòng)物，如除人類以外的靈長(zhǎng)類、綿羊、狗、牛、豬等等。
術(shù)語(yǔ)“淀粉樣變性病”旨在包括但不限于阿耳茨海默氏病、原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、老年系統(tǒng)性淀粉樣變性病、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變I(familial amyloidpolyneuropathy I)、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變III(familial amyloidpolyneuropathy III)、家族性非神經(jīng)病變淀粉樣變性病(familialnon-neuropathic amyloidosis)、遺傳性大腦淀粉樣血管病(hereditarycerebral amyloid angiopathy)、家族性英國(guó)型癡呆(Familial BritishDementia，F(xiàn)BD)、血液透析相關(guān)淀粉樣變性病(Haemodialysis-relatedamyloidosis)、家族性淀粉樣變性病(芬蘭型)、家族性上皮下角膜淀粉樣變性病(Familial subepithelial corneal amyloid)、II型糖尿病、遺傳性腎淀粉樣變性病(Hereditary renal amyloidosis)、垂體腺淀粉樣變性病(Pituitary-gland amyloidosis)、注射局限淀粉樣變性病(Ini ection localized amyloidosis)、甲狀腺髓質(zhì)癌(Medullarycarcinoma of the thyroid)、心房淀粉樣變性病(Atrial amyloidosis)、家族性丹麥型癡呆(Familial Danish Dementia，F(xiàn)DD)和唐氏綜合癥(Downs syndrome)。與淀粉樣變性病相關(guān)的疾病(其中檢測(cè)到淀粉樣纖維)包括但不限于海綿狀腦病(Spongiform encephalopathy)、散發(fā)性克-雅病(Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease)、家族性克-雅病(familial Creutzfeldt-Jakob disease)、Iatropic朊蛋白病(Iatropicprion disorder、變異克-雅病(Variant Creutzfeldt-Jakob disease)、GSS病(Gerstmann-Str_ussler-Scheinker Disease)、苦魯病(Kuru)、帕金森病(Parkinson′s disease)、亨廷頓病(Huntington’s disease)、家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(Familial amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease)。
另外，淀粉樣變性病可被定義為在大腦、骨髓或其它器官的淀粉樣沉積的病變。這種病變的一個(gè)實(shí)例為阿耳茨海默氏病。特征為淀粉樣沉積的其它癡呆病變?yōu)楹＞d狀腦病，散發(fā)性克-雅病、家族性克-雅病、Iatropic朊蛋白病、變異克-雅病、GSS病、苦魯病、帕金森病、亨廷頓病、家族性英國(guó)性癡呆、家族性丹麥型癡呆、唐氏綜合癥、原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病，如免疫球蛋白輕鏈相關(guān)淀粉樣變性病、繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病，如與淀粉樣A蛋白相關(guān)的淀粉樣變性病、家族性系統(tǒng)性淀粉樣變性病，如家族性甲狀腺素運(yùn)載蛋白相關(guān)的淀粉樣變性病、家族性載脂蛋白A-I相關(guān)淀粉樣變性病、家族性凝溶角蛋白相關(guān)淀粉樣變性病、家族性纖維蛋白原Aα相關(guān)的淀粉樣變性病、家族性溶酶體淀粉樣變性病，老年系統(tǒng)性淀粉樣變性病、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變I、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變III、家族性非神經(jīng)病變淀粉樣變性病、遺傳性大腦淀粉樣血管病、血液透析相關(guān)淀粉樣變性病、家族性淀粉樣變性病(芬蘭型)、家族性上皮下角膜淀粉樣變性病、II型糖尿病、遺傳性腎淀粉樣變性病、垂體腺淀粉樣變性病、注射局限淀粉樣變性病、甲狀腺髓質(zhì)癌、心房淀粉樣變性病、慢性阻塞性肺疾病和家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥。詳細(xì)的參考文獻(xiàn)可見(jiàn)James C.Sacchettini and Jeffery W.KellyNature Reviews，DrugDiscovery，Vol.1 April 2002，267-275。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者為受試人?；蛘撸茉囌邽楸磉_(dá)ApoE-CTD樣抗原的哺乳動(dòng)物，該抗原與本發(fā)明的多肽發(fā)生交叉反應(yīng)。本發(fā)明的多肽可以治療為目的給藥給受試人(后文進(jìn)一步詳細(xì)描述)。另外，以治療動(dòng)物為目的，或以作為人類疾病的動(dòng)物模型為目的，可將抗ApoE-CTD多肽給藥給表達(dá)ApoE-CTD樣抗原的除人類以外的哺乳動(dòng)物(如靈長(zhǎng)類、豬或小鼠)，該多肽結(jié)合ApoE-CTD樣抗原?；诤笠环N目的，這種動(dòng)物模型在評(píng)估多肽的治療效果上是有益的(如在檢測(cè)給藥劑量以及給藥時(shí)間過(guò)程上)。
對(duì)于體內(nèi)實(shí)施方案，接觸步驟在受試者體內(nèi)起作用，其包括將抗-ApoE-CTD多肽在配體和斑塊可結(jié)合，并且可治療，即破壞斑塊的有效條件下給藥給受試者。
抗-ApoE-CTD多肽的給藥方法在《藥物組合物》(PharmaceuticalCompositions)中描述。所使用分子的合適劑量取決于受試者的年齡和體重以及所使用的具體藥物。
可在體直接使用抗-ApoE-CTD配體，通過(guò)天然的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)，去除含ApoE-CTD的斑塊。本發(fā)明的多肽可包括補(bǔ)體結(jié)合效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，如IgG1的Fc部分，結(jié)合補(bǔ)體的IgM的-2、-3或相應(yīng)部分。可通過(guò)加入補(bǔ)體或含補(bǔ)體的血清進(jìn)行輔助治療。另外，本發(fā)明的多肽所包被的斑塊的吞噬作用可通過(guò)補(bǔ)體蛋白的結(jié)合作用得以提高。
抗體打靶的淀粉樣斑塊可通過(guò)A型清道夫受體被小膠質(zhì)細(xì)胞納入其中(Melanie I.Brazil，Haeyong Chung，and Frederick R.Maxfield.Effects of Incorporation of Immunoglobulin G and ComplementComponent Clq on Uptake and Degradation of Alzheimer′s DiseaseAmyloid Fibrils by Microglia J.Biol.Chem.，May 2000；27516941-16947)?；蛘?，其它不依賴小膠質(zhì)細(xì)胞Fc受體的機(jī)制在清除彌散的、3D6免疫反應(yīng)的、硫代-S-陰性斑塊和可溶性Aβ部分上也起著作用(Wilcock DM，DiCarlo G，Henderson D，Jackson J，Clarke K，Ugen KE，Gordon MN，Morgan DIntracranially administeredanti-Abeta antibodies reduce beta-amyloid deposition by mechanisms bothindependent of and associated with microglial activation.J Neurosci 2003，233745-3751)。與本假說(shuō)相一致，F(xiàn)c敲除的小鼠在Aβ免疫療法治療后，斑塊含量降低(Das P，Howard V，Loosbrock N，Dickson D，MurphyMP，Golde TEAmyloid-beta immunization effectively reduces amyloiddeposition in FcRgamma-/-knock-out mice.J Neurosci 2003，238532-8)。
本發(fā)明還包括了處死或切除方法，其使用了用于預(yù)防的抗-ApoE-CTD。例如，可使用這些材料預(yù)防或延緩阿耳茨海默氏病，系統(tǒng)性淀粉樣變性病或其它淀粉樣變性病的發(fā)展或進(jìn)程。
使用本發(fā)明的治療方法治療阿耳茨海默氏病或系統(tǒng)性淀粉樣變性病，具有諸多益處。由于多肽特異性識(shí)別ApoE-CTD，其它組織免受損傷，并且將較高水平的試劑直接釋放到需要治療的部位。根據(jù)本發(fā)明的治療方法可用臨床參數(shù)有效監(jiān)控?；蛘?，可使用這些參數(shù)指示應(yīng)何時(shí)進(jìn)行這種治療。
F.藥物組合物 在另外一方面，本發(fā)明提供了組合物，如在藥理學(xué)上可接受的組合物，其包括與藥理學(xué)上可接受的載體一起按照配方制備的本發(fā)明的抗體。本文中所使用的“藥物組合物”包括用于在體成像的標(biāo)記配體和治療組合物。
本文中所使用的“可藥用的載體”包括任何在生理學(xué)上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包被劑等等。優(yōu)選地，載體適合于靜脈、肌肉、皮下、非腸道、脊柱或表皮給藥(如通過(guò)注射或灌輸)。根據(jù)給藥途徑的不同，可將諸如多肽的活性化合物用某種材料包被，以使化合物免受可能使化合物失活的酸或其它自然條件的作用。
本發(fā)明的組合物可為多種形式。這些形式包括，例如，液體、半固體或固體劑量形式，如液體溶液(如可注射和可灌輸溶液)、分散液或懸浮液、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于所決定的給藥和治療應(yīng)用模式。一般的優(yōu)選的組合物為可注射或可灌輸溶液的形式，如用于與抗體一起給藥給人類的組合物的相似組合物。優(yōu)選的給藥模式為非腸道給藥(如靜脈、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉給藥)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗ApoE-CTD多肽通過(guò)靜脈灌輸或注射給藥。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗ApoE-CTD配體通過(guò)肌肉注射或皮下注射給藥。
在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“非腸道給藥”和“以非腸道方式給藥”指一般通過(guò)注射的給藥模式，而非腸內(nèi)給藥和局部給藥，包括但不限于靜脈、肌肉、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和灌輸。
藥物組合物一般必須無(wú)菌，并在制備和存儲(chǔ)條件下穩(wěn)定存在。
組合物可制成溶液、微乳劑、分散劑、脂質(zhì)體或其它適于高濃度藥物的有序結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^(guò)如下步驟制備無(wú)菌注射液按照要求，將恰當(dāng)溶劑中所需劑量的活性化合物(如多肽)與上述一種成分或多種成分的組合混合，然后過(guò)濾除菌。一般地，可通過(guò)將活性化合物加入無(wú)菌載體中制備分散劑，該無(wú)菌載體含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的上述其它成分。就用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉劑而言，優(yōu)選的制備方法是真空和冷凍干燥，該方法可生成活性成分和其它來(lái)自前述過(guò)濾除菌溶液的所需成分的粉劑。可維持溶液的適當(dāng)流動(dòng)性，例如，通過(guò)使用諸如卵磷脂的包被劑，通過(guò)維持在分散狀況下所需顆粒的大小和通過(guò)使用表面活性劑。延長(zhǎng)注射化合物的吸收時(shí)間可通過(guò)在組合物中加入延緩吸收的試劑例如單硬脂酸鹽和明膠實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法給藥，盡管對(duì)于很多應(yīng)用而言，優(yōu)選的給藥途徑/模式為靜脈注射或灌輸。例如，對(duì)于治療應(yīng)用而言，可將抗體以小于30、20、5或1mg/min的速率通過(guò)靜脈灌輸給藥，以達(dá)到1到100mg/m2，如7到25mg/m2。給藥途徑和/或模式根據(jù)所需結(jié)果的不同而不同。
藥物組合物可用本領(lǐng)域所熟知的醫(yī)學(xué)裝置給藥。例如，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可用無(wú)針皮下注射裝置給藥，如在美國(guó)專利Nos.5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所公開的裝置。已知的用于本發(fā)明的植入劑和組件的實(shí)例包括美國(guó)專利No.4,487,603，其公開了一種以精確灌輸速率分散藥物的可植入微型灌輸泵；美國(guó)專利No.4,447,224，其公開了一種用于連續(xù)藥物釋放的變流可植入灌輸裝置；美國(guó)專利No.4,439,196，其公開了一種具有多室隔區(qū)的滲透型藥物釋放系統(tǒng)；和美國(guó)專利No.4,475,196，其公開了一種滲透型藥物釋放系統(tǒng)。理所當(dāng)然，同樣已知許多其它的植入劑、釋放系統(tǒng)和分子。
在某些實(shí)施方案中，可配制本發(fā)明的化合物，以確保在體內(nèi)正確的分布。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高度親水性化合物。為確保本發(fā)明的治療化合物通過(guò)BBB，可將其配制成例如以脂質(zhì)體形式。就制備脂質(zhì)體的方法而言，參見(jiàn)美國(guó)專利4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂質(zhì)體可包含一個(gè)或多個(gè)部分，其選擇性進(jìn)入到特異性細(xì)胞或器官，藉此提高打靶藥物的釋放(見(jiàn)如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。
改變劑量安排，以提供所需最佳效應(yīng)(如治療效應(yīng))。例如，可給予單劑快速濃注；可按時(shí)間給予幾劑；或者根據(jù)治療情況的緊急要求按比例降低或升高劑量。為使給藥簡(jiǎn)單化，藥量均一化，特別優(yōu)先以劑量單位形式制成非腸道組合物。本文中提到的“劑量單位形式”指物理上分離的單位，適合作為有待治療的受試者的單位劑量，每個(gè)單位含活性化合物的預(yù)定量，通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)該預(yù)定量在所需藥物載體的聯(lián)合下可產(chǎn)生所需治療效應(yīng)。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由以下因素決定并直接取決于以下因素(a)活性化合物的獨(dú)特特征和所要獲得的具體治療效果，和(b)配制用于治療個(gè)體敏感狀況的活性化合物過(guò)程中內(nèi)在的限制。
本發(fā)明的抗體的治療或預(yù)防有效量的一個(gè)示例性、非限定性的范圍是0.1～20mg/kg，更優(yōu)選的是1～10mg/kg。可將抗體以小于30、20、10、5或1mg/min的速率通過(guò)靜脈灌輸給藥，以達(dá)到大約1到100mg/m2或5到30mg/m2的劑量。對(duì)于分子量較IgG低的抗體片段而言，合適的劑量可按比例減少。需要注意的是劑量值可根據(jù)需要緩解的病癥的類型和嚴(yán)重程度的不同而改變。還需要理解的是對(duì)于任何特定受試者，應(yīng)該根據(jù)個(gè)體需要以及管理或監(jiān)督組合物給藥的專業(yè)人士的意見(jiàn)，隨著時(shí)間的變化改變具體劑量安排；并且本文所列出的劑量范圍僅僅是示例性的，并非意在限定要求專利保護(hù)的組合物的范圍或使用。
本發(fā)明的藥物組合物可包括本發(fā)明的抗體的“治療有效量”或“預(yù)防有效量”。想要獲得的治療結(jié)果一般是指減輕或改善接受治療的個(gè)體所患疾病或病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀。本發(fā)明的抗體的治療劑量可為起到減緩或停止淀粉樣沉淀合成、消除已存在淀粉樣沉淀、緩和潛在病變(其導(dǎo)致繼發(fā)性淀粉樣變性病)和緩解由心臟或腎臟損傷所引起的癥狀的含量?！爸委熡行Я俊笔侵冈趧┝可虾退仨毜囊欢螘r(shí)間內(nèi)能有效地獲得想要獲得的治療效果的劑量。組合物的治療有效劑量可根據(jù)各種因素的不同而不同，如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個(gè)體體重、和在個(gè)體中多肽配體引發(fā)所需反應(yīng)的能力。治療有效劑量同樣也為組合物的治療有益效果超過(guò)組合物的毒副效果的治療有效劑量。優(yōu)選地，“治療有效量”是指相對(duì)于未得到治療的受試者，將可檢測(cè)參數(shù)，如斑塊形成或生長(zhǎng)速率，抑制了至少大約20％，更優(yōu)選至少大約40％、更為優(yōu)選至少大約60％，并且更為優(yōu)選至少大約80％。化合物抑制可檢測(cè)參數(shù)的能力可在預(yù)示其在人上的效果的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)估。或者，組合物的這個(gè)性質(zhì)可通過(guò)檢測(cè)化合物體外抑制該抑制作用的能力進(jìn)行評(píng)估，該抑制通過(guò)為普通技術(shù)人員所熟知的方法檢測(cè)。
“預(yù)防有效劑量”是指在劑量上和所必須的一段時(shí)間內(nèi)能有效地獲得想要獲得的預(yù)防效果的劑量。想要獲得的預(yù)防效果是指可抑制或延緩與疾病相關(guān)癥狀的出現(xiàn)和進(jìn)程，該疾病是在需要治療的個(gè)體中要預(yù)防的。一般地，由于預(yù)防劑量是在發(fā)病前或發(fā)病初期用于病人，因此預(yù)防有效劑量較治療有效劑量小。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的還有試劑盒，該試劑盒含有本發(fā)明的抗體和如用于治療、預(yù)防或診斷的使用說(shuō)明書，在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷應(yīng)用的說(shuō)明書包括使用抗體體外(如在樣本中，如在患阿耳茨海默氏病或系統(tǒng)性淀粉樣變性病的病人的活組織或細(xì)胞中)或體內(nèi)檢測(cè)與斑塊相關(guān)的ApoE-CTD形成的使用方法。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，治療應(yīng)用的說(shuō)明書包括給藥給患阿耳茨海默氏病或系統(tǒng)性淀粉樣變性病的病人的建議劑量和/或給藥模式。試劑盒還可包括至少一種其它試劑，如診斷或治療試劑。
通過(guò)如下實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的說(shuō)明，而并非作為進(jìn)一步限定來(lái)解釋。在本申請(qǐng)中所引用的所有參考文獻(xiàn)的內(nèi)容、所附的專利申請(qǐng)和已公布的專利在此通過(guò)引用全文特別地納入本文。
盡管本發(fā)明已參照其優(yōu)選的實(shí)施方案具體說(shuō)明并描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解的是在不背離所附權(quán)利要求書所囊括的本發(fā)明的范圍下，可在形式和細(xì)節(jié)上存在各種變化。
實(shí)施例 實(shí)施例1抗體文庫(kù)組成 結(jié)合淀粉樣變性病斑塊中的ApoE，而不結(jié)合VLDL的抗體選自Dyax嗜菌粒文庫(kù)Fab300中的人源噬菌體抗體?？贵w多樣性出現(xiàn)在用于在CTD上選擇的文庫(kù)中，輕鏈和重鏈的多樣性包括 重鏈 重鏈由一個(gè)重鏈基因區(qū)段(V3-33、或Dp-47)組成，其中，使用合成型寡核苷酸，在HCDR1和HCDR2的某些位置可形成多樣性。分布方式的基礎(chǔ)是對(duì)天然序列的多樣性分析。附加的HCDR3多樣性來(lái)源于B細(xì)胞(來(lái)自一系列自身免疫供體)的IgM庫(kù)天然存在的序列。
輕鏈 輕鏈庫(kù)來(lái)自一組天然重排的輕鏈序列，其來(lái)自與H-CDR3多樣性相同的來(lái)源。這意味著我們可以不同范圍的種系區(qū)段為基礎(chǔ)預(yù)測(cè)Vκ和Vλ基因，并且在CDR內(nèi)部或外部發(fā)生體細(xì)胞突變。
對(duì)照抗體 下述抗-ApoE抗體可用來(lái)作為對(duì)照 3D12，結(jié)合CTD、VLDL、LDL、ApoE2、ApoE3和ApoE4的小鼠抗體(Colabek et al.Biophysical J.，791008-1015)； E19，抗CTD的山羊抗體(Weisgraber(1986)，J.Biol.Chem.，2612068-2076)；和 6C5，抗NTD的小鼠抗體(Castano 1995)J.Biol.Chem.，27017610-17615。
實(shí)施例2纖維的制備和預(yù)試驗(yàn) 從脾臟和腎臟中提取纖維。通過(guò)在冷0.15M NaCl，0.1％NaN3中進(jìn)行幾輪機(jī)械勻漿，從人組織提取可溶性淀粉狀纖維，隨后離心以獲得沉淀中的淀粉樣蛋白。最后，淀粉樣蛋白溶解/重懸于水中，并將其保存。通過(guò)對(duì)懸浮液涂片進(jìn)行剛果紅染色確定淀粉樣蛋白的含量。提取纖維的方法為本領(lǐng)域所熟知，參見(jiàn)，例如Skinner et al.Prep.Biochem.1982；12(5)461-476?？梢源_定，通過(guò)Marvel-PBS-Tween(0.1％)洗滌5次，PBS-Tween洗滌2次，PBS洗滌1次，可分離結(jié)合的和非結(jié)合的噬菌體。
實(shí)施例3生物素化CTD(bCTD)的制備和預(yù)試驗(yàn) 使用具有SEQ ID NO1所示出氨基酸序列的CTD。使用摩爾比為1/2和1/10的CTD/生物素，根據(jù)Pierce所描述的方法，用磺基-NHS-SS-生物素進(jìn)行生物素化。SDS PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)100％的材料被標(biāo)記。在質(zhì)譜分析中，比率為1/10時(shí)，五個(gè)可能的生物素位點(diǎn)中有三個(gè)到五個(gè)位點(diǎn)被生物素標(biāo)記。比率為1/2時(shí)，bCTD顯示每個(gè)分子有一個(gè)或兩個(gè)生物素標(biāo)記，這有利于維持分子結(jié)構(gòu)。所使用的全部CTD和NTD用相同方法以比率1/2進(jìn)行標(biāo)記，并用SDS-page檢測(cè)。
用生物素包被BSA、洗滌、加入鏈霉親和素，并在再次洗滌后加入b-CTD，可制備包被bCTD。
為合成變性bCTD，可用尿素處理bCTD，并在洗滌后將其結(jié)合生物素化BSA上的鏈霉親和素。為確保在尿素處理過(guò)程中bCTD結(jié)合微珠并停留在上面，我們?cè)谀蛩靥幚砬昂髾z測(cè)了bCTD的含量以及其與微珠的結(jié)合。未見(jiàn)bCTD丟失。
實(shí)施例4在纖維和ur-bCTD上的選擇 在選擇方法中，其目的在于選擇結(jié)合淀粉樣纖維中CTD復(fù)合物形式的抗體。第一輪選擇在來(lái)自腎臟的纖維上進(jìn)行，第二輪選擇在來(lái)自脾臟的纖維上進(jìn)行，第三輪和第四輪選擇在ur-bCTD上進(jìn)行。在第二輪和第三輪選擇中未見(jiàn)富集，而在第四輪富集了1379。在第二種方法中，在bCTD上中進(jìn)行了三輪篩選擇。
然后進(jìn)行預(yù)篩選，以確定選擇哪一輪選擇用于高通量篩選和應(yīng)使用哪種抗原。在對(duì)bCTD和ur-bCTD的篩選上未見(jiàn)顯著差異。因此，決定使用鏈霉親和素包被bCTD對(duì)ur-bCTD選擇進(jìn)行高通量篩選?？墒褂面溍褂H和素包被的板作為陰性對(duì)照bBSA。
實(shí)施例5測(cè)序和結(jié)合分析 在包被bCTD上對(duì)2000多個(gè)克隆進(jìn)行篩選。在自動(dòng)系統(tǒng)中進(jìn)行ELISA。使用相同方法篩選NTD結(jié)合物。進(jìn)一步分析結(jié)合bCTD而不結(jié)合bNTD的克隆。
對(duì)在高通量bCTD噬菌體ELISA中呈現(xiàn)陽(yáng)性的克隆的重鏈和輕鏈基因進(jìn)行測(cè)序。可使用Dyax’s所有的“webphage”軟件分析克隆序列。
在纖維和ur-bCTD上的第3輪選擇后篩選了752個(gè)克隆(23個(gè)陽(yáng)性)，第4輪選擇后篩選了216個(gè)克隆(216個(gè)陽(yáng)性)。在bCTD上的第2輪選擇后篩選了940個(gè)克隆。在使用bCTD的ELISA中陽(yáng)性克隆數(shù)為463。所獲得的正確序列數(shù)為163。
為分析序列數(shù)據(jù)，對(duì)不同水平的序列進(jìn)行比較，包括 (1)整體多樣性＝不同序列數(shù)，若發(fā)現(xiàn)一個(gè)氨基酸不同，便將一個(gè)克隆識(shí)別為不同克隆(稱為VH+VL多樣性)＝163 (2)重鏈多樣性＝具有不同重鏈的克隆數(shù)，忽略輕鏈序列＝152 (3)HCDR3多樣性＝具有不同重鏈CDR3的克隆數(shù)＝54(具有琥珀HCDR3的+2個(gè)克隆)。
進(jìn)行這三個(gè)水平的分析基于兩個(gè)原因 首先，人們普遍認(rèn)為重鏈和其在該結(jié)構(gòu)域的HCDR3區(qū)在對(duì)抗體的表位識(shí)別上非常重要。具有相同H-CDR3序列的所有抗體分為一組。
其次，文庫(kù)多樣性的設(shè)計(jì)導(dǎo)致抗體變體具有相同的HCDR3，且在重鏈其它CDR發(fā)生突變，并且某些時(shí)候需要相同的輕鏈，某些時(shí)候需要不同輕鏈。
實(shí)施例6抗體與bCTD和VLDL的結(jié)合 為監(jiān)測(cè)與VLDL的結(jié)合，將VLDL包被在微量滴定板上，并與待測(cè)抗體一起孵育。采用二抗-HRP檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)合抗體。用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和H2O2進(jìn)行染色。只有未結(jié)合抗體被洗掉。與VLDL的結(jié)合在ELISA中會(huì)產(chǎn)生較高信號(hào)。
我們使用抗ApoE的單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。兩種結(jié)合CTD和VLDL的抗體(3D12、E19)在bCTD ELISA(圖1A)和VLDL ELISA(圖1B)中呈陽(yáng)性。另外一種結(jié)合NTD的抗體(6C5)并不與bCTD結(jié)合，但充分結(jié)合VLDL。該NTD位點(diǎn)不為VLDL所掩蓋，且能測(cè)定ApoE自身的包被質(zhì)量。由于該抗體信號(hào)較高，我們推斷有足夠的ApoE被包被，以進(jìn)行VLDL ELISA。
我們將噬菌體抗體(圖2)分成三組總呈陽(yáng)性的抗體(高于陰性噬菌體結(jié)合的三倍)，有時(shí)呈陽(yáng)性、有時(shí)呈陰性的抗體(有時(shí)高于陰性噬菌體結(jié)合的二倍，有時(shí)呈陰性)和陰性抗體。對(duì)于不確定的抗體，ELISA可能不夠敏感，或抗體不能結(jié)合，或親和力可能不足以獲得較高的信號(hào)，或者可能是與VLDL有交叉反應(yīng)(表位部分在VLDL上，部分在所掩蓋的CTD上)。
實(shí)施例7VLDL分析的開發(fā)和自動(dòng)化 對(duì)全部203個(gè)bCTD陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行VLDL ELISA分析。發(fā)現(xiàn)6個(gè)一直呈陽(yáng)性克隆(高于本底值的三倍)。其它克隆所獲得的信號(hào)2倍于本底值(圖3)。并不排除對(duì)此階段的這些克隆進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。只有六個(gè)克隆是VLDL陽(yáng)性，且信號(hào)較高。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次，并獲得相同的結(jié)果。同時(shí)檢測(cè)了抗體與bNTD的結(jié)合。沒(méi)有抗體與bNTD結(jié)合。對(duì)與VLDL結(jié)合的克隆不進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。
實(shí)施例8噬菌體重克隆到Fab，特異性檢測(cè) 由于在包被VLDL ELISA中較低含量的VLDL結(jié)合物，以及VLDL競(jìng)爭(zhēng)性ELISA結(jié)果的多變性，我們同時(shí)將噬菌體上的Fab的全部不同的157個(gè)克隆重克隆成可溶性Fab。推測(cè)許多Fab結(jié)合bCTD，這是由于它們的單價(jià)性質(zhì)相對(duì)于多價(jià)噬菌體，因此，通過(guò)bCTD上的Fab ELISA信號(hào)的手段能排除較低親和力的結(jié)合物。
在重克隆后，85個(gè)抗體特異性結(jié)合bCTD。未發(fā)現(xiàn)新的VLDL或NTD結(jié)合物。這些抗體的VH和VL鏈的CDR區(qū)的氨基酸序列見(jiàn)表9和10。
實(shí)施例9表位作圖 通過(guò)監(jiān)測(cè)Fab和噬菌體抗體之間的競(jìng)爭(zhēng)可檢測(cè)其與相同表位的結(jié)合。將一定量的噬菌體和足量的Fab加入bCTD包被ELISA孔中。在結(jié)合步驟結(jié)束后，與抗-M13HRP抗體一起孵育，然后通過(guò)過(guò)氧化物酶反應(yīng)檢測(cè)噬菌體。由于加入了高濃度的Fab，與Fab抗相同表位的噬菌體被競(jìng)爭(zhēng)掉，F(xiàn)ab信號(hào)將降低。
來(lái)自相同VH-CDR3組的抗體可識(shí)別重疊表位。可使用該規(guī)則排除用于免疫組織化學(xué)(IHC)的克隆。只檢測(cè)到具有最高/最低的解離速率的克隆。不屬于大VH-CDR3組的所有克隆用IHC檢測(cè)。
抗體807A-M0026-F05和807A-M0027-E11并不彼此交叉反應(yīng)。但是均與抗體807A-M0028-A07交叉反應(yīng)，這表明兩種抗體均識(shí)別相似但非相同的表位。
與抗體807A-M0026-F05和807A-M0027-E11相比，抗體807A-M0028-B02可能識(shí)別另外一個(gè)表位。
實(shí)施例10解離速率檢測(cè) 為最優(yōu)化Biacore檢測(cè)，我們使用了用鏈霉親和素包被的Biacore芯片結(jié)合bCTD。首先我們對(duì)抗體3D12和E19與芯片的結(jié)合進(jìn)行了分析。我們還重克隆了我們從預(yù)篩選中回收的Fab(不結(jié)合VLDL，在Fab ELISA中呈陽(yáng)性)。在Biacore中Mab 3D12并不結(jié)合，這可能是由于親和力較低。Ab E19和非純化的Fab 1F7(透析得到的胞質(zhì)部分)并不與bCTD芯片相結(jié)合。我們使用bBSA包被的通道作為對(duì)照；沒(méi)有抗體結(jié)合該表面。
使用胞質(zhì)提取物在該bCTD芯片上確定所選擇的Fab的解離速率分類(對(duì)克隆分類非常重要，在現(xiàn)在以及在親和力成熟研究中)。表1示出解離速率檢測(cè)的代表性列表。
使用純化的Fab片段在芯片上以較低密度的bCTD進(jìn)行親和力測(cè)定。
實(shí)施例11免疫組織化學(xué) 對(duì)具有相同VH-CDR3組的最低解離速率的抗體和所有具有不同VH-CDR3(單個(gè)克隆)的抗體所進(jìn)行的免疫組織化學(xué)(IHC)采用在冰凍組織切片上的IHC進(jìn)行檢測(cè)。
在IHC和親和力檢測(cè)中使用純化的Fab。抗體片段(Fab)在細(xì)菌表達(dá)(一般在400ml培養(yǎng)液中，IPTG誘導(dǎo)4小時(shí))，并通過(guò)固定金屬親和層析(Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC)從胞質(zhì)提取物中純化。胞質(zhì)提取物通過(guò)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行“滲透壓休克”(osmotic shock)處理制備。將樣本加入一個(gè)1ml Co-IDA柱并用0-150mM的線性梯度的咪唑進(jìn)行洗脫。使用PBS對(duì)蛋白制品進(jìn)行透析并通過(guò)非還原SDS-PAGE分析。
只有三種作為Fab的抗體結(jié)合AD斑塊807A-M0027-E11、807A-M0028-B02和807A-M0026-F05。
在IHC中，抗體807A-M0027-E11檢測(cè)阿耳茨海默氏病(AD)斑塊。重要的是抗體特異性識(shí)別組織中的斑塊，但不結(jié)合暴露在血清中的載脂蛋白E。一般地，本發(fā)明的抗體可結(jié)合至少兩個(gè)患AD疾病的病人的斑塊，并可結(jié)合也潛在患系統(tǒng)性淀粉樣變性病的病人的斑塊。因此，在新鮮血漿存在時(shí)進(jìn)行IHC。在IHC中，使用作為噬菌體和作為Fab的807A-M0027-E11染色，即使存在50％血清信號(hào)也不會(huì)猝滅。同樣加入VLDL至溶液中也不會(huì)改變?nèi)旧?。這與抗NTD的對(duì)照抗體6C5相反，其信號(hào)被新鮮血漿或VLDL溶液猝滅。sFab抗體807A-M0028-B02在AD斑塊上染色呈陽(yáng)性，同樣對(duì)星狀膠質(zhì)細(xì)胞也呈陽(yáng)性。sFab抗體807A-M0026-F05對(duì)AD斑塊染色微弱。該抗體的染色方式不是非常強(qiáng)，是由于該抗體的親和力較低所導(dǎo)致?？贵w在一個(gè)以上患者的組織中是陽(yáng)性的。
其它sFab抗體807A-M0039-C10、807A-M0037-D01、807A-M0046-A06和807A-M0039-C10僅可檢測(cè)AD大腦組織的星狀膠質(zhì)細(xì)胞。
實(shí)施例12對(duì)在IHC中與斑塊結(jié)合的sFab的親和力測(cè)定 三種Fab 807A-M0027-E11、807A-M0028-B02和807A-M0026-F05在Biacore分析中進(jìn)行了進(jìn)一步研究。首先，bCTD被包被到鏈霉親和素芯片上；然后將sFab以不同濃度流過(guò)芯片，并測(cè)定結(jié)合共振單位(binding resonance units，RU)。作為陰性對(duì)照，芯片的一個(gè)通道充滿了生物素-BSA。圖4A示出了sFab抗體807A-M0027-E11在bCTD上的分析結(jié)果，得到親和力為47.8nM。sFab抗體807A-M0028-B02的親和力顯示出相似方式，親和力為179nM(圖4B)。抗體807A-M0026-F05親和力較低(在μM級(jí)范圍內(nèi))，難于測(cè)定(圖4C)。
相反，當(dāng)sFab通過(guò)抗-Fc抗體偶聯(lián)到CM5芯片時(shí)，未見(jiàn)與抗體807A-M0027-E11的結(jié)合(見(jiàn)圖4D)，也未見(jiàn)與抗體807A-M0028-B02的結(jié)合。
在兩次不同的Biacore檢測(cè)中，顛倒包被劑和分析物所得到的不同結(jié)果表明抗體807A-M0027-E11和807A-M0028-B02僅僅結(jié)合包被bCTD，而不與溶液中的bCTD結(jié)合。
實(shí)施例13IgG的抗體重構(gòu)、表達(dá)和純化 抗體(批量)重構(gòu)形成IgG1 85個(gè)克隆顯示作為可溶性Fab與CTD特異性結(jié)合。其中被選用于IHC研究中的30個(gè)候選物被重構(gòu)以形成完整的人IgG1抗體。
含有全部85個(gè)“可溶性Fab結(jié)合物”的157個(gè)CTD特異的Fab，用于以同時(shí)限制性消化為基礎(chǔ)的批量重構(gòu)，形成人IgG1表達(dá)載體pBh1。
批量重構(gòu)方法包括兩個(gè)克隆步驟，并在圖5中示出。在第一步中，將完整的Fab片段插入pBh1中。在第二步中，交換內(nèi)部/調(diào)節(jié)序列。
為“再次鑒定”初始Fab，大約300個(gè)單個(gè)克隆用DNA測(cè)序法進(jìn)行了分析。在85個(gè)“可溶性Fab結(jié)合物”中發(fā)現(xiàn)有72個(gè)回復(fù)為原形(back)。值得注意的是30個(gè)用于IHC的優(yōu)選候選物(作為噬菌體和可溶性Fab)中，29個(gè)作為IgG1構(gòu)建體通過(guò)批量重構(gòu)獲得。
在13個(gè)保留“可溶性Fab結(jié)合物”中，11個(gè)可被單獨(dú)重構(gòu)形成人IgG1表達(dá)載體pRh1。重構(gòu)抗體與其相應(yīng)Fab的同一性通過(guò)測(cè)序確認(rèn)。除了完整Fab插入物的初次PCR擴(kuò)增，克隆方法與在圖5中所示出的批量重構(gòu)相同。
IgG1抗體的表達(dá)和純化 重構(gòu)IgG1抗體在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中表達(dá)?？贵w從～5×106轉(zhuǎn)染細(xì)胞(每瓶)的培養(yǎng)液上清中純化，并在培養(yǎng)液中保持大約一個(gè)星期。通過(guò)基于蛋白A的親和層析分析法進(jìn)行純化。使用PBS對(duì)純化的抗體進(jìn)行透析，并在還原條件和非還原條件下在SDS-ge1上進(jìn)行分析。
IgG抗體的生物素化 在PBS中對(duì)抗體進(jìn)行生物素化，與摩爾濃度超過(guò)15倍的磺基琥珀酰-2-(生物素氨基)乙基-1，3-二硫代丙酸酯與純化抗體一起孵育2個(gè)小時(shí)。使用HABA(2-(4’-hydroxyazobenzene)benzoic acid，2-(4’-4-羥基偶氮苯)安息香酸)法(Pierce)測(cè)定摻入生物素的水平(即每個(gè)抗體分子上生物素基團(tuán)的平均數(shù))。使用這種方法，我們發(fā)現(xiàn)生物素化抗體每個(gè)分子含3個(gè)到4個(gè)生物素基團(tuán)。
實(shí)施例14IgG1抗體的特異性檢測(cè) IgG1抗體與其它物種的結(jié)合 檢測(cè)人抗體與其它物種的bCTD的交叉反應(yīng)，以識(shí)別可在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中研究的抗體。
將可結(jié)合AD組織中的斑塊的作為sFab的抗體(807A-M0028-B02、807A-M0027-E11、807A-M0026-F05)重構(gòu)形成hIgG1，對(duì)其與生物素化的重組小鼠CTD(mbCTD)、重組靈長(zhǎng)類CTD(pbCTD)和重組人CTD(hbCTD)的結(jié)合能力進(jìn)行檢測(cè)。
抗體807A-M0028-B02和807A-M0027-E11(圖6A和6C)結(jié)合三種不同物種的CTD。兩種抗體結(jié)合程度相同，這表明被抗體識(shí)別的表位在這些物種中是相同的。
抗體807A-M0026-F05(圖6B)結(jié)合pCTD和hCTD，但不結(jié)合小鼠CTD，表明該抗體抗小鼠中不存在的表位或者所使用的濃度不夠高。該ELISA中較低OD值解釋為該抗體親和力較低。
IgG1抗體與bNTD的結(jié)合 807A-M0027-E11和807A-M0026-F05并不結(jié)合bNTD。在非常高的濃度下(10和5μg/ml)抗體807A-M0028-B02可結(jié)合。為檢測(cè)這是否與特異性結(jié)合相關(guān)，我們?cè)囍萌芤褐?000倍的bNTD(溶液中的為540μg/ml，包被的為0.5μg/ml)相競(jìng)爭(zhēng)(圖7)。在競(jìng)爭(zhēng)中非特異性信號(hào)并不降低。該信號(hào)最可能是由于所加抗體的較高含量所致，同樣見(jiàn)于抗-MUC1抗體PH1(圖7)。
IgG1抗體與VLDL的結(jié)合 在ELISA中檢測(cè)了抗體與包被VLDL的結(jié)合。與噬菌體和斑塊結(jié)合物的Fab不同，抗體807A-M0028-B02(圖8)和807A-M0027-E11以相同程度結(jié)合VLDL。與非-CTD結(jié)合物(PH1，其為MUC1結(jié)合物)的結(jié)合相比，該結(jié)合似乎為特異性的。
因?yàn)閂LDL是由ApoE和脂質(zhì)組成，所以在ELISA處理中包被VLDL可改變其構(gòu)象，并且CTD可不再被脂質(zhì)掩蓋。因此，我們與溶液中的抗體、結(jié)合板的bCTD、溶液中過(guò)量的CTD或VLDL進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)(圖9)。在本分析中我們未檢測(cè)到VLDL對(duì)人抗體的抑制作用(圖9A和B)，CTD對(duì)抗體807A-M0028-B02的抑制作用(圖9B)也極低。相反，商購(gòu)的抗CTD抗體3D12和E19被VLDL以及CTD明顯抑制。在本分析中，抗NTD單克隆抗體6C5沒(méi)有結(jié)合。
這些結(jié)果表明人抗體(807A-M0028-B02、807A-M0027-E11)不結(jié)合溶液中的VLDL，并且與包被bCTD相比，以較低程度識(shí)別溶液中的CTD。
結(jié)論 在三種結(jié)合AD病人斑塊的抗體中，兩種(807A-M0028-B02，807A-M0027-E11)與pCTD和mCTD發(fā)生交叉反應(yīng)。第三種抗體(807A-M0026-F05)并不與mCTD發(fā)生交叉反應(yīng)，但結(jié)合pCTD。所研究抗體并不結(jié)合NTD。在使用較高抗體濃度時(shí)，兩種抗體(807A-M0028-B02，807A-M0027-E11)結(jié)合包被VLDL?？贵w807A-M0026-F05并未顯示出這些特性，這可能與抗體的親和力相關(guān)。
實(shí)施例15Biacore分析 為比較Fab和IgG1的結(jié)合，并為了研究人抗體與溶液中CTD的結(jié)合的本質(zhì)，進(jìn)一步使用了Bioacore分析。
Biacore分析中Fab和IgG的比較 圖10、11、12和13總結(jié)了CTD特異克隆807A-M0026-F05、807A-M0027-E11和807A-M0028-B02的Biacore分析的結(jié)果。正如所預(yù)期的那樣，與其初始Fab形式相比較，所有三種作為IgG1的斑塊結(jié)合物更好地結(jié)合bCTD。IgG1抗體807A-M0027-E11的結(jié)合為抗體807A-M0028-B02的三倍，而抗體807A-M0026-F05以極低微摩爾親合力結(jié)合芯片。
與注入終止后立即檢測(cè)得到的親合力相比，在抗體注入終止50秒后所檢測(cè)得到的親合力較高。這種差異可能是由于在芯片上有游離bCTD時(shí)抗體與芯片的重新結(jié)合。
抗體與捕捉CTD的結(jié)合 由于VLDL ELISA中的不一致性人IgG1抗體結(jié)合包被bCTD/VLDL，但不結(jié)合溶液中的CTD/VLDL，又進(jìn)行了Biacore試驗(yàn)(也見(jiàn)在Fab上的Biacore分析)。在這些試驗(yàn)中，捕捉到bCTD或ApoE。將一抗-hFc抗體偶聯(lián)到芯片，然后與特異性抗體結(jié)合，然后注入bCTD或ApoE。
圖12示出直接偶聯(lián)到芯片的Fab抗體807A-M0027-E11并不結(jié)合bCTD(280nM)。使用Fab抗體807A-M0028-B02，并在使用兩種抗體的IgG1時(shí)，獲得相同的曲線(未示出數(shù)據(jù))。用來(lái)源于人血清的ApoE進(jìn)行檢測(cè)。只有極少量的ApoE(17RU，＜1％)與抗體結(jié)合(圖13)。
結(jié)論 在Biacore分析中，IgG1抗體807A-M0027-E11和807A-M0028-B02以nM級(jí)親合力結(jié)合包被bCTD，而IgG1抗體807A-M0026-F05以μM級(jí)親合力結(jié)合。在溶液中抗原上進(jìn)行的親和力分析表明抗體807A-M0027-E11和807A-M0028-B02均未有效捕捉bCTD或ApoE。這些結(jié)果證實(shí)了VLDL/CTD競(jìng)爭(zhēng)性ELISA中所得到的結(jié)果抗體807A-M0027-E11和807A-M0028-B02更好地結(jié)合包被bCTD，而不是溶液中的CTD。
實(shí)施例16研究抗體與天然CTD、肽的結(jié)合的其它檢測(cè) 純化hApoE的SDS-PAGE分析 通過(guò)還原SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)純化hApoE進(jìn)行分析。正如所預(yù)期的那樣，蛋白遷移的主要條帶為～35kDa，同樣也有在～70kDa的較寬條帶以及從70kDa到～200kDa的微弱脫尾。Western-Blot分析表明35kDa條帶和較高分子量的形式均含hApoE。
純化hApoE的免疫沉淀 用807A-M0028-B02、807A-M0027-E11和807A-M0026-F05對(duì)純化hApoE進(jìn)行免疫沉淀。我們使用E19(一種山羊抗-hApoE抗體)作為陽(yáng)性對(duì)照。我們使用PH1抗體作為陰性對(duì)照。未經(jīng)處理的、純化的hApoE也作為參照。SDS-凝膠對(duì)樣本進(jìn)行分析，蛋白被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用Western-blot檢測(cè)hApoE。
如所預(yù)期的那樣，抗體E19、807A-M0028-B02和807A-M0027-E11能特異性免疫沉淀hApoE，盡管并不是非常有效。有趣的是，抗體E19似乎對(duì)35kDa條帶是特異的，而抗體807A-M0028-B02和807A-M0027-E11對(duì)高分子量形式更為特異。相反，807A-M0026-F05不能免疫沉淀hApoE，這可能是由于抗體的親和力較低所致。
細(xì)胞裂解物的免疫沉淀 用807A-M0028-B02、807A-M0027-E11和807A-M0026-F05和E19(陽(yáng)性對(duì)照)以及M43G5、M43F8、PH1、A2、癌基因蛋白單克隆抗體(herceptin)和人IgG1κ骨髓瘤抗體(陰性對(duì)照)對(duì)PBMC的細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀。在還原條件下用SDS-PAGE對(duì)樣本進(jìn)行分析，并且隨后進(jìn)行銀染或Western-Blot。
只有E19與所期望大小的條帶(如～35kDa)發(fā)生了免疫沉淀。與E19發(fā)生免疫沉淀的物質(zhì)在Western-blot中也有極其微弱的信號(hào)。這表明E19捕捉了細(xì)胞裂解液中的一些hApoE，盡管該結(jié)果必須慎重考慮，因?yàn)?1)807A-M0028-B02和807A-M0027-E11并不與任何來(lái)自細(xì)胞裂解液的hApoE進(jìn)行免疫沉淀；(2)不能與hApoE免疫沉淀的807A-M0026-F05在Western-blot中也有微弱信號(hào)；并且(3)兩種無(wú)關(guān)抗體A2和807A-M0043-F08在Western-blot中產(chǎn)生強(qiáng)烈信號(hào)。
重要的是在此研究的三種抗體(807A-M0028-B02、807A-M0027-E11和807A-M0026-F05)似乎并不與細(xì)胞裂解物種任何主要組分發(fā)生免疫沉淀。807A-M0027-E11的本底值稍微高一點(diǎn)，但是比諸如PH1的本底值低。這些結(jié)果表明抗體807A-M0028-B02、807A-M0026-F05和807A-M0027-E11的整體特異性是由于其與CTD的結(jié)合。
VLDL的免疫沉淀 同樣采用免疫沉淀方法檢測(cè)了抗體與VLDL的結(jié)合。在這些檢測(cè)中使用了10％VLDL。也使用檢測(cè)抗體6C5。在用ECL方法的Westernblot顯色五分鐘后，未檢測(cè)到結(jié)合所研究的人抗體的ApoE。在過(guò)夜顯色后，與對(duì)照VLDL(非免疫沉淀VLDL，用于免疫沉淀的量的10％)相比，檢測(cè)到抗體807A-M0027-E11和807A-M0028-B02的微弱條帶。與用人抗體所進(jìn)行的免疫沉淀相比，用6C5抗體進(jìn)行的免疫沉淀其條帶更寬。
討論 807A-M0028-B02和807A-M0027-E11，而非807A-M0026-F05，優(yōu)先免疫沉淀從血漿中純化的hApoE的高分子量形式。這些形式的性質(zhì)并不清楚，盡管非常清楚它們含hApoE，并且肯定形成非常穩(wěn)定的復(fù)合物。這些抗體與主要細(xì)胞組分沒(méi)有顯著性相互作用。VLDL與抗體可發(fā)生免疫沉淀，盡管量可能會(huì)非常低。
實(shí)施例17在體研究 培育在大腦內(nèi)表達(dá)人淀粉樣前體蛋白(APP)基因的小鼠瑞典型突變K670N，M671L，APP系2576、單獨(dú)由倉(cāng)鼠朊蛋白(prion)啟動(dòng)子(Hsia et al Science 1996，27499-102)所驅(qū)動(dòng)，或者與由人血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor)所驅(qū)動(dòng)的突變型人早老素1(PS1)M146L聯(lián)合驅(qū)動(dòng)(Duff et al，Nature 1996，383(6602)710-3，Holcomb et al，Nature Med 1998，497-100)。
對(duì)要求表達(dá)人ApoE的研究而言，培育表達(dá)由膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的人ApoE的小鼠，其中小鼠ApoE基因可被敲除，也可不敲除(Sun et al，J Neurosci，1998，183261-3272)，并與humAPPSwe和humPS1M146L或僅與humAPPSwe聯(lián)合。
與抗載脂蛋白(ApoE)的C端結(jié)構(gòu)域(CTD)結(jié)合的人免疫球蛋白G1(hIgG1)同種型的單克隆抗體(mAb)以如10mg/kg的濃度腹膜內(nèi)注射到非轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)。一些小鼠注射一次并在注射兩天后處死；一些小鼠注射兩次，在注射兩天后再給予相同劑量，然后再過(guò)兩天后，也就是在第一次注射四天后處死。采用ELISA監(jiān)測(cè)所注射抗體中結(jié)合CTD的hIgG抗體濃度。將用鏈霉親和素特異性單克隆抗體注射的小鼠大腦作為陰性對(duì)照。大腦樣本立即在-70℃冷凍，然后進(jìn)行冷凍切片。
對(duì)大腦切片中人IgG是否存在的染色表明染色均一的斑塊均勻地散布在皮質(zhì)和海馬中。在體內(nèi)暴露后未發(fā)現(xiàn)其它大腦結(jié)構(gòu)被染色。相反，在從體內(nèi)暴露后，沿著淀粉樣斑塊的幾個(gè)結(jié)構(gòu)被染色?？贵w可接近的斑塊(通過(guò)抗ApoE-CTD抗體或mAb可體外染色)中，70％可在體內(nèi)暴露于抗ApoE-CTD抗體2天(n＝3)或4天(n＝3)后染色。在指定劑量下體內(nèi)暴露2天或4天，并不能完全飽和可得的結(jié)合位點(diǎn)，這由在體外給與更多抗-CTD抗體所獲得的額外染色強(qiáng)度所表明。
抗體一般作為大分子，不能自由通過(guò)血腦屏障(BBB)。IgG的通過(guò)被認(rèn)為非常有限，并且已經(jīng)報(bào)道了在CSF中的濃度低于0.5％的血漿濃度(Elovaara et al，1987 Eur Neurol 26229-34，Ganrot & Laurell1974，Clinical Chemistry 20571-3)。在對(duì)大腦切片中腹腔注射的人IgG是否存在的染色表明在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中，ApoE-CTD特異性抗體到達(dá)了均勻分布于不同腦區(qū)的大腦斑塊，表明通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)技術(shù)染色發(fā)現(xiàn)充分通過(guò)BBB。阿耳茨海默氏病(AD)的斑塊為在大小和密度上多變的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)的大腦淀粉樣斑塊被認(rèn)為代表了在AD患者中小的彌散的和中等大小的斑塊。斑塊均一染色表明mAb不僅僅到達(dá)了斑塊外層，而且還穿透了整個(gè)斑塊結(jié)構(gòu)。體外染色可達(dá)的斑塊在體內(nèi)70％暴露后被染上色。考慮到以10mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給藥并不能飽和可得的斑塊結(jié)合位點(diǎn)，非飽和水平的抗體仍可產(chǎn)生攜帶FcR的噬菌細(xì)胞導(dǎo)致的抗體介導(dǎo)的斑塊降解。
實(shí)施例18抗體重構(gòu)到小鼠IgG2a 就體內(nèi)檢測(cè)而言，抗體807A-M0028-B02、807A-M0027-E11、807A-M0026-F05的可變區(qū)和對(duì)照抗體(抗-鏈霉親和素克隆A2)被重克隆到含有小鼠重鏈IgG2a恒定區(qū)和小鼠Cκ和抗體可變區(qū)的載體中。
這些克隆從人IgG1表達(dá)載體(pBh1)轉(zhuǎn)移到表達(dá)小鼠IgG2a抗體(pRmk2a)的構(gòu)建體中，該構(gòu)建體除了這些恒定重鏈區(qū)，還含有小鼠恒定κ輕鏈基因。通過(guò)PCR將VL和VH區(qū)從人IgG1表達(dá)載體中分離，并隨后克隆到pRmk2a。VL作為ApaL1/BsiW1片段插入抗體前導(dǎo)序列的3’端和恒定κ基因5’端。就VH區(qū)而言，5’端毗鄰IRES基序包括在PCR擴(kuò)增引物中；Asc1/Nhe1片段被插入pRmk2a中。構(gòu)建體的完整性通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)?？寺》椒ㄒ?jiàn)圖14。
實(shí)施例19肽的制備 合成包含全部ApoE CTD的10個(gè)肽(長(zhǎng)為16個(gè)氨基酸)。
如圖15所示，含8個(gè)氨基酸的肽彼此重疊。肽含有可結(jié)合鏈霉親和素的S-S生物素基團(tuán)(磁珠選擇)。另外，每個(gè)肽均含有一個(gè)可偶聯(lián)載體蛋白(BSA)的半胱氨酸。
將肽溶于二甲基甲酰胺(DMF)，然后溶于水。除了肽4，所有的肽以低于10％的濃度溶于DMF。對(duì)于所有的肽而言，可在10％DMF中進(jìn)行偶聯(lián)，除了肽4，其在30％DMF中偶聯(lián)。過(guò)量的馬來(lái)酰亞胺活化的BSA用來(lái)結(jié)合肽。孵育后，過(guò)量的半胱氨酸用于結(jié)合可能的游離半胱氨酸。BSA偶聯(lián)的肽(b肽-BSA)用于選擇。
實(shí)施例20抗體與重疊肽的結(jié)合 檢測(cè)在實(shí)施例5中所識(shí)別的抗體807A-M0026-F05、807A-M0028-B02和807A-M0027-E11與重疊肽的結(jié)合。通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)首先檢測(cè)哪種肽在進(jìn)一步選擇中可優(yōu)先使用b肽-BSA或b肽；然后檢測(cè)在實(shí)施例5中所選擇的抗體是否可結(jié)合重疊肽，并且如果結(jié)合，它們所識(shí)別的表位是否不同，是否支持在實(shí)施例9中所進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)果所得到的表位作圖。通過(guò)這種方式比較了人抗體和小鼠抗體。
對(duì)人抗體而言，用IgG1和噬菌體展示的Fab進(jìn)行肽作圖。例如，克隆807A-M0026-F05作為噬菌體的Fab片段以及全部IgG1識(shí)別b肽-BSA 4和8。ELISA的靈敏度不足以顯示該抗體與b肽4和8的結(jié)合。因此，我們確定開始在b肽-BSA上進(jìn)行選擇，以捕捉大部分肽結(jié)合物是最佳的，并且若需要，在后一輪的選擇中使用b肽。令人吃驚的是與鼠類單克隆抗體相比，抗體807A-M0026-F05與CTD的結(jié)合較與肽的結(jié)合更佳?？贵w807A-M0028-B02結(jié)合肽4?？贵w807A-M0027-E11不顯著性結(jié)合任何重疊肽。
在實(shí)施例9中，我們發(fā)現(xiàn)被抗體807A-M0026-F05和抗體807A-M0027-E11所識(shí)別的表位被一大群抗體所掩蓋。兩個(gè)抗體均不彼此競(jìng)爭(zhēng)。由于與抗體807A-M0027-E11相比，CTD對(duì)抗體807A-M0026-F05的親和力非常低，因此人們預(yù)測(cè)若它們識(shí)別相同表位，那么與抗體807A-M0026-F05相比，抗體807A-M0027-E11將更為強(qiáng)烈地結(jié)合肽4和8。因此，人們可認(rèn)為兩種抗體均識(shí)別相關(guān)但非同一表位?？贵w807A-M0028-B02結(jié)合肽4，并且不同于在競(jìng)爭(zhēng)性表位作圖中的兩個(gè)其它抗體的抗體群，并且能識(shí)別不同的表位。
我們同樣檢測(cè)了重疊肽上的對(duì)照小鼠抗體?？贵w3H1、12D10和E19分別結(jié)合肽3、10和5+10。與人抗體相反，所有的對(duì)照抗體均以基本相同的程度結(jié)合肽和bCTD。
實(shí)施例21在肽上的選擇和篩選 對(duì)10種綴合BSA的重疊生物素化肽(b肽-BSA)上進(jìn)行了三輪選擇，并在相應(yīng)的生物素化肽(b-肽)上進(jìn)行了一輪選擇。使用鏈霉親和素-磁珠在10個(gè)單個(gè)肽上進(jìn)行了選擇。為應(yīng)對(duì)選擇的高數(shù)目，在選擇輪次間不進(jìn)行輸入/輸出滴定(液相擴(kuò)增)。
所使用的方法在圖16中示出。首先，使用自動(dòng)Kingfisher系統(tǒng)對(duì)與b肽-BSA的結(jié)合進(jìn)行三輪選擇。用在噬菌體上展示的Fab對(duì)第二輪和第三輪的預(yù)選擇表明在第二輪中陽(yáng)性克隆頻率非常低，并且在第三輪中許多克隆結(jié)合BSA，盡管在BSA上缺失和減少更廣泛。極為可能的是該結(jié)合物針對(duì)我們用于偶聯(lián)肽的BSA上的接頭分子。因此，進(jìn)行對(duì)b肽的第三輪選擇。對(duì)該選擇而言，本底結(jié)合可忽略不計(jì)。
為緩解測(cè)序壓力，批量重構(gòu)噬菌體-Fab克隆以合成sFab，并且在sFab水平上對(duì)克隆進(jìn)行大規(guī)模篩選(ELISA和測(cè)序)。在ELISA中發(fā)現(xiàn)307個(gè)抗體呈陽(yáng)性，其中46個(gè)抗體通過(guò)測(cè)序測(cè)定發(fā)現(xiàn)是獨(dú)特的，如表11和12所示。
實(shí)施例22在纖維和肽上的選擇和篩選 在來(lái)自含淀粉樣斑塊的器官的纖維上進(jìn)行兩輪選擇，在10個(gè)相應(yīng)的b-BSA-肽上進(jìn)行兩輪選擇，在10個(gè)相應(yīng)的b-肽上進(jìn)行一輪選擇。
所使用的方法在圖17中總結(jié)。對(duì)單個(gè)b肽-BSA進(jìn)行了第三輪和第四輪選擇。在預(yù)篩選后，發(fā)現(xiàn)少有的幾個(gè)陽(yáng)性克隆。因此，使用b肽進(jìn)行第五輪選擇。在預(yù)篩選中，發(fā)現(xiàn)對(duì)肽4和8為陽(yáng)性的克隆。在批量重構(gòu)之后，我們對(duì)這兩種選擇篩選了sFab。一共篩選了390個(gè)sFab，在ELISA中有109個(gè)為陽(yáng)性，并且4個(gè)克隆是獨(dú)特的。這些獨(dú)特的克隆的VH鏈和VL鏈的氨基酸序列在表11和12中示出。在這些方法中，大部分克隆均含唯一的VH-CDR3(表12)，并且發(fā)現(xiàn)了高度富集一個(gè)克隆富集了148倍，并且在方法B1和方法B2中均發(fā)現(xiàn)。這與實(shí)施例5中的選擇相反。
少有的幾個(gè)克隆結(jié)合bCTD(表13)，這使得其在與實(shí)施例20中所得到的結(jié)果相比是獨(dú)特的，在實(shí)施例20中，bCTD結(jié)合物與肽微弱結(jié)合，或根本不結(jié)合。在實(shí)施例21和22的篩選過(guò)程中，沒(méi)有Fab結(jié)合VLDL或NTD。
在IHC中發(fā)現(xiàn)11個(gè)Fab呈陽(yáng)性，這些Fab中有10個(gè)來(lái)源于實(shí)施例的篩選過(guò)程，一個(gè)來(lái)源于實(shí)施例21和22的篩選過(guò)程。
實(shí)施例23在ur-bCTD和肽上的選擇和篩選 在尿素處理的生物素化CTD(ur-bCTD)上進(jìn)行了兩輪選擇，然后在來(lái)源于含淀粉樣斑塊的器官的纖維上進(jìn)行了兩輪選擇。所使用的方法在圖18中總結(jié)。
在urea-CTD抗原上進(jìn)行了兩輪選擇，然后在AD病人的纖維1上進(jìn)行了兩輪選擇。在本方法中，在第三次和第四次選擇后進(jìn)行了預(yù)篩選。頻率分別為82/95和83/95。在預(yù)篩選過(guò)程中我們使用ur-bCTD和bCTD，并且在兩種類型的抗原間未見(jiàn)差異。在第三輪選擇之后，保留了許多結(jié)合bCTD而不結(jié)合纖維的克隆，而在纖維上的第二輪選擇后(第四輪選擇)，保留這些結(jié)合物的可能性非常小。因此，在第四輪選擇中進(jìn)行了大規(guī)模篩選。在ur-bCTD上篩選到950個(gè)sFab。在ELISA中有233個(gè)作為可溶性Fab的克隆呈陽(yáng)性，83個(gè)是獨(dú)特的。這些獨(dú)特的Fab的VH鏈和VL鏈的氨基酸序列見(jiàn)表14和15。在VLDLELISA中，5個(gè)結(jié)合Fab呈陽(yáng)性或?yàn)榭梢山Y(jié)合。
沒(méi)有Fab結(jié)合bNTD。
許多Fab屬于同一VH-CDR3組的大家族，單個(gè)抗體富集247倍。對(duì)單個(gè)克隆(不屬于大VH-CDR3組)和屬于以緩慢解離速率選擇的大VH-CDR3組克隆進(jìn)行IHC檢測(cè)。
在第一次IHC篩選中，6個(gè)Fab結(jié)合AD病人的斑塊。bCTD結(jié)合物的性質(zhì)在表17中總結(jié)。
實(shí)施例24IHC中作為可溶性Fab的候選克隆的制備 合成Fab進(jìn)行進(jìn)一步分析。對(duì)100μl培養(yǎng)物的胞質(zhì)部分進(jìn)行ELISA。對(duì)全部克隆的50ml培養(yǎng)物的胞質(zhì)部分進(jìn)行的Biacore解離速率檢測(cè)見(jiàn)含Biacore結(jié)果的表。
制備了大約90種可溶性Fab蛋白用于IHC檢測(cè)。對(duì)初步分析而言至少需要10μg。由于可溶性Fab表達(dá)水平的較寬偏差，通過(guò)IMAC層析，使用96孔過(guò)濾板(filter plate)和真空放大器(vacuum manifold)，從50ml細(xì)菌培養(yǎng)物的胞質(zhì)提取物或400ml培養(yǎng)物的胞質(zhì)提取物中純化蛋白。該產(chǎn)量主要在10-100μg范圍內(nèi)。
IHC陽(yáng)性可溶性Fab的大規(guī)模生產(chǎn) 在進(jìn)行IHC的斑塊組織中，15種候選Fab為陽(yáng)性/潛在陽(yáng)性。在這些克隆中，制備更多可溶性Fab蛋白，用于其它檢測(cè)。
從400ml細(xì)菌培養(yǎng)物的胞質(zhì)提取物制備可溶性Fab蛋白。
實(shí)施例25表位作圖及與初步的IHC結(jié)果的比較 在所選肽類和作為對(duì)照的非重疊肽上進(jìn)行高通量Fab篩選。在表位作圖中，就其與所有其它肽類的結(jié)合反應(yīng)性篩選所有的肽陽(yáng)性抗體。表13包括詳細(xì)結(jié)果。
兩個(gè)Fab結(jié)合所有肽類(很可能結(jié)合BSA-接頭)，被認(rèn)為是非特異性的。
未發(fā)現(xiàn)肽5和肽10特異性的Fab(盡管在對(duì)噬菌體上的Fab預(yù)篩選中發(fā)現(xiàn)一些陽(yáng)性結(jié)合物)。
49個(gè)不同F(xiàn)ab特異性結(jié)合肽類。39個(gè)特異性Fab僅僅結(jié)合將其選擇出來(lái)的肽。在肽1上選擇的一個(gè)Fab也識(shí)別肽6。來(lái)自肽4選擇的3個(gè)Fab也結(jié)合肽9，來(lái)自肽9選擇的3個(gè)Fab識(shí)別肽4。另外，在肽8上選擇的3種肽也結(jié)合肽4。只有9個(gè)Fab也結(jié)合bCTD。這表明絕大部分Fab結(jié)合重組bCTD所沒(méi)有的表位，并識(shí)別另外一種可發(fā)現(xiàn)于斑塊的(可能為拉伸的)結(jié)構(gòu)。掩蓋肽3和肽4的區(qū)域被識(shí)別為“選擇顯性表位(selection dominant epitope)”，含所有49個(gè)特異性Fab中的39個(gè)Fab以及9個(gè)bCTD結(jié)合物的8個(gè)結(jié)合物。有趣的是ApoE的該區(qū)域被認(rèn)為參與與VLDL顆粒的結(jié)合中。
IHC篩選假說(shuō) 49個(gè)特異性Fab中，有39個(gè)結(jié)合肽，但不結(jié)合bCTD。這表明這些Fab可能不會(huì)識(shí)別例如包含在VLDL顆粒中的天然ApoE。如果該Fab在IHC中會(huì)結(jié)合，則表明該表位是獨(dú)特的，并且僅見(jiàn)于斑塊，并且這些Fab對(duì)進(jìn)一步研究非常重要。
事實(shí)上，初步的IHC數(shù)據(jù)表明在這些Fab中，有四個(gè)可能結(jié)合AD病人的組織。這四個(gè)Fab均結(jié)合肽4，但不結(jié)合重疊肽，這表明它們可識(shí)別相似(重疊)表位(第1組)，可能為含氨基酸LVEDMQRQ的表位，或者僅見(jiàn)于肽4和斑塊的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
其它兩種Fab，在IHC中呈陽(yáng)性并在肽4上被選擇，結(jié)合肽4和肽9，以及結(jié)合不存在于bCTD或在bCTD中不常見(jiàn)的構(gòu)象。這兩種抗體的表位可能包括序列MQRQWAGL(第2組)。
另外一種在肽9上選擇的可能在IHC中呈陽(yáng)性的Fab，僅僅識(shí)別肽9，但不識(shí)別重疊肽或bCTD，可識(shí)別表位WAGLVEKV或僅見(jiàn)于肽9(第3組)和斑塊的構(gòu)象。
49個(gè)特異性Fab中，有10個(gè)結(jié)合肽和bCTD，表明這些抗體識(shí)別多種構(gòu)象的表位。
一種Fab結(jié)合肽1、6和bCTD。預(yù)計(jì)該表位(RTRDRLDE)并不在VLDL(第4組)的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部。
兩種抗體，從在肽4和9上的選擇獲得，識(shí)別肽(表位MQRQWAGL)和CTD，因此不同于第2組的Fab(第5組)。
一種抗體，在肽8上選擇，結(jié)合肽4、8(表位WFEPLVED)和bCTD(第6組)。
因此，根據(jù)該假說(shuō)，在實(shí)施例21和22中所識(shí)別的Fab，可分為六組Fab，每組識(shí)別不同的表位。
實(shí)施例26由實(shí)施例21和22中的方法所鑒定的Fab的Biacore解離速率分析 在全部10個(gè)肽上進(jìn)行了可溶性Fab的Biacore解離速率分析。制備并測(cè)定來(lái)自實(shí)施例21和22的全部獨(dú)特Fab的胞質(zhì)部分。其結(jié)果證實(shí)了用ELISA方法進(jìn)行的表位作圖。
結(jié)合了更多肽和/或結(jié)合bCTD的Fab一般表現(xiàn)出對(duì)那些分子的幾乎相同的解離速率。相反，對(duì)于選擇Fab的肽而言，RU(抗體結(jié)合數(shù)量的量度)通常最高。
實(shí)施例21和22的方法不能鑒別屬于同一VH-CDR3大家族的抗體。所以解離速率檢測(cè)不能被用作IHC的標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例27實(shí)施例23的抗體的表位作圖及與初步IHC結(jié)果的比較 在自動(dòng)篩選中，以其對(duì)ur-bCTD的結(jié)合反應(yīng)篩選Fab并以鏈霉親和素BSA作為陰性對(duì)照。沒(méi)有抗體結(jié)合NTD。表16包括了詳細(xì)結(jié)果。
在全部81個(gè)不同的抗體中，發(fā)現(xiàn)與ur-bCTD和CTD的結(jié)合。在這些抗體中，有5個(gè)結(jié)合包被VLDL。沒(méi)有抗體結(jié)合bNTD。20個(gè)抗體還結(jié)合肽。如實(shí)施例21和22的方法中那樣，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)在肽3和4周圍的選擇顯性表位。
在IHC中，81個(gè)抗體中有5個(gè)抗體發(fā)生結(jié)合。這些抗體中僅有一個(gè)結(jié)合肽。該抗體以較低RU(Biacore)結(jié)合肽4，并以高RU。有趣的是使用實(shí)施例21和22中的方法時(shí)也可發(fā)現(xiàn)該抗體。另外四個(gè)抗體可與實(shí)施例5中的抗體807A-M0028-B02和807A-M0027-E11相比較。
實(shí)施例28將候選Fab重構(gòu)到人IgG1 大多數(shù)上述IHC陽(yáng)性克隆可以通過(guò)兩個(gè)以限制性核酸內(nèi)切酶為基礎(chǔ)的(“剪切和粘貼”)克隆步驟，被單獨(dú)重構(gòu)到Dyax hIgG1表達(dá)構(gòu)建體pBh1中(見(jiàn)圖5)。
除含琥珀終止子的克隆807B-M0079-D10(807B-M0027-D08)和807B-M0081-A11(807B-M0081-F12)以及克隆807B-M0009-C03外，將Fab重構(gòu)到IgG，并且IgG在HEK 293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。
在使用上述步驟重構(gòu)克隆之前，807B-M0079-D10的CDR2中的琥珀終止子突變?cè)凇笆删Ｋ健鄙媳患m正。
使用不同的重構(gòu)方法/“以PCR為基礎(chǔ)，重構(gòu)hIgG1表達(dá)構(gòu)建體pRh1”來(lái)修復(fù)807B-M0081-A11的VL的5’端的琥珀突變。由于琥珀終止子突變位于我們的“CJ-κ-提升引物(CJ-κ-lifting primer)”序列之內(nèi)這一事實(shí)，在Fab片段的PCR擴(kuò)增期間，糾正了該終止突變。將PCR/Fab片段克隆到pRh1的方法與“剪切和粘貼”到pBh1的方法相同。
實(shí)施例29結(jié)論 通過(guò)采用Dyax’s人Fab300文庫(kù)的多種選擇方法，分離結(jié)合CTD的229個(gè)候選Fab。兩種方法包括在肽上的選擇(實(shí)施例21和22)。在實(shí)施例23的選擇方法中，通過(guò)首先在ur-bCTD上選擇，然后在纖維上的選擇，逆轉(zhuǎn)了實(shí)施例5的成功選擇。此外，與實(shí)施例5相反，我們沒(méi)有篩選噬菌體，而是首先進(jìn)行了從噬菌體Fab到Fab的批量重克隆。
作為Fab抗體，極少幾個(gè)(五個(gè))抗體與包被VLDL發(fā)生反應(yīng)。沒(méi)有Fab對(duì)于bNTD呈陽(yáng)性。
在實(shí)施例21和22的方法中，一些克隆被富集，我們觀察到具有少量個(gè)別克隆的VH-CDR3組。
實(shí)施例21和22的方法中的Fab抗體識(shí)別肽3和4周圍的選擇顯性表位。在實(shí)施例23的方法中發(fā)現(xiàn)相同的顯性表位。
在IHC篩選中，在IHC的第一次篩選中發(fā)現(xiàn)了與斑塊結(jié)合的15個(gè)陽(yáng)性抗體。對(duì)在第一次IHC篩選中呈陽(yáng)性的Fab克隆的特征的概括見(jiàn)表17。
實(shí)施例30IHC中呈陽(yáng)性的15個(gè)Fab的IgG1性質(zhì) 將15個(gè)在Fab-IHC中呈陽(yáng)性的Fab重構(gòu)形成IgG1。在這些抗體中，9個(gè)在IgG1-IHC中呈陽(yáng)性。
幾乎所有的IgG抗體在肽表位作圖中都結(jié)合肽。這可能是由于與Fab相比，IgG1的親合力較高。對(duì)于在肽4上選擇的抗體而言，其作為Fab僅結(jié)合肽4，一些作為IgG僅結(jié)合肽9。對(duì)于最初來(lái)自實(shí)施例23中描述的篩選方法的抗體，IgG抗體結(jié)合肽4和8，肽9或肽7。僅有一個(gè)抗體，807B-M0083E11，不結(jié)合任何肽。
將人CTD、小鼠CTD和靈長(zhǎng)類CTD進(jìn)行相互比較。幾個(gè)IgG抗體均結(jié)合這三個(gè)物種的bCTD。
盡管在Fab ELISA中抗體不結(jié)合包被VLDL，但在IgG1 ELISA中，幾個(gè)但非全部抗體與VLDL結(jié)合。
當(dāng)bCTD被包被在芯片上時(shí)，與在Biacore分析中的Fab相比，全部IgG抗體均表現(xiàn)出改良的結(jié)合。
在表18中總結(jié)了IgG1結(jié)果。
實(shí)施例31VLDL對(duì)807A-M0028-B02與淀粉樣沉積中的CTD的結(jié)合的影響 為分析在脂蛋白顆粒存在時(shí)807A-M0028-B02與淀粉樣沉積中的CTD的結(jié)合，在存在或不存在VLDL時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)，以觀察VLDL的存在是否導(dǎo)致斑塊染色強(qiáng)度的降低。
將抗體807A-M0028-B02連續(xù)稀釋，并在與APP/PS1和患AD疾病的人大腦切片孵育前與VLDL混合。即使在抗體濃度最低時(shí)(0.04μg/ml)也未發(fā)現(xiàn)信號(hào)的猝滅。相反，在抗體濃度較高時(shí)(5μg/ml)，抗CTD的商業(yè)化抗體(3H1)已完全猝滅(圖20)。
實(shí)施例32抗體807A-M0028-B02對(duì)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的吞噬活性的影響 為評(píng)估807A-M0028-B02對(duì)吞噬活性的影響，建立了固定在卵白素包被的FluoSphere熒光微珠(Molecular Probes)上的CTD的吞噬作用分析。
將固定在由1.2μm黃綠乳膠FluoSpheres_ NeutrAvidinTM標(biāo)記的微珠上的生物素化CTD((Molecular Probes Europe BV，Leiden，荷蘭)用不同濃度IgG轉(zhuǎn)化克隆807A-M0028-B02重懸，該克隆在含1％BSA(經(jīng)組織培養(yǎng)檢測(cè)，Invitrogen AB，瑞典)和2％ITS-X(Gibco，Invitrogen AB，瑞典)血清添加劑的OPTI-MEM培養(yǎng)液中稀釋，并且在+4℃孵育30min。將有或沒(méi)有2.0％NaN3(吞噬作用抑制劑)的CM中的THP-1細(xì)胞(106細(xì)胞ml-1)以1∶100的比率(細(xì)胞微珠)加入。為實(shí)現(xiàn)與Fc-受體結(jié)合，在+4℃將細(xì)胞同步化20min，并低速離心(200g、10min、+4℃)除去未結(jié)合細(xì)胞的微珠。用CM重懸細(xì)胞沉淀并在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)40min。胰蛋白酶消化后，在無(wú)菌條件下收集細(xì)胞懸浮液，并在7.5％牛血清白蛋白(BSA)緩沖液中分層，然后4℃、150×g離心10min，以除去未攝入的微珠。將細(xì)胞沉淀在0.3ml含2％PFA的PBS中重懸。結(jié)果表示為對(duì)照的百分比，即在存在抗體時(shí)含兩個(gè)或多個(gè)微珠的巨噬細(xì)胞的含量與不存在抗體時(shí)的比值，其用流式細(xì)胞儀測(cè)得。使用FAScanTM(Becton Dickinson，San Jose，CA)，其含有空氣冷卻的氬激光源，該激光源可提供488nm的激發(fā)光。每個(gè)樣本收集10000個(gè)事件(events)并且以列表模式數(shù)據(jù)庫(kù)形式儲(chǔ)存。在520nm(FL1)收集吞噬作用熒光發(fā)射。數(shù)據(jù)收集和分析在Consort30系統(tǒng)和LYSIS-II程序上進(jìn)行。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，先在門控過(guò)程中表示為雙參數(shù)組合和細(xì)胞大小，然后表示為熒光(FL1)頻率分布直方圖，以分析吞噬作用?？墒褂脛┝?反應(yīng)曲線(吞噬作用百分比對(duì)濃度范圍(0.01-5μg/ml))檢測(cè)每種待測(cè)抗體的EC50(吞噬活性升高50％的濃度)。然后，從這些曲線外推出EC50并將其用于比較抗體刺激吞噬作用的相對(duì)效率。IgG轉(zhuǎn)化克隆807A-M0028-B02表現(xiàn)出刺激THP-1細(xì)胞的較高效率(EC50＝34±15ng/ml)。因此，該結(jié)果表明807A-M0028-B02以濃度依賴方式特異性指導(dǎo)人巨噬細(xì)胞/類小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)攜帶CTD微珠的體外吞入作用。
實(shí)施例33實(shí)施例4、實(shí)施例21和實(shí)施例22所描述選擇中發(fā)現(xiàn)的克隆的種系校正 進(jìn)一步研究了表18中所述抗體中的五個(gè)抗體(807A-M0028-B02、807B-M0004-H03、807B-M0009-F06、807B-M0004-A03和807B-M0079-D10)。在所有克隆中均發(fā)現(xiàn)這些抗體的輕鏈可變區(qū)的體細(xì)胞突變。一些克隆還含有輕鏈恒定區(qū)的突變(表21)。對(duì)基因組與已知種系序列進(jìn)行序列比對(duì)，并確定了正確的氨基酸(在表19和表20中以粗體表示)。校正克隆的VL鏈在表19中描述，IgG的恒定區(qū)在表20中描述。
為確認(rèn)IgG分子為該種系，在DNA水平上，在五個(gè)抗體中校正體細(xì)胞突變，所有五個(gè)種系校正IgG1均表達(dá)(在HEK 293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá))。采用Biacore(實(shí)施例34)、CTD-ELISA和IHC進(jìn)行比較結(jié)合分析，確認(rèn)種系校正的抗體仍有功能。表23概括了該結(jié)果。
實(shí)施例34種系校正IgG的Biacore分析 在Biacore中分析表19和20中所描述的種系校正克隆。通過(guò)使用不同濃度的IgG流過(guò)具有包被bCTD的表面進(jìn)行該分析。將生物素化對(duì)照IgG的表面作為陰性表面。
對(duì)克隆807A-M0028-B02、807A-M0028-B02.1和807A-M0028-B02.2的Biacore分析顯示這三種IgG分子以相似的動(dòng)力學(xué)(相似的結(jié)合速度與解離速度)結(jié)合bCTD。IgG的親和力沒(méi)有顯著改變。比較807B-M0004-A03和07B-M0004-A03.1時(shí)也得到了相同的結(jié)果。
對(duì)807B-M0004-H03和807B-M0004-H03.1的Biacore分析顯示807B-M0004-H03.1以不同的動(dòng)力學(xué)與親本克隆結(jié)合。但是這并不顯著影響親和力值。如在CTD-ELISA、Biacore分析和CTD-ELISA中所示，克隆807B-M0009-F06.1失去了與bCTD的結(jié)合能力。
實(shí)施例35ELISA檢測(cè)抗體與ApoE-CTD的結(jié)合 用包被ApoE-CTD ELISA就抗體與ApoE-CTD的結(jié)合篩選抗體。將人、狨猴或鼠類的ApoE-CTD包被在微量滴定板上，然后與待測(cè)抗體共培養(yǎng)。然后，抗體含量由HRP-二抗和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物測(cè)定。ApoE-CTD的結(jié)合在ELISA的吸光度測(cè)定中產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)。在圖22中舉例說(shuō)明了807A-M0028-B02，807A-M0028-B02.1和807A-M0028-B02.2的結(jié)合。結(jié)果在表22中顯示。
實(shí)施例36抗體與人脂蛋白的結(jié)合 用包被VLDL的ELISA測(cè)定與脂蛋白結(jié)合能力篩選抗體。將人VLDL包被于酶標(biāo)板上再與測(cè)試抗體共培養(yǎng)。然后，結(jié)合的抗體量由HRP-二抗和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物測(cè)定。在ELISA中測(cè)作光密度(OD)的VLDL的結(jié)合產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)。在圖23中舉例說(shuō)明807A-M0028-B02、807A-M0028-B02.1、807A-M0028-B02.2、807B-M0004-H03.0、807B-M0004-H03.1、807B-M0004-A03和807B-M0004-A03.1的結(jié)合。結(jié)果在表22中示出。
實(shí)施例37807A-M0028-B02，807B-M0004H03，807B-M0004-A03，807B-M0079-D10，807B-M0009-F06與小鼠大腦斑塊的體內(nèi)結(jié)合和Fab克隆與AD病人大腦斑塊的體外結(jié)合 用對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔注射和靜脈注射證明了807A-M0028-B02、807B-M0004H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10和807B-M0009-F06與大腦斑塊的體內(nèi)結(jié)合(免疫裝飾，immunodecoration)(圖24和25)。當(dāng)807A-M0028-B02以10mg/kg單劑給藥后兩天觀察到免疫裝飾。807A-M0028-B02、B807B-M0004H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10和807B-M0009-F06的結(jié)合僅見(jiàn)于斑塊，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞或其它大腦結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)染色(圖24和25)。通過(guò)用單克隆抗體對(duì)毗鄰切片上的Aβ(6E10)染色確定了每只小鼠所具有的全部斑塊，與之進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)數(shù)量的斑塊與各自的克隆發(fā)生免疫裝飾。
通過(guò)組織化學(xué)還證實(shí)了親合力成熟的克隆與AD病人大腦切片中的淀粉樣沉積的體外結(jié)合(圖25)。
在圖26中示出在AD病人斑塊中不同野生型克隆的體外結(jié)合。
實(shí)施例38通過(guò)VH-CDR3摻加所進(jìn)行的807A-M0028-B02、807B-M0004H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10、807B-M0009-F06的親和力成熟 摻加誘變可在807A-M0028-B02、807B-M0004H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10和807B-M0009-F06的VH-CDR3的全長(zhǎng)上向原始野生型殘基中引入較低水平的突變(見(jiàn)圖29)。使用寡核苷酸和與FR1區(qū)同源的特異性引物進(jìn)行PCR，其中，該寡核苷酸在每個(gè)抗體的VH-CDR3序列長(zhǎng)度上攜帶摻入的多樣性區(qū)，該多樣性區(qū)的邊界是與FR3和FR4區(qū)目標(biāo)V基因同源的區(qū)域；FR1區(qū)可與到目標(biāo)V基因的5’端退火。
對(duì)于抗體807A-M0028-B02、807B-M0009-F06和807B-M0004-H03，通過(guò)一步PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)其VH-CDR3的多樣性。使用與輕鏈恒定區(qū)互補(bǔ)的5’引物和3’特異性摻加寡核苷酸進(jìn)行PCR。然后使用高級(jí)2PCR酶系統(tǒng)(Clontech)和10pmole的每種引物在50μl的容積中進(jìn)行25個(gè)循環(huán)(95℃ 1min，60℃ 1min，68℃ 2min)的PCR。選擇100nM的引物濃度以便包括由摻加寡核苷酸攜帶的全部多樣性。需要100到200個(gè)反應(yīng)來(lái)獲得～6μg的PCR產(chǎn)物。使用GFX純化試劑盒(Amersham)來(lái)純化所有產(chǎn)物。
所得到的730bp PCR產(chǎn)物包含內(nèi)部XbaI位點(diǎn)和BstEII位點(diǎn)，該位點(diǎn)也納入寡核苷酸中。使用這些位點(diǎn)將這些產(chǎn)物克隆到展示載體中。
用兩個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)了807B-M0004-A03和807B-M0079-D10的VH-CDR3的多樣性在如上所述的初次擴(kuò)增之后，將所得到的730bpPCR產(chǎn)物用附有SfiI位點(diǎn)的5’端嵌套正向引物和3’端Nhe1-標(biāo)記CH1反向引物的組合再次擴(kuò)增。然后使用高級(jí)2PCR酶系統(tǒng)(Clontech)和10pmole的每種引物在50μl的容積中進(jìn)行20個(gè)循環(huán)(95℃ 1min，68℃ 3min)的PCR；需要100到200個(gè)反應(yīng)來(lái)獲得～6μg的PCR產(chǎn)物。循環(huán)數(shù)目保持非常低(20個(gè)循環(huán))以便維持在第一次PCR步驟中引入的最大多樣性。為了再次確保最大多樣性，對(duì)于每個(gè)反應(yīng)，將50ng的第一次PCR的產(chǎn)物用作模板來(lái)啟動(dòng)第二次PCR反應(yīng)。使用GFX純化試劑盒(Amersham)來(lái)純化所有產(chǎn)物。
使用50U/μg DNA的XbaI和BstEII(對(duì)于807A-M0028-B02、807B-M0009-F06和807B-M0004-H03)或者SfiI和NheI(對(duì)于807B-M0004-A03和807B-M0079-D10)來(lái)消化PCR產(chǎn)物和載體主鏈。所得到的酶切產(chǎn)物(載體和PCR片段)被凝膠純化，使用T4 DNA連接酶(NEB)將1.6μg的每個(gè)DNA片段連接到10μg相似剪切的噬菌粒載體主鏈中，每個(gè)摻加文庫(kù)的連接混合物通過(guò)電穿孔被轉(zhuǎn)入到大腸桿菌(E.coli)TG1細(xì)胞中。
使用輔助噬菌體M13-KO7(Marks et al.，(J.Mol.Biol.222，581(1991))，使用來(lái)自每個(gè)文庫(kù)中的足夠細(xì)菌用于接種，從文庫(kù)中挽救噬菌粒顆粒以便讓每個(gè)克隆至少表達(dá)一次。
通過(guò)測(cè)序來(lái)評(píng)估每個(gè)文庫(kù)中VH-CDR3的多樣性。為每個(gè)文庫(kù)隨機(jī)挑選了96個(gè)分離物，并且將VH-CDR3區(qū)測(cè)序并與參照野生型VH-CDR3序列進(jìn)行比較。
對(duì)于克隆807B-M0079-D10和807B-M0004-A03，測(cè)定完整VH序列并將其與VH-CDR3外部的VH參照區(qū)進(jìn)行比較。
使用由兩輪選擇構(gòu)成的選擇過(guò)程先于文庫(kù)中的較低親和力克隆優(yōu)先富集較高親和力的克隆。使用相對(duì)于用于選擇野生型抗體濃度有所降低的抗原濃度來(lái)進(jìn)行第一輪親和力選擇。使用野生型抗體和對(duì)照抗體，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定最佳的降低的抗體濃度。在存在競(jìng)爭(zhēng)的可溶性Fab或IgG時(shí)，在進(jìn)一步降低抗原濃度的情況下，進(jìn)行第二輪選擇。在表3中詳細(xì)描述了所使用的選擇條件。
為了確定是否已經(jīng)發(fā)生了陽(yáng)性抗原克隆的富集，在抗原ELISA中對(duì)46個(gè)隨機(jī)挑選的克隆進(jìn)行檢測(cè)，該克隆來(lái)自于每個(gè)待成熟抗體的第一輪選擇之前和之后。在所有情況下，僅在一輪選擇后便觀察到陽(yáng)性抗原克隆的富集。
選擇后，從載體中去除基因III殘干，以允許可溶性Fab表達(dá)。隨機(jī)挑選200個(gè)克隆，通過(guò)ELISA進(jìn)行篩選，并對(duì)其重鏈進(jìn)行測(cè)序。使用Dyax WEBPHAGE數(shù)據(jù)庫(kù)將ELISA數(shù)據(jù)連接到各自的序列。進(jìn)一步分析了在篩選實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性的克隆(OD信號(hào)＝3×本底值)的VH-CDR3序列。
對(duì)于克隆807B-M0079-D10和807B-M0004-A03，將全部VH區(qū)擴(kuò)增并克隆，因此獲得了全部VH序列，并與VH參照序列進(jìn)行比較以便檢測(cè)VH-CDR3外部的任何突變。丟棄在骨架區(qū)中含突變的克隆，保留在VH-CDR1-CDR2中有突變的克隆。
在表24到30中列出所選擇克隆的氨基酸頻率分析的結(jié)果。在VH-CDR3中，一些氨基酸位置相當(dāng)保守而其它的突變頻率高。
以解離速率或KD為基礎(chǔ)，使用Biacore篩選選擇五個(gè)CDR3突變Fab。CDR3突變的Fab在細(xì)菌中表達(dá)。制備胞質(zhì)提取物并將其在Biacore中篩選。以與hCTD或肽結(jié)合的解離速率或KD為基礎(chǔ)，選擇最佳克隆，如表4中所示。
將生物素化的肽或人CTD包被在鏈霉親和素芯片上。將10ml培養(yǎng)物中的胞質(zhì)提取物在加有0.1％BSA的HBS中一倍稀釋。樣品用kinject程序以30μl/min的速度注射3min。3min解離后，任何殘留樣品均從芯片表面剝離。解離速率在約1min(10-70s之間)的時(shí)間窗上測(cè)定。這些數(shù)據(jù)在表31到35中示出。
如果koff和Fab濃度均已知，可由Biacore曲線計(jì)算出結(jié)合速率。在遇到完全質(zhì)量轉(zhuǎn)化限制(Mass Transfer Limitation，MLT)的條件下--同在用極高密度的芯片和低流速運(yùn)行時(shí)所面臨的情況相似，Biacore的信號(hào)僅依賴于流過(guò)芯片表面的分析物的濃度。從由不同濃度的純化Fab在高密度蛋白A芯片上流過(guò)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線中可以測(cè)定粗提樣品中的Fab濃度。用從該方法得到的Fab濃度和koff值，我們從Biacore曲線中計(jì)算了kon數(shù)據(jù)。由koff/kon得到平衡解離常數(shù)KD。這些數(shù)據(jù)在表31到35中示出。需要注意的是807B-M0079-D10不結(jié)合蛋白A。所以只示出該克隆的koff。
成功選出807B-M0004-A03、807B-M0004-H03、807B-M0009-F06和807A-M0028-B02的五個(gè)變體。所選變體見(jiàn)表36。對(duì)于807B-M0079-D10而言，未發(fā)現(xiàn)具有顯著改進(jìn)的Koff的克隆(未給出該克隆KD數(shù)據(jù))。
所選Fab在大腸桿菌中合成并以固定金屬親和層析從胞質(zhì)提取物中純化。制備物質(zhì)量由還原性和非還原性SDS-PAGE檢測(cè)。
純化的Fab用于精確測(cè)定平衡解離常數(shù)KD。
將生物素化的肽或CTD包被在鏈霉親和素芯片上。實(shí)驗(yàn)在HBS工作緩沖液中進(jìn)行。純化的Fab被稀釋至200nM并_梯度稀釋至12.5nM，并測(cè)定兩份。使用kinject程序以30-40μl/min注入樣品進(jìn)行結(jié)合。3min解離后，任何殘留樣品均從芯片表面剝離。用BIAevaluation軟件3.1中的同時(shí)ka/kd擬合程序(simultaneous ka/kdfitting program)分析Sensorgrams。數(shù)據(jù)總結(jié)于表36。對(duì)于807B-M0004-A03、807B-M0009-F06和807A-M0028-B02，由Biacore篩選出的最佳克隆表現(xiàn)出比原始克隆高2-3倍的親和力。對(duì)于807B-M0004-H03，Biacore信號(hào)不能對(duì)不同克隆作出精確比較。
免疫組織化學(xué)分析純化Fab。表37示出所選克隆和野生型克隆的名稱并指出了在免疫組織化學(xué)中它們是否對(duì)斑塊染色。
實(shí)施例39選自實(shí)施例38的抗體變體的輕鏈替換 作為輕鏈替換的起點(diǎn)(圖29的循環(huán)2)，選自實(shí)施例38的VH-CDR3改進(jìn)的變體相應(yīng)的重鏈(圖29的循環(huán)1)和野生型(WT)克隆一起使用。
不包括野生型克隆807B-M0009-F06，因?yàn)榕c循環(huán)1中所選變體相比，這種克隆的親和力顯著較低。對(duì)于抗體807B-M0079-D10，由于在循環(huán)1中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)親和力改進(jìn)的變體，LC替換僅在野生克隆中進(jìn)行。
在本實(shí)施例中，非親和力成熟的抗體被指定為野生型克隆，從循環(huán)1中所選抗體被指定為親本克隆。
將選自循環(huán)1的重鏈變體克隆到FAB310載體主鏈中，該載體主鏈包含用大約108個(gè)輕鏈替換的5至6個(gè)重鏈(HC)庫(kù)，以形成組合多樣性。
每一個(gè)克隆都在TG1培養(yǎng)物中進(jìn)行Qiagen DNA制備。然后用SfiI和NotI限制性酶剪切10μg DNA，產(chǎn)生650bp大小的重鏈片段。也對(duì)FAB310載體主鏈作了相似剪切。
所得到的酶切產(chǎn)物(載體和片段)被凝膠純化，每個(gè)文庫(kù)的重鏈變體片段以等量混合，用T4 DNA連接酶(NEB)將3μg混合片段與6μg酶切噬菌粒載體主鏈連接。每個(gè)文庫(kù)中除去鹽分的連接混合物通過(guò)電穿孔被轉(zhuǎn)入到大腸桿菌TG1細(xì)胞中。
所獲得的文庫(kù)大小為每一個(gè)重鏈變體與輕鏈庫(kù)的每個(gè)成員的至少一個(gè)拷貝相聯(lián)合。
測(cè)定了從每個(gè)文庫(kù)隨機(jī)選出的50個(gè)分離物的重鏈序列。
從807A-M0028-B02起源的未選擇文庫(kù)中隨機(jī)選擇的48個(gè)分離物和從807B-M0009-F06起源的未篩選文庫(kù)中隨機(jī)選擇的48個(gè)分離物的輕鏈序列。獲得63個(gè)具有獨(dú)特功能的輕鏈。
使用輔助噬菌體M13-KO7(Marks et al.，(J.Mol.Biol.222，581(1991))，使用來(lái)自每個(gè)文庫(kù)中的足夠細(xì)菌用于接種，從文庫(kù)中挽救噬菌粒顆粒以便讓每個(gè)克隆至少表達(dá)一次。
選出了改善親和力的變體的5個(gè)輕鏈替換文庫(kù)。在選擇前，通過(guò)將文庫(kù)和100μl鏈霉親和素順磁微珠在1ml 2％MPBS中預(yù)孵育，使文庫(kù)與鏈霉親和素結(jié)合抗體反應(yīng)完全。對(duì)于每個(gè)文庫(kù)，使用三個(gè)抗原濃度以測(cè)定第二輪選擇的最佳濃度(表5)。噬菌體和微珠靶向復(fù)合物(bead-target complex)的培養(yǎng)時(shí)間被減少至0.5h，并在Kingfisher裝置中進(jìn)行11輪程序化洗滌。在選擇后結(jié)合的噬菌體被洗脫并轉(zhuǎn)染大腸桿菌(TG1 OD為0.5)，并在25ml 2xTY/氨芐青霉素(100ug/ml)、葡萄糖(2％w/v)中，30℃、搖速250rpm條件下過(guò)夜來(lái)液相擴(kuò)增。濃縮細(xì)胞并用甘油保存以便進(jìn)行第二輪選擇。
未選擇文庫(kù)及產(chǎn)物文庫(kù)被滴定以得到用于挑選和篩選的單個(gè)克隆。在噬菌體ELISA(以b-BSA和鏈霉親和素包被所有抗原，抗原濃度0.5μg/ml)中從未選擇文庫(kù)和產(chǎn)物文庫(kù)中挑選和篩選出47個(gè)克隆。
所有選擇方法均得到抗原結(jié)合克隆的富集?；谶@些結(jié)果選擇用于第二輪選擇的抗原濃度。
第二輪選擇的條件更為嚴(yán)格，并被設(shè)計(jì)為選擇改善的(更快的)kon和改善的(更慢的)koff。使用了表6所列出的三種方法方法I進(jìn)一步降低抗原濃度；方法II進(jìn)一步降低抗原濃度，并縮短與抗原孵育的時(shí)間(kon選擇)；方法III進(jìn)一步降低抗原濃度，并且提高嚴(yán)格洗滌(koff選擇)。在KingFisher自動(dòng)裝置上進(jìn)行選擇，并使用大約1012噬菌體的輸入量。在選擇前以上述方式使文庫(kù)與鏈霉親和素結(jié)合抗體反應(yīng)完全。在選擇后結(jié)合噬菌體以前述方式洗脫并用于轉(zhuǎn)染大腸桿菌(TG1 OD為0.5)。濃縮細(xì)胞并用甘油保存。
在ELISA中對(duì)第二輪的產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)篩選，以測(cè)定抗原結(jié)合克隆的百分比。對(duì)一定數(shù)量克隆進(jìn)行序列分析，以測(cè)定是否有特定克隆為顯性選擇，在所選克隆中是否有顯性輕鏈家族。
第二輪的每個(gè)噬菌體產(chǎn)物(一共15個(gè))都被批量重克隆，以生產(chǎn)可溶性Fab。這通過(guò)從載體中去除基因III殘干來(lái)實(shí)現(xiàn)。
隨機(jī)挑選200個(gè)克隆并用ELISA就其與各自抗原的結(jié)合進(jìn)行篩選。僅對(duì)陽(yáng)性命中的抗體序列進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)Dyax WEBPHAGE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行儲(chǔ)存和初始序列分析。
對(duì)于文庫(kù)807B-M0004-A03、807B-M079-D10和807A-M0004-H03，選擇富集2到8倍的抗體。對(duì)于文庫(kù)807A-M0028-B02和807B-M009-F06，由于獨(dú)特克隆數(shù)較低，選擇所有克隆。所有ELISA陽(yáng)性和獨(dú)特命中的輕鏈和重鏈序列在表38到42中示出。
在對(duì)潛在親和力成熟的結(jié)合物進(jìn)行Biacore分析后，發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)結(jié)合物具有較高親和力。只有文庫(kù)807B-M0004-A03、807A-M0028-B02和807B-M004-H03給出具有比較野生型和親代本克隆親和力更高的親和力成熟抗體。將那些被選出的克隆的輕鏈序列與種系做了比對(duì)。有趣的是相同的氨基酸位置似乎在同屬于同一種系的所有所選克隆中呈現(xiàn)出多樣性。相同的氨基酸位置似乎在同屬于同一種系的所有所選克隆中呈現(xiàn)出多樣性。
對(duì)于文庫(kù)807B-M0004-A03，雖然M148E08和M150E03克隆具有完全相同的重鏈和只有兩個(gè)氨基酸不同的輕鏈，但是與M148E08相比，克隆M150E03親合力提高了3.2倍，這表明只有位于FR1的兩個(gè)氨基酸負(fù)責(zé)該提高。
對(duì)于文庫(kù)807B-M0028-B02和807B-M0004-A03，與野生型相比，在CDR和FR所觀察到的大部分多樣性有向種系序列的返祖現(xiàn)象。
在文庫(kù)807A-M0028B02起源的克隆的FR3中僅觀察到少數(shù)幾個(gè)保守性改變。
在Biacore分析中，所有克隆變體都在小規(guī)模培養(yǎng)(一般為10ml)中生長(zhǎng)，制備了胞質(zhì)提取物(PE)并通過(guò)將樣品流過(guò)蛋白質(zhì)A/G芯片測(cè)定了PE中Fab的濃度。然后把PE稀釋到相同的Fab濃度(25-50nM)并流過(guò)靶標(biāo)包被芯片(肽4、8、9或CTD)。以結(jié)合和解離階段的幅值(807A-M0028-B02、807B-M0004-A03、807B-M0009-F06)或平衡時(shí)Biacore信號(hào)的值(807B-M0004-H03)為基礎(chǔ)鑒定最佳克隆。807B-M0079-D10起源的克隆不結(jié)合蛋白質(zhì)A/G芯片，因此僅基于它們的解離速度來(lái)分級(jí) 807B-M0004-H03起源的克隆以平衡時(shí)Biacore信號(hào)的值為基礎(chǔ)進(jìn)行分類，該信號(hào)的值反映平衡解離常數(shù)KD平衡時(shí)的Biacore信號(hào)越高，親和力越好。
807B-M0079-D10起源的克隆僅以koff為基礎(chǔ)分類。
從807A-M0028-B02和807B-M0004-A03中分別選出了四個(gè)和五個(gè)變體。分離出的807B-M0009-F06變體中似乎沒(méi)有哪個(gè)顯示出比從CDR3摻加獲得的最佳變體具有更高的親和力。對(duì)于807B-M0004-H03，以平衡時(shí)Biacore信號(hào)的值為基礎(chǔ)選擇兩個(gè)變體。以解離速率分析為基礎(chǔ)，未能選到807B-M0079-D10的變體。
所選的選出克隆在大腸桿菌中制備，并從胞質(zhì)提取物純化。在Biacore中，該原料用于精確測(cè)定平衡解離常數(shù)KD。數(shù)據(jù)總結(jié)在表7中。通過(guò)輕鏈替換所分離的最佳克隆顯示出比野生型克隆或從CDR3摻加分離的最佳克隆高～5倍的親和力。
由輕鏈替換選出的克隆在表43和44中示出。
表1來(lái)源于在纖維和ur-bCTD上的選擇的sFab的解離速率的檢測(cè)結(jié)果 表2在CTD包被芯片上對(duì)候選克隆807A-M0026-F05(26F5)、807A-M0027-E11(27E11)和807A-M0028-B02(28B2)的Fab和IgG結(jié)合的比較 *在注入結(jié)束后立即測(cè)量得到的Kd #在注入結(jié)束后約50sec測(cè)量得到的Kd n.f.沒(méi)有擬合的 n.d.未測(cè)定 表3 表4 表5在抗原濃度降低時(shí)，從第一輪選擇中回收的抗原結(jié)合克隆的百分比 表6第二輪選擇方法的條件 表7 *動(dòng)力學(xué)分析，1∶1模式 表8SEQ ID NOS21-164和171-206的描述 表9使用實(shí)施例5中篩選方法所鑒定的抗體的VL鏈的氨基酸序列 表10使用實(shí)施例5中的篩選方法所鑒定的抗體的VH鏈的氨基酸序列 表11使用實(shí)施例21和22中的篩選方法所鑒定的抗體的VL鏈的氨基酸序列 表12使用實(shí)施例21和22中的篩選方法所鑒定的抗體的VH鏈的氨基酸序列 表13 表14使用實(shí)施例23中的篩選方法所鑒定的抗體的VL鏈的氨基酸序列 表15使用實(shí)施例23中的篩選方法所鑒定的抗體的VH鏈的氨基酸序列 表16 表17與CTD和肽類的Fab結(jié)合數(shù)據(jù) *低RURUs較低，未測(cè)定親和力 **無(wú)RU沒(méi)有觀察到結(jié)合 表18與CTD和肽類的IgG結(jié)合數(shù)據(jù) *低RURu較低，未檢測(cè)親和力**無(wú)RU未觀察到結(jié)合

VLDL ELISAVLDL被包被，加入5μg/ml恰當(dāng)?shù)膆IgG，2x本底值的OD值為0.420。
表19種系校正的抗體的VL鏈的氨基酸序列 表20種系校正的抗體的CL鏈的氨基酸序列 表21 SEQ ID NOS539-548的描述 表22與CTD和肽類的IgG結(jié)合數(shù)據(jù) 1n.d.未檢測(cè)4低RURU較低，未檢測(cè)親和力。
2IHC使用AD病人皮質(zhì)的組織。
加入1μg/ml合適的hIgG。
5VLDL ELISA人VLDL包被，對(duì)0.0003-100μg/ml恰當(dāng)?shù)膆IgG的結(jié) 合進(jìn)行檢測(cè)。
3無(wú)RU未觀察到結(jié)合6ELISA人、小鼠或靈長(zhǎng)類CTD包被，對(duì)0.0003-100μg/ml恰當(dāng)?shù)?hIgG的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。
表23種系校正的IgG與CTD和組織的結(jié)合 1n.d未檢測(cè) 2VLDL ELISA人VLDL包被，對(duì)0.0003-100μg/ml合適hIgG的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè) 3IHC使用APP/PS1小鼠的腦組織切片。加入1,5-1.8μg/ml恰當(dāng)?shù)膆IgG。
3*與mCTD的反應(yīng)性較與hCTD的反應(yīng)性更低。
4CTD ELISA人、小鼠或靈長(zhǎng)類CTD包被，對(duì)0.0003-100μg/ml恰當(dāng)?shù)膆IgG的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。
表24807B-M0004-A03為被選用于Fab合成的39個(gè)克隆 表25807B-M0004-H03為被選用于Fab合成的54個(gè)克隆第一部分 表26807B-M0004-H03為被選用于Fab合成的54個(gè)克隆第二部分 表27807B-M0079-D10為被選用于Fab合成的33個(gè)克隆 表28807A-M0028-B02-CTD為被選用于Fab合成的60個(gè)克隆 表29807A-M0028-B02-纖維為被選用于Fab合成的12個(gè)克隆 表30807B-M0009-F06為被選用于Fab合成的24個(gè)克隆 表31807B-M0004-A03、原始克隆和變體的Biacore分析 *為所選克隆 BC為Biacore分析 表32807B-M0004-H03、原始克隆和變體的Biacore分析 *為所選克隆 表33807B-M0009-F06、原始克隆和變體的Biacore分析 *為所選克隆 表34807B-M0079-D10、原始克隆和變體的Biacore篩選 *所選克隆 表35807A-M0028-B02、原始克隆和變體的Biacore篩選 *所選克隆 BC為Biacore篩選 表36807B-M0004-A03、807B-M0009-F06、807A-M0028-B02和變體的Biacore 詳細(xì)分析結(jié)果 表37選自Biacore篩選的克隆的免疫組織化學(xué) 表38807A-M0028-B02的親和力成熟的克隆 表39807B-M0004-A03的親和力成熟的克隆 表40807B-M0004-H03的親和力成熟的克隆 表41807B-M0009-F06的親和力成熟的克隆 表42807B-M0079-D10的親和力成熟的克隆 表43通過(guò)VH-CDR3摻加和輕鏈替換所選擇的抗體的輕鏈序列 表44通過(guò)VH-CDR3摻加和輕鏈替換所選擇的抗體的重鏈序列
序列表
<110>阿斯特拉曾尼卡有限公司
戴克斯公司
<120>抗體
<130>N.90271E GCW/PT
<140>PCT/EP2004/013426
<141>2004-11-26
<150>US 60/525,174
<151>2003-11-28
<160>527
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>84
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>1
Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu
1 5 10 15
Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala
20 25 30
Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser
35 40 45
Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu
50 55 60
Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro
65 70 75 80
Ser Asp Asn His
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>2
Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu
1 5 10 15
<210>3
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>3
Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala
1 5 10 15
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>4
Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>5
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>5
Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu
1 5 10 15
<210>6
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>6
Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro
1 5 10 15
<210>7
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>7
Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val
1 5 10 15
<210>8
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>8
Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu
1 5 10 15
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>9
Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp
1 5 10 15
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>10
Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val
1 5 10 15
<210>11
<211>12
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>11
Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
1 5 10
<210>12
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>12
Leu Val Glu Asp Met Gln Arg Gln
1 5
<210>13
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>13
Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu
1 5
<210>14
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>14
Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val
1 5
<210>15
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>15
Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu
1 5
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>16
Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp
1 5
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>17
Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser
1 5
<210>18
<211>24
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>18
Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu
1 5 10 15
Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val
20
<210>19
<211>32
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>19
Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp
1 5 10 15
Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val
20 25 30
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(3)
<223>X＝任何氨基酸
<400>20
Ser Xaa Xaa Leu Asp Tyr
1 5
<210>21
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>21
Lys Tyr Ser Met His
1 5
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>22
Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Lys Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>23
<211>6
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>23
Ser Leu Asp Leu Asp Tyr
1 5
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>24
Met Tyr Met Met Asp
1 5
<210>25
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>25
Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>26
<211>6
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>26
Ser Val Leu Leu Asp Tyr
1 5
<210>27
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>27
Tyr Tyr Ala Met Gln
1 5
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<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>28
Ser Leu Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>29
<211>19
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>29
Gly Arg Gly Asn Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Met Asp Val
<210>30
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>30
Arg Ala Ser Gln Arg Ile Arg Lys Asn Leu His
1 5 10
<210>31
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>31
Asp Ala Ser Ser Asn Glu Arg
1 5
<210>32
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>32
Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>33
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Arg Asn His Leu Gly
1 5 10
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>34
Glu Ala Ser Ile Leu Gln Ser
1 5
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>35
Leu Gln Tyr Asp Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210>36
<211>12
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>36
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>37
Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr
1 5
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>38
Gln Gln Gly Tyr Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210>39
<211>115
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>39
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Lys Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>40
<211>115
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Met Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Val Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln GLy Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>41
<211>128
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>41
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ala Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Leu Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gly Asn Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>42
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>42
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Arg Lys
20 25 30
Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Asn Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Arg Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>43
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>43
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Arg Asn
20 25 30
His Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu
35 40 45
Ile Arg Glu Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Thr Phe Tyr
50 55 60
Gly Ser Gly Tyr Gly Arg Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Phe Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>44
<211>110
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>44
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser
20 25 30
Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Val Pro Val Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gly Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asn Trp
85 90 95
Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>45
Phe Tyr Gly Met Val
1 5
<210>46
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>46
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>47
<211>14
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>47
Asp Gly Arg Arg Pro His Tyr Gly Ser Gly Arg Trp Ala Tyr
1 5 10
<210>48
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>48
Arg Tyr Leu Met Met
1 5
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<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>49
Val Ile Ser Pro Ser Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>50
Ser Ile Ala Ala Ala Gly Thr Asp Tyr
1 5
<210>51
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>51
Asn Tyr Phe Met Ile
1 5
<210>52
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>52
Trp Ile Ser Pro Ser Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
<210>53
<211>4
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>53
Glu Ala Gly Tyr
1
<210>54
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>54
Ala Tyr Tyr Met Gly
1 5
<210>55
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>55
Val Ile Arg Pro Ser Gly Gly Lys Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
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Gly Pro His Gly Gln Gly Gly Val Asp Ser
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<210>57
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>57
Glu Tyr Phe Met Thr
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>58
Ser Ile Arg Pro Ser Gly Gly Lys Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>59
Val Ser Arg Tyr Tyr Asn Asn Gly Ala Tyr Arg Leu Asp Ala Phe Asp
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Ile
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
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Ala Tyr Arg Met Ala
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
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Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>62
Gly Thr His Leu Pro Gly Val Asp Tyr
1 5
<210>63
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>63
Gly Tyr Ile Met Ala
1 5
<210>64
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>64
Gly Ile Gly Ser Ser Gly Gly Leu Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211>4
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>65
Glu Ala Gly Tyr
1
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<212>PRT
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<400>66
Ser Tyr Pro Met Val
1 5
<210>67
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>67
Gly Ile Trp Ser Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
<210>68
<211>20
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>68
Glu Gly Ser Ala Gly Val Val Lys Gly Pro Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Met Asp Val
20
<210>69
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>69
Lys Tyr Gln Met Thr
1 5
<210>70
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>70
Val Ile Ser Ser Ser Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>71
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>71
Asp Arg Gly Tyr Cys Ser Gly Asn Thr Cys Tyr Ile Asp Ala Phe Asp
1 5 10 15
Ile
<210>72
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>72
Pro Tyr Trp Met Phe
1 5
<210>73
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>73
Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>74
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>74
Val Gly Met Ser Thr Tyr Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210>75
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>75
His Tyr Gly Met Ser
1 5
<210>76
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>76
Ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>77
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>77
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Trp Asp Tyr
1 5
<210>78
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>78
Asn Tyr Arg Met Glu
1 5
<210>79
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>79
Ser Ile Trp Ser Ser Gly Gly Leu Thr Lys Gln Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>80
<211>4
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>80
Gly Leu Tyr Arg
1
<210>81
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>81
Trp Tyr Leu Met His
1 5
<210>82
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>82
Ser Ile Val Pro Ser Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>83
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>83
Asp Leu Trp Phe Gly Glu Trp Asp Tyr
1 5
<210>84
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>84
Trp Tyr Ser Met Val
1 5
<210>85
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>85
Ser Ile Gly Pro Ser Gly Gly Met Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>86
<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>86
Asp Gln Gly Ile Thr Met Val Gln Gly Ala Met Gly Tyr
1 5 10
<210>87
<211>5
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>87
Val Tyr Ser Met Ala
1 5
<210>88
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>88
Gly Ile Trp Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>89
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>89
Glu Asp Phe Trp Ser Gly Leu Glu Asp Val
1 5 10
<210>90
<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>90
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Glu Tyr Val Tyr
1 5 10
<210>91
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>91
Arg Asn Asp Gln Arg Pro Ser
1 5
<210>92
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>92
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Gly Trp Cys
1 5 10
<210>93
<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>93
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210>94
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>94
Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210>95
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>95
Ala Ala Trp His Asp Gly Leu Asn Gly Pro Val
1 5 10
<210>96
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>96
Lys Ala Ser Gln Ser Val Arg Ala Phe Ile Ala
1 5 10
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<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>97
Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
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<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>98
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg Tyr Thr
1 5
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<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>99
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>100
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>100
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210>101
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>101
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Thr
1 5
<210>102
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>102
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210>103
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>103
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210>104
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>104
Gln Gln Tyr Ala Gly His Pro Ile Thr
1 5
<210>105
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>105
Thr Gly Ala Thr Arg Asp Val Ser
1 5
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<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>106
Tyr Glu Val Ser Ser Arg Pro Ser
1 5
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<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>107
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1 5 10
<210>108
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>108
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Met His Arg Asn Gly His His Phe Phe Asp
1 5 10 15
<210>109
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>109
Trp Ala Ser Asn Arg Ala Pro
1 5
<210>110
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>110
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr
1 5
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<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>111
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1 5 10
<210>112
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>112
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>113
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>113
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210>114
<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>114
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr
1 5 10
<210>115
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>115
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210>116
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>116
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Trp Val
1 5 10
<210>117
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>117
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>118
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>118
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210>119
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>119
Met Gln Ala Leu Gln Thr Ile Thr
1 5
<210>120
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>120
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp Leu Ala
1 5 10
<210>121
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>121
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>122
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>122
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210>123
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>123
Ala Gly Asp Glu Leu Gly Asn Lys Tyr Ala Ser
1 5 10
<210>124
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>124
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1 5
<210>125
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>125
Gln Ser Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
1 5
<210>126
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>126
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210>127
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>127
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>128
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210>129
<211>14
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>129
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210>130
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>130
Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210>131
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>131
Ser Ser Tyr Ala Gly Arg Asn Phe Val Val
1 5 10
<210>132
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>132
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Thr Lys Ile Val Asn
1 5 10
<210>133
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>133
Asp Asn Ser Asp Arg Pro Ser
1 5
<210>134
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>134
Gln Leu Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Pro Ile
1 5 10
<210>135
<211>123
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>135
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Arg Arg Pro His Tyr Gly Ser Gly Arg Trp Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>136
<211>118
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>136
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Pro Ser Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ile Ala Ala Ala Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>137
<211>113
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>137
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Phe Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Ser Pro Ser Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210>138
<211>119
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>138
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Arg Pro Ser G1y Gly Lys Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro His Gly Gln Gly Gly Val Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>139
<211>126
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>139
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Phe Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Pro Ser Gly Gly Lys Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Arg Tyr Tyr Asn Asn Gly Ala Tyr Arg Leu Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>140
<211>118
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>140
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Arg Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr His Leu Pro Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>141
<211>113
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>141
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ile Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Ser Ser Gly Gly Leu Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210>142
<211>129
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>142
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Trp Ser Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Ala Gly Val Val Lys Gly Pro Ala Arg Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210>143
<211>126
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>143
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Gln Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Ser Ser Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Cys Ser Gly Asn Thr Cys Tyr Ile Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>144
<211>119
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>144
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Met Ser Thr Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210>145
<211>118
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>145
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Leu Ser Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>146
<211>113
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>146
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Arg Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Trp Ser Ser Gly Gly Leu Thr Lys Glu Ala Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Leu Tyr Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210>147
<211>118
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>147
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Leu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Val Pro Ser Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Trp Phe Gly Glu Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211>122
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>148
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Ser Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Gly Pro Ser Gly Gly Met Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Gly Ile Thr Met Val Gln Gly Ala Met Gly Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>149
<211>119
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>149
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
20 25 30
Ser Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Trp Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Trp Ser Gly Leu Glu Asp Val Trp Gly Lys Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>150
<211>110
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>150
Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Glu
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Pro Gly Trp Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>151
<211>110
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>151
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp His Asp Gly Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>152
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>152
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Arg Ala
20 25 30
Phe Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ser Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>153
<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>153
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
20 25 30
Ser Ser Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
<210>154
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>154
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
20 25 30
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Gly His Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>155
<211>105
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>155
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Ala Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Leu Ser Cys Thr Gly Ala Thr Arg Asp Val Ser Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Val Leu Tyr Glu Val Ser
35 40 45
Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Met Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Thr Thr Ser Arg Ala Pro Arg Val Val Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>156
<211>113
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>156
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Met His
20 25 30
Arg Asn Gly His His Phe Phe Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asn Arg Ala Pro Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210>157
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>157
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Asp Asn
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
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Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211>110
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>158
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>159
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
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Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>160
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>161
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ala Gly Asp Glu Leu Gly Asn Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
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<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>162
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211>110
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>163
Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
15 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Arg
85 90 95
Asn Phe Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>164
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>164
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Thr Lys Ile Val
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
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Pro Ile Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>165
<211>317
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>165
Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Leu Ala Gly Cys
1 5 10 15
Gln Ala Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu
20 25 30
Arg Gln Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu
35 40 45
Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln
50 55 60
Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala
65 70 75 80
Leu Met Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu
85 90 95
Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser
100 105 110
Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp
115 120 125
Val Arg Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu
130 135 140
Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg
145 150 155 160
Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg
165 170 175
Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu
180 185 190
Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val
195 200 205
Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg
210 215 220
Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly
225 230 235 240
Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu
245 250 255
Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala
260 265 270
Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu
275 280 285
Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala
290 295 300
Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
305 310 315
<210>166
<211>317
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>166
Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Leu Ala Gly Cys
1 5 10 15
Gln Ala Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu
20 25 30
Arg Gln Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu
35 40 45
Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln
50 55 60
Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala
65 70 75 80
Leu Met Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu
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Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser
100 105 110
Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp
115 120 125
Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu
130 135 140
Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg
145 150 155 160
Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg
165 170 175
Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu
180 185 190
Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val
195 200 205
Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg
210 215 220
Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly
225 230 235 240
Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu
245 250 255
Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala
260 265 270
Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu
275 280 285
Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala
290 295 300
Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
305 310 315
<210>167
<211>317
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>167
Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Leu Ala Gly Cys
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Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu
130 135 140
Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg
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Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Cys
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Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu
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Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val
195 200 205
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Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly
225 230 235 240
Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu
245 250 255
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Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu
275 280 285
Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala
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Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
305 310 315
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>168
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100 105 110
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180 185 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly
275 280 285
Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
290 295
<210>169
<211>299
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>169
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Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
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Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
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Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130 135 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145 150 155 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
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Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
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275 280 285
Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
290 295
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<211>299
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>170
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1 5 10 15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
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35 40 45
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115 120 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130 135 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Cys Leu Ala
145 150 155 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165 170 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180 185 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195 200 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210 215 220
Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg
225 230 235 240
Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala
245 250 255
Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met
260 265 270
Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly
275 280 285
Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
290 295
<210>171
<211>330
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>171
caagacatcc agatgaccca gtctccaggc accctgtctt tgtctccagg ggaaagagcc 60
accctctcct gcagggccag tcagagtatt ggcagccgct acttagcctg gtaccagcag120
aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc tatgatgcat ccaagagggc cactggcgtc180
ccagtcaggt tcagcggcag tggatctggg acagacttca ctctcaccat cagcagcctg240
gggcctgaag attttgcagt ttattactgc caacagggct acaactggcc tccgtggacg300
ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa 330
<210>172
<211>384
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>172
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tattacgcta tgcagtgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct ctctatcctt ctggtggcaa tacttcttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagaggtcgc300
gggaattacg atttttggag tgcgggctac tactactact acatggacgt ctggggcaaa360
gggaccacgg tcaccgtctc aagc 384
<210>173
<211>324
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>173
caagacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 60
accatcactt gccgggcaag tcagcgcata agaaagaatt tacattggta tcagcagaaa120
ccagggaaag cccctaacct cctgatctat gatgcatcca gtaacgaacg tggggtccca180
tcaaggttca gtggcagagg atctgggaca gagttcactc tcaccatcag cagtctacaa240
cctgaagatc ttgcaactta ctactgtcaa cagagtttca gtagcccctg gacgttcggc300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210>174
<211>345
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>174
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtactcta tgcattgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctattctt ctggtggcaa gactatttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca accctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagatcgctt300
gatcttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct caagc345
<210>175
<211>324
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>175
caagacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 60
accatcactt gccggacaag tcaggacatt agaaatcatt taggctggtt tcagcagaaa120
ccagggaaag cccctcagcg cctgattcgt gaagcatcca ttttacaaag tggggtccca180
tcaacatttt acggcagtgg atatgggaga gaattcactc tcacaatcag cagcctgcag240
cctgaggatt ttgcaaccta ttattgtcta caatatgatt ctttcccata cacctttggc300
caggggacca agctggagat caaa 324
<210>176
<211>345
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>176
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtacatga tggattgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctggcctt ctggtggcca gacttggtat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagatccgtc300
ctccttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct caagc345
<210>177
<211>330
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>177
cagtacgaat tgactcagcc accctcagtg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagttc caacatcgga agtgagtatg tgtactggtt ccagcagctc120
ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatgatc agcggccctc aggggtccct180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tggcctccag240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgcc tggttggtgt300
tccggcggcg ggaccaagct gaccgtccta 330
<210>178
<211>369
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>178
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ttttacggta tggtttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggcta tactctttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gaaagatggg300
agacggcccc actatggttc ggggaggtgg gcctactggg gccagggaac cctggtcacc360
gtctcaagc369
<210>179
<211>330
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>179
cagagcgaat tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta ccagcagctc120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aataataatc agcggccctc aggggtccct180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatggcatg acggcctgaa tggtccggtg300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210>180
<211>354
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>180
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cgttacctta tgatgtgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atctctcctt ctggtggccg tacttggtat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgt gaggagtata300
gcagcagctg gaactgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagc 354
<210>181
<211>321
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>181
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgta aggccagtca gagtgttcgc gccttcatag cctggtacca gcagaaacct120
ggccaggctc ccaggctcct catctctggt gcatccaaca gggccactgg catcccagac180
aggttcagtg gcggtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct240
gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tacggtagtt cacggtacac ttttggccag300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210>182
<211>339
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>182
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aattacttta tgatttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atctctcctt ctggtggcac tactcagtat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagaagcc300
ggctactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcaagc 339
<210>183
<211>333
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>183
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctccta catagtagtg gatacaacta tttggattgg120
tacctgcaga agccaggaca gtctccacaa ctcctgattt atttgggttc taatcgggcc180
tccggggtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaaccccc300
actttcggcg gagggaccaa ggtggacatc aaa 333
<210>184
<211>357
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>184
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgtteagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttactata tgggttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atccgtcctt ctggtggcaa gactaagtat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagaggcccg300
catggtcagg ggggtgttga ctcgtggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcaagc 357
<210>185
<211>321
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>185
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgta gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg cgtcccagcc180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctct ccatcagcag cctgcagcct240
gaagactttg caacttatta ctgtcaacag tatgctggtc accccatcac cttcggccaa300
gggacccgac tggagattaa a 321
<210>186
<211>378
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>186
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gagtacttta tgacttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atccgtcctt ctggtggcaa gactcgttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagttagt300
cgctactata ataatggtgc ttatcgcctt gatgcatttg atatctgggg cccagggaca360
gtggtcaccg tctcaagc 378
<210>187
<211>315
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>187
cagagcgaat tgactcaggc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccctc 60
tcctgcactg gagccaccag ggacgtctcc tggtaccagc aacacccagg caaggccccc120
aaactcgtcc tttatgaagt cagtagtcgc ccctcaggcg tttccgatcg cttctctggc180
tccatgtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctggac tccaggctga ggacgaggct240
gattattact gctcctcaac cacaagtcgc gcccctcgcg tggttttcgg cggagggacc300
aaactgaccg tccta 315
<210>188
<211>354
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>188
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttaccgta tggcttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctcttctt ctggtggcgt tacttcttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga agagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagaggcacg300
cacctcccgg gggttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagc 354
<210>189
<211>336
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>189
gacatccaga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca gatctagtca gagcctcatg cataggaatg gacaccactt cttcgattgg120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct attgggcttc taatcgggcc180
cccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagactttac actaaaaatc240
agcagagtgg aggctgagga tgttgggatt tattactgca tgcaagctct acaaaccccg300
tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
<210>190
<211>339
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>190
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ggttacatta tggcttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atcggttctt ctggtggcct tactgcttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagaagcc300
ggctactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcaagc 339
<210>191
<211>321
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>191
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctataggaga cagagtcacc60
atctcttgcc aggcgagtca aaacattgac aactatttaa attggtatca gcagaaacca120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcgaac gttcggccaa300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210>192
<211>387
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>192
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tcttacccta tggtttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctggtctt ctggtggcct tacttattat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagagggc300
tcggccggag tggttaaagg gccggcccgg tactactact actacatgga cgtctggggc360
aaagggacca cggtcaccgt ctcaagc387
<210>193
<211>330
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>193
cagagcgaat tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaattatg tatactggta ccagcagctc120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tgcctgggtg300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210>194
<211>378
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>194
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtaccaga tgacttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atctcttctt ctggtggcga tactgcttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagatcgg300
ggttattgta gtggtaatac ttgctatatt gatgcttttg atatctgggg ccaagggaca360
atggtcaccg tctcaagc 378
<210>195
<211>333
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>195
gacatccaga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc60
atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttagattgg120
tacctgcaga aaccagggca gtctccacag ctcctgatct ctttgggttc taatcgggcc180
tccggggtcc ctgccaggtt cagtggcagt ggctcaggca cagattttac actgaaaatc240
agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tactactgca tgcaagctct acaaactatc300
accttcggcc aagggacacg actggagatt aaa 333
<210>196
<211>357
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>196
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttactgga tgttttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atcgtttctt ctggtggcat gactggttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagtgggg300
atgtccacct atgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcaagc 357
<210>197
<211>321
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>197
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac tttcggcgga300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210>198
<211>354
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>198
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ttggtggttc tttacgtctt60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacggta tgtcttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atccgttctt ctggtggccg tacttggtat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagttt actattgtgc gaaaggctcc300
cttagcagtg gctgggacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagc 354
<210>199
<211>318
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>199
cagagcgctt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc ctggacagac agccagcatc60
acctgcgctg gagatgaatt gggtaataaa tatgcttcct ggtatcagca gaagccaggc120
cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat aggaagcggc cctcagggat ccctgagcga180
ttctctggct cccactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctctc240
gatgaggctg actattactg tcagtcgtgg gacagcagct ctgtgatatt cggcggcggg300
accaaggtga ccgtccta 318
<210>200
<211>339
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>200
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aattaccgta tggagtgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctggtctt ctggtggcct tactaaggag180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagaggcctg300
taccggtggg gccagggaac cctggtcacc gtctcaagc 339
<210>201
<211>330
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>201
cagtacgaat tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag120
catccaggca aagcccccaa attcatgatt tatgaggtca ataagcggcc ctcaggggtc180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccgt ctctgggctc240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc agctcatatg caggcaggaa ctttgtggta300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210>202
<211>366
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>202
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtactcta tggtttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcggtcctt ctggtggcat gactcgttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagatcaa300
gggattacta tggttcaggg agctatgggc tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc360
tcaagc 366
<210>203
<211>324
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>203
cagagcgctt tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt60
acctgtgggg gaaacaacat tggtactaaa attgtaaact ggtaccagca gaggccaggc120
caggcccctg tggtggtcgt ctatgataat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga180
ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg240
gatgaggccg actattactg tcagctgtgg gatagtagta gtgaccatcc gatcttcgga300
actgggacca aggtcaccgt ccta 324
<210>204
<211>357
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<400>204
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gtttactcta tggcttgggt tcgccaagct120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctggcctt ctggtggccc tactgcttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagaagat300
ttttggagtg gtttggagga cgtctggggc aaagggacca cggtcaccgt ctcaagc 357
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gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagaa ttctctctct ccatcagcag cctgcagcct240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tccctctcac tttcggcgga300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
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cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcgttcctt ctggtggcac tactgtttat180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagaccta300
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85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>291
<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>291
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Leu Leu His
20 25 30
Arg Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Met Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Ala Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
100 105 110
<210>292
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>292
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Gly Ile Asn Gly
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Ser Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210>293
<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>293
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>294
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>294
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Gly Asn
20 25 30
His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu
35 40 45
Ile Arg Glu Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Thr Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ala Phe Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>295
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>295
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Val Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Tyr Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
100 105
<210>296
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>296
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Arg
20 25 30
Trp Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Glu Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>297
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Phe Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Gly Arg Ser Glu Ala Asp Phe Thr Leu Ala Ile Thr Ser Leu Gln
65 70 75 80
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85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
100 105
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<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>298
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Thr
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asp Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Ser Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210>299
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>299
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile
20 25 30
His Leu Ala Trp Phe Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210>300
<211>107
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>300
Gln Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>301
<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>301
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>302
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>302
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Gly Ile Arg Asn
20 25 30
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr His Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
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85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>303
<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>303
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
20 25 30
Ser Ser Gly Tyr His Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>304
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>304
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Thr Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu
35 40 45
Met Tyr Gly Ala Tyr Lys Leu Gln Tyr Gly Val Pro Thr Lys Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln
65 70 75 80
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85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys
100 105
<210>305
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>305
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Gly Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Ser Ile Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>306
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>306
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Met Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Met
20 25 30
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asn Trp Pro
85 90 95
Phe His Phe Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Lys
100 105
<210>307
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>307
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Asn Asn
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Lys Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Val Asp Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Tyr Lys Ala Phe Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys
100 105
<210>308
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>308
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Glu Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Pro Lys Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>309
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>309
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Thr
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>310
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>310
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>311
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>311
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Phe
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Arg Gly Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ala Thr Leu Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>312
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>312
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn
20 25 30
Ala Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Lys
100 105
<210>313
<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>313
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn
20 25 30
Ile Asp Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Arg Ala Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>314
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>314
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn
20 25 30
Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gln Lys Asn Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>315
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>315
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Tyr Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Asn Ile Pro Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Ser
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ser Val Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Phe Pro
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Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>316
<211>128
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>316
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Met Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
<210>317
<211>115
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>317
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Met Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ile Leu His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>318
<211>115
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>318
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Met Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Leu Leu Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>319
<211>115
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>319
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Met Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Leu Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>320
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>320
Ser Ile Ala Ala Asp Arg Thr Asp Tyr
1 5
<210>321
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>321
Ser Ile Ala Ala Ser Arg Thr Asp Tyr
1 5
<210>322
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>322
Ser Ile Ala Ser Ala Gly Thr Asp His
1 5
<210>323
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>323
Ser Ile Ala Ser Ala Arg Thr Asp Ser
1 5
<210>324
<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>324
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
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Ala Leu Gln Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>325
<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>325
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210>326
<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>326
Ser Gly Ser Asn Ser Asn Val Gly Thr Lys Thr Val Asn
1 5 10
<210>327
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
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1 5 10
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<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>328
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1 5 10
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<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
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1 5 10
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<213>人(homo sapiens)
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1 5
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<213>人(homo sapiens)
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<400>342
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<213>人(homo sapiens)
<400>343
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val
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<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>344
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>346
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<213>人(homo sapiens)
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
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<213>人(homo sapiens)
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Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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<213>人(homo sapiens)
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>360
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<213>人(homo sapiens)
<400>361
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<213>人(homo sapiens)
<400>362
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<213>人(homo sapiens)
<400>363
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>364
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<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>365
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
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<213>人(homo sapiens)
<400>366
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<213>人(homo sapiens)
<400>367
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
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Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
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Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
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<213>人(homo sapiens)
<400>368
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<213>人(homo sapiens)
<400>369
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20 25 30
Leu Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Pro Ser Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ile Ala Ala Asp Arg Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro
130
<210>370
<211>131
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>370
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Pro Ser Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ile Ala Ser Ala Gly Thr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro
130
<210>371
<211>131
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>371
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Pro Ser Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ile Ala Ser Ala Arg Thr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro
130
<210>372
<211>131
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>372
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Pro Ser Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ile Ala Ala Ser Arg Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro
130
<210>373
<211>20
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>373
Glu Arg Ser Val Ala Val Phe Lys Ala Arg Pro Arg His Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Met Asp Val
20
<210>374
<211>20
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>374
Asp Gly Ser Ala Arg Val Val Lys Gly Pro Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ile Asp Val
20
<210>375
<211>20
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>375
Glu Gly Ser Ala Arg Val Val Lys Gly Pro Ala Arg Tyr Phe Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Met Asp Leu
20
<210>376
<211>20
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>376
Glu Gly Ser Ser Gly Val Val Lys Gly Pro Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Met Asp Ala
20
<210>377
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>377
Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210>378
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>378
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210>379
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>379
Gln Gln Ser Asn Ser Ile Pro Arg Thr
1 5
<210>380
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>380
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210>381
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>381
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210>382
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>382
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>383
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>383
Ala Ala Tyr Thr Leu Gln Ser
1 5
<210>384
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>384
Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>385
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>385
Asp Ala Ser Thr Leu Gln Asn
1 5
<210>386
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>386
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210>387
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>387
Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>388
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1 5 10
<210>389
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>389
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>390
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>391
Arg Ala Ser Arg Gly Val Ser Thr Ser Leu Asn
1 5 10
<210>392
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>392
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Lys Asn Leu Asn
1 5 10
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<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>393
Arg Ala Ser Arg Arg Ile Gly Thr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210>394
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>394
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210>395
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>395
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Asn Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210>396
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>396
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg Trp Leu Ala
1 5 10
<210>397
<211>142
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>397
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
130 135 140
<210>398
<211>142
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>398
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Trp Ser Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Tyr Ile Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
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130 135 140
<210>399
<211>142
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>399
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Tyr Met Asp Ala Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
130 135 140
<210>400
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>400
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Lys Asn
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105
<210>401
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>401
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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65 70 75 80
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85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>402
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>402
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Tyr Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Arg Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Ile Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Val Glu Ile Arg
100 105
<210>403
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>403
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>404
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>404
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>405
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>405
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>406
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>406
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Gly Val Ser Thr
20 25 30
Ser Leu Asn Trp Tyr Gln Ile Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Thr Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>407
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>407
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>408
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>408
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Lys
20 25 30
Asn Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Gly Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro
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Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
100 105
<210>409
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>409
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
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Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>410
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>410
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>411
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>411
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>412
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>412
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>413
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>413
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>414
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>414
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>415
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>415
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>416
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>416
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>417
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>417
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Arg Ile Gly Thr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Thr Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>418
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>418
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>419
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>419
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>420
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>420
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Asn Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asp Leu Leu
35 40 45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>421
<211>108
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>421
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>422
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>422
Ala Gly Asp Glu Leu Gly Asn Lys Tyr Ala Ser
1 5 10
<210>423
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>423
Ser Gly Asp Ile Leu Gly Asn Lys Tyr Ser Ser
1 5 10
<210>424
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>424
Ser Gly Asp Lys Leu Arg Asn Lys Tyr Ala Ser
1 5 10
<210>425
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>425
Ser Gly Asn Lys Leu Gly Asn Thr Tyr Ile Ser
1 5 10
<210>426
<211>14
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>426
Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Arg Tyr Ser His Val Ser
1 5 10
<210>427
<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>427
Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Leu Asn Pro Val Asn
1 5 10
<210>428
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>428
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Lys Tyr Thr Ser
1 5 10
<210>429
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>429
Ser Gly Gln Ile Leu Gly Glu Arg Ser Ala Ser
1 5 10
<210>430
<211>14
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>430
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Arg Tyr Asn Arg Val Ser
1 5 10
<210>431
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>431
Ser Gly Asp Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Ala Ser
1 5 10
<210>432
<211>13
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>432
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210>433
<211>11
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>433
Ser Gly Asp Lys Leu Arg Asn Lys Tyr Gly Ser
1 5 10
<210>434
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>434
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1 5
<210>435
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>435
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>436
Ala Val Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
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<211>7
<212>PRT
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<400>437
Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>438
Gln Asn Arg Lys Arg Pro Ser
1 5
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<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>439
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1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Arg His
20 25 30
Asn Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
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50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
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<210>440
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>440
Gln Ser Ser Gln Arg Pro Ser
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>441
Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
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<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>442
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1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn
20 25 30
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35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Arg Ala Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>443
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>443
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210>444
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>444
Gln Ser Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
1 5
<210>445
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>445
Gln Ala Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
1 5
<210>446
<211>9
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<213>人(homo sapiens)
<400>446
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1 5
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<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>447
Gln Thr Trp Asp Arg Ser Ser Val Val
1 5
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<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>448
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1 5 10
<210>449
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>449
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1 5
<210>450
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>450
Gln Ala Trp Asp Asn Ser Ala Val Ile
1 5
<210>451
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>451
Gln Thr Trp Asp Thr Ser Ile Leu
1 5
<210>452
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>452
Ser Ser Tyr Arg Asn Thr Gly Pro Leu
1 5
<210>453
<211>17
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>453
Ser Ile Trp Ser Ser Gly Gly Leu Thr Lys Glu Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>454
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>454
Asn Ser Tyr Thr Asn Ser Ala Thr Leu Val
1 5 10
<210>455
<211>119
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>455
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val
1 5 10 15
Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ala Gly Asp Glu
20 25 30
Leu Gly Asn Lys Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Gly Thr Gln Ala Leu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp
85 90 95
Asp Ser Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Ser Gln Pro Lys Ala Ala Pro
115
<210>456
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>456
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ile Leu Gly Asn Lys Tyr Ser
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>457
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>457
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Arg Asn Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>458
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>458
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ile Leu Gly Asn Lys Tyr Ser
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>459
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>459
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asn Lys Leu Gly Asn Thr Tyr Ile
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Thr Gln Ser Leu
65 70 75 80
Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Arg Ser Ser Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>460
<211>119
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>460
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val
1 5 10 15
Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Arg Asn Lys Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Ile Pro
50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp
85 90 95
Asp Ser Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
115
<210>461
<211>109
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>461
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Arg Tyr
20 25 30
Ser His Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Ala Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Thr Tyr His Cys Gln Ser Tyr Thr Thr Thr
85 90 95
Gly Thr Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Thr Val
100 105
<210>462
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>462
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ile Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ile Leu Gly Asn Lys Tyr Ser
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Phe
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>463
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>463
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asn Lys Leu Gly Asn Thr Tyr Ile
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Thr Gln Ser Leu
65 70 75 80
Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Arg Ser Ser Val Val
85 90 95
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100 105
<210>464
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>464
Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asn Lys Leu Gly Asn Thr Tyr Ile
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
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Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105
<210>465
<211>107
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>465
Gln Ser Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg
1 5 10 15
Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Leu Asn Pro
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65 70 75 80
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100 105
<210>466
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>466
Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Lys Tyr Thr
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Gln Asn Arg Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Gly Thr Gln Ala Ile
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Asn Ser Ala Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>467
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>467
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Arg Asn Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>468
<211>105
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>468
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly His
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Gln Ile Leu Gly Glu Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr
35 40 45
Gln Ser Ser Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Thr Ser Ile Leu Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>469
<211>109
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>469
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Arg Tyr
20 25 30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ser Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Phe Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Asn Thr
85 90 95
Gly Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>470
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>470
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ile Leu Gly Asn Lys Tyr Ser
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>471
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>471
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Lys Tyr Thr
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Gln Asn Arg Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Asn Ser Ala Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>472
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>472
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Asn Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Val Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>473
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>473
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Lys Tyr Thr
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Gln Asn Arg Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Gly Thr Gln Ala Ile
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Asn Ser Ala Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>474
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>474
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Lys Tyr Thr
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Gln Asn Arg Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Gly Thr Gln Ala Ile
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Asn Ser Ala Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>475
<211>110
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>475
Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Arg Tyr
20 25 30
Ser His Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Ala Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Thr Tyr His Cys Gln Ser Tyr Thr Thr Thr
85 90 95
Gly Thr Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>476
<211>105
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>476
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly His
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Gln Ile Leu Gly Glu Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr
35 40 45
Gln Ser Ser Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ile Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ser Ile
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Thr Ser Ile Leu Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>477
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>477
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Arg Asn Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>478
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>478
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ile Leu Gly Asn Lys Tyr Ser
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>479
<211>109
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>479
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Arg Tyr
20 25 30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ser Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Phe Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Asn Thr
85 90 95
Gly Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>480
<211>109
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>480
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr Asn Ser Ala
85 90 95
Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>481
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>481
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ile Leu Gly Asn Lys Tyr Ser
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>482
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>482
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asn Lys Leu Gly Asn Thr Tyr Ile
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Thr Gln Ser Leu
65 70 75 80
Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Arg Ser Ser Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>483
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>483
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Arg Asn Lys Tyr Gly
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>484
<211>106
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>484
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Arg Asn Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
His Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Ser Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>485
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>485
Val Gly Ile Ser Thr Tyr Gly Phe Asp Leu
1 5 10
<210>486
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>486
Val Gly Met Ala Thr Tyr Gly Phe Asp Ile
1 5 10
<210>487
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>487
Val Gly Met Ser Asn Tyr Gly Phe Asp Phe
1 5 10
<210>488
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>488
Val Gly Met Ser Thr Tyr Gly Phe Asp Lys
1 5 10
<210>489
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>489
Val Gly Met Tyr Asn Tyr Gly Phe Asp Ile
1 5 10
<210>490
<211>132
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>490
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Met Ala Thr Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro
130
<210>491
<211>132
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>491
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Met Ser Asn Tyr Gly Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro
130
<210>492
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>492
Met Gln Ala Leu Gln Thr Leu Thr
1 5
<210>493
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>493
Met Gln Ala Leu Arg Ala Ile Thr
1 5
<210>494
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>494
Met Gln Ala Leu Gln Ala Ile Thr
1 5
<210>495
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>495
Met Gln Ala Leu Gln Ser Pro Thr
1 5
<210>496
<211>8
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>496
Met Gln Ala Leu Gln Ser Ile Thr
1 5
<210>497
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>497
Met Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210>498
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>498
Leu Gly Ser His Arg Ala Ser
1 5
<210>499
<211>7
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>499
Phe Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210>500
<211>132
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>500
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Ile Ser Thr Tyr Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro
130
<210>501
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>501
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>502
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>502
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>503
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>503
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>504
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>504
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Tyr His Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>505
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>505
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>506
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>506
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp
1 5 10 15
<210>507
<211>16
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>507
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Arg His Asn Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>508
<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>508
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>509
<211>132
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>509
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Met Ser Thr Tyr Gly Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro
130
<210>510
<211>132
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>510
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Met Tyr Asn Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro
130
<210>511
<211>112
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>511
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>512
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>807A-M0028-B02的親和力成熟的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X＝S或G
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>X＝V或I
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X＝L，H或F
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X＝Y(jié)，N或K
<400>512
Xaa Xaa Leu Xaa Asp Xaa
1 5
<210>513
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>807B-M0004-A03的親和力成熟的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X＝A或S
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X＝D，S或A
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X＝R或G
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>X＝Y(jié)，H或S
<400>513
Ser Ile Ala Xaa Xaa Xaa Thr Asp Xaa
1 5
<210>514
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>807B-M0004-H03的親和力成熟的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X＝E或D
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>X＝G或R
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X＝A，S或V
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X＝G，R或A
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X＝V或F
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>X＝G或A
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>X＝P或R
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X＝A，P或R
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>X＝Y(jié)或H
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>X＝Y(jié)或F
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>Xaa可為任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>X＝V，L或A
<400>514
Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Val Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Xaa Asp Xaa
20
<210>515
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>807B-M0009-F06的親和力成熟的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>X＝M或I
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X＝S或A
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X＝T或N
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X＝A或G
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>X＝I，L，F(xiàn)或K
<400>515
Val Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Phe Asp Xaa
1 5 10
<210>516
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>807B-M0009-F06的親和力成熟的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>X＝V或I
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X＝L，H或F
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X＝K，Y或N
<400>516
Gly Xaa Leu Xaa Asp Xaa
1 5
<210>517
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>807A-M0004-A03的親和力成熟的CDR3區(qū)的共有氨基酸序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X＝S或A
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X＝S或A
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X＝R或G
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>X＝H或Y
<400>517
Ser Ile Ala Xaa Xaa Xaa Thr Asp Xaa
1 5
<210>518
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的VL鏈的氨基酸序列
<400>518
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210>519
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的CL鏈的氨基酸序列
<400>519
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>520
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的VL鏈的氨基酸序列
<400>520
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210>521
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的CL鏈的氨基酸序列
<400>521
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>522
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的VL鏈的氨基酸序列
<400>522
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210>523
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的CL鏈的氨基酸序列
<400>523
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210>524
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的VL鏈的氨基酸序列
<400>524
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210>525
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的VL鏈的氨基酸序列
<400>525
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210>526
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的VL鏈的氨基酸序列
<400>526
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210>527
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>種系校正的抗體的CL鏈的氨基酸序列
<400>527
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
G1u Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 10權(quán)利要求
1.一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段
(i)結(jié)合一種多肽，該多肽具有SEQ ID NO1中所示出載脂蛋白E的C端結(jié)構(gòu)域(ApoE-CTD)的氨基酸序列，或其部分的氨基酸序列，并且
(ii)結(jié)合人斑塊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的抗體或抗體片段，其含有重鏈CDR3區(qū)，該CDR3區(qū)含有SEQ ID NO512、SEQ ID NO513、SEQ IDNO514、SEQ ID NO515、SEQ ID NO516或SEQ ID NO517所示出序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的抗體或抗體片段，其含重鏈CDR3區(qū)，該CDR3區(qū)含SEQ ID NO20所示出序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO23或SEQ ID NO26所示出序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO207、SEQ ID NO208、SEQ ID NO209、SEQ ID NO210、SEQ ID NO320、SEQ ID NO321、SEQ ID NO322、SEQ ID NO323、SEQ ID NO373、SEQ ID NO374、SEQ ID NO375、SEQ ID NO376、SEQ ID NO485、SEQ ID NO486、SEQ ID NO487、SEQ ID NO488或SEQ ID NO489所示出序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO207、SEQ ID NO208、SEQ ID NO209、SEQ ID NO320、SEQ ID NO321、SEQ ID NO322或SEQ ID NO373所示出序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的抗體或抗體片段，其含重鏈CDR3區(qū)，該CDR3區(qū)含有選自SEQ ID NO29、SEQ ID NO47、SEQ ID NO50、SEQ ID NO53、SEQ ID NO56、SEQ ID NO59、SEQ ID NO62、SEQID NO65、SEQ ID NO68、SEQ ID NO71、SEQ ID NO74、SEQ IDNO77、SEQ ID NO80、SEQ ID NO83、SEQ ID NO86和SEQ ID NO89所示出序列的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO50、SEQ ID NO68、SEQ ID NO74或SEQ ID NO80。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其中含部分SEQ ID NO1的氨基酸序列的所述多肽含有SEQ ID NO2，SEQ IDNO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16或SEQID NO17所示出序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其中含部分SEQ ID NO1的氨基酸序列的所述多肽含SEQ ID NO18或SEQID NO19所示出序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其結(jié)合具有SEQ ID NO1所示出氨基酸序列的所述多肽。
12.一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段
(i)結(jié)合具有SEQ ID NO1所示出的ApoE-CTD的氨基酸序列的多肽，或其部分的氨基酸序列；并且
(ii)含有包括SEQ ID NO512、SEQ ID NO513、SEQ ID NO514、SEQ ID NO515、SEQ ID NO516或SEQ ID NO517所示出序列的重鏈CDR3區(qū)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO20所示出序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO23或SEQ ID NO26所示出序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO207、SEQ ID NO208、SEQ ID NO209、SEQ ID NO210、SEQ ID NO320、SEQ ID NO321、SEQ ID NO322、SEQ ID NO323、SEQ ID NO373、SEQ ID NO374、SEQ ID NO375、SEQ ID NO376、SEQ ID NO485、SEQ ID NO486、SEQ ID NO487、SEQ ID NO488或SEQ ID NO489所示出序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO207、SEQ ID NO208、SEQ ID NO209、SEQ ID NO320、SEQ ID NO321、SEQ ID NO322或SEQ ID NO373所示出序列。
17.一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段
(i)結(jié)合具有SEQ ID NO1所示出的ApoE-CTD的氨基酸序列的多肽，或其部分的氨基酸序列；并且
(ii)含有重鏈CDR3區(qū)，其含選自SEQ ID NO29、SEQ ID NO47、SEQ ID NO50、SEQ ID NO53、SEQ ID NO56、SEQ ID NO59、SEQID NO62、SEQ ID NO65、SEQ ID NO68、SEQ ID NO71、SEQ IDNO74、SEQ ID NO77、SEQ ID NO80、SEQ ID NO83、SEQ ID NO86和SEQ ID NO89所示出序列的氨基酸序列。
18.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的抗體或片段，其在極低密度脂蛋白(VLDL)存在時(shí)結(jié)合所述多肽。
19.一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段在VLDL存在時(shí)，結(jié)合具有SEQ ID NO1所示出ApoE-CTD氨基酸序列或其部分的氨基酸序列的多肽。
20.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的抗體或抗體片段，其中所述多肽為重組多肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求14中所述的抗體或抗體片段，其中所述重組多肽被生物素化。
22.一種人抗體或抗體片段，其中抗體或片段
(i)結(jié)合人斑塊；并且
(ii)含有重鏈CDR3區(qū)，其含SEQ ID NO512、SEQ ID NO513、SEQ ID NO514、SEQ ID NO515、SEQ ID NO516或SEQ ID NO517所示出序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO20所示出序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含有SEQ ID NO23或SEQ ID NO26所示出序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求22中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO207、SEQ ID NO208、SEQ ID NO209、SEQ ID NO210、SEQ ID NO320、SEQ ID NO321、SEQ ID NO322、SEQ ID NO323、SEQ ID NO373、SEQ ID NO374、SEQ ID NO375、SEQ ID NO376、SEQ ID NO485、SEQ ID NO486、SEQ ID NO487、SEQ ID NO488或SEQ ID NO489所示出序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求25中所述的抗體或抗體片段，其中所述CDR3區(qū)含SEQ ID NO207、SEQ ID NO208、SEQ ID NO209、SEQ ID NO320、SEQ ID NO321、SEQ ID NO322或SEQ ID NO373所示出序列。
27.一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段
(i)結(jié)合人斑塊；并且
(ii)含重鏈CDR3區(qū)，其含選自SEQ ID NO29、SEQ ID NO47、SEQ ID NO50、SEQ ID NO53、SEQ ID NO56、SEQ ID NO59、SEQID NO62、SEQ ID NO65、SEQ ID NO68、SEQ ID NO71、SEQ IDNO74、SEQ ID NO77、SEQ ID NO80、SEQ ID NO83、SEQ ID NO86和SEQ ID NO89所示出序列的氨基酸序列。
28.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述抗體或抗體片段，其在VLDL存在時(shí)結(jié)合所述斑塊。
29.根據(jù)權(quán)利要求18、19和28中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其中所述VLDL存在于人血漿中。
30.根據(jù)權(quán)利要求29中所述的抗體或抗體片段，其在25％血漿存在時(shí)結(jié)合斑塊。
31.根據(jù)權(quán)利要求30中所述的抗體或抗體片段，其在25％到50％血漿存在時(shí)結(jié)合斑塊。
32.根據(jù)權(quán)利要求31中所述的抗體或抗體片段，其在50％血漿存在時(shí)結(jié)合斑塊。
33.一種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO136所示出重鏈序列和SEQ ID NOS521和522所示出輕鏈序列。
34.一種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO142所示出重鏈序列和SEQ ID NO523所示出輕鏈序列。
35.一種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO40所示出重鏈序列和SEQ ID NO517和/或518所示出輕鏈序列。
36.一種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO40所示出重鏈序列和SEQ ID NO519和/或520所示出輕鏈序列
37.一種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO24所示出重鏈CDR1序列、SEQ ID NO25所示出重鏈CDR2序列和SEQ ID NOS207、209和210任一序列所示出重鏈CDR3序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求37中所述的抗體或抗體片段，其含SEQ ID NOS33、34和35，SEQ ID NOS219、247和269，SEQ ID NOS226、252和275或SEQ ID NOS218、34和268所示出輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求38中所述的抗體或抗體片段，其中所述重鏈含SEQ ID NO210所示出序列，并且所述輕鏈含SEQ ID NOS33、34和35所示出序列，所述重鏈含SEQ ID NO209所述序列，并且輕鏈含SEQID NOS219、247和269或SEQ ID NOS218、34和268所示出序列，或者所述重鏈含SEQ ID NO207中所示出序列，并且輕鏈含SEQ IDNOS226、252和275中所示出序列。
40.根據(jù)權(quán)利要求37到39中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其中所述重鏈含SEQ ID NO317、318或319任一序列所示出序列。
41.根據(jù)權(quán)利要求38到40中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其中所述輕鏈含SEQ ID NO43、295、294或304所示出序列。
42.一種抗體或抗體片段，其含SEQ ID NO48所示出重鏈CDR1序列，SEQ ID NO49所示出重鏈CDR2序列和SEQ ID NOS320、322和323任一序列所示重鏈CDR3序列。
43.根據(jù)權(quán)利要求42中所述的抗體或抗體片段，其含SEQ ID NOS326，334和341、SEQ ID NOS93，333和341或SEQ ID NOS325和333所示出輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列。
44.根據(jù)權(quán)利要求43中所示出的抗體或抗體片段，其中所述重鏈含SEQ ID NO320所示出序列，并且所述輕鏈含SEQ ID NOS93、333和341或SEQ ID NOS325、333和341所示出序列；所述重鏈含SEQ IDNO322所示出序列，并且所述輕鏈含SEQ ID NOS326、334和341，SEQ ID NOS93、333和341或SEQ ID NOS325、333和341所示序列，或者所述重鏈含SEQ ID NO323所示出序列，并且所述輕鏈含SEQID NOS93、333和341所示出序列。
45.根據(jù)權(quán)利要求42到44中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其中所述重鏈含SEQ ID NO369、370、371或372所示出序列。
46.根據(jù)權(quán)利要求43到45中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其中所述輕鏈含SEQ ID NO347、348、357或362所示出序列。
47.一種抗體或抗體片段，其含SEQ ID NO66所示出重鏈CDR1序列、SEQ ID NO67所示出重鏈CDR2序列和SEQ ID NO373所示出重鏈CDR3序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的抗體或抗體片段，其含SEQ ID NOS391、382和378或SEQ ID NOS394、386和378所示出輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求47或48所述的抗體或抗體片段，其中所述重鏈含SEQ ID NO397所示出序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求48或49所述的抗體或抗體片段，其中所述輕鏈含SEQ ID NO406或418所示出序列。
51.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的抗體或抗體片段，其中所述抗體為IgG。
52.根據(jù)權(quán)利要求1到50中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其中所述抗體片段為Fab片段或scFv。
53.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的抗體或抗體片段，其為單克隆抗體。
54.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的抗體或抗體片段，其為人源化抗體。
55.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的抗體或抗體片段，其為嵌合型的。
56.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的抗體或抗體片段，其用于接受治療的人體或動(dòng)物體的治療方法中或在人體或動(dòng)物體上實(shí)施的診斷方法。
57.根據(jù)權(quán)利要求1到55中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段用于生產(chǎn)治療或預(yù)防淀粉樣變性病的藥物中的用途。
58.根據(jù)權(quán)利要求57中所述的用途，其中所述淀粉樣變性病選自阿耳茨海默氏病、原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、老年系統(tǒng)性淀粉樣變性病、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變I、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變III、家族性非神經(jīng)病變淀粉樣變性病、遺傳性大腦淀粉樣血管病、家族性英國(guó)型癡呆(FBD)、血液透析相關(guān)淀粉樣變性病、家族性淀粉樣變性病(芬蘭型)、家族性上皮下角膜淀粉樣變性病、II型糖尿病、遺傳性腎淀粉樣變性病、垂體腺淀粉樣變性病、注射局限的淀粉樣變性病、甲狀腺髓質(zhì)癌、心房淀粉樣變性病、家族性丹麥型癡呆(FDD)、唐氏綜合癥、海綿狀腦病、散發(fā)性克-雅病、家族性克-雅病、Iatropic朊蛋白病、變異克-雅病、GSS病、苦魯病、帕金森病、亨廷頓病、家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)和慢性阻塞性肺疾病。
59.一種含根據(jù)權(quán)利要求1到55中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段的藥物組合物和一種可藥用的載體或稀釋劑。
60.一種治療患淀粉樣變性病的受試者的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1到55中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段以治療有效劑量給藥給所述受試者。
61.一種診斷受試者是否患淀粉樣變性病的方法，包括
(i)將根據(jù)權(quán)利要求1到55中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段給藥給所述受試者；并且
(ii)測(cè)定所述抗體或抗體片段是否結(jié)合所述受試者的斑塊，其中所述抗體或抗體片段與斑塊的結(jié)合是淀粉樣變性病的指標(biāo)，由此確定受試者是否患淀粉樣變性病。
62.根據(jù)權(quán)利要求61中所述的方法，其中所述抗體或抗體片段已被標(biāo)記。
63.根據(jù)權(quán)利要求60或61中所述的方法，其中所述淀粉樣變性病選自阿耳茨海默氏病、原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、老年系統(tǒng)性淀粉樣變性病、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變I、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變III、家族性非神經(jīng)病變淀粉樣變性病、遺傳性大腦淀粉樣血管病、家族性英國(guó)型癡呆(FBD)、血液透析相關(guān)淀粉樣變性病、家族性淀粉樣變性病(芬蘭型)家族性上皮下角膜淀粉樣變性病、II型糖尿病、遺傳性腎淀粉樣變性病、垂體腺淀粉樣變性病、注射局限的淀粉樣變性病、甲狀腺髓質(zhì)癌、心房淀粉樣變性病、家族性丹麥型癡呆(FDD)、唐氏綜合癥、海綿狀腦病、散發(fā)性克-雅病、家族性克-雅病、Iatropic朊蛋白病、變異克-雅病、GSS病、苦魯病、帕金森病、亨廷頓病、家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)和慢性阻塞性肺疾病。
64.一種多核苷酸，編碼根據(jù)權(quán)利要求1到55中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段。
65.一種載體，含根據(jù)權(quán)利要求64中所述的多核苷酸。
66.一種宿主細(xì)胞，表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1到55中任一項(xiàng)所述的多肽。
67.一種病毒，編碼根據(jù)權(quán)利要求64中所述的多核苷酸。
68.一種檢測(cè)ApoE-CTD的試劑盒，該試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求1到55中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段和檢測(cè)所述抗體或抗體片段的手段。
69.一種檢測(cè)來(lái)自受試者樣本的ApoE-CTD存在與否的方法，該方法包括
(i)在根據(jù)權(quán)利要求1到55中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段可結(jié)合ApoE-CTD的條件下，將該抗體或抗體片段與取自受試者的樣本相接觸；并且
(ii)檢測(cè)抗體或抗體片段是否結(jié)合樣本，由此確定樣本中ApoE-CTD存在與否。
全文摘要
抗體一種人抗體或抗體片段，該抗體或片段(i)結(jié)合一種多肽，該多肽具有SEQ ID No1中所示出載脂蛋白E的C端結(jié)構(gòu)域(ApoE－CTD)的氨基酸序列，或其部分的氨基酸序列，并(ii)結(jié)合人斑塊。
文檔編號(hào)C12N15/13GK1890266SQ20048003525
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者C·諾德斯特德特, T·戈德施米特, M·亨德里克斯, R·霍爾, H·胡吉恩布姆, S·赫夫頓, C·V·安迪生, J·林德奎斯特, D·森尼馬克, S·利奧諾夫 申請(qǐng)人:阿斯特拉曾尼卡有限公司, 戴克斯公司