專利名稱：制備不飽和酰胺和羧酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用酰胺酶從相應(yīng)的酰胺制備烯鍵式不飽和羧酸的方法和采用腈水合酶從相應(yīng)的腈制備烯鍵式不飽和酰胺的方法。本發(fā)明還涉及新的腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶及能產(chǎn)生這種酶的微生物。
有很多文獻(xiàn)證明了化學(xué)反應(yīng)的酶催化。采用生物催化劑如含有酶的微生物或者使用與微生物分離開來(lái)的酶來(lái)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)是眾所周知的。已知各種烯鍵式不飽和單體可通過(guò)使用生物催化劑將底物原料轉(zhuǎn)化成所需的單體來(lái)制備。
已知腈水合酶催化腈的水合，生成相應(yīng)的酰胺。腈水合酶通?？捎啥喾N微生物合成，例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、無(wú)芽孢桿菌屬(Bacteridium)、微球菌屬(Micrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)、土壤桿菌(Agrobacterium)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、紅球菌屬(Rhodococcus)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)的微生物。
已知使用腈水合酶作為催化劑從丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺。當(dāng)用生物法生產(chǎn)這種產(chǎn)物時(shí)，宜采用能夠生產(chǎn)高濃度的丙烯酰胺水溶液而又不被丙烯腈和高濃度的丙烯酰胺中毒的酶。
Yamada和Kobayashi，Biosci.Biotech.Biochem 601391-1400(1996)的綜述文章以圖表說(shuō)明了生產(chǎn)濃度最高達(dá)50％的丙烯酰胺單體的生物催化方法的進(jìn)展。該綜述描述了為工業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺而開發(fā)的三代催化劑，最后一代為紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1，一種需要鈷作為催化丙烯腈形成丙烯酰胺的腈水合酶一部分的細(xì)菌。由于培養(yǎng)基中存在尿素作為誘導(dǎo)物，可以以很高的水平合成腈水合酶。
Nawaz等，Arch.Microbiol.156231-238(1991)題為‘Metabolism ofacrylonitrile by Klebsiella pneumoniae’的文章描述了肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)的分離、生長(zhǎng)及其隨后對(duì)丙烯腈的快速利用和形成丙烯酰胺，所形成的丙烯酰胺接著進(jìn)一步水解成丙烯酸。該細(xì)菌是用富集培養(yǎng)技術(shù)在pH 7.5下以丙烯腈為唯一氮源分離的。
Takashima等，J Indust.Microbiol.Biotechnol.(1998)，Nitrilehydratase from a thermophilic Bacillus smithii描述了合成腈水合酶的嗜熱細(xì)菌的特征。此腈水合酶具有高的丙烯腈轉(zhuǎn)化活性，最高活性出現(xiàn)在pH 10.5或以上。這暗示為使此酶達(dá)到最佳活性，反應(yīng)溶液必須緩沖在該高pH下。
Ramakrishna和Desai Biotechnol.Lett.15(3)267-270(1993)描述了一種節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)IPCB-3的鈷誘導(dǎo)丙烯腈水合酶與該菌的含鐵腈水合酶相比在轉(zhuǎn)化丙烯腈生成丙烯酰胺上的優(yōu)越性。這種細(xì)菌分別需要鈷和尿素作為輔因子和誘導(dǎo)物，以獲得最高的腈水合酶活性。雖然這種細(xì)菌的含鈷腈水合酶似乎具有良好的丙烯腈耐受性，但在高于25％的丙烯酰胺濃度下該酶的活性大大下降。
已發(fā)現(xiàn)紫紅紅球菌的不同株能十分有效地產(chǎn)生腈水合酶。EP-0307 926描述了在含有鈷離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫紅紅球菌，具體為J1株。此腈水合酶可用于使腈水合生成酰胺，特別是使3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化成煙酰胺。此細(xì)菌在EP-0362829中有進(jìn)一步的描述，該專利描述了培養(yǎng)紫紅紅球菌的方法，所述方法包括用至少尿素和鈷離子之一來(lái)制備具有腈水合酶活性的紫紅紅球菌細(xì)胞。具體描述的是紫紅紅球菌J1。
紫紅紅球菌J1在商業(yè)上用于從丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺單體，這種方法已由Nagasawa和Yamada，Pure Apply.Chem.671241-1256(1995)進(jìn)行描述。
Leonova等，Appl.Biochem.Biotechnol.88231-241(2000)題為“Nitrile Hydratase of Rhodococcus”的文章描述了紫紅紅球菌M8的生長(zhǎng)和其中腈水合酶的合成。這一菌株的腈水合酶由培養(yǎng)基中存在的尿素誘導(dǎo)，尿素還用作此菌生長(zhǎng)的氮源。鈷也為高腈水合酶活性所必需。這篇文章主要著眼于誘導(dǎo)和代謝效應(yīng)。
上述每一篇參考文獻(xiàn)描述產(chǎn)生腈水合酶的細(xì)菌。所有這些公開文獻(xiàn)要求細(xì)菌在接近中性pH下生長(zhǎng)。
迪茨菌屬(Dietzia)由Rainey等，Int.J.Syst.Bacteriol 4532-36(1995)最先描述。海洋迪茨菌(Dietzia maris)成為此屬的模式種。在1999年又增加了一個(gè)種Dietzia natronolimnaea，這個(gè)種由Grant等，Extremophiles 2359-366(1998)題為‘Dietzia natronolimnaios sp.Nov.，anew member of the genus Dietzia isolated from an East African soda lake’的出版物首先描述。
這些研究者分離的Dietzia natronolimnaios株15LN1(CBS 107.95)是嗜堿生物(alkaliphile)，因此在高pH(10)下生長(zhǎng)，另外它在高鹽濃度(40g/l)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
已描述了迪茨菌屬對(duì)飽和化合物合成的催化作用。例如，WO-A-02/12530描述了用迪茨菌ADL1(ATCC PTA-1854)通過(guò)水解3-羥基腈制備3-羥基羧酸的方法。
WO01/048234描述了用微生物從氨基乙腈(glycinonitrile)制備甘氨酸的方法。該專利描述了多個(gè)種的微生物，包括海洋迪茨菌(Dietziamaris)。
具體產(chǎn)生將不飽和腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)酰胺或羧酸的丙烯腈水合酶或其他類似酶的微生物在大約中性pH下即pH 6-8左右生長(zhǎng)。因此，在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中保持無(wú)菌狀態(tài)更加困難，因?yàn)橐汛_認(rèn)在此pH下將有許多許多微生物生長(zhǎng)。因此可能出現(xiàn)的具體問(wèn)題是，發(fā)酵中會(huì)污染其他微生物。這種污染不但削弱所需的酶的生產(chǎn)，而且當(dāng)將酶用于使不飽和腈轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)物時(shí)還會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物。另外，最不希望有其他微生物存在，因?yàn)闉楸ＷC它們沒(méi)有害也即沒(méi)有致病性，須對(duì)這些未知污染菌進(jìn)行鑒定。發(fā)酵可能會(huì)因此被放棄，而這既費(fèi)錢又費(fèi)時(shí)。
已經(jīng)提到，經(jīng)常將尿素添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中作為許多顯示從丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺的微生物的腈水合酶的誘導(dǎo)物。尿素溶液由于其中存在銨離子而呈堿性。另外如果尿素在發(fā)酵過(guò)程中被完全降解，會(huì)釋放出銨離子，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH升高，除非加入緩沖鹽形式的高水平緩沖能力，或者更為可能的是向發(fā)酵液中加入酸來(lái)中和升高的pH作用。因此這是在中性pH下進(jìn)行微生物發(fā)酵的又一個(gè)問(wèn)題，原因在于往往需要對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖，以抵消加入尿素所產(chǎn)生的作用。所使用的緩沖溶液可包括磷酸鹽、檸檬酸與堿式鹽如磷酸鹽、Tris或通常所知的適用于發(fā)酵系統(tǒng)中以產(chǎn)生中性pH的其他任何緩沖液的組合?？捎糜诰彌_目的的酸包括磷酸、乙酸、硫酸和適合于此目的的其他任何酸。
腈還有一個(gè)問(wèn)題是，許多微生物往往不耐受高濃度的鹽，這會(huì)導(dǎo)致在細(xì)菌生長(zhǎng)和用作生物催化劑的過(guò)程中發(fā)生細(xì)胞滲漏，這是因?yàn)榧?xì)胞中與發(fā)酵或反應(yīng)培養(yǎng)基中的滲透壓之差造成的。例如，如果用某種微生物制備羧酸鹽，則此溶液的離子強(qiáng)度將比水或緩沖溶液要高。情況可能是，取決于所用的微生物，細(xì)胞中與反應(yīng)溶液中的滲透壓之差會(huì)造成細(xì)胞破裂，從而降低微生物充當(dāng)有效生物催化劑的能力，而且由于胞內(nèi)物質(zhì)現(xiàn)作為污染物存在于反應(yīng)混合物中，這是完全不希望的。
因此希望提供某種方法和某種微生物形式的生物催化劑，來(lái)克服所有這些問(wèn)題的。特別希望提供產(chǎn)率高而又無(wú)不需要副產(chǎn)物的方法，其中可從相應(yīng)酰胺制備烯鍵式不飽和羧酸及其銨鹽，從相應(yīng)腈制備烯鍵式不飽和酰胺。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，我們提供生產(chǎn)烯鍵式不飽和酰胺的方法，其中在含水介質(zhì)中用腈水合酶處理腈，所述方法的特征在于所述腈水合酶可獲自迪茨菌屬微生物。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，我們提供生產(chǎn)烯鍵式不飽和羧酸的銨鹽的方法，其中在含水介質(zhì)中用酰胺酶處理酰胺，所述方法的特征在于所述酰胺酶可獲自迪茨菌屬微生物。
我們意想不到地發(fā)現(xiàn)，迪茨菌屬微生物能夠產(chǎn)生適合在工業(yè)規(guī)模上將烯鍵式不飽和腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)酰胺和羧酸的特異性腈水合酶和酰胺酶。
迪茨菌屬微生物可在堿性pH例如pH 9-10下培養(yǎng)，這有利于改善發(fā)酵的無(wú)菌狀況。有利的是，我們現(xiàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵和生物處理過(guò)程可整合在一起，從而可在單個(gè)步驟中進(jìn)行。
此外，我們意想不到地發(fā)現(xiàn)，迪茨菌屬微生物顯示對(duì)高濃度不飽和羧酸的高耐受性，因此使得烯鍵式不飽和酰胺如丙烯酰胺能夠高濃度地轉(zhuǎn)化成羧酸如丙烯酸(為銨鹽)。通常認(rèn)為這樣高濃度的酸會(huì)造成細(xì)胞滲漏，使得細(xì)胞不適合在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中重新使用。還有可能使用迪茨菌屬微生物及從中產(chǎn)生的腈水合酶來(lái)生產(chǎn)高濃度的丙烯酰胺。在這個(gè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)中，可用兩步方法從相應(yīng)的腈制備烯鍵式不飽和羧酸，所述兩步方法包括第一階段用迪茨菌屬的腈水合酶將腈水合成相應(yīng)的酰胺和第二階段用迪茨菌屬產(chǎn)生的酰胺酶將酰胺轉(zhuǎn)化成羧酸。
優(yōu)選烯鍵式不飽和腈是(甲基)丙烯腈，烯鍵式不飽和酰胺是(甲基)丙烯酰胺，烯鍵式不飽和羧酸是(甲基)丙烯酸。
在每種情況下，均可從微生物中提取酶并直接用于反應(yīng)中。不過(guò)優(yōu)選酶包含在微生物的完整細(xì)胞中。
所述微生物可以是迪茨菌屬的任何種，但優(yōu)選的種是選自Dietzianatronolimnaios、海洋迪茨菌(Dietzia maris)和Dietzia psychralcaliphila的迪茨菌。
最優(yōu)選用以提供腈水合酶或酰胺酶的微生物是新的微生物——Dietzia natronolimnaios NCIMB 41165株。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，我們要求保護(hù)新微生物Dietzia natronolimnaios NCIMB 41165株。
可通過(guò)培養(yǎng)Dietzia natronolimnaios NCIMB 41165株分別獲得的腈水合酶和酰胺酶也是新的。以下給出有關(guān)NCIMB 41165株的詳細(xì)描述1.來(lái)源與保藏該株由我們從英國(guó)布拉德福(Bradford)的土壤中分離得到，并在2003年3月5日保藏于國(guó)家工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(theNational Collection of Industrial and Marine Bacteria，NCIMB)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約分配到檢索號(hào)NCIMB 41165。
2.形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征(1)多形生長(zhǎng)(2)運(yùn)動(dòng)性不運(yùn)動(dòng)(3)不產(chǎn)芽孢(4)革蘭氏陽(yáng)性(5)需氧(6)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上30℃下生長(zhǎng)48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生粉紅色圓形有光澤菌落(7)在堿性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)產(chǎn)生鮮紅色有光澤帶黏液質(zhì)地的菌落。
3.培養(yǎng)與腈水合酶合成本發(fā)明的迪茨菌屬細(xì)菌如Dietzia natronolimnaios可在適合于本發(fā)明目的的任何條件下培養(yǎng)，但最優(yōu)選在堿性且還可含有高水平鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基的實(shí)例在公開的實(shí)施例中顯示。
此外，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中應(yīng)包括合適的腈水合酶或酰胺酶誘導(dǎo)物。這些誘導(dǎo)物可以是腈如乙腈、丙腈、異丁腈或丙烯腈，或者是酰胺如乙酰胺、丙酰胺、異丁酰胺或丙烯酰胺。具體到針對(duì)酰胺形成的腈水合酶活性，尿素可用作酶誘導(dǎo)物。
以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1A)從土壤分離Dietzia natronolimnaios NCIMB 41165，使其生長(zhǎng)于裝有含以下成分(g/L)的400mL培養(yǎng)基的2L帶擋板三角燒瓶中磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；葡萄糖10.0；酵母膏3.0；蛋白胨5.0；七水硫酸鎂0.5；尿素5.0；六水氯化鈷0.01；自來(lái)水定容至1L。培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.2。培養(yǎng)物在28℃下生長(zhǎng)5天。離心收獲菌體，在-20℃下貯藏。
B)按(A)所述使Dietzia natronolimnaios NCIMB 41165生長(zhǎng)，但培養(yǎng)基中排除尿素，加入5g/L的乙腈。
C)按(A)所述使Dietzia natronolimnaios NCIMB 41165生長(zhǎng)，但培養(yǎng)基中排除尿素，加入5g/L的異丁腈。
D)將(A)的一部分菌體解凍并懸浮于50mM pH 7磷酸鈉緩沖液(20mL)中。懸浮液在15℃下孵育10分鐘。將丙烯腈(0.247mL)加入到細(xì)胞懸浮液中，振搖所得混合物。立即移取樣品(0.3mL)并將其加入到8.8％o-磷酸的溶液(0.3mL)中。離心除去細(xì)胞。用HPLC分析上清液中丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸銨的存在。反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。細(xì)胞的腈水合酶比活性為44,170微摩爾/分鐘/克細(xì)胞干重。
按(D)所述處理(B)的一部分菌體。細(xì)胞的腈水合酶比活性為11,060微摩爾/分鐘/克細(xì)胞干重。
E)按(D)所述處理(C)的一部分菌體。細(xì)胞的腈水合酶比活性為1150微摩爾/分鐘/克細(xì)胞干重。
實(shí)施例2A)使Dietzia natronolimnaios NCIMB 41165在以下培養(yǎng)基(單位g/L)中在28℃下生長(zhǎng)4天磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；蛋白胨5.0；酵母膏5.0；葡萄糖10；尿素5.0；七水硫酸鎂0.5；氯化鈷0.01。將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.2。
B)將一部分收獲的細(xì)胞重懸于50mM pH 7.0磷酸鈉緩沖溶液中。向細(xì)胞懸浮液中加入大約1％的丙烯腈(w/w)，然后在15℃下孵育20分鐘。20分鐘后，丙烯腈轉(zhuǎn)化成0.79％的丙烯酰胺和0.57％的丙烯酸銨。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)烯鍵式不飽和酰胺的方法，其中在含水介質(zhì)中用腈水合酶處理腈，所述方法的特征在于所述腈水合酶可獲自迪茨菌屬微生物。
2.一種生產(chǎn)烯鍵式不飽和羧酸的銨鹽的方法，其中在含水介質(zhì)中用酰胺酶處理酰胺，所述方法的特征在于所述酰胺酶可獲自迪茨菌屬微生物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中烯鍵式不飽和腈是(甲基)丙烯腈。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中烯鍵式不飽和酰胺是(甲基)丙烯酰胺。
5.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的方法，其中烯鍵式不飽和羧酸是(甲基)丙烯酸。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述酶包含在微生物的完整細(xì)胞中。
7.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是選自迪茨菌(Dietzia spp.)、Dietzia natronolimnaios、海洋迪茨菌(Dietzia maris)和Dietzia psychralcaliphila的迪茨菌種。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是Dietzianatronolimnaios NCIMB 41165株。
9.Dietzia natronolimnaios NCIMB 41165株。
10.一種腈水合酶，所述酶可通過(guò)培養(yǎng)Dietzia natronolimnaiosNCIMB 41165株獲得。
11.一種酰胺酶，所述酶可通過(guò)培養(yǎng)Dietzia natronolimnaiosNCIMB 41165株獲得。
全文摘要
分別通過(guò)腈水合酶的作用從腈生產(chǎn)酰胺或通過(guò)酰胺酶的作用從酰胺生產(chǎn)烯鍵式不飽和羧酸的銨鹽的方法，其中所述酶類可獲自迪茨菌屬微生物。
文檔編號(hào)C12P7/40GK1886501SQ200480035497
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月2日
發(fā)明者J·胡赫斯, Y·阿米塔格 申請(qǐng)人:西巴特殊化學(xué)水處理有限公司