專利名稱：酰胺的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用能夠產(chǎn)生腈水合酶的微生物作為生物催化劑從相應(yīng)腈制造酰胺的方法。
已經(jīng)熟知采用生物催化劑例如含有酶的微生物進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。已知腈水合酶直接催化腈的水合作用而生成相應(yīng)酰胺。典型的腈水合酶可通過多種微生物產(chǎn)生，例如芽胞桿菌屬(Bacillus)、無芽胞桿菌屬(Bacteridium)、微球菌屬(Micrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、檸檬酸細(xì)菌屬(Citrobacter)、無色桿菌屬(Achromobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、假諾卡菌屬(Pseudonocardia)及紅球菌屬(Rhodococcus)微生物。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高效產(chǎn)生腈水合酶的紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)種的多種菌株。EP-0 307 926描述了紫紅紅球菌，尤其是菌株J1在含有鈷離子的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)?？墒褂秒嫠厦笇㈦嫠蠟轷０罚姨貏e的將3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化為尼克酰胺。商業(yè)上使用紫紅紅球菌J1自丙烯腈制造丙烯酰胺單體且Nagasawa和Yamada在Pure Appl.Chem.671241-1256(1995)中描述了這種方法。EP-A-0362829描述了包含至少一種脲和鈷離子的紫紅紅球菌物種的細(xì)菌培養(yǎng)的方法，用于制備具有腈水合酶活性的紫紅紅球菌細(xì)胞。特別描述的是紫紅紅球菌J1。
Leonova等，Appl Biochem.Biochem.88231-241(2000)題目為，“Nitrile Hydratase of Rhodococcus”，描述了在紫紅紅球菌M8中腈水合酶的生長及合成。在培養(yǎng)基中通過脲誘導(dǎo)這種菌株的腈水合酶合成，脲也用作這種生物生長的氮源。鈷也是高腈水合酶活性所必需的。這篇文獻(xiàn)大體上著眼于誘導(dǎo)及代謝效應(yīng)。
Leonova等Appl.Biochem.Biotechnol.88231-241(2000)也說明了在俄國使用紫紅紅球菌M8生產(chǎn)商用丙烯酰胺。俄國專利1731814描述了紫紅紅球菌菌株M8。
在US-A-5827699中描述了不需要誘導(dǎo)物例如脲生產(chǎn)腈水合酶的紫紅紅球菌菌株M33。此微生物的菌株為紫紅紅球菌M8的衍生物。
觀察到使用生物催化劑的主要缺點(diǎn)是在保存、運(yùn)輸和使用期間用濕微生物材料(wet microbial material)通常缺乏穩(wěn)定性。即使相對穩(wěn)定的酶和細(xì)菌例如紅球菌細(xì)胞中的腈水合酶，使用前變質(zhì)的可能性使工業(yè)中需要用一些方法處理生物催化劑細(xì)胞懸液，例如通過冰凍或冷凍干燥水混合液或可選擇的固定細(xì)胞于多聚體基質(zhì)中。為了達(dá)到生物催化劑的最大生產(chǎn)率，在其制備期間和使用前的保存期間保持最大生物催化活性是重要的。在Chaplin和Bucke(1990)的Enzyme Technology，Cambridge University Press出版，第47頁(Enzyme preparation and use)中，認(rèn)為加熱、蛋白酶解、非最適的pH、氧化變性劑及不可逆抑制劑可導(dǎo)致酶失活。許多物質(zhì)可導(dǎo)致酶催化反應(yīng)能力的比率降低。這些物質(zhì)包括非特異性蛋白質(zhì)變性劑，例如脲。
對于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，Willem JH van Berkel，WageningenUniversity，提出了值得考慮的可導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活或解折疊的因素，且這些因素包括蛋白酶、由于氧或氧自由基的存在所致氧化及變性劑例如脲導(dǎo)致的不可逆解折疊。
Chaplin and Bucke(1990)在Enzyme Technology，CambridgeUniversity Press出版，第73頁(Enzyme preparation and use)中揭示了關(guān)于保存酶活性的關(guān)鍵因素涉及維護(hù)酶結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。因此認(rèn)為重要的是避免共價(jià)結(jié)構(gòu)中解折疊、聚集和改變。考慮3種方法達(dá)到這一點(diǎn)(1)使用添加劑；(2)共價(jià)修飾的控制使用；和(3)酶的固定化。
EP-B-0-243-967描述了通過向酶的溶液或混懸液加入選自腈、酰胺和有機(jī)酸及其鹽的穩(wěn)定化合物，或者通過酶的固定化形式從而保存腈水解酶的腈水合活性。在說明書中該文清楚的敘述了雖然能夠產(chǎn)生水合腈例如丙烯腈生成相應(yīng)酰胺例如丙烯酰胺的腈水解酶的微生物溶液或混懸液只要保存期短可在室溫下保存，但是優(yōu)選在低溫下保存，尤其在接近0℃下保存。在EP-A-0 707 061中描述了向含有微生物細(xì)胞懸浮液或固定化的微生物細(xì)胞的水性培養(yǎng)基中加入濃度在100mM至飽和濃度之間的無機(jī)鹽維持細(xì)胞和酶活性更長一段時(shí)間。描述這種技術(shù)用來保存具有腈水合酶或腈水解酶活性的微生物細(xì)胞。在US-B-6,368,804中描述了向具有腈水解酶活性的微生物細(xì)胞水溶液或未固定化的微生物細(xì)胞加入碳酸氫鹽或碳酸鹽。固定化經(jīng)常涉及將酶固定在基質(zhì)前自完整細(xì)胞分離酶。然而，雖然這種固定化作用對酶提供了非常好的保護(hù)，但是自完整細(xì)胞抽提酶是一個(gè)復(fù)雜的步驟，其可以是費(fèi)時(shí)的、昂貴的并可造成酶的損失。另外，整個(gè)微生物細(xì)胞可被固定。US-A-5,567,608提供了在陽離子共聚物中固定整個(gè)細(xì)胞生物催化劑的方法，其具有良好的保存穩(wěn)定性且防止腐敗。
紫紅紅球菌商業(yè)上用于制造丙烯酰胺單體，將其固定使(a)允許運(yùn)輸且(b)提高使用中生物催化壽命。在US-A-5,567,608中發(fā)明人敘述了在工業(yè)規(guī)模上常規(guī)固定生物催化劑使自生物催化劑容易自反應(yīng)產(chǎn)物分離，避免從生物催化劑洗脫入產(chǎn)物的雜質(zhì)，及有助于連續(xù)過程和生物催化劑回收再用。然而，固定化是需要額外的移植步驟并可能使用許多其他原料例如海藻酸鹽、角叉藻聚糖、丙烯酰胺和其他丙烯酸酯單體，及乙烯醇。因此，這是一種昂貴的處理步驟。
已經(jīng)提出了其他各種方法，試圖降低在化學(xué)反應(yīng)過程中負(fù)面影響而使酶失活的有害作用降到最低。
US-A-6,043,061中顯示在反應(yīng)混合物中降低氫氰酸濃度可抑制腈水合酶的失活。
也已經(jīng)知道為保護(hù)長時(shí)間保存的酶的活性而凍干生物催化劑。但這又是一種潛在的昂貴的方法，所以其通常在小規(guī)模制備生物催化劑中采用。在液氮中或在液氮的氣相中深低溫保藏也能長期保存微生物細(xì)胞但是需要不斷供應(yīng)液氮。
用作生物催化劑的微生物的生長可發(fā)生在幾天時(shí)間內(nèi)。在這段時(shí)間微生物活躍生長且通過給予適當(dāng)營養(yǎng)素及維持適于生長的溫度和pH和如有需要供應(yīng)氧微生物保持在生長狀態(tài)。
營養(yǎng)素的耗盡或有毒的代謝產(chǎn)物的蓄積限制微生物的正常生長且降低生長速率。通過給予適當(dāng)營養(yǎng)素及維持適于生長的溫度和pH和如有需要供應(yīng)氧使微生物維持生長。
有些例子中以完整微生物細(xì)胞形式的生物催化劑的生長期已經(jīng)停止，但是為使其成為活性生物催化劑需要繼續(xù)的新陳代謝，例如出現(xiàn)用于生物催化劑反應(yīng)的輔助因子的再生。在這些情況下要給予生物催化劑化合物以維持新陳代謝。
然而，如果例如產(chǎn)生腈水合酶的生物催化劑不繼續(xù)生長一段時(shí)間甚至幾天而保存，則正常的要自發(fā)酵液分離微生物細(xì)胞，無論其是需要作為催化劑的細(xì)胞內(nèi)的酶，還是將酶分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)。這樣就防止在發(fā)酵培養(yǎng)基中微生物生長所致的液體培養(yǎng)基的腐敗(putrefaction)且降低可導(dǎo)致所需酶破壞的蛋白酶的活性。因此通常使發(fā)酵液自身防腐或分離細(xì)胞以防止通過外源生物活性例如微生物污染的生物催化劑的降解。如果不如此操作，生物催化劑的活性預(yù)期會在非常短的時(shí)間內(nèi)例如在一天內(nèi)且必定少于2天就會下降。在生物催化劑保存期間，甚至達(dá)一周的時(shí)間保護(hù)活性的方法通常包括自發(fā)酵液分離生物催化劑和/或?qū)⑸锎呋瘎┕潭ㄔ谶m當(dāng)?shù)幕|(zhì)和/或使用穩(wěn)定化物質(zhì)穩(wěn)定，然后在反應(yīng)混合物中穩(wěn)定化物質(zhì)或者會成為污染物并且可成為進(jìn)一步的下游問題，或者在作為生物催化劑使用前需要另外的處理步驟自微生物細(xì)胞除去。
生物催化劑沒有做這種防腐處理，當(dāng)在室溫保存時(shí)將失去活性直到不再有效甚至不適于催化反應(yīng)。
需要提供一種腈生物轉(zhuǎn)化為酰胺的簡化方法。另外需要在用來制造酰胺前保存微生物而不顯著喪失活性的方法，且避免為達(dá)到穩(wěn)定保存通常采用的另外處理步驟。也需要避免在室溫保存時(shí)微生物的腐敗。
根據(jù)本發(fā)明，我們提供了一種從相應(yīng)腈制備酰胺的方法，包括下列步驟，i)提供一種能夠生成腈水合酶生物催化劑的微生物，ii)在適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，iii)貯存該微生物，iv)使微生物在水性培養(yǎng)基中接觸腈并將腈轉(zhuǎn)化為酰胺，其中微生物作為非活躍生長的游離細(xì)胞貯存在包含水的貯存培養(yǎng)基中。
貯存的微生物可作為完整的微生物細(xì)胞存在，且可以是從發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基或生長培養(yǎng)基)回收的細(xì)胞糊狀物(cell paste)的形式。
進(jìn)一步的，微生物可自菌種生長培養(yǎng)基回收且然后以微生物細(xì)胞水懸浮液保存在懸浮介質(zhì)(suspending medium)中。例如可以使用適當(dāng)?shù)膽腋〗橘|(zhì)例如水、生理鹽水溶液、適當(dāng)?shù)膒H緩沖液例如磷酸鹽，或者含有發(fā)酵培養(yǎng)基的組分和/或微生物生長產(chǎn)物的發(fā)酵液制備微生物細(xì)胞的水性懸浮液。
優(yōu)選的，微生物不從最初發(fā)酵培養(yǎng)基中回收且不用另外下游處理步驟保存，例如使用例如離心或過濾回收微生物。
微生物細(xì)胞可看作非活躍生長培養(yǎng)物。我們以此指其中保存的微生物預(yù)期沒有促進(jìn)生長的培養(yǎng)基和貯存條件。例如貯存培養(yǎng)基可為自發(fā)酵培養(yǎng)基回收的微生物細(xì)胞、水、生理鹽水、適當(dāng)?shù)木彌_液例如磷酸鹽緩沖液或任何其他類似緩沖液或生長培養(yǎng)基，通過測定生長速率或生物量濃度或氧消耗量或營養(yǎng)素消耗量或其他在監(jiān)測微生物生長與代謝中通常使用的測定形式，其中在微生物細(xì)胞中新陳代謝基本上為零。
組合物或貯存培養(yǎng)基可包含任何殘留發(fā)酵液組分。發(fā)酵液可包括用作培養(yǎng)微生物任何典型的成分且也包括微生物產(chǎn)生的產(chǎn)物和副產(chǎn)物。發(fā)酵液的典型組分包括糖、多糖、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、氮源、無機(jī)鹽、維生素、生長調(diào)節(jié)劑及酶誘導(dǎo)劑。尤其可包括糖中的單糖或二糖；銨鹽或其他氮源；無機(jī)鹽例如磷酸鹽、硫酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鈉鹽及鉀鹽；金屬化合物；維生素；及復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)基組分例如玉米漿；蛋白胨；酵母提取物；可用于特定微生物生長需要的有機(jī)化合物或無機(jī)化合物；特定的酶誘導(dǎo)劑(例如用來誘導(dǎo)一些微生物的腈水合酶的脲)；和有機(jī)酸例如檸檬酸鹽或丙酮酸鹽；及可用來確保微生物成功培養(yǎng)的任何其他有機(jī)化合物或無機(jī)化合物。
通常如果微生物例如產(chǎn)生腈水合酶的微生物不繼續(xù)生長而貯存一段時(shí)間，甚至幾天，正常的應(yīng)自發(fā)酵液分離微生物細(xì)胞，無論是需要作為催化劑的細(xì)胞還是自細(xì)胞或發(fā)酵培養(yǎng)基回收的酶。這樣是為了防止在發(fā)酵液中微生物生長導(dǎo)致液體培養(yǎng)基腐敗且降低可導(dǎo)致所需酶破壞的蛋白酶活性。因此通常保存發(fā)酵液自身或分離細(xì)胞以防止生物催化劑通過外源生物活性例如微生物污染而降解。如果不采用這種方法，生物催化劑活性預(yù)期通?？稍诜浅６痰臅r(shí)間例如一天內(nèi)及必定少于兩天內(nèi)降低。
在文中描述的貯存方法應(yīng)有效的增進(jìn)穩(wěn)定性使生物催化劑可容易的使用而活性沒有任何顯著降低。不需要使用例如固定化作用、添加穩(wěn)定化合物、冷凍干燥方法達(dá)到保存穩(wěn)定性。不需要分離任何發(fā)酵液組分例如脲或脲衍生物，即使已知脲為蛋白質(zhì)減活化劑，可達(dá)到保存穩(wěn)定性。
組合物或貯存方法中使用的環(huán)境可含有氧或可為基本上無氧。無氧，我們指氧的濃度應(yīng)低于1％溶解氧濃度。可通過任何常規(guī)除氧方法自發(fā)酵液除去氧。這些方法包括用惰性氣體換氣一段時(shí)間，清除貯存容器中任何頂部空間，在減壓下貯存或添加已知除氧劑例如抗壞血酸或肼和酰肼。
預(yù)期貯存2天后及尤其數(shù)天后腈水合酶活性將喪失一些。甚至在無氧時(shí)也有降低。尤其在殘留發(fā)酵液組分例如脲存在下，0℃以上溫度下也會降低。這是因?yàn)樯锎呋瘎┲械鞍酌缚善茐募?xì)胞中其他蛋白質(zhì)，包括腈水合酶。然而，本生物催化劑沒有預(yù)期缺點(diǎn)因此腈水合酶活性沒有顯著喪失。
相反我們發(fā)現(xiàn)在貯存期間包含腈水合酶的生物催化劑的活性實(shí)際上提高了。這樣在本發(fā)明的另一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明貯存方法通過將生物催化劑貯存在貯存培養(yǎng)基中，我們提供了一種提高能夠產(chǎn)生腈水合酶的生物催化劑的腈水合酶活性的方法。因此，由于其活性增加本方法可產(chǎn)生新型組合物。因此，生物催化劑組合物中，尤其在生物催化劑貯存期間形成的的腈水合酶是新型的的腈水合酶。同樣在貯存期間生物催化劑不產(chǎn)生與腐敗有關(guān)的不良?xì)馕丁?br> 優(yōu)選的保存方法使生物催化劑保存至少兩天且更優(yōu)選一周或幾周。特別的生物催化劑可保存3-28天，例如3-14天。
通過包括在發(fā)酵混合物中脲或脲衍生物可存在于生物催化劑組合物中。在本發(fā)明的一種形式中，組合物或含有催化劑的貯存介質(zhì)可為脫氧的且含有發(fā)酵液組分例如脲。生物催化劑是所需的能夠產(chǎn)生腈水合酶的微生物。例如其可選自芽胞桿菌屬(Bacillus)、無芽胞桿菌屬(Bacteridium)、微球菌屬(Micrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、檸檬酸細(xì)菌屬(Citrobacter)、無色桿菌屬(Achromobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、假諾卡菌屬(Pseudonocardia)及紅球菌屬(Rhodococcus)微生物。該生物催化劑尤其是紅球菌屬微生物，優(yōu)選紫紅紅球菌種。在我們的指定案例參考號數(shù)(reference number)為BT/3-2235/P1的UK專利申請0327907.2中描述并要求保護(hù)了一種特別適當(dāng)?shù)纳锎呋瘎┦亲霞t紅球菌粉紅色菌株NCIMB 41164。
紫紅紅球菌菌株NCIMB 411641.起源和保藏我們在Bradford，England，自土壤分離菌株NCIMB 41164，并在2003年3月5日保藏于國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(National Collection of Industrial and Marine Bacteria)(NCIMB)，在Budapest Treaty下指定其檢索號為NCIMB 41164。
2.形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征(1)多態(tài)生長(2)運(yùn)動(dòng)性不能游動(dòng)的(3)非產(chǎn)芽孢菌(4)革蘭氏染色陽性(5)需氧(6)30℃下在營養(yǎng)瓊脂上生長48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)淡紅色圓形菌落本發(fā)明這個(gè)方面的特別優(yōu)勢的特色為不再需要自其培養(yǎng)的發(fā)酵混合物分離生物催化劑。由于不需要另外的處理步驟，這點(diǎn)具有重要價(jià)值。因此然后保存的組合物可包含發(fā)酵混合物。在保存生物催化劑的方法中，我們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵混合物的存在對酶活性沒有任何不利影響。然后立即使用發(fā)酵液催化反應(yīng)物，或保存幾天或甚至幾周并無不利影響，同時(shí)也進(jìn)行幾天的生物轉(zhuǎn)化步驟，這樣就保證了輕易可得到的生物催化劑的連續(xù)供應(yīng)而不需要另外的處理步驟，從而簡化了生物轉(zhuǎn)化步驟且降低了其費(fèi)用。
生物催化劑可在其凝固點(diǎn)以上溫度下方便地保存。典型的生物催化劑可保存在室溫下，例如高達(dá)30℃或40℃。但是，本方法的優(yōu)勢是生物催化劑可在室溫并沒有任何特別的監(jiān)測和控制溫度的預(yù)防措施下保存。優(yōu)選生物催化劑在溫度為4℃至30℃或40℃之間保存，更優(yōu)選在5℃至25℃之間，例如10℃至25℃之間且尤其在15℃至25℃之間。
根據(jù)本發(fā)明，可在含有氧的環(huán)境中保存或在無氧環(huán)境中保存生物催化劑。在起始腈的轉(zhuǎn)化前可含有或不含有殘留的發(fā)酵液。這可以是由于保存的微生物有發(fā)酵液組分，生物催化劑的保存與其一致。
如上所述，生物催化劑不需要自制備生物催化劑的發(fā)酵混合物分離。根據(jù)本發(fā)明，保存生物催化劑的環(huán)境也含有發(fā)酵液的組分。因此，含有發(fā)酵液組分的生物催化劑組合物可與腈結(jié)合，然后腈水合成相應(yīng)酰胺。我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，與以前的認(rèn)識例如在US-A-5,567,608中敘述的優(yōu)選固定生物催化劑以防止雜質(zhì)自生物催化劑洗脫入反應(yīng)產(chǎn)物中相反，在反應(yīng)混合物中包括發(fā)酵液不影響終產(chǎn)物的質(zhì)量且在我們的共同申請(co-filed)UK申請0327901.5描述了這個(gè)方面，案號(case number)為BT/3-22349/P1。
發(fā)酵混合物將包含使微生物生長及持續(xù)的主要成分。通?；旌衔镏辽俸刑荚础⒌春透鞣N營養(yǎng)素。這可包括單糖例如葡萄糖或其他糖或二糖或多糖，銨鹽，復(fù)合培養(yǎng)基組分例如酵母提取物和蛋白胨、氨基酸、維生素、磷酸鹽、鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽及鈣鹽，微量元素例如鐵、鈷、錳、銅、鋅等。這些成分及其他成分可以適于特定微生物的濃度包括在發(fā)酵混合物中。已知在生物催化劑生產(chǎn)中發(fā)酵可能變化且可在不同培養(yǎng)階段使用發(fā)酵液，因此在以此方法生產(chǎn)后能夠保存生物催化劑是重要的。
我們發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)延長時(shí)間內(nèi)生物催化劑的活性并未顯著降低。因此生物催化劑較少可被替代。優(yōu)選使用生物催化劑至少2天且超過這個(gè)時(shí)間基本上不損失活性。
通常使用腈水合酶催化的反應(yīng)能使腈一步轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺。當(dāng)腈是丙烯腈和酰胺是丙烯酰胺時(shí)這種方法特別有用。最好是用單批生物催化劑進(jìn)行該轉(zhuǎn)化步驟數(shù)次，經(jīng)過幾天時(shí)間移去部分以完成數(shù)次腈轉(zhuǎn)化為酰胺的反應(yīng)。因此，重要的是能夠?qū)Υ呋瘎o害的盡可能廉價(jià)的保存此生物催化劑，同時(shí)生物轉(zhuǎn)化步驟同時(shí)進(jìn)行。因此實(shí)際上一批生物催化劑可保存用來準(zhǔn)備生產(chǎn)幾批產(chǎn)物例如丙烯酰胺。此處幾批可為5-10批或更多，甚至15-20批。
下列實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明。
實(shí)施例1在含有180L培養(yǎng)基的280L發(fā)酵罐中培養(yǎng)紫紅紅球菌NCIMB41164，培養(yǎng)基含有下列組分(g/L)磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；葡萄糖1.0；酵母提取物3.0；硫酸鎂七水合物0.5；氯化鈷六水合物0.01；脲5.0。培養(yǎng)基的pH調(diào)整到pH 7.2。培養(yǎng)物生長3天。
25L的發(fā)酵液在室溫下保存前用氮脫氣20分鐘，其在約5℃下保存3.5天。收獲15小時(shí)后在25℃下測定腈水合酶活性且發(fā)現(xiàn)其為242,000U/g。3天后在第一次丙烯酰胺生產(chǎn)試驗(yàn)前立即重測NH活性，發(fā)現(xiàn)其為293,000U/g。
實(shí)施例2在28℃、180rpm攪拌下、在培養(yǎng)基中，在2L錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)紫紅紅球菌NCIMB 41164 5天，培養(yǎng)基含有下列組分(g/L)磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；葡萄糖10.0；酵母提取物3.0；脲5.0；硫酸鎂七水合物0.5；氯化鈷六水合物0.01。使用離心法自一半液體培養(yǎng)基收獲細(xì)菌細(xì)胞。液體培養(yǎng)基分為兩部分，一半用氮脫氧10分鐘。液體培養(yǎng)基脫氧部分和含氧部分均在4℃、15℃及25℃下孵育1周。定時(shí)測定各部分的腈水合酶活性。
表1中顯示了腈水合酶測定的結(jié)果。結(jié)果以U/mg細(xì)胞干重表示。
表1
實(shí)施例3在28℃、180rpm攪拌下、在培養(yǎng)基中，在2L錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)紫紅紅球菌J1 5天，培養(yǎng)基含有下列組分(g/L)磷酸氫二鉀0.5；磷酸氫鉀0.5；葡萄糖20.0；蛋白胨5.0；酵母提取物1.0；脲7.5；硫酸鎂七水合物0.5；氯化鈷六水合物0.01。使用離心法自一半液體培養(yǎng)基收獲細(xì)菌細(xì)胞。液體培養(yǎng)基分為兩部分，一半用氮脫氧10分鐘。液體培養(yǎng)基脫氧部分和含氧部分均在4℃、15℃及25℃下孵育1周。定時(shí)測定各部分的腈水合酶活性。表2中顯示了測定結(jié)果。
表2
從實(shí)施例2和實(shí)施例3的結(jié)果均可發(fā)現(xiàn)生物催化劑可在室溫下有效保存。另外可發(fā)現(xiàn)與保存0天比較，腈水合酶活性升高。這點(diǎn)對紫紅紅球菌NCIMB 41164是最顯著的。
實(shí)施例4紫紅紅球菌NCIMB 41164的解凍細(xì)胞再懸浮于水中。測定超過1周的腈水合酶活性。表3中顯示了測定的相對腈水合酶活性。
表3
表3中結(jié)果顯示在1-7天孵育期期間在任何保存溫度下活性并未降低。
實(shí)施例5(1)在含有100mL培養(yǎng)基的0.5L帶有擋板的錐形瓶中培養(yǎng)紫紅紅球菌NCIMB 41164，培養(yǎng)基含有下列組分(g/L)磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；葡萄糖10.0；酵母提取物3.0；硫酸鎂七水合物0.5；脲5.0；氯化鈷六水合物0.01；飲用水到1L。培養(yǎng)基的pH調(diào)整到pH 7.2。培養(yǎng)物在30℃下培養(yǎng)4天。生長2、3及4天后在25℃下測定腈水合酶活性。
(2)(a)除用二甲基脲代替脲外在(1)中所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫紅紅球菌NCIMB 41164。
(b)除用乙基脲代替脲外在(1)中所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫紅紅球菌NCIMB 41164。
(c)除加入2.5脲和2.5g/l二甲基脲代替5g/l脲外在(1)中所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫紅紅球菌NCIMB 41164。
(d)除加入2.5脲和2.5g/l乙基脲代替5g/l脲外在(1)中所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫紅紅球菌NCIMB 41164。
表4中顯示了腈水合酶活性表權(quán)利要求
1.一種從相應(yīng)腈制備酰胺的方法，包括下列步驟，i)提供能夠產(chǎn)生腈水合酶生物催化劑的微生物，ii)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，iii)保存該微生物，iv)使所述微生物與所述腈在水性培養(yǎng)基中接觸從而將腈轉(zhuǎn)化為酰胺，其中所述微生物以非活躍生長的游離細(xì)胞形式保存在包含水的貯存培養(yǎng)基中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物從生長培養(yǎng)基中以包含完整微生物細(xì)胞的水性糊狀物的形式回收。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物從生長培養(yǎng)基回收且以微生物細(xì)胞的水性懸浮液形式保存在選自水、生理鹽水溶液、生理緩沖溶液和含有至少一種生長培養(yǎng)基組分的水溶液的懸浮介質(zhì)中。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物保留在生長培養(yǎng)基中。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述酰胺為烯式不飽和酰胺，優(yōu)選丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述生長培養(yǎng)基的組分包含在含有尿素或尿素衍生物的貯存培養(yǎng)基中。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物在貯存培養(yǎng)基凝固點(diǎn)以上的溫度下保存，優(yōu)選在0℃以上，更優(yōu)選在4℃-30℃之間。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物保存至少2天，優(yōu)選3-28天之間。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物為紅球菌屬微生物，優(yōu)選紫紅紅球菌種微生物。
10.權(quán)利要求1-98中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物為紫紅紅球菌NCIMB41164。
全文摘要
一種從相應(yīng)腈生成酰胺的方法，包括下列步驟，i)提供能夠生成腈水合酶生物催化劑的微生物，ii)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，iii)保存該微生物，iv)使所述微生物與所述腈在水性介質(zhì)中接觸從而將腈轉(zhuǎn)化為酰胺，其中所述微生物以非活躍生長游離細(xì)胞形式保存在包含水的貯存培養(yǎng)基中。保存的微生物可為完整微生物細(xì)胞，其可以是從發(fā)酵培養(yǎng)基回收的細(xì)胞糊狀物的形式；微生物細(xì)胞的水性懸浮液形式，用水、生理鹽水溶液、生理緩沖溶液和含有至少一種生長培養(yǎng)基組分的水溶液的懸浮介質(zhì)制備。例如如果保存至少2天，優(yōu)選3－28天之間，該微生物不表現(xiàn)出顯著的活性喪失。
文檔編號C12P13/02GK1886518SQ200480035499
公開日2006年12月27日 申請日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月2日
發(fā)明者Y·阿米塔格, J·S·庫拉爾 申請人:西巴特殊化學(xué)水處理有限公司