專利名稱：用于微生物的冷凍保護(hù)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于微生物的冷凍保護(hù)劑。
背景技術(shù)：
通常通過(guò)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)病原體，分離病原體或病原體的一部分或病原體的產(chǎn)物，并且采用該材料作為配制疫苗的免疫原而生產(chǎn)疫苗。含有完整病原體的疫苗包括全細(xì)胞百日咳疫苗和麻疹疫苗。含有病原體的部分的疫苗包括非細(xì)胞百日咳疫苗。含有病原體的產(chǎn)物的疫苗包括白喉和破傷風(fēng)疫苗。在可以用作疫苗之前，病原體、部分和產(chǎn)物可能需要通過(guò)例如化學(xué)處理而解毒。
產(chǎn)物用于生產(chǎn)疫苗的病原體的一個(gè)例子是白喉棒桿菌，其產(chǎn)物是白喉毒素。白喉是由白喉棒桿菌感染導(dǎo)致的威脅生命的疾病，白喉棒桿菌是革蘭氏陽(yáng)性、需氧、桿狀的細(xì)菌。該疾病是通過(guò)白喉棒桿菌的毒素生產(chǎn)菌株局部侵入鼻咽組織而導(dǎo)致的。該生物在覆蓋疼痛、出血和壞死性病變的堅(jiān)韌、纖維狀膜上生長(zhǎng)，所述病變可以位于扁桃體上或位于鼻咽區(qū)內(nèi)。在過(guò)去的典型流行病學(xué)中，該疾病的傳播是通過(guò)飛沫傳染。從白喉恢復(fù)的患者可能在其喉和鼻咽攜帶產(chǎn)毒細(xì)菌數(shù)周或數(shù)月，除非用抗生素進(jìn)行集中治療。
白喉的大多數(shù)臨床癥狀是由于從攜帶tox基因的棒桿菌原噬菌體產(chǎn)生的強(qiáng)白喉毒素。在原噬菌體感染白喉棒桿菌菌株和發(fā)生溶原化之后，菌株變得有毒力。用非毒性形式的白喉毒素(類毒素)進(jìn)行主動(dòng)免疫而誘導(dǎo)的毒素中和抗體(抗毒素)可以預(yù)防白喉。目前的免疫策略是利用通過(guò)甲醛處理將白喉毒素轉(zhuǎn)化為其無(wú)毒但具有抗原性的類毒素形式而制備的白喉疫苗。白喉類毒素在與其它疫苗成分的多種組合中使用，用于世界范圍的大量免疫。世界衛(wèi)生組織(WHO)最近估計(jì)每年世界范圍內(nèi)有大約100000病例和最多達(dá)8000例死亡是由于嬰兒的免疫低下、成人中對(duì)白喉的免疫減弱，和疫苗供應(yīng)不足。
白喉棒桿菌的Parke Williams 8(PW8)菌株的變體通常被用于生產(chǎn)外毒素，通過(guò)化學(xué)修飾從外毒素生產(chǎn)類毒素。概言之，具有氨基酸、痕量維生素、無(wú)機(jī)鹽和碳水化合物源如麥芽糖的培養(yǎng)基制劑促進(jìn)細(xì)菌的顯著生長(zhǎng)。不同的培養(yǎng)基，如酪蛋白的酸消化物和牛肉的酶消化物(胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)是用于生產(chǎn)毒素的合適培養(yǎng)基。在常規(guī)方法中，在含有動(dòng)物來(lái)源的蛋白材料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌。白喉生產(chǎn)中常用的培養(yǎng)基是NZ-Amine A型培養(yǎng)基，其含有酪蛋白消化物。在最優(yōu)條件下，采用Limes絮凝方法，用NZ-Amine A型培養(yǎng)基生產(chǎn)的毒素量是180Lf/mL。
在疫苗，如舉例的白喉疫苗中使用動(dòng)物來(lái)源的蛋白材料，會(huì)導(dǎo)致將不需要的污染物引入用所述培養(yǎng)基生產(chǎn)的白喉毒素中。
大多數(shù)工作人員致力于生產(chǎn)基本不含或除去了動(dòng)物成分的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)病原體，如白喉棒桿菌。還需要提供基本不含或缺乏動(dòng)物成分的種子培養(yǎng)物，特別是冷凍保護(hù)劑，用于培養(yǎng)病原體，如白喉棒桿菌。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于微生物的冷凍保護(hù)劑。
一方面，提供了用于微生物的凍干培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基基本不含動(dòng)物衍生的產(chǎn)物，并且包含酵母提取物和谷氨酸一鈉。所述凍干培養(yǎng)基可以包含約1-10％(w/v)谷氨酸一鈉和約1-10％(w/v)酵母提取物，如約5％(w/v)谷氨酸一鈉和約10％(w/v)酵母提取物。所述微生物可以是細(xì)菌，包括白喉棒桿菌的菌株。
在本發(fā)明的第二方面，提供了制備微生物的冷凍干燥的培養(yǎng)物的方法，包括以下步驟提供一定量的微生物，將所述量與凍干培養(yǎng)基混合以提供混合物，和對(duì)所述混合物進(jìn)行冷凍干燥，所述培養(yǎng)基基本不含動(dòng)物衍生的產(chǎn)物，并且包含酵母提取物和谷氨酸一鈉。所述凍干培養(yǎng)基可以包含約5％(w/v)谷氨酸一鈉和約10％(w/v)酵母提取物，如約5％(w/v)谷氨酸一鈉和約10％(w/v)酵母提取物。對(duì)所述混合物進(jìn)行冷凍干燥可以包括以下步驟使所述混合物達(dá)到大約-30℃的第一溫度，以提供冷卻的混合物，并且將所述冷卻的混合物維持在真空中一段時(shí)間，直到所述冷卻的混合物基本干燥，以提供干燥的混合物。合適的真空是大約120mT，合適的時(shí)間是大約10-大約12小時(shí)。將所述冷卻的混合物維持在真空中一段時(shí)間，直到所述冷卻的混合物基本干燥，以提供干燥的混合物的步驟可以包括將所述冷卻的混合物維持在真空中大約10-大約12小時(shí)的時(shí)間，并且將所述大約-30℃的溫度增加到大約+20℃的第二溫度。合適的真空是大約120mT。所述微生物可以是細(xì)菌，包括白喉棒桿菌的菌株。
也提供了冷凍干燥的凍干物(lyophile)，其中包含微生物的細(xì)胞和凍干培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基基本不含動(dòng)物衍生的產(chǎn)物，并且包含酵母提取物和谷氨酸一鈉。所述凍干培養(yǎng)基可以包含約1-10％(w/v)谷氨酸一鈉和約1-10％(w/v)酵母提取物，如約5％(w/v)谷氨酸一鈉和約10％(w/v)酵母提取物。所述微生物可以是細(xì)菌，包括白喉棒桿菌的菌株。
附圖簡(jiǎn)述從參考附圖的以下說(shuō)明，可以進(jìn)一步理解本發(fā)明，在附圖中

圖1顯示了流程圖，其中概括了白喉棒桿菌培養(yǎng)物的制備和凍干。
發(fā)明詳述概括白喉棒桿菌培養(yǎng)物的制備和凍干的流程圖示于圖1。將白喉棒桿菌菌株1M1514N3S的凍干物接種到含有PhytoneTM蛋白胨瓊脂的瓊脂板上，并且在36℃溫育43-48小時(shí)。PhytoneTM蛋白胨培養(yǎng)基的組成描述于下文表1-2。
表1.含有15g/L PhytoneTM的PhytoneTM蛋白胨培養(yǎng)基的組成
表2.生長(zhǎng)因子溶液的組成
表3.下文提供了制造商Difco Laboratories提供的PhytoneTM蛋白胨的典型分析
將培養(yǎng)物重懸于5mL PhytoneTM蛋白胨培養(yǎng)基，并且將1.5mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有90mL PhytoneTM蛋白胨培養(yǎng)基的第一搖瓶中，所述培養(yǎng)基含有0.9mL 1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和0.45mL 1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))。將培養(yǎng)物在36℃、200rpm溫育24小時(shí)。將5mL所述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有250mL PhytoneTM蛋白胨培養(yǎng)基的第二搖瓶培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)基含有2.5mL 1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和1.25mL 1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))。將培養(yǎng)物再在36℃溫育24-48小時(shí)。將10mL上述第二搖瓶培養(yǎng)物分配到5個(gè)50mL的無(wú)菌螺旋蓋離心管中，4℃下以6000xg離心10分鐘。
倒去上清液，將每個(gè)離心管的沉淀物重懸于5mL以下凍干培養(yǎng)基之一a)10％(w/v)脫脂乳(動(dòng)物對(duì)照)b)10％(w/v)酵母提取物c)10％(w/v)PhytoneTM蛋白胨d)5％(w/v)谷氨酸一鈉+10％(w/v)酵母提取物e)10％(w/v)PhytoneTM蛋白胨+10％(w/v)酵母提取物+0.25％(w/v)瓊脂將上述凍干培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物以0.25mL的量分配到1mL的玻璃管形瓶中，并且按下文的方法冷凍干燥。
冷凍干燥循環(huán)使產(chǎn)物溫度達(dá)到-30℃，并且在120mT的真空中保持該溫度大約10-12小時(shí)。10-12小時(shí)喉，增加產(chǎn)物溫度，在120mT的真空中保持在20℃。在真空下密封管形瓶，在4℃儲(chǔ)存。通過(guò)測(cè)量Columbia血瓊脂板上的菌落形成單位(CFU/mL)，分析冷凍干燥的培養(yǎng)物的生存力。
在冷凍干燥白喉棒桿菌菌株之前和之后獲得的CFU結(jié)果以列表形式示于表4、5、6和7。
表4脫脂乳和不含動(dòng)物成分的凍干培養(yǎng)基中白喉棒桿菌的冷凍干燥的培養(yǎng)物的CFU計(jì)數(shù)比較。在冷凍干燥白喉棒桿菌菌株之前的CFU計(jì)數(shù)是6.0×109CFU/mL。
表5作為時(shí)間的函數(shù)的脫脂乳和不含動(dòng)物成分的凍干培養(yǎng)基中白喉棒桿菌的冷凍干燥的培養(yǎng)物的CFU計(jì)數(shù)比較。(白喉棒桿菌菌株)
表6冷凍干燥后無(wú)動(dòng)物成分的凍干培養(yǎng)基的篩選和它們與動(dòng)物成分凍干培養(yǎng)基相比的各自的CFU計(jì)數(shù)
表7動(dòng)物成分和無(wú)動(dòng)物成分凍干培養(yǎng)基中白喉棒桿菌的冷凍干燥的培養(yǎng)物的CFU計(jì)數(shù)比較
如表4-7所示，對(duì)冷凍干燥最穩(wěn)定的混合物是酵母提取物(10％w/v)與谷氨酸一鈉(5％w/v)的混合物。
公開內(nèi)容概述在本公開內(nèi)容概述中，提供了用于微生物的凍干培養(yǎng)基及其用途，其中所述培養(yǎng)基基本不含動(dòng)物衍生的產(chǎn)物，并且包含酵母提取物和谷氨酸一鈉。在本發(fā)明的范圍中，可以進(jìn)行改動(dòng)。
權(quán)利要求
1.用于微生物的凍干培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基基本不含動(dòng)物衍生的產(chǎn)物，并且包含酵母提取物和谷氨酸一鈉。
2.權(quán)利要求1的凍干培養(yǎng)基，包含約1-10％(w/v)谷氨酸一鈉和約1-10％(w/v)酵母提取物。
3.權(quán)利要求2的凍干培養(yǎng)基，包含約5％(w/v)谷氨酸一鈉和約10％(w/v)酵母提取物。
4.權(quán)利要求1或2或3的凍干培養(yǎng)基，其中所述微生物是細(xì)菌的菌株。
5.權(quán)利要求4的凍干培養(yǎng)基，其中所述細(xì)菌的菌株是白喉棒桿菌。
6.制備微生物的冷凍干燥的培養(yǎng)物的方法，包括以下步驟提供一定量的微生物；將所述量與凍干培養(yǎng)基混合以提供混合物，其中培養(yǎng)基基本不含動(dòng)物衍生的產(chǎn)物，并且包含酵母提取物和谷氨酸一鈉；和對(duì)所述混合物進(jìn)行冷凍干燥。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述凍干培養(yǎng)基包含約5％(w/v)谷氨酸一鈉和約10％(w/v)酵母提取物。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述凍干培養(yǎng)基包含約1-10％(w/v)谷氨酸一鈉和約1-10％(w/v)酵母提取物。
9.權(quán)利要求6或7或8的方法，其中對(duì)所述混合物進(jìn)行冷凍干燥包括以下步驟(a)使所述混合物達(dá)到大約-30℃的第一溫度，以提供冷卻的混合物；(b)將所述冷卻的混合物維持在真空中一段時(shí)間，直到所述冷卻的混合物基本干燥，以提供干燥的混合物。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述的真空是大約120mT。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述時(shí)間是大約10-大約12小時(shí)。
12.權(quán)利要求7的方法，其中將所述冷卻的混合物維持在真空中一段時(shí)間，直到所述冷卻的混合物基本干燥，以提供干燥的混合物的步驟包括(a)將所述冷卻的混合物維持在真空中大約10-大約12小時(shí)的時(shí)間；(b)將所述大約-30℃的溫度增加到大約+20℃的第二溫度。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述真空是大約120mT。
14.權(quán)利要求6或7或8的方法，其中所述微生物是細(xì)菌的菌株。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)菌的菌株是白喉棒桿菌的菌株。
16.冷凍干燥的凍干物，其中包含微生物的細(xì)胞和凍干培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基基本不含動(dòng)物衍生的產(chǎn)物，并且包含酵母提取物和谷氨酸一鈉。
17.權(quán)利要求12的冷凍干燥的凍干物，其中所述培養(yǎng)基包含約1-10％(w/v)谷氨酸一鈉和約1-10％(w/v)酵母提取物。
18.權(quán)利要求13的冷凍干燥的凍干物，其中所述培養(yǎng)基包含約5％(w/v)谷氨酸一鈉和約10％(w/v)酵母提取物。
19.權(quán)利要求16或17或18的冷凍干燥的凍干物，其中所述微生物是細(xì)菌的菌株。
20.權(quán)利要求19的冷凍干燥的凍干物，其中所述細(xì)菌的菌株是白喉棒桿菌的菌株。
全文摘要
提供了用于微生物的凍干培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基基本不含動(dòng)物衍生的產(chǎn)物，并且包含酵母提取物和谷氨酸一鈉。凍干培養(yǎng)基可以用于對(duì)細(xì)菌，如白喉棒桿菌的菌株進(jìn)行冷凍保護(hù)。也提供了用凍干培養(yǎng)基和微生物的凍干物制備微生物的冷凍干燥的培養(yǎng)物的方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1898376SQ200480035957
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者T·李 申請(qǐng)人:圣諾菲·帕斯圖爾有限公司