專利名稱：結(jié)合測定組分的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及診斷學(xué)領(lǐng)域。更詳細(xì)的說，本發(fā)明涉及用于檢測分析物例如抗體或抗原的方法。本發(fā)明的檢測方法尤其適于醫(yī)學(xué)或其它疾病或疾病前(pre-condition)的診斷或風(fēng)險(xiǎn)分析，或用于確定感染狀態(tài)或免疫狀態(tài)。
先有技術(shù)的描述在說明書的結(jié)束部分也列出了本說明書的參考文獻(xiàn)詳細(xì)目錄。
在說明書中參考的任何先有技術(shù)不是且不應(yīng)被看作對(duì)這種先有技術(shù)在任何國家內(nèi)形成共有普通知識(shí)部分的承認(rèn)及任何形式的建議。
在研究、分析、開發(fā)及臨床上使用各種不同的測定方法檢測目標(biāo)分析物。免疫測定是一種利用抗體-抗原反應(yīng)的特異性、強(qiáng)度和多樣性分析樣品及檢測其中特定組分的特別有用的測定方法。
對(duì)特異性抗原的抗體的檢測已經(jīng)用于特定疾病狀態(tài)的診斷。例如，甲型肝炎病毒抗體的存在表明感染了甲型肝炎病毒且對(duì)該病毒的繼發(fā)感染可能具有免疫力。不同種類的抗體或免疫球蛋白的檢測也可提供關(guān)于疾病或患者免疫狀態(tài)的進(jìn)一步的信息。例如，可通過存在的IgM抗體區(qū)分當(dāng)前疾病狀態(tài)，同時(shí)通過檢測IgG抗體區(qū)分更久遠(yuǎn)的感染。
也已經(jīng)知道針對(duì)特異性抗原的抗體的檢測方法。例如，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)及放射免疫測定(RIA)是實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)使用的方法。這些方法通常需要具有一定水平的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員。也已經(jīng)開發(fā)了許多種幾乎不需要技巧且迅速完成的方法，且因此適于護(hù)理上(at the point of care)檢測特異性抗原的抗體。
在許多免疫測定中，需要形成含有特異性抗原連同可檢測標(biāo)記的綴合物。例如，病毒的抗原可與膠體金結(jié)合使得可以測定在裝置內(nèi)抗原-膠體金復(fù)合物和特異性抗體之間的免疫反應(yīng)性?？蛇x擇的，病毒的抗原可與酶例如辣根過氧化物酶結(jié)合，使得可以用ELISA測定抗原-酶復(fù)合物和特異性抗體之間的免疫反應(yīng)性。
然而，在膠體金或酶和目標(biāo)抗原之間結(jié)合的過程可導(dǎo)致抗原和要測定的抗體之間的免疫反應(yīng)性降低。具體說來，抗體結(jié)合位點(diǎn)可以是導(dǎo)致其難以接近抗體分子的結(jié)合到膠體金或酶的物理位點(diǎn)，或這種結(jié)合過程可轉(zhuǎn)變抗原構(gòu)象導(dǎo)致其不再被抗體分子識(shí)別。至少，抗原與膠體金或酶的結(jié)合可以為隨機(jī)趨向(random orientation)，這樣在診斷試驗(yàn)中僅有部分抗原分子可與患者的抗體反應(yīng)而給出可檢測的信號(hào)。
抗原的金或酶綴合物的制備需要使用高度純化的抗原以防止形成含有污染蛋白質(zhì)的金或酶綴合物，污染蛋白質(zhì)然后可與抗體反應(yīng)導(dǎo)致非特異性反應(yīng)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。用來廣泛純化抗原的方法增加了這種制備的費(fèi)用，也會(huì)導(dǎo)致抗原免疫活性的降低。
因此需要改良檢測分析物例如抗體或抗原的測定系統(tǒng)，使用結(jié)合有檢測標(biāo)記(bound detection markers)的分析物-結(jié)合分子，作為結(jié)果，其與檢測標(biāo)記的結(jié)合不會(huì)降低測定的靈敏度或特異性。
發(fā)明概述在本說明書中，除非另有說明，詞語“包含”或類似表述，例如“包含”(″comprises″)或“包含”(″comprising″)將理解為暗指包括所述元件或整體或元件群或整體群，但是不排除任何其它元件或整體或元件群或整體群。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種適于檢測樣品中目標(biāo)特異性分析物的檢測復(fù)合物。這種復(fù)合物包含通過橋連復(fù)合物間接連接到分析物結(jié)合配偶體的檢測標(biāo)記。這種排列有利于保護(hù)或增強(qiáng)在分析物結(jié)合配偶體上的分析物結(jié)合位點(diǎn)的可用性且因而增強(qiáng)了分析物的檢測。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種適于檢測樣品中目標(biāo)特異性抗體的檢測復(fù)合物。這種復(fù)合物包含間接與抗原組分連接的檢測標(biāo)記，其中抗原包含抗體識(shí)別的表位。為了保護(hù)這種抗原表位對(duì)抗體的可用性且因而便于檢測抗體，檢測標(biāo)記通過橋連復(fù)合物間接連接到抗原。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種使用橋連復(fù)合物檢測一種或多種抗體的方法，使用的橋連復(fù)合物包含多聚體分子、二聚體分子或嵌合分子或顆粒，它們各自包含抗原且通過使用抗體或蛋白結(jié)合分子、核酸結(jié)合分子、糖類結(jié)合分子或脂質(zhì)結(jié)合分子偶聯(lián)到檢測標(biāo)記。
本發(fā)明提供了一套結(jié)合配偶體，用于檢測分析物，尤其是保護(hù)或增強(qiáng)當(dāng)分析物結(jié)合配偶體連接到檢測標(biāo)記時(shí)分析物結(jié)合配偶體結(jié)合分析物的能力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測體系，使用保護(hù)或增強(qiáng)抗原表位結(jié)合抗體的可用性且因而便于其檢測的檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物檢測樣品中抗體。本發(fā)明復(fù)合物特別適于作為測定法、試劑盒及其它設(shè)備的一部分用于篩選化合物例如特異性抗體或抗原。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，抗原為肝炎病毒抗原且結(jié)合到肝炎病毒抗原的抗體為抗肝炎病毒抗體。
在一些實(shí)施方案中，肝炎病毒抗原為甲型肝炎病毒和/或乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒和/或戊型肝炎病毒。
雖然在檢測特異性抗體中使用特定的檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物描述本發(fā)明，但是本發(fā)明并不局限于此且擴(kuò)展到使用檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物檢測特異性分析物。術(shù)語“抗原”和“抗原多肽”包括半抗原及其它可產(chǎn)生抗體的分子。
為改良其敏感性和/或特異性，本檢測復(fù)合物可與廣泛的不同免疫測定法組合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，在暴露到檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物前將分析物固定在固體載體上。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物或復(fù)合物組分可貯存在試劑盒或設(shè)備的隔室(compartments)內(nèi)。檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物的組分可貯存在分離的位置(separate locations)或隔室內(nèi)。
試劑盒可包含可選擇的檢測標(biāo)記、橋連配偶體組分及分析物結(jié)合配偶體。
在一個(gè)方面，檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體排列且具有下列結(jié)構(gòu)M-X2+X1-A其中M為檢測標(biāo)記，間接連接到A從而形成檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物；A為分析物特異性識(shí)別的分析物結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方案中，A為帶有被檢測抗體特異性識(shí)別的表位的抗原。在一些實(shí)施方案中，A也結(jié)合到X2從而作為X2的一部分表達(dá)或者作為X2的一部分天然存在；X1及X2包含橋連結(jié)合配偶體，其在檢測標(biāo)記(M)和分析物結(jié)合配偶體(A)間形成橋連復(fù)合物且通過可逆非共價(jià)鍵(+)連接；X1包含第一橋連結(jié)合配偶體，所述橋連結(jié)合配偶體為顆粒、二聚體、多聚體、嵌合體或融合蛋白，其包含的一部分連接到X2而另一部分連接到或包含分析物結(jié)合配偶體(A)，且其中毗連的(-)是在第一橋連結(jié)合配偶體和分析物結(jié)合配偶體(A)之間的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵；顆粒是指病毒顆粒或病毒樣顆粒(viral like particle)。在一些實(shí)施方案中，X1包含的重組病毒樣顆粒包含蛋白質(zhì)分析物結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒得自鳥嗜肝DNA病毒且抗原作為L多肽的一部分表達(dá)。
X2包含連接、融合或以另外方式直接或間接連接到可檢測標(biāo)記(M)的第二橋連結(jié)合配偶體，且其中毗連的(-)是共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方案中，X2使用一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子例如抗體-抗體生物素-鏈霉抗生物素蛋白(strepavidin)或生物素-抗-生物素抗體對(duì)連接到可檢測標(biāo)記。
在一些實(shí)施方案中，X2為抗原結(jié)合分子、蛋白結(jié)合分子、核酸結(jié)合分子、糖類結(jié)合分子或脂質(zhì)結(jié)合分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X2為抗原-結(jié)合分子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，X2為抗體或其抗原結(jié)合片段。
在本排列中使用的分析物結(jié)合配偶體可為不同純度，因?yàn)樵谌魏位旌衔镏兄挥刑禺愋苑治鑫锝Y(jié)合配偶體會(huì)與檢測標(biāo)記形成復(fù)合物。例如，含有目標(biāo)抗原的整個(gè)細(xì)胞的溶解產(chǎn)物可用于形成復(fù)合物，且僅僅目標(biāo)抗原會(huì)被標(biāo)記。
檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物具有能夠定向使目標(biāo)分析物結(jié)合位點(diǎn)的可用性最大化的優(yōu)點(diǎn)。特別地，如果橋連復(fù)合物包含一個(gè)或多個(gè)抗體，則抗原可與檢測標(biāo)記在各方向均勻(uniformorientation)連接，進(jìn)一步使抗原表位與患者抗體結(jié)合的可用性最大化。
對(duì)于免疫測定，抗原可僅具有適于結(jié)合患者抗體的單一位點(diǎn)從而給出診斷試驗(yàn)結(jié)果。在這種情況下，檢測標(biāo)記與抗原的結(jié)合可妨礙或減少隨后的或同時(shí)發(fā)生的患者抗體與相同的抗原類的結(jié)合。本發(fā)明通過使用其中可得到兩個(gè)或多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)拷貝的多價(jià)體抗原或者其中目標(biāo)抗原和與膠體金-抗體綴合物結(jié)合的相同抗原內(nèi)的特殊抗原或特殊表位具有物理學(xué)上聯(lián)系的嵌合抗原解決了這個(gè)問題。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，檢測標(biāo)記可在任何時(shí)間連接到分析物結(jié)合配偶體，直到并且包括進(jìn)行測定時(shí)。
附圖簡述

圖1為顯示檢測標(biāo)記(膠體金)-抗原復(fù)合物的圖示，包含二聚體ORF2.1抗原，該抗原經(jīng)一個(gè)分子連接到與檢測標(biāo)記結(jié)合的抗體，二聚體中余下的第二分子與樣品抗體(IgM)相互作用。IgM固定在含有抗人IgM的條帶(strip)上。
圖2為顯示包含甲型肝炎病毒(HAV)顆粒(第一橋連結(jié)合配偶體)的檢測標(biāo)記(膠體金)抗原復(fù)合物的圖示，通過其多聚性質(zhì)也包含帶有被固定化IgM抗體及綴合到檢測標(biāo)記的單克隆抗-HAV抗體(第二橋連結(jié)合配偶體)識(shí)別表位的抗原。在限定條件例如病毒濃度及孵育時(shí)間下，每個(gè)病毒內(nèi)僅一個(gè)或幾個(gè)拷貝的表位將與結(jié)合到膠體金的單克隆抗體反應(yīng)，剩下病毒顆粒內(nèi)其余表位與患者抗體反應(yīng)。IgM固定在含有抗人IgM的條帶上。
圖3為顯示包含鴨乙型肝炎病毒(DHBV)(第一橋連結(jié)合配偶體)的病毒樣顆粒(VLP)的檢測標(biāo)記(膠體金)抗原復(fù)合物的圖示，包含帶有被固定化IgM患者抗體及綴合到檢測標(biāo)記的識(shí)別VLP S抗原上第二表位的單克隆抗-DHBV S抗原抗體(第二橋連結(jié)合配偶體)識(shí)別表位的抗原。綴合到膠體金(McAb 7c12)的單克隆抗體定向到VLP(S抗原)的DHBV部分中表位而不是分析物結(jié)合配偶體抗原，剩下VLP上抗原的拷貝與患者抗體反應(yīng)從而給出診斷試驗(yàn)中可見信號(hào)。IgM固定在含有抗人IgM的條帶上。
圖4為顯示包含鴨乙型肝炎病毒(DHBV)(第一橋連結(jié)合配偶體)的病毒樣顆粒(VLP)的檢測標(biāo)記(膠體金)抗原復(fù)合物的圖示，包含帶有被固定化IgM患者抗體及識(shí)別綴合到檢測標(biāo)記的分析物結(jié)合抗原上的相同表位的單克隆抗體(第二橋連結(jié)合配偶體)識(shí)別的表位的抗原。綴合到膠體金的單克隆抗體定向到分析物結(jié)合配偶體抗原，但是由于帶有表位拷貝的VLP的3-維結(jié)構(gòu)伸展在其表面，每個(gè)VLP內(nèi)僅一個(gè)或幾個(gè)拷貝的表位將與單克隆抗體反應(yīng)，剩下的VLP內(nèi)拷貝與患者抗體結(jié)合從而在診斷試驗(yàn)中給出可見信號(hào)。IgM固定在含有抗人IgM的條帶上。
圖5為顯示檢測標(biāo)記(膠體金)-抗原復(fù)合物的圖示，包含單價(jià)抗原經(jīng)一個(gè)表位與綴合到檢測標(biāo)記的抗體結(jié)合，剩下單體的第二表位與樣品抗體(IgM)相互作用。IgM固定在含有抗人IgM的條帶上。
圖6為顯示檢測標(biāo)記(膠體金)-抗原復(fù)合物的圖示，復(fù)合物中包含的嵌合重組融合蛋白包含融合到分析物結(jié)合抗原的甘露糖結(jié)合蛋白(第一橋連結(jié)合配偶體)，復(fù)合物中還包含綴合到膠體金的甘露糖結(jié)合蛋白的單克隆抗體(第二橋連結(jié)合配偶體)。由于單克隆抗體定向到MBP，完整分析物抗原與樣品抗體自由反應(yīng)。樣品抗體IgM固定在含有抗人IgM的條帶上。
圖7顯示檢測標(biāo)記(膠體金)-抗原復(fù)合物的圖示，復(fù)合物中包含的嵌合重組融合蛋白包含融合到分析物結(jié)合抗原的甘露糖結(jié)合蛋白(第一橋連結(jié)合配偶體)，復(fù)合物中還包含綴合到膠體金上的甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)的配體(第二橋連結(jié)合配偶體)。由于配體定向到MBP，完整分析物抗原與樣品抗體自由反應(yīng)。樣品抗體IgM固定在含有抗人IgM的條帶上。
圖8為顯示檢測對(duì)甲型肝炎的IgM抗體的圖示。特別地，檢測標(biāo)記(膠體金)通過橋連結(jié)合配偶體與分析物結(jié)合蛋白(HAV顆粒)連接且使用蛋白蛋白結(jié)合分子(生物素抗生物素抗體)連接檢測標(biāo)記和第二橋連結(jié)合配偶體(X2)。使用抗-HAV單克隆抗體結(jié)合能夠結(jié)合目標(biāo)抗體(甲型肝炎IgM抗體)的甲型肝炎病毒顆粒(一個(gè)包含顆?；蚨嗑垠w的X1的實(shí)例)。膠體金綴合到識(shí)別生物素化抗-HAV單克隆抗體的抗-生物素抗體上。在使用中，每個(gè)病毒顆粒內(nèi)僅有幾個(gè)拷貝的表位將和抗-HAV抗體反應(yīng)。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明提供了一個(gè)測定中用于檢測分析物的體系，且更詳細(xì)的說在免疫測定中檢測抗體。
本發(fā)明提供了用于檢測樣品中分析物的方法，此方法包括將樣品與檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物接觸，其中所述檢測標(biāo)記通過橋連復(fù)合物間接連接到分析物結(jié)合配偶體從而保護(hù)或增強(qiáng)對(duì)分析物的結(jié)合位點(diǎn)的可用性；且檢測此檢測標(biāo)記從而指示樣品中分析物的存在。
除非另有明確說明，本文中所用單數(shù)形式“一”和“該”包括復(fù)數(shù)方面。因此，例如所用的“抗體”包括單個(gè)抗體或一類抗體，也包括兩種或多種相同或不同特異性的抗體；所用的“樣品”包括兩種或多種樣品；等等。
使用本領(lǐng)域認(rèn)可的方法檢測本發(fā)明的檢測標(biāo)記-分析物復(fù)合物。
本文中所用“檢測”，其最廣泛的含義包括對(duì)分析物的存在進(jìn)行定性試驗(yàn)或定量試驗(yàn)測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到有許多測定方法適用于本發(fā)明復(fù)合物。色譜測定是特別成熟的，且有大量不同的色譜形式可用，根據(jù)常用試劑和設(shè)備以及在任何特定考察中所需的結(jié)果選擇適用的色譜形式。調(diào)節(jié)根據(jù)色譜原理的“快速”測定以滿足準(zhǔn)確、快速及方便使用的條件。本發(fā)明復(fù)合物特別適于使用免疫色譜設(shè)備。然而，帶有檢測標(biāo)記的本復(fù)合物也適于用各種格式分析。特別優(yōu)選且在Wild D“The Immunoassay Handbook”，NaturePublishing Group，2001中描述了免疫測定或基于酶的色譜測定，且通過參考美國專利號(hào)4,016,043、4,590,159、5,714,389、5,877,028、5,922,537、6,168,956及6,548,309結(jié)合到本文且經(jīng)參考公開資料而引用。為了免疫色譜測定，通過與同樣連接到檢測標(biāo)記的分析物的抗體凝集反應(yīng)檢測目標(biāo)分析物。類似的基于酶的測定使用酶反應(yīng)代替抗原-抗體反應(yīng)。在已公開的美國專利申請?zhí)?0010006821、20040087036及20040214347中描述了免疫色譜法的各種變化，其全部內(nèi)容已結(jié)合到本文中。在已結(jié)合到本文中公開的美國專利申請?zhí)?0030165970中描述了用于復(fù)合分析物分析的免疫金過濾方法。
已經(jīng)描述了許多“檢測標(biāo)記”且適于在本發(fā)明中使用?？筛鶕?jù)任何經(jīng)分析可鑒別的檢測復(fù)合物的標(biāo)記的物理或化學(xué)性質(zhì)檢測。因此這種標(biāo)記可為質(zhì)量標(biāo)記(mass tag)，其可為放射性的，或可通過顏色、光譜學(xué)或其磁性或其順磁性特征鑒別。在許多測定中分析物的檢測涉及結(jié)合或未結(jié)合檢測復(fù)合物的空間分離?？蛇x擇的，只有連接到目標(biāo)分析物時(shí)，檢測標(biāo)記才可生成一種可區(qū)分的信號(hào)。特別優(yōu)選膠體綴合物。
用于本測定的方便的檢測標(biāo)記包括但不限于例如吖啶酯(acridinium ester)、吖啶磺酰胺(acridinium sulphonamide)、異魯米諾(isoluminol)；輔酶例如ATP、FAD、NAD；電化學(xué)發(fā)光團(tuán)(electrochemiluminophores)例如三(雙吡啶)釕(ruthenium tris(bipyridul))；酶例如乙酸激酶、堿性磷酸酶、β-內(nèi)酰胺酶、葡萄糖氧化酶、熒火蟲熒光素酶、β-D-半乳糖苷酶(galctosidase)、辣根過氧化物、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蟲漆酶、Renilla熒光素酶、黃嘌呤氧化酶；熒光團(tuán)(flurophores)例如三雙吡啶銪穴狀化合物(europium trisbipyridinecryptate)(及其他鑭系元素穴狀化合物)、熒光素、β-藻紅素、玫瑰紅(rhodamine)、傘形酮衍生物、德克薩斯紅(Texas Red)；自由基例如氧化亞氮(nitroxide)；融合綴合物例如堿性磷酸酶-抗-植物色素單鏈抗體；堿性磷酸酶-堿性纖維母細(xì)胞生長因子受體；脫水母發(fā)光蛋白(apoaequorin)-IgG重鏈；細(xì)菌堿性磷酸酶-IgG Fc結(jié)合蛋白；熒火蟲熒光素酶-蛋白A；人胎盤堿性磷酸酶-4-1 BB配體；海生細(xì)菌熒光素酶(β-亞基)-蛋白A；變兒茶酚酶-蛋白A；蛋白A-抗植物色素單鏈抗體；Pyrophorus plagiophthalamus熒光素酶-蛋白A；基因例如熒火蟲熒光素酶；金屬與類金屬例如金、銀、硒；金屬絡(luò)合物例如三羰基環(huán)戊二烯基錳(I)(cyclopentadienylmanganese tricarbonyl)、金簇；微粒例如膠乳、紅細(xì)胞、脂質(zhì)體；核酸例如pUC19 DNA；磷光體例如銪活化的氧硫化釔(yttrium oxisulfide)；發(fā)光蛋白例如水母發(fā)光蛋白；量子點(diǎn)例如硫化鋅包被的(zinc sulfide-coated)CdSe微粒；放射性同位素例如125I；氧化還原絡(luò)合物例如二茂鐵；底物例如半乳糖傘形酮及病毒例如噬菌體T4。
雖然不希望將本發(fā)明限制在任何特定檢測標(biāo)記及檢測模式，但是使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)在高通量體系中是特別便利的。正如本領(lǐng)域中所知，流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)是一種高通量技術(shù)，該技術(shù)包括當(dāng)混懸在流動(dòng)液體內(nèi)的顆粒通過一個(gè)或多個(gè)激光束通路時(shí)，迅速分析顆粒的物理和化學(xué)性質(zhì)。由于各個(gè)細(xì)胞或顆粒阻斷激光束，使用任何適當(dāng)?shù)母櫵惴z測和記錄各個(gè)細(xì)胞或顆粒發(fā)射的散射光和熒光。使用熒光團(tuán)特別有效。自表1中所列可選擇適當(dāng)熒光團(tuán)的實(shí)例。在此格式中使用的其他可檢測標(biāo)記包括冷光及磷光，也包括前面提及的紅外染料。
表1
1 Ex峰激發(fā)波長(nm)2 Em峰發(fā)射波長(nm)本發(fā)明包括分析熒光發(fā)射的任何適當(dāng)方法。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明考慮的技術(shù)包括但不限于，例如Lakowicz等.Biophys.J.72567，1997，公開的2-光子及3-光子時(shí)間分辨熒光光譜，其通過引用結(jié)合到本文中)，例如Eriksson等(Biophys.J.64，1993，其通過引用結(jié)合到本文中)公開的熒光壽命成像和例如Youvan等(Biotechnology et elia31-18，1997)公開的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
“分析物”包括任何生物學(xué)感興趣分子且包括但不限于細(xì)胞因子、激素、抗原、法醫(yī)樣品、抗體、半抗原、酶、天然產(chǎn)物、化學(xué)文庫組分、包括獸藥或藥學(xué)上感興趣的藥物、環(huán)境成分等。
抗原通常要求為純化形式，且常常方便地通過重組產(chǎn)生。但是，本發(fā)明抗原可為天然合成的、重組體、糖類、脂類或藥物分子。通常通過參考需要與其反應(yīng)的抗體來測定表達(dá)分子的大小和組成。如果抗原特別復(fù)雜，其可能包含不需要檢測的抗體結(jié)合位點(diǎn)。相應(yīng)的文中所用術(shù)語抗原是指以蛋白形式時(shí)帶有表位的分子部分。此術(shù)語不排除修飾的多肽或蛋白質(zhì)性質(zhì)分子且包括肉豆蔻化(myristilation)、糖基化、磷酸化等。此定義包括例如含有一種或多種氨基酸類似物(包括例如表2中給出的非天然氨基酸)的多肽，或者帶有取代鍵的多肽。多肽或蛋白質(zhì)指氨基酸聚合物且不應(yīng)限制任何特定長度。因此此術(shù)語包括任何長度的表位、肽、多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)性質(zhì)分子。這種抗原多肽可包含單表位區(qū)經(jīng)過包括重復(fù)表位區(qū)的多表位區(qū)。雖然考慮自病原體例如病毒、細(xì)菌、真菌、原蟲、吸蟲、線蟲、蛋白酶傳染性因子等得到腫瘤相關(guān)抗原，但是這種抗原多肽可得自單一來源或多重來源。本領(lǐng)域已熟知許多試劑和腫瘤相關(guān)蛋白的抗原區(qū)。
表2非常規(guī)氨基酸編碼
例如可使用交聯(lián)劑穩(wěn)定3D構(gòu)象，使用相同雙功能(homo-bifunctional)交聯(lián)劑例如具有(CH2)n間隔基團(tuán)的雙功能亞胺酯類，其中n為1-6，戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯和雜雙功能試劑，其通常含有一個(gè)氨基反應(yīng)部分例如N-羥基琥珀酰亞胺及其他特異性反應(yīng)基團(tuán)例如馬來酰亞胺基(maleimido)或二硫代部分(SH)或碳化二亞胺carbodiimide(COOH)。另外，可通過結(jié)合Cα和Nα-甲基氨基酸且在氨基酸的Cα及Cβ之間引入雙鍵從結(jié)構(gòu)上限制肽。
術(shù)語“融合多肽”或“嵌合多肽”或“雜合多肽”可互換使用表示一種多肽，該多肽包含兩種或多種作為相同表達(dá)產(chǎn)物的一部分表達(dá)，或通過合成方法產(chǎn)生的相連的多肽。融合多肽可包含兩種或多種多肽和插入?yún)^(qū)域例如，連接區(qū)或間隔區(qū)。特別地，可選擇允許或直接或間接促進(jìn)特定表面拓?fù)鋵W(xué)的區(qū)域。例如可通過蛋白酶保護(hù)測定(protease protection assay)或通過測定與抗體的相互作用評(píng)價(jià)在病毒顆粒中的多肽拓?fù)鋵W(xué)。相應(yīng)地，術(shù)語“融合蛋白”中“融合”不以“病毒融合”的意義使用。本文中所用的“受試者”指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物且更優(yōu)選人?；颊邿o論人或不是人的動(dòng)物均可指個(gè)體、受試者、動(dòng)物、宿主或受體。本發(fā)明的分子和方法應(yīng)用于人用藥物、獸藥及一般馴養(yǎng)或野生畜牧業(yè)。為方便起見，“動(dòng)物”包括鳥類例如家禽、籠中鳥(aviary bird)或獵鳥。優(yōu)選的動(dòng)物為人或其他靈長類動(dòng)物、家畜類動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物、寵物(companion animals)或捕獲的野生動(dòng)物。
實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)例包括鴨、雪雁、小鼠、大鼠、兔、豚鼠及侖鼠。兔及嚙齒動(dòng)物例如大鼠和小鼠，提供了方便的試驗(yàn)體系或動(dòng)物模型。家畜類動(dòng)物包括綿羊、母牛、豬、山羊、馬和驢。也考量了非哺乳動(dòng)物例如鳥類、斑馬魚及兩棲動(dòng)物。
抗原可包含不同生物體、種或亞種的兩種或多種多肽的表位區(qū)域。
術(shù)語“樣品”以其最廣泛語境中用來包括自受試者、實(shí)驗(yàn)室或環(huán)境純化或未純化組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品為從含有得自受試者抗體的體液收集的生物樣品，且可包括但不限于得自任何組織例如血、血漿、淋巴、唾液或其他粘液分泌物、淚、脊髓液等的組織或細(xì)胞。應(yīng)理解所述樣品包括經(jīng)一些加工方式處理的樣品，也包括直接自受試者、環(huán)境或?qū)嶒?yàn)室取得的樣品。加工方式可包括例如稀釋、過濾或其它分離技術(shù)或浸軟這類步驟。
除非另有說明，文中所用術(shù)語“結(jié)合”、“綴合”、“絡(luò)合”、“連接”、“鍵合”可互換使用。復(fù)合物的組分部分可通過許多不同化學(xué)鍵連接。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)重要的限制是為測定目的復(fù)合物要保留完整性。組分間的共價(jià)鍵本質(zhì)上為非可逆鍵。但是抗體-抗原及配體-配體結(jié)合配偶體鍵通常是非共價(jià)鍵，在它們符合要求的基礎(chǔ)上選定組分。術(shù)語“抗原”和“抗原多肽”包括半抗原及可產(chǎn)生抗體的其它分子。
測定和貯存條件保護(hù)或提高結(jié)合位點(diǎn)的可用性指如果分析物結(jié)合配偶體直接或經(jīng)抗體綴合到檢測標(biāo)記結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)可用性。尤其是通過使用根據(jù)本發(fā)明連接到分析物結(jié)合分子上的多聚體、二聚體、嵌合體、融合或病毒顆粒分子，預(yù)留分析物結(jié)合分子的結(jié)合位點(diǎn)用于結(jié)合分析物。
可通常使用已熟知的技術(shù)例如在生物實(shí)驗(yàn)手冊例如Sambrook和Russell“Molecular Cloning-A Laboratory Manual”(Cold Spring HarbourPress，2001，通過引用結(jié)合到本文)中概述的技術(shù)制備包含分析物結(jié)合分子例如抗原的融合蛋白。融合蛋白由在其氨基末端或羧基末端共價(jià)連接到一種或多種載體序列的目標(biāo)氨基酸序列組成。載體序列或者氨基酸序列可包含分析物結(jié)合蛋白。如果載體序列攜帶抗原表位，可方便的使用表位標(biāo)記方法。在Sambrook和Russell(上述)以及純化和重折疊實(shí)驗(yàn)方案中也描述了表達(dá)系統(tǒng)和載體?？筛鶕?jù)需表達(dá)分析物結(jié)合分子的大小及性質(zhì)使用特異性表達(dá)系統(tǒng)例如細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母或昆蟲宿主。許多市售質(zhì)粒適用于融合蛋白表達(dá)。使用相當(dāng)程序生成包含融合到第一橋連結(jié)合配偶體多肽的分析物結(jié)合分子的嵌合體蛋白及多聚體分子。
本文所用“顆粒”是指病毒顆?；虿《緲宇w粒。
通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備病毒顆粒及病毒樣顆粒。VLPs模擬天然病毒體的衣殼或被膜且通過例如在牛痘(Hagensee等J.Virol.67315，1993)中或在桿狀病毒(Rose等，J.Virol.671936，1993)中衣殼或被膜蛋白質(zhì)的重組表達(dá)獲得?？紤]使用乙型肝炎病毒(HBV)亞病毒顆粒(HBsAg-S)生成重組VLPs。數(shù)個(gè)研究確定適于插入外來表位的區(qū)域(Bruss等J.Virol.653813-3820，1994；Delpeyroux等J.Mol.Biol.195343-350，1987)，包括N末端的PreS區(qū)域融合(Prange等，J.Gen.Virol.762131-2140，1995)。
通?？墒褂靡咽熘夹g(shù)例如在Paul，″Fundamental Immunology″，第3版，243-247(Raven Press，1993)中概述的技術(shù)鑒別抗原且引用參考。這種技術(shù)包括篩選能夠與抗原-特異性抗體、抗血清和/或T-celllines或克隆反應(yīng)的多肽及重疊片段。如本文所用的，如果其特異性結(jié)合到抗原(即其與蛋白質(zhì)在ELISA或其他免疫測定法中反應(yīng)，且不與無關(guān)蛋白質(zhì)發(fā)生可檢測的反應(yīng))則抗血清和抗體為“抗原-特異性”?？乖慰稍谂c全長多肽反應(yīng)性相似或更高水平上反應(yīng)?？赏ǔＪ褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行篩選，例如在Harlow和Lane，″AntibodiesA Laboratory Manual″(Cold Spring Harbor Laboratory，1988)中描述的方法。例如，多肽可固定在固體支持物上且與病人血清接觸從而使血清中抗體與固定的多肽結(jié)合。然后可除去未結(jié)合血清且檢測結(jié)合的抗體，例如使用標(biāo)記過的蛋白A。
術(shù)語“結(jié)合配偶體”或“結(jié)合對(duì)”是指通過結(jié)構(gòu)確定的經(jīng)可逆性非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵結(jié)合或相互作用的互補(bǔ)分子。示例性蛋白質(zhì)性質(zhì)的結(jié)合配偶體包括抗體-抗原、酶-底物、生物素-鏈霉抗生物素蛋白、甘露糖/麥芽糖/直鏈淀粉-甘露糖/麥芽糖/直鏈淀粉-結(jié)合蛋白及細(xì)胞因子或配體受體相互作用。
單克隆抗體適于以純的形式且大量方便地制備。用于單克隆抗體生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞系制備通過將致敏淋巴細(xì)胞與無限增殖細(xì)胞系融合且選擇本領(lǐng)域已熟知的特異性抗體程序通過如Harlow和Lane(supra)；及Kohler和Milstein，European Journal of Immunology 6511-519，1976中描述的標(biāo)準(zhǔn)程序而取得。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中抗體的方法，包括使所述抗體與其中抗原包含被抗體特異性識(shí)別的表位的檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物接觸，且其中所述檢測標(biāo)記間接連接到所述抗原從而保護(hù)在所述抗原上的表位的可用性；且提供了檢測分析物的方法。
與這種實(shí)施方案有關(guān)，檢測標(biāo)記通過包含結(jié)合對(duì)的橋連復(fù)合物間接連接到所述分析物結(jié)合配偶體，其中橋連結(jié)合對(duì)的第一配偶體是顆粒、復(fù)合物、多聚體或包含所述分析物結(jié)合配偶體的融合蛋白，且第二橋連結(jié)合配偶體綴合到或融合到或以其它方式連接到所述可檢測標(biāo)記。
相應(yīng)的，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于檢測樣品中抗體的方法，包括使所述抗體與其中抗原包含被所述抗體特異性識(shí)別的表位的檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物接觸，其中所述檢測標(biāo)記間接連接到所述抗原從而保護(hù)在所述抗原上的表位的可用性，且其中通過包含結(jié)合對(duì)的橋連復(fù)合物間接連接，其中橋連結(jié)合對(duì)的第一配偶體是顆粒、復(fù)合物、多聚體包括二聚體、嵌合體或融合蛋白或包含所述抗原的相當(dāng)結(jié)構(gòu)，且橋連結(jié)合對(duì)的第二配偶體綴合到或以其它方式融合到所述可檢測標(biāo)記；且提供了檢測分析物的方法。
在所述的方面中，這種檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物包含下列結(jié)構(gòu)M-X2+X1-A其中M為檢測標(biāo)記，間接連接到A從而形成檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物；A為分析物特異性識(shí)別的分析物結(jié)合配偶體。在一個(gè)實(shí)施方案中，A為帶有被患者樣品中存在的抗體特異性識(shí)別的表位的抗原；
X1及X2是橋連結(jié)合配偶體，其在檢測標(biāo)記(M)和分析物結(jié)合配偶體(A)間形成橋連復(fù)合物且通過可逆性非共價(jià)鍵(+)連接；X1包含為顆粒、復(fù)合物、二聚體、多聚體或融合蛋白的第一橋連結(jié)合配偶體，其包含一部分連接到X2而另一部分連接到分析物結(jié)合配偶體(A)，且其中毗連的(-)為在第一橋連結(jié)合配偶體和分析物結(jié)合配偶體(A)之間的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵；X2包含被連接、融合或以另外方式連接到可檢測標(biāo)記(M)的第二橋連結(jié)合配偶體，且其中毗連的(-)是共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。
在一些實(shí)施方案中，使用一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子例如生物素-鏈霉抗生物素蛋白或生物素-抗生物素抗體將X2連接到可檢測標(biāo)記上。
在一些實(shí)施方案中，X2為抗原結(jié)合分子、蛋白結(jié)合分子、核酸結(jié)合分子、糖類結(jié)合分子或脂質(zhì)結(jié)合分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X2為抗原-結(jié)合分子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，X2為抗體或其抗原結(jié)合片段。
在一些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段可具有有利的特異性，與待分析抗體的特異性相同或不同。
在一些實(shí)施方案中，綴合或以其它方式連接到檢測標(biāo)記上的第二結(jié)合配偶體為單克隆抗體，其識(shí)別待分析特異性樣品抗體識(shí)別的相同的優(yōu)勢免疫表位。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，第一橋連配偶體，X2包含抗原的二聚體或多聚體形式。
在另一個(gè)方面，第一橋連結(jié)合配偶體(X2)為病毒顆粒或病毒樣顆粒。優(yōu)選的病毒顆粒得自嗜肝DNA病毒。優(yōu)選的病毒樣顆粒得自如在實(shí)施例中圖表顯示的鴨乙型肝炎病毒。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二橋連結(jié)合配偶體包含糖類且包含抗原的此融合蛋白也包含糖類結(jié)合蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二橋連結(jié)合配偶體包含甘露糖且包含抗原的此融合蛋白包含甘露糖結(jié)合蛋白。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種用于檢測樣品中特異性抗體的試劑盒，其隔室形式上包含接受樣品的部分，及接受檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物部分，其中抗原包含能夠被如果樣品中存在的所述特異性抗體識(shí)別的表位，且其中所述檢測標(biāo)記間接連接到所述抗原從而保護(hù)對(duì)所述抗體的抗原表位的可用性及檢測其與對(duì)照的相對(duì)值。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的這個(gè)方面的檢測標(biāo)記通過包含結(jié)合對(duì)的橋連復(fù)合物間接連接到抗原，其中橋連結(jié)合對(duì)的第一配偶體為顆粒、復(fù)合物、二聚體、多聚體或包含所述抗原的融合蛋白，且橋連結(jié)合對(duì)的第二配偶體綴合到或以其他方式連接到所述可檢測標(biāo)記上。
根據(jù)這個(gè)方面，這種檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物包含橋連復(fù)合物且具有下列結(jié)構(gòu)M-X2+X1-A其中M為檢測標(biāo)記，間接連接到A從而形成檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物；A為分析物特異性識(shí)別的分析物結(jié)合配偶體。在一個(gè)實(shí)施方案中，A為帶有被患者樣品中存在的抗體特異性識(shí)別的表位的抗原；X1及X2包含橋連結(jié)合配偶體，其在檢測標(biāo)記(M)和分析物結(jié)合配偶體(A)間形成橋連復(fù)合物且通過可逆性非共價(jià)鍵(+)連接；X1包含為顆粒、復(fù)合物、二聚體、多聚體或融合蛋白的第一橋連結(jié)合配偶體，其包含一部分連接到X2而另一部分連接到分析物結(jié)合配偶體(A)，且其中毗連的(-)是在第一橋連結(jié)合配偶體和分析物結(jié)合配偶體(A)之間的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵；X2包含同樣連接、融合或以另外方式連接到可檢測標(biāo)記(M)的第二橋連結(jié)合配偶體，且其中毗連的(-)是共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。
在一些實(shí)施方案中，X2包含蛋白結(jié)合分子、糖類結(jié)合分子、核酸結(jié)合分子或脂質(zhì)結(jié)合分子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，X2包含抗體或抗原結(jié)合分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物且具有下列結(jié)構(gòu)M1-X2+X1-A1其中M1為間接連接到A而形成檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物的可見的、光學(xué)上或磁學(xué)上或其他儀器或化學(xué)上可檢測的標(biāo)記；A1為帶有被患者樣品中存在的抗體特異性識(shí)別的表位的抗原；X1及X2包含在檢測標(biāo)記和結(jié)合配偶體之間形成橋連復(fù)合物的橋連結(jié)合配偶體，且通過可逆性(+)非共價(jià)鍵結(jié)合；X1包含為顆粒、復(fù)合物、二聚體、多聚體或融合蛋白的第一橋連結(jié)合配偶體，其所包含的一部分連接到X2而另一部分連接到或包含抗原(A1)，且其中毗連的(-)是在第一橋連結(jié)合配偶體和抗原(A1)之間的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵；X2包含第二橋連結(jié)合配偶體，其為抗體或抗原-結(jié)合分子，綴合或以其它方式連接到可見的、光學(xué)上或磁學(xué)上或其他儀器或化學(xué)上可檢測的標(biāo)記(M1)，且其中毗鄰的(-)為共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。
在一些實(shí)施方案中，試劑盒為色譜包括免疫色譜試劑盒且分析物固定到固體支持物上從而便于其檢測。
此試劑盒可選擇性或另外包含單獨(dú)的隔室以貯存檢測標(biāo)記-第二橋連結(jié)合配偶體復(fù)合物及所述第一橋連結(jié)合配偶體-抗原復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，檢測標(biāo)記、X2、X1及分析物結(jié)合配偶體的一種或每一種貯存在單獨(dú)的隔室中。如果在試劑盒中這些組分單獨(dú)貯存，這些組分在測定前或在測定程序間可結(jié)合。組分可以溶液形式、無水、冷凍或凍干形式貯存。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，制造期間在加入設(shè)備前可以混合膠體金-單克隆抗體綴合物與同源抗原。在戊型肝炎病毒的實(shí)例中，綴合有單克隆抗體4B2的膠體金(Riddell，M.A.等J.Virol.748011-8017，2000)與等體積的重組HEV抗原ORF2.1混合，且在添加到設(shè)備的“綴合墊前”在約15-37℃孵育。然后干燥試劑，接著再水合，預(yù)先形成的復(fù)合物適于在設(shè)備中和固定化抗-HEV特異性IgM反應(yīng)。
可選擇的，在設(shè)備制造期間可物理上分離膠體金-單克隆抗體綴合物與抗原，且在進(jìn)行測定期間混合及形成復(fù)合物。在甲型肝炎病毒的實(shí)例中，向設(shè)備的“綴合墊”(“conjugate pad”)加入綴合有單克隆抗體K3-4C8的膠體金(MacGregor A等，J.Clin.Microbiol.，18(5)1237-1243，1983)，同時(shí)向“病毒墊”(“virus pad”)單獨(dú)加入滅活的完整病毒HAV抗原且然后干燥試劑。在進(jìn)行測定期間，首先再水合“綴合墊”且然后在進(jìn)行測定時(shí)與“病毒墊”接觸，使病毒再水合。在此過程中新生成了復(fù)合物且然后適于在設(shè)備中與固定化抗-HAV特異性IgM反應(yīng)。
可選擇的，可通過間接方法例如不限制使用膠體金-抗生物素抗體綴合物和如果混合則形成膠體金-單克隆抗體綴合物的非共價(jià)鍵復(fù)合物的生物素-單克隆抗體綴合物，從而制備膠體金-單克隆抗體綴合物。
試劑盒以無水和/或凍干形式方便的貯存且在使用前重建。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種患者樣品中特異性抗體為固定化的。使用同樣可為對(duì)特定抗體同種型例如IgM、IgA、IgE或IgG特異的抗物種(anti-species)抗體可方便的將抗體固定在固體支持物上。在本領(lǐng)域中目前已知許多不同的固體支持物且包括珠(beads)、顆粒(particles)、平板(plates)、膜(membranes)、濾器(filters)、管(tubes)等。
在高通量或多重(multiplexed)測定中，本發(fā)明的檢測復(fù)合物特別適于作為組分使用復(fù)合檢測復(fù)合物能夠單獨(dú)或共同分析復(fù)合樣品。優(yōu)選的測定法通過計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)化進(jìn)行和/或控制。
通過下列非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明。
實(shí)施例1
戊型肝炎病毒的二聚體ORF2.1抗原在此實(shí)施例制造期間，在膠體金-抗體綴合物應(yīng)用到設(shè)備上以前綴合物與二聚體戊型肝炎病毒ORF2.1抗原復(fù)合。單克隆抗體(McAb4B2)可定向目標(biāo)針對(duì)目的抗原中優(yōu)勢免疫表位，且在飽和量的抗原存在下僅二聚體的一個(gè)分子將與結(jié)合到膠體金的單克隆抗體反應(yīng)，剩下二聚體中第二分子與患者抗體反應(yīng)從而在診斷試驗(yàn)中給出如圖1圖示代表的可見信號(hào)。在這個(gè)實(shí)施例中，患者抗體為IgM來指示目前或近期感染了編碼此目標(biāo)目的抗原的病原生物體，但是本方法同樣可以使用其它類的抗體(例如IgG或IgA或IgE)代替在可包含扁平表面(flat)、平坦表面(planar)、圓形表面(round)或彎曲表面(curved)固相上適當(dāng)?shù)目姑庖咔虻鞍卓贵w是顯而易見的。在Li，F(xiàn)等J Med Virol.52289-300，1997；Anderson D.A.等J.Virol.Methods.131-142，1999；Li，F(xiàn).等J Med Virol.60379-386，2000；和Riddell，M.A.，等(supra)中描述了該ORF2.1重組抗原。
實(shí)施例2甲型肝炎病毒的多聚體抗原通過集合分離的含有這兩部分的隔室，在進(jìn)行測定期間膠體金-抗體綴合物與甲型肝炎病毒顆粒(抗原)復(fù)合。在這個(gè)實(shí)施例中，單克隆抗體(K34C8)也可定向目標(biāo)針對(duì)目的抗原(病毒)中優(yōu)勢免疫表位，但是在限定條件例如病毒濃度及孵育時(shí)間下每個(gè)病毒顆粒內(nèi)僅一個(gè)或幾個(gè)拷貝的表位將與結(jié)合到膠體金的單克隆抗體反應(yīng)，剩下病毒顆粒內(nèi)其余表位與患者抗體反應(yīng)從而在診斷試驗(yàn)中給出如圖2圖示代表的可見信號(hào)。
實(shí)施例3鴨肝炎病毒的病毒樣顆粒(VLP).
A.抗DHBV橋的用途在這個(gè)實(shí)施例中，膠體金-抗體綴合物可優(yōu)先與鴨乙型肝炎病毒(DHBV)的病毒樣顆粒(VLPs)復(fù)合，其中目標(biāo)抗原表達(dá)為嵌合體VLP的一部分(在以Hepgenics Pty Ltd名義的國際申請?zhí)朩O 2004/092387中描述)。在這個(gè)實(shí)施例中，結(jié)合到膠體金(7C12)的單克隆抗體定向針對(duì)VLP(S或L抗原)的DHBV部分中表位而不是目標(biāo)目的抗原中表位，因此VLP內(nèi)目標(biāo)目的抗原的剩下拷貝與患者抗體反應(yīng)從而在診斷試驗(yàn)中給出如圖3圖示代表的可見信號(hào)。
實(shí)施例4鴨乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒(VLP).
B.抗分析物橋的用途在這個(gè)實(shí)施例中，膠體金-抗體綴合物又可優(yōu)先與鴨乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒(VLPs)復(fù)合，其中目標(biāo)抗原表達(dá)為嵌合體VLP的一部分(在以Hepgenics Pty Ltd名義的國際申請?zhí)朩O 2004/092387中描述)。在這個(gè)實(shí)施例中，結(jié)合到膠體金的單克隆抗體可定向目標(biāo)針對(duì)目的抗原中優(yōu)勢免疫表位，但是由于帶有多個(gè)拷貝表位的VLP的3-維結(jié)構(gòu)伸展在其表面，每個(gè)VLP內(nèi)僅一個(gè)或幾個(gè)拷貝的表位將與結(jié)合到膠體金的單克隆抗體反應(yīng)，VLP內(nèi)剩下拷貝與患者抗體反應(yīng)從而在診斷試驗(yàn)中給出如圖4圖示代表的可見信號(hào)。
實(shí)施例5帶有第二結(jié)合位點(diǎn)的單價(jià)抗原作為橋A.在分析物抗原上第二表位的用途在第5個(gè)實(shí)施例中，膠體金-抗原綴合物可與單價(jià)抗原復(fù)合。在這個(gè)實(shí)施例中，綴合到膠體金的單克隆抗體不定向針對(duì)目標(biāo)目的抗原中優(yōu)勢免疫表位，而是定向目標(biāo)針對(duì)目的抗原中分離表位，剩下優(yōu)勢免疫表位與患者抗體反應(yīng)從而在診斷試驗(yàn)中給出如圖5圖示代表的可見信號(hào)。
實(shí)施例6帶有第二結(jié)合位點(diǎn)的單價(jià)抗原作為橋B.融合蛋白例如甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)和分析物橋的融合蛋白的用途此實(shí)施例也應(yīng)用嵌合重組抗原例如甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)和目標(biāo)目的抗原的融合，其中綴合到膠體金的單克隆抗體定向于MBP，剩下目標(biāo)整個(gè)目的抗原與患者抗體自由反應(yīng)從而在診斷試驗(yàn)中給出如圖6圖示代表的可見信號(hào)。
實(shí)施例7帶有配體結(jié)合位點(diǎn)的單價(jià)抗原作為橋在此實(shí)施例中，膠體金和甘露糖化學(xué)性綴合，由于MBP對(duì)該配體的天然親和性，其與膠體金和甘露糖化學(xué)性綴合物結(jié)合，剩下優(yōu)勢免疫表位與患者抗體反應(yīng)從而在診斷試驗(yàn)中給出如圖7圖示代表的可見信號(hào)。
實(shí)施例8使用蛋白蛋白結(jié)合分子(生物素抗生物素抗體)連接甲型肝炎病毒檢測標(biāo)記的多聚體抗原和X2通過集合含有這兩部分的分離的試驗(yàn)隔室，在進(jìn)行測定期間將膠體金-抗體綴合物與甲型肝炎病毒顆粒復(fù)合。在此實(shí)施例中，經(jīng)本領(lǐng)域中已熟知方法可通過使用將膠體金綴合到抗生物素抗體或鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)與綴合到生物素的單克隆抗體(K34C8(MacGregor等(同上)))形成復(fù)合物生成膠體金-抗體綴合物。在此實(shí)施例中，單克隆抗體(K34C8)也可定向針對(duì)抗原中優(yōu)勢免疫表位，但是在限定條件例如病毒濃度和/或孵育時(shí)間下每個(gè)病毒顆粒內(nèi)僅一個(gè)或幾個(gè)拷貝的表位將與結(jié)合到膠體金的單克隆抗體反應(yīng)，剩下病毒顆粒內(nèi)其余表位與患者抗體反應(yīng)從而在診斷試驗(yàn)中給出如圖8圖示代表的可見信號(hào)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本文所述本發(fā)明易于進(jìn)行除特定描述的以外的變化及修改。應(yīng)理解本發(fā)明包括所有的這種變化和修改。本發(fā)明也包括在此說明書中單獨(dú)的或共同的涉及的或指示的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任何兩種或多種所述步驟或特征的任何及所有組合。
文獻(xiàn)目錄anderson D.A.等，J.Virol.Methods.81131-142，1999；Ausubel等“Current Protoclos in Biology″John Wiley & Sons Inc，1994-1998；Bruss et al.，J.Virol.653813-3820，1994；Delpeyroux等J.Mol.Biol.343-350，1987；Eriksson et al.Biophys.J.264，1993；Hagensee et315，1993；Harlow and Lane，″AntibodiesA Laboratory Manual″Cold SpringHarbor Laboratory，1988；Kohler and Milstein，European Journal of Immunology 6511-519，1976；Lakowicz等，Biophys.J.72567，1997；Li，F(xiàn) et al.J Med Virol.52289-300，1997；Li，F(xiàn) et al.J Med Virol.60379-386，2000；MacGregor A.等，J.Clin.Microbiol.，18(5)1237-1243，1983；Paul，F(xiàn)undamental Immunology，3rd ed.，243-247(Raven Press，1993)；Prange，et al，J.Gen.Virol.762131-2140，1995；Riddell，M.A.，et al J.Virol.748011-8017，2000；Rose et al J.Virol.671936，1993；Sambrook and Russell″Molecular Cloning-A Laboratory Manual″Cold spring Harbour Press，2001；Wild D.，“The Immunoassay Handbook”Nature Publishing Group，2001；Youvan et al.(Biotechnology et elia 31-18，1997).
權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中分析物的方法，所述方法包括樣品和檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物接觸，其中檢測標(biāo)記通過橋連復(fù)合物間接連接到分析物結(jié)合配偶體從而保護(hù)或增強(qiáng)分析物結(jié)合配偶體上對(duì)分析物的結(jié)合位點(diǎn)的可用性，且其中橋連復(fù)合物包含蛋白質(zhì)X1、X2及其中X1包含顆粒、二聚體、多聚體、嵌合體、融合蛋白或結(jié)合到或包含分析物結(jié)合配偶體且也可逆的結(jié)合到X2的等價(jià)結(jié)構(gòu)，其中X2通過X1結(jié)合且也結(jié)合、融合或以其他方式連接到檢測標(biāo)記上，并檢測該檢測標(biāo)記從而指示樣品中分析物的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中檢測標(biāo)記-分析物結(jié)合配偶體復(fù)合物單獨(dú)或一起貯存或使用。
3.權(quán)利要求2的方法，其中檢測標(biāo)記-X2組分和X1-分析物結(jié)合配偶體組分單獨(dú)貯存且依次使用。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中分析物結(jié)合配偶體為分離的、重組、合成的、天然存在的、化學(xué)的或蛋白質(zhì)分子。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中分析物結(jié)合配偶體為蛋白質(zhì)分子。
6.權(quán)利要求5的方法，其中X1包含顆粒、二聚體、多聚體、嵌合體、融合蛋白或包含分析物結(jié)合配偶體的等價(jià)結(jié)構(gòu)。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中分析物能夠與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。
8.權(quán)利要求7的方法，其中分析物為抗體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中抗體為IgM、IgE、IgA和IgG抗體中的一種。
10.權(quán)利要求8的方法，其中分析物結(jié)合配偶體為抗原。
11.權(quán)利要求6的方法，其中顆粒為病毒顆粒或病毒樣顆粒。
12.權(quán)利要求11的方法，其中病毒樣顆粒為包含分析物結(jié)合配偶體的一個(gè)或多個(gè)拷貝的重組嗜肝DNA病毒病毒樣顆粒(VLP)。
13.權(quán)利要求6的方法，其中X1為二聚體且分析物結(jié)合到該二聚體的一個(gè)分子上及X2結(jié)合到該二聚體的另一個(gè)分子上。
14.權(quán)利要求6的方法，其中X1為多聚體形式。
15.權(quán)利要求6的方法，其中X1為嵌合體形式。
16.權(quán)利要求6的方法，其中X1為融合蛋白形式。
17.權(quán)利要求6的方法，其中X2包含抗原結(jié)合分子、蛋白結(jié)合分子、核酸結(jié)合分子、糖類結(jié)合分子或脂質(zhì)結(jié)合分子。
18.權(quán)利要求17的方法，其中結(jié)合分子結(jié)合到分析物結(jié)合配偶體或結(jié)合到X1中不同表位。
19.權(quán)利要求17的方法，其中檢測標(biāo)記包含一種或多種質(zhì)量標(biāo)記、染料、膠體或磁性顆粒、酶、放射性分子、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、熒光團(tuán)、磷光分子、發(fā)光分子例如熒火蟲熒光素酶、金屬與類金屬、金屬絡(luò)合物、微粒、核酸、磷光體、電解質(zhì)、順磁性和/或磷光性顆粒、發(fā)光蛋白、量子點(diǎn)、放射性同位素、氧化還原復(fù)合物、底物、病毒或其他等價(jià)分子。
20.一種檢測樣品中特異性抗體的方法，所述方法包括樣品與檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物接觸，其中抗原包含被抗體特異性識(shí)別的表位，且其中檢測標(biāo)記經(jīng)保護(hù)或增強(qiáng)抗原上針對(duì)抗體的表位可用性的橋連復(fù)合物間接連接到抗原，且其中橋連復(fù)合物包含橋連結(jié)合配偶體X1和X2，其中X1包含顆粒、二聚體、多聚體、嵌合體、融合蛋白或結(jié)合到或包含抗原且也可逆的結(jié)合到X2的等價(jià)結(jié)構(gòu)，其中X2包含抗體或蛋白結(jié)合分子，其通過X1結(jié)合且也結(jié)合、融合或以其他方式連接到檢測標(biāo)記，并檢測該檢測標(biāo)記從而指示樣品中抗體的存在。
21.權(quán)利要求20的方法，其中檢測標(biāo)記-X2組分及X1-分析物結(jié)合配偶體組分單獨(dú)貯存且依次使用。
22.權(quán)利要求21的方法，其中X2結(jié)合到抗原或X1的不同表位上。
23.權(quán)利要求20、21或22的方法，其中X1為抗原的二聚體形式且其中X2與抗原結(jié)合。
24.權(quán)利要求20、21或22的方法，其中X1為抗原的二聚體形式且其中X2和特異性抗體與相同或不同表位結(jié)合。
25.權(quán)利要求20、21或22的方法，其中X1為病毒顆?；虿《緲宇w粒。
26.權(quán)利要求25的方法，其中病毒顆粒為一種或多種重組體、嵌合體或天然存在的肝炎病毒顆粒。
27.權(quán)利要求25的方法，其中病毒樣顆粒(VLP)為禽嗜肝DNA病毒樣顆粒。
28.權(quán)利要求27的方法，其中VLP為重組禽嗜肝DNA病毒樣顆粒且X2連接到抗原。
29.權(quán)利要求27的方法，其中VLP為重組嗜肝DNA病毒樣顆粒且X2連接到不是抗原的一部分的X1的表位。
30.權(quán)利要求27的方法，其中VLP為重組鴨嗜肝DNA病毒樣顆粒且X2為通過鴨嗜肝DNA病毒屬的S或L抗原測定的單克隆抗體。
31.權(quán)利要求20、21或22的方法，其中X1包含抗原和與X2可逆性結(jié)合的第二結(jié)合蛋白的融合蛋白，其中X2為被第二抗原組分結(jié)合的抗體或蛋白質(zhì)或糖類結(jié)合分子，且其中X2也結(jié)合、融合或以其他方式連接到檢測標(biāo)記。
32.權(quán)利要求31的方法，其中蛋白或糖類結(jié)合分子為糖類且X1包含糖類結(jié)合蛋白。
33.權(quán)利要求31的方法，其中蛋白結(jié)合分子為配體且X1包含受體。
34.權(quán)利要求31的方法，其中蛋白或糖類結(jié)合分子為蛋白質(zhì)且X1包含蛋白結(jié)合蛋白。
35.權(quán)利要求20的方法，其中檢測標(biāo)記為質(zhì)量標(biāo)記、染料、膠粒、酶、放射性分子、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、熒光團(tuán)、磷光分子、發(fā)光分子例如熒火蟲熒光素酶、金屬與類金屬、金屬絡(luò)合物、微粒、核酸、磷光體、電解質(zhì)、順磁性和/或磷光性顆粒、發(fā)光蛋白、量子點(diǎn)、放射性同位素、氧化還原復(fù)合物、底物、病毒或其他等價(jià)分子。
36.權(quán)利要求35的方法，其中檢測標(biāo)記為膠粒，例如膠體金、膠體銀或膠體硒。
37.權(quán)利要求20的方法，其中分析物在檢測前固定于固體載體上。
38.權(quán)利要求20的方法，其中復(fù)合物的組分單獨(dú)或一起貯存或使用。
39.權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)的方法，用于檢測樣品中一種或許多種特異性分析物。
40.權(quán)利要求20-38中任一項(xiàng)的方法，用于檢測樣品中一種或許多種針對(duì)肝炎例如甲型肝炎和/或乙型肝炎和/或丙型肝炎和/或戊型肝炎的特異性抗體。
41.權(quán)利要求40的方法，其中抗體選自IgA、IgM、IgE及IgG抗體。
42.權(quán)利要求40的方法，其中方法為色譜法或免疫色譜法。
43.一種檢測樣品中特異性抗體的試劑盒，所述試劑盒為包含一部分接受樣品而另一部分接受檢測標(biāo)記-抗原復(fù)合物的隔室形式，其中抗原包含被特異性抗體識(shí)別的表位，如果在所述樣品中存在，且其中檢測標(biāo)記經(jīng)橋連復(fù)合物間接連接到抗原而保護(hù)抗原上針對(duì)抗體的表位的可用性且檢測其相對(duì)參照值，且其中橋連復(fù)合物包含橋連結(jié)合配偶體X1和X2，其中X1包含顆粒、二聚體、多聚體、嵌合體、融合蛋白或結(jié)合到或包含抗原且也可逆的結(jié)合到X2的等價(jià)結(jié)構(gòu)，其中X2包含抗體或蛋白結(jié)合分子，其通過X1結(jié)合且也結(jié)合、融合或以其他方式連接到檢測標(biāo)記。
44.權(quán)利要求43的試劑盒，其中檢測標(biāo)記-X2組分和X1-分析物結(jié)合配偶體組分單獨(dú)貯存且依次使用。
45.權(quán)利要求43或44的試劑盒，其中X2結(jié)合到抗原或X1中不同表位。
46.權(quán)利要求43、44或45的試劑盒，其中X1為抗原的二聚體形式且X2結(jié)合到抗原。
47.權(quán)利要求43、44或45的試劑盒，其中X1為抗原的二聚體形式且其中X2和特異性抗體與相同或不同表位結(jié)合。
48.權(quán)利要求43、44或45的試劑盒，其中X1為病毒顆?；虿《緲宇w粒。
49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中病毒顆粒為重組體、嵌合體或天然存在的肝炎病毒顆粒。
50.權(quán)利要求48的試劑盒，其中病毒樣顆粒(VLP)為禽嗜肝DNA病毒樣顆粒。
51.權(quán)利要求50的試劑盒，其中VLP為重組體禽嗜肝DNA病毒樣顆粒且X2結(jié)合到抗原。
52.權(quán)利要求50的試劑盒，其中VLP為重組體嗜肝DNA病毒樣顆粒且X2連接到不是抗原的一部分的X1的表位。
53.權(quán)利要求52的試劑盒，其中VLP為重組鴨嗜肝DNA病毒樣顆粒且X2為通過鴨乙型肝炎病毒的S抗原測定的單克隆抗體。
54.權(quán)利要求43、44或45的試劑盒，其中X1為包含抗原和與X2可逆性結(jié)合的第二抗原組分的融合蛋白，其中X2包含抗體或被第二抗原組分結(jié)合的抗原結(jié)合分子，且其中X2也結(jié)合、融合或以其他方式連接到檢測標(biāo)記。
55.權(quán)利要求54的試劑盒，其中抗原結(jié)合分子為糖類且X1包含糖類結(jié)合蛋白。
56.權(quán)利要求54的試劑盒，其中抗原結(jié)合分子為糖類且X1包含糖類結(jié)合蛋白。
57.權(quán)利要求54的試劑盒，其中抗原結(jié)合分子為配體且X1包含受體。
58.權(quán)利要求54的試劑盒，其中抗原結(jié)合片段為蛋白質(zhì)且X1包含蛋白結(jié)合蛋白。
59.權(quán)利要求43的試劑盒，其中檢測標(biāo)記包含一種或多種質(zhì)量標(biāo)記、膠粒、酶、放射性分子、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、熒光團(tuán)、磷光分子、發(fā)光分子例如熒火蟲熒光素酶、金屬與類金屬、金屬絡(luò)合物、微粒、核酸、磷光體、電解質(zhì)、順磁性和/或磷光性顆粒、發(fā)光蛋白、量子點(diǎn)、放射性同位素、氧化還原復(fù)合物、底物、病毒或其他等價(jià)分子。
60.權(quán)利要求59的試劑盒，其中檢測標(biāo)記為膠粒，例如膠體金、膠體銀或膠體硒。
61.權(quán)利要求43或44的試劑盒，其中特異性抗體在檢測前固定在固體載體上。
62.權(quán)利要求43-61中任一項(xiàng)的試劑盒，其中復(fù)合物的組分單獨(dú)或一起貯存或使用。
63.權(quán)利要求43-62中任一項(xiàng)的試劑盒，用于檢測樣品中一種或許多種針對(duì)樣品中甲型肝炎和/或乙型肝炎和/或丙型肝炎和/或戊型肝炎的特異性抗體。
64.權(quán)利要求63的試劑盒，其中抗體選自IgA、IgM、IgE及IgG抗體。
65.權(quán)利要求44的試劑盒，其中試劑盒為色譜試劑盒或免疫色譜試劑盒。
全文摘要
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測樣品中特異性目標(biāo)分析物的復(fù)合物。該復(fù)合物包含被橋接復(fù)合物間接連接在分析物結(jié)合配偶體上的檢測標(biāo)記。這種排列有利于保護(hù)或增強(qiáng)在分析物結(jié)合配偶體上的分析物結(jié)合位點(diǎn)的可用性且因而增強(qiáng)了分析物的檢測。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種適于檢測樣品中目標(biāo)特異性抗體的檢測復(fù)合物。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種使用橋連復(fù)合物檢測一種或多種抗體的方法，使用的橋連復(fù)合物包含多聚體分子、二聚體分子或嵌合分子或顆粒，它們各自包含抗原且通過使用抗體或蛋白結(jié)合分子、核酸結(jié)合分子、糖類結(jié)合分子或脂質(zhì)結(jié)合分子偶聯(lián)到檢測標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1902496SQ200480039821
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者D·A·安迪生, T·S·霍華德 申請人:赫普金尼克斯股份有限公司