專(zhuān)利名稱(chēng)：抗衣原體感染的免疫接種的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)，特別是涉及使用核酸分子免疫宿主以提供抗衣原體感染的保護(hù)。
背景技術(shù)：
核酸免疫是一種產(chǎn)生抗傳染性疾病的保護(hù)性免疫的方法(參考文獻(xiàn)1-在整個(gè)申請(qǐng)中，圓括號(hào)中示出引用各種參考文獻(xiàn)以便更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。(引用的全部著錄信息列于本發(fā)明書(shū)的結(jié)尾處、權(quán)利要求之前。這些參考文獻(xiàn)公開(kāi)的內(nèi)容在此引入本公開(kāi)中作為參考)。與基于蛋白或肽的亞單位疫苗不同，核酸或DNA免疫接種通過(guò)宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白而提供保護(hù)性免疫作用，因此允許以更類(lèi)似于在病毒或細(xì)胞內(nèi)病原體感染期間所發(fā)生的方式使抗原呈遞到免疫系統(tǒng)(參考文獻(xiàn)2)。盡管人們對(duì)該技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)關(guān)注，但是由DNA免疫大多數(shù)還是誘導(dǎo)對(duì)病毒性疾病的成功免疫(參考文獻(xiàn)3)。由非病毒性病原體導(dǎo)致的結(jié)果更多樣，其可能反映病原體的性質(zhì)、所選擇的免疫抗原以及免疫接種途徑方面的差異(參考文獻(xiàn)4)。DNA接種的進(jìn)一步發(fā)展將取決于闡明基礎(chǔ)免疫學(xué)機(jī)理進(jìn)而將其應(yīng)用擴(kuò)大到無(wú)法用現(xiàn)有的疫苗研制策略解決的其它傳染性疾病。
衣原體屬包括四個(gè)種，沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原體(C.pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)和牲畜衣原體(C.pecorum)。沙眼衣原體是專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌病原體，其通常局限于人類(lèi)宿主的粘膜上皮表面。衣原體是具有稱(chēng)作原生小體(EB)的細(xì)胞外孢子樣傳遞細(xì)胞和稱(chēng)作網(wǎng)狀體的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制細(xì)胞的雙態(tài)性細(xì)菌(參考文獻(xiàn)5)。沙眼衣原體是最常見(jiàn)的性傳播病原體之一，并且是全世界防盲的主要目標(biāo)(參考文獻(xiàn)6)。從公共健康的角度來(lái)看，衣原體感染是非常重要的感染，因?yàn)樗鼈兪遣挥Y、失明的重要原因，并且是便于人類(lèi)免疫缺陷病毒1型傳播的流行性輔因子(參考文獻(xiàn)7)。沙眼衣原體有導(dǎo)致沙眼、生殖器、呼吸和眼感染的多種血清型。據(jù)認(rèn)為由Th1樣CD4淋巴細(xì)胞反應(yīng)所釋放的細(xì)胞因子以及粘膜分泌物中的局部抗體，通過(guò)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫影響對(duì)沙眼衣原體的保護(hù)性免疫，并且據(jù)認(rèn)為對(duì)沙眼衣原體的保護(hù)性免疫是主要針對(duì)主要外膜蛋白(MOMP)，其是衣原體細(xì)菌細(xì)胞上在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)的表面蛋白，具有約40kDa的分子量(參考文獻(xiàn)11)。CD8+T-細(xì)胞的作用似乎是次要的。
研制衣原體疫苗的最初努力是基于用整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的非腸道免疫。盡管這種方法在人類(lèi)試驗(yàn)中獲得了一些成功，但是其受到限制，因?yàn)楸Ｗo(hù)是短暫的，部分的，并且可能是由于對(duì)某種衣原體抗原的病理學(xué)反應(yīng)，在后來(lái)的感染事件期間接種可能使疾病惡化(參考文獻(xiàn)8)。對(duì)衣原體疫苗設(shè)計(jì)的更近的嘗試是基于使用MOMP蛋白或多肽的亞單位設(shè)計(jì)(參考文獻(xiàn)9)。這些亞單位疫苗也普遍失敗，可能是因?yàn)槊庖咴瓫](méi)有誘導(dǎo)由生物體上天然表位所喚起的保護(hù)性的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)(參考文獻(xiàn)10)。
在1997年7月11日申請(qǐng)的，轉(zhuǎn)讓給Manitoba大學(xué)的美國(guó)專(zhuān)利No.6,235,290中，其所公開(kāi)的內(nèi)容在此引入作為參考，描述了使用在質(zhì)粒中編碼沙眼衣原體MOMP的DNA序列，通過(guò)DNA免疫接種產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。
最近已經(jīng)測(cè)定了沙眼衣原體(參考文獻(xiàn)14)和鼠沙眼衣原體(C.muridium)(參考文獻(xiàn)15)小鼠肺炎株(MoPn)的整個(gè)基因組序列。在2001年3月29日公開(kāi)的PCT出版物WO01/21803中，公開(kāi)了肺炎衣原體的mgp002基因。
衣原體感染可用抗生素，如四環(huán)素衍生物，尤其是強(qiáng)力霉素，以及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)或氮環(huán)內(nèi)酯如紅霉素和阿奇霉素治療；然而，感染常常是無(wú)癥狀的，嚴(yán)重的并發(fā)癥通常表現(xiàn)為感染的首發(fā)癥狀(參考文獻(xiàn)6)。由于抗生素使用的增加已經(jīng)導(dǎo)致抗生素抗性微生物的增加，因此化學(xué)治療或抗生素治療可能不是長(zhǎng)期可行的策略。因此，仍然存在有效預(yù)防和治療衣原體感染的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及核酸免疫，具體地是DNA免疫，在宿主中產(chǎn)生對(duì)衣原體菌株的Mgp002基因或其截短型的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種核酸分子，其包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6(d)SEQ ID No8(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾且不喪失免疫原性的(a)、(b)(c)或(d)的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)、(b)(c)或(d)的多肽在氨基酸序列上至少75％相同。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種核酸分子，其包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾，不喪失免疫原性的(a)、(b)(c)或(d)的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)、(b)(c)或(d)的多肽在氨基酸序列上至少75％相同，其中所述核酸分子有效地結(jié)合到用于在施用了所述核酸分子的宿主中表達(dá)所述核酸分子的序列。
用于表達(dá)的序列可以是巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，可能包含在人巨細(xì)胞病毒主要立即早期啟動(dòng)子-增強(qiáng)子區(qū)。其它合適的啟動(dòng)子可以是病毒啟動(dòng)子或者能在靶真核細(xì)胞中促進(jìn)表達(dá)的其它哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。載體可以是質(zhì)粒載體，核苷酸序列可以是SEQ ID No1、3、5或7的核苷酸序列。
衣原體菌株可以是包括沙眼衣原體或肺炎衣原體的衣原體株或血清變型。非復(fù)制性載體可以是其中插入有核苷酸序列或其衍生物或其修飾的質(zhì)粒pcDNA3.1。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供在體內(nèi)施用給宿主用以在宿主中產(chǎn)生對(duì)衣原體株的Mgp002基因或其片段的保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫原性組合物，其包括這里所提供的非復(fù)制性載體和藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供從衣原體株中分離的多核苷酸，其選自包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列的多核苷酸；包括SEQ IDNO3所示的核苷酸序列的多核苷酸；包括SEQ ID NO5所示的核苷酸序列的多核苷酸；包括SEQ ID NO7所示的核苷酸序列的多核苷酸；與SEQ ID NO1、3、5或7的核苷酸序列至少95％同源的多核苷酸；以及在42℃，在含有50％甲酰胺的6x SSC的嚴(yán)緊雜交條件下，與包括SEQ ID NO1、3、5或7所示的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸，其中向哺乳動(dòng)物施用免疫原性有效量的所述分離的多核苷酸，在所述哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗由所述衣原體株感染的免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包括載體的疫苗，其中載體包含編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)中任何一種多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾的(a)到(e)中任何一種的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(e)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用于使多肽在哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列有效地連接，其中疫苗提供抗衣原體所致疾病的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種藥物組合物，其包括適于在疫苗中使用的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ IDNo6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾，不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(e)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用于使多肽在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列有效地連接。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種免疫宿主使其抗衣原體菌株感染所致疾病的方法，其包括向所述宿主施用如本發(fā)明所提供的有效量的非復(fù)制性載體。
可以任何方便的方式，如通過(guò)肌肉內(nèi)或鼻內(nèi)向宿主，其包括人類(lèi)宿主施用核酸分子。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種預(yù)防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子的步驟(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)包含來(lái)自(a)到(c)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(d)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾，不喪失免疫原性的(a)到(c)中任何一種的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(c)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用于多肽表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列有效地連接。
可在本發(fā)明的這個(gè)方面中使用上述所討論的各種選項(xiàng)和可供選擇的選項(xiàng)。
那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易地理解，本發(fā)明不僅提供編碼衣原體多肽的多核苷酸序列，也提供編碼由這些多肽衍生的片段的多核苷酸。此外，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)被理解為提供這些多肽和其衍生片段的突變體和衍生物，其是由于這里所述的非必需氨基酸的添加、缺失或取代所致。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員也將很容易地理解，本發(fā)明不僅提供編碼衣原體多肽的多核苷酸序列，而且進(jìn)一步提供特異性結(jié)合這些多肽的單特異性抗體。
本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用，并且包括表達(dá)盒、載體和用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述參考附圖，將從下列描述中進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中

圖1顯示鼠衣原體(Chlamydia muridium)(Nigg株)的Mgp002基因的全長(zhǎng)核苷酸序列(SEQ ID No1)和推定的全長(zhǎng)Mgp002基因產(chǎn)物的氨基酸序列(SEQ ID No2)，以及缺失信號(hào)序列的核苷酸序列(在箭頭處開(kāi)始)(SEQ ID No5)和推定的氨基酸序列(SEQ ID No6)。
圖2顯示沙眼衣原體(血清變型D)的Mgp002基因的全長(zhǎng)核苷酸序列(SEQ ID No3)和推定的全長(zhǎng)Mgp002基因產(chǎn)物的氨基酸序列(SEQID No4)，以及缺失信號(hào)序列的核苷酸序列(在箭頭處開(kāi)始)(SEQ IDNo7)和推定的氨基酸序列(SEQ ID No8)。
圖3顯示一個(gè)用編碼Mgp002基因或其截短型的核酸分子治療衣原體感染的免疫方案的具體實(shí)施方式
的圖示。IM指肌肉內(nèi)免疫，而IN指鼻內(nèi)免疫。
圖4，包括圖A和B，顯示用克隆到質(zhì)粒pcDNA3.1中的編碼全長(zhǎng)Mgp002基因(圖A)和缺失信號(hào)序列的Mgp002基因(圖B)的核酸分子的免疫，與在用傳染性衣原體攻擊免疫的Balb/c小鼠中體重喪失之間的關(guān)系。說(shuō)明EB＝殺死宿主的原生小體，PCACTmgp002＝插入全長(zhǎng)Mgp002基因的pcDNA3，PCACTmgp002δ＝缺失信號(hào)序列的Mgp002基因， ＝?jīng)]有免疫，pAMycHis＝空載體。
圖5，比較圖A和B，顯示用全長(zhǎng)Mgp002基因(圖A)和缺失信號(hào)序列的Mgp002基因(圖B)免疫以及用傳染性衣原體攻擊的Balb/c小鼠的肺中提高的衣原體的清除率。圖例EB＝殺死宿主的原生小體，PCACTmgp002＝插入全長(zhǎng)Mgp002基因的pcDNA3，PCACTmgp002δ＝缺失信號(hào)序列的Mgp002基因， ＝?jīng)]有免疫，pAMycHis＝空載體。
圖6，圖解說(shuō)明質(zhì)粒pET30b(+)mgp002+SP的構(gòu)建，用于表達(dá)含有N末端His-Tag的重組Mgp002蛋白。
圖7，用圖說(shuō)明在用純化的重組Mgp002蛋白連同ISCOM佐劑免疫的CH3小鼠中，對(duì)沙眼衣原體血清變型D的生殖器攻擊的保護(hù)。動(dòng)物用鹽水 Mgp002蛋白(mg002)或衣原體原生小體(EB)皮下免疫，然后用活的沙眼衣原體血清變型D隨后通過(guò)陰道內(nèi)攻擊。測(cè)定感染后第3天和第5天的沖洗液中衣原體的感染單位。
發(fā)明詳述為了闡明本發(fā)明，構(gòu)建含有編碼沙眼衣原體小鼠肺炎株(MoPn)Mgp002基因的核酸分子的質(zhì)粒DNA，其是天然的鼠科病原體，在小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。已知在小鼠模型中初次感染誘發(fā)對(duì)再次感染發(fā)生強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫。對(duì)于人類(lèi)免疫，可使用編碼沙眼衣原體的Mgp002基因或其截短型的核酸分子。
可使用任何適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體，如pcDNA3.1，真核II可選擇的表達(dá)載體(Invitrogen，San Diego，CA，USA)，含有人類(lèi)巨細(xì)胞病毒主要的立即早期啟動(dòng)子-增強(qiáng)子區(qū)或其衍生物，如pCAMycHis。可將編碼Mgp002基因或其片段的核酸分子以任何適當(dāng)?shù)姆绞讲迦氲捷d體中?？墒褂煤线m的引物從沙眼衣原體基因組DNA中通過(guò)PCR擴(kuò)增基因，并將PCR產(chǎn)物克隆到載體中?？蓪y帶編碼Mgp002基因或其片段的核酸分子的質(zhì)粒，如通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)移到大腸桿菌或任何適當(dāng)?shù)乃拗髦羞M(jìn)行復(fù)制?？梢匀魏芜m當(dāng)?shù)姆绞綇拇竽c桿菌中提取質(zhì)粒。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供編碼衣原體多肽的分離的多核苷酸，在SEQ ID Nos2、4、6和8中顯示其氨基酸序列。
將術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”定義為離開(kāi)了其天然存在的環(huán)境的多核苷酸。例如，存在于活細(xì)菌的基因組中或者作為基因庫(kù)一部分的天然存在的DNA分子是未經(jīng)分離的，但是從細(xì)菌基因組的剩余部分中分離的同樣分子，作為例如克隆事件(擴(kuò)增)的結(jié)果，是分離的。通常，分離的DNA分子是不帶有在天然存在的基因組中該DNA分子5′或3′端緊鄰的DNA區(qū)(例如，編碼區(qū))的。這種分離的多核苷酸可以是載體或組合物的一部分，但其仍然被定義為“分離的”，因?yàn)檫@種載體或組合物不是這種多核苷酸的天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明的多核苷酸是RNA或DNA(cDNA、基因組DNA或合成的DNA)，或者其修飾形式、變體、同系物或片段。DNA是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈的，那么是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。如在SEQ IDNo1、3、5和7中所示，任何一種編碼本發(fā)明多肽的序列都是(a)編碼序列，(b)從(a)的轉(zhuǎn)錄物中衍生的核糖核苷酸序列，或(c)利用遺傳密碼的冗余性或簡(jiǎn)并性編碼同一多肽的編碼序列。“多肽”或“蛋白質(zhì)”意思是氨基酸的任何鏈，無(wú)論長(zhǎng)度或翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)。兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可在本發(fā)明申請(qǐng)中交換使用。
相應(yīng)于本發(fā)明的第一方面，提供與SEQ ID No2、4、6或8同源的氨基酸序列。如這里所使用的，“同源氨基酸序列”是全部或部分地由在低于臨界解鏈溫度(Tm)25-35℃下與SEQ ID No1、3、5或7所示的核苷酸序列的任何部分雜交的核酸序列所編碼的任何多肽。同源氨基酸序列是由于一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代而與SEQ ID No2、4、6或8所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列。這種序列也包括血清型變體(下面所定義的)以及包含缺失或插入的序列，其保留多肽的內(nèi)在特性如免疫原性。優(yōu)選地，這種序列與SEQ ID No2、4、6或8至少75％，更優(yōu)選地80％，最優(yōu)選地90％到95％相同。
同源性氨基酸序列包括與SEQ ID No2、4、6或8相同或基本上相同的序列?！鞍被嵝蛄谢旧舷嗤币馑际桥c參考的氨基酸序列至少90％，更優(yōu)選地97％以及最優(yōu)選地99％相同的序列，優(yōu)選地由于大多數(shù)保守性氨基酸取代而與參考序列不同。
保守性氨基酸取代是在同一類(lèi)型氨基酸之間的取代。這些類(lèi)型包括，例如，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸，如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有酸性側(cè)鏈的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；以及具有非極性側(cè)鏈的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
通過(guò)使用序列分析軟件如威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，大學(xué)大街1710號(hào)，Madison的遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組的序列分析軟件包，WI53705測(cè)量同源性。將氨基酸序列排列起來(lái)使相同性最大?？上蛐蛄兄腥斯ひ肴笨谝垣@得適當(dāng)?shù)男蛄袑?duì)比。一旦建立最佳的序列對(duì)比，那么通過(guò)記錄兩個(gè)序列的氨基酸都相同的所有位置的數(shù)量相對(duì)于位置的總數(shù)，建立同源性的程度。
以類(lèi)似的方式定義同源性多核苷酸序列。優(yōu)選地，同源序列是與SEQ ID No1、3、5或7的編碼序列至少45％，更優(yōu)選地60％，最優(yōu)選地85％相同。
相應(yīng)于本發(fā)明的第一方面，具有與SEQ ID No2、4、6或8同源序列的多肽包括天然發(fā)生的等位基因變體，以及突變體或保留SEQ IDNo2、4、6或8多肽內(nèi)在特性的任何其它非天然發(fā)生的變體。
如在本領(lǐng)域中已知，等位基因變體是多肽的替代型，其特點(diǎn)是具有不改變多肽生物學(xué)功能的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加?！吧飳W(xué)功能”意思是指多肽在細(xì)胞中自然發(fā)生的功能，即使該功能不是細(xì)胞生長(zhǎng)或存活所必需的。例如，膜孔蛋白的生物學(xué)功能是允許細(xì)胞外介基中存在的化合物進(jìn)入細(xì)胞。生物學(xué)功能與抗原性質(zhì)不同。多肽可具有一個(gè)以上的生物學(xué)功能。不同的等位基因變體可具有相似的抗原性質(zhì)。
等位基因變體在自然界中非常常見(jiàn)。例如，細(xì)菌物種如沙眼衣原體通常通過(guò)各種血清變型表示，其相互間僅有較小的等位基因變異的差異。事實(shí)上，在不同菌株中完成同一生物學(xué)功能的多肽可具有在每種菌株中都不同的氨基酸序列(和多核苷酸序列)。盡管有這種差異，但是已經(jīng)證明了通常針對(duì)許多等位基因變體的免疫反應(yīng)。在衣原體MOMP抗原的研究中，盡管存在菌株和菌株之間的MOMP的氨基酸序列變異，但是出現(xiàn)了交叉株抗體結(jié)合，以及傳染性的中和，表明當(dāng)MOMP用作免疫原時(shí)可接受的氨基酸變異。
通過(guò)對(duì)常規(guī)方法提取的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，得到編碼同源多肽或等位基因變體的多核苷酸。這涉及使用與編碼區(qū)的5′和3′末端的上游和下游匹配的合成的寡核苷酸引物。根據(jù)在SEQ ID No1、3、5或7中所提供的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)合適的引物。方法如下選擇由10到40，優(yōu)選地15到25個(gè)核苷酸構(gòu)成的引物。選擇所含C和G核苷酸的比例足以確保有效雜交的引物是有利的，即，C和G核苷酸的量至少為總核苷酸含量的40％，優(yōu)選地50％。標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)通常每100μL含有0.5到5單位的Taq DNA聚合酶，每種脫氧核苷酸20到200μM，優(yōu)選地以相等的濃度，在總脫氧核苷酸濃度中0.5到2.5mM的鎂，105到106個(gè)靶分子以及每種引物大約20pmol。進(jìn)行大約25到50個(gè)PCR循環(huán)，退火溫度低于引物的真正Tm 15℃到5℃。更嚴(yán)緊的退火溫度提高了對(duì)不正確退火引物的排斥并降低了引物3’端不正確核苷酸的摻入。盡管對(duì)于富含G+C靶的變性來(lái)說(shuō)，更高的溫度可能是適當(dāng)?shù)?，但是變性溫度一般?5℃到97℃。所進(jìn)行的循環(huán)數(shù)取決于靶分子的起始濃度，然而由于非特異性背景產(chǎn)物趨于累積，一般建議不超過(guò)40個(gè)循環(huán)。
獲取編碼同源多肽或等位基因變體的多核苷酸的可選擇的方法是通過(guò)DNA或RNA文庫(kù)的雜交篩選。雜交方法是本領(lǐng)域熟知的方法。在用于獲得兩個(gè)相互分離的互補(bǔ)DNA鏈的上述臨界解鏈溫度的公式中反映優(yōu)化雜交條件的重要參數(shù)。對(duì)于大約600個(gè)或更多的核苷酸來(lái)說(shuō)，該公式如下Tm 81.5+0.41×(％G+C)+16.6log(陽(yáng)離子濃度)-0.63×(甲酰胺％)-600/堿基數(shù)。在適當(dāng)?shù)膰?yán)緊條件下，雜交溫度(Th)是大約低于所計(jì)算Tm的20到40℃，20到25℃，或者，優(yōu)選地30到40℃。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將會(huì)理解可很容易地確定最佳溫度和鹽條件。
對(duì)于本發(fā)明的多核苷酸，預(yù)雜交和雜交孵育的嚴(yán)緊條件是(i)在42℃，在含有50％甲酰胺的6x SSC中4-16小時(shí)，或者(ii)在65℃，在水性6x SSC溶液(1M NaCl、0.1M枸櫞酸鈉(pH 7.0))中4-16小時(shí)。通常，雜交實(shí)驗(yàn)在從60到68℃，例如65℃進(jìn)行。在這種溫度，可在6xSSC，優(yōu)選地在2xSSC或1x SSC，更優(yōu)選地在0.5xSSC，0.3xSSC或0.1x SSC(缺乏甲酰胺)中獲得嚴(yán)緊雜交條件。1xSSC含有0.15M NaCl和0.015M枸櫞酸鈉。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將會(huì)理解，探針核酸序列將與互補(bǔ)的靶核酸序列雜交。
使用已知方法設(shè)計(jì)非天然存在的有用的同系物和其片段，用于鑒定可能耐受氨基酸序列改變和/或缺失的抗原區(qū)。作為實(shí)例，比較不同物種的同源多肽；鑒定保守的序列。趨異的序列最有可能耐受序列改變。作為實(shí)例，可使用Altschul等(參考文獻(xiàn)12)的BLAST同源性搜索算法，分析序列之間的同源性?？蛇x擇地，基于可能的T或B細(xì)胞表位的計(jì)算機(jī)輔助分析，對(duì)序列進(jìn)行修飾使得它們對(duì)T和/或B細(xì)胞的反應(yīng)性更強(qiáng)。然而另一種可選擇的方法是在體外突變多肽內(nèi)的特定氨基酸殘基或序列，然后根據(jù)下面概述的方法篩選突變體多肽預(yù)防或治療衣原體感染的能力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)很容易地理解，通過(guò)本發(fā)明的篩選過(guò)程后，將不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)便會(huì)確定SEQ ID No.2、4、6或8的特定同系物或免疫原性片段是否可用于預(yù)防或治療衣原體感染。篩選方法包括下列步驟(i)用試驗(yàn)同系物或片段免疫動(dòng)物，優(yōu)選小鼠，(ii)用傳染性衣原體接種免疫的動(dòng)物；和(iii)選擇那些賦予抗衣原體保護(hù)的同系物或片段。
“賦予保護(hù)”意思是與不用試驗(yàn)的同系物或片段免疫的對(duì)照動(dòng)物相比，降低任何衣原體感染影響的嚴(yán)重性。
相應(yīng)于本發(fā)明的第一方面，提供多肽衍生物，其是SEQ ID No.1、3、5或7的部分核酸序列，與SEQ ID No.2、4、6或8同源的多肽序列的部分序列，通過(guò)內(nèi)部缺失由全長(zhǎng)多肽衍生的多肽以及融合蛋白。在免疫學(xué)領(lǐng)域中使用蛋白免疫原的片段和變體作為疫苗是一種可接受的實(shí)踐，因?yàn)樗袑?duì)誘導(dǎo)對(duì)蛋白的免疫反應(yīng)所必需的是蛋白的小(例如，8到10個(gè)氨基酸)免疫原性區(qū)。已經(jīng)證明與在非衣原體病原體的表面所暴露的抗原相對(duì)應(yīng)的各種短合成肽是抗它們各對(duì)應(yīng)病原體的有效疫苗抗原，例如，鼠乳腺腫瘤病毒的11殘基肽(Casey & Davidson，Nucl.Acid Res.(1977)41539)、Semliki Forest病毒的16殘基肽(Snijders等，1991.J.Gen.Virol.72557-565)以及均來(lái)自狗細(xì)小病毒的兩個(gè)15殘基的重疊肽(Langeveld等，Vaccine 12(15)1473-1480，1994)。
因此，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的是，閱讀本說(shuō)明書(shū)后，SEQ ID No2、4、6或8的部分序列或者它們的同源氨基酸序列是全長(zhǎng)序列固有的，并且是經(jīng)由本發(fā)明的教導(dǎo)得出的。這些多肽片段的長(zhǎng)度優(yōu)選地至少為12個(gè)氨基酸。有利地是，它們的長(zhǎng)度至少為20個(gè)氨基酸，優(yōu)選地至少50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地至少75個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地至少100個(gè)氨基酸。
使用上述參數(shù)以及使用與有待擴(kuò)增片段的5’和3’端的上游和下游序列匹配的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲取編碼與SEQ ID No2、4、6或8同源序列的部分序列的30到600個(gè)核苷酸的多核苷酸。這種擴(kuò)增的模板多核苷酸是與SEQ ID No1、3、5或7同源的全長(zhǎng)多核苷酸，或者多核苷酸的混合物，如DNA或RNA文庫(kù)中所包含的多核苷酸。作為獲取部分序列的可選擇的方法，在上述條件下并且使用計(jì)算Tm的公式進(jìn)行篩選雜交。
如果將要獲取30到600個(gè)核苷酸的片段，通過(guò)減法修正所計(jì)算的Tm(600/多核苷酸堿基對(duì)大小)，通過(guò)低于Tm 5到10℃的雜交溫度確定嚴(yán)緊條件。如果要獲得比20-30個(gè)堿基更短的寡核苷酸，計(jì)算Tm的公式如下Tm＝4×(G+C)+2(A+T)。例如，50％G+C的18個(gè)核苷酸片段的Tm大約為54℃。對(duì)于是SEQ ID No2、4、6或8的片段或者其同源序列的短肽，通過(guò)化學(xué)合成法直接獲得。
在整個(gè)長(zhǎng)度的多肽中存在誘導(dǎo)保護(hù)性T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)的表位。然而，一些表位可能被多肽的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)掩蓋。為了顯示這些被掩蓋的表位，建立大量的除去了大部分原始蛋白結(jié)構(gòu)、并暴露被掩蓋表位的內(nèi)部缺失體。這種內(nèi)部缺失體有時(shí)影響除去菌株之間高度變異性的免疫顯性區(qū)的額外優(yōu)勢(shì)。
使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建編碼多肽片段的多核苷酸和具有大量?jī)?nèi)部缺失的多肽。這種方法包括標(biāo)準(zhǔn)PCR、反向PCR、所克隆DNA分子的限制酶處理。很容易地從各種商業(yè)來(lái)源如Stratagene中獲得這些方法的成分和它們的使用說(shuō)明。一旦構(gòu)建缺失突變體，如上如上所述檢驗(yàn)它們預(yù)防或治療衣原體感染的能力。
如本文所使用的，融合多肽是含有在N或C末端融合了任何其它多肽(這里及下文稱(chēng)作肽尾)本發(fā)明的多肽或多肽衍生物的多肽。獲得這種融合多肽的簡(jiǎn)單方式是通過(guò)多核苷酸序列的符合讀框融合，即雜合基因的翻譯。將編碼融合多肽的雜合基因插入到用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的表達(dá)載體中?？蛇x擇地，將編碼多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列插入到已存在編碼肽尾的多核苷酸的表達(dá)載體中?？少I(mǎi)到這種載體和它們的使用說(shuō)明，例如，從New England Biolabs購(gòu)買(mǎi)的pMal-c2或pMal-p2系統(tǒng)，其中肽尾是麥芽糖結(jié)合蛋白、Pharmacia的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)或者可從Novagen獲得的His-Tag系統(tǒng)。這些和其它表達(dá)系統(tǒng)提供了便于本發(fā)明的多肽和衍生物進(jìn)一步純化的手段。
融合多肽的有利的實(shí)例是將本發(fā)明的多肽或同系物或片段與具有佐劑活性的多肽融合，如霍亂毒素的B亞基或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素的B亞基。另一個(gè)有利的融合是將多肽、同系物或片段與強(qiáng)T細(xì)胞表位或B-細(xì)胞表位融合。這種表位可以是本領(lǐng)域中已知的表位(例如，乙型肝炎病毒核心抗原，D.R.Millich等，“Antibody production to thenucleocapsid and envelope of the Hepatitis B virus primed by a singlesynthetic T cell site”，Nature.1987.329547-549)，或者基于可能的T或B細(xì)胞表位的計(jì)算機(jī)輔助分析，已在本發(fā)明的另一個(gè)多肽中被鑒定的表位。相應(yīng)于本發(fā)明的該方面的是包括SEQ ID No2、4、6或8或其同系物或片段的T或B細(xì)胞表位的融合多肽，其中表位來(lái)自所述多肽或同系物或片段的多個(gè)變體，各變體之間因其表位在多肽內(nèi)的位置和序列上不同而不同。這種融合在衣原體感染的預(yù)防和治療中是有效的，因?yàn)槠鋬?yōu)化了對(duì)整個(gè)多肽、同系物或片段的T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)。
為了實(shí)現(xiàn)融合，將本發(fā)明的多肽融合到具有佐劑活性或者T或B細(xì)胞表位的多肽N末端，或者優(yōu)選地融合到C末端。可選擇地，將本發(fā)明的多肽片段內(nèi)部地插入到具有佐劑活性的多肽的氨基酸序列內(nèi)。也可將T或B細(xì)胞表位內(nèi)部地插入到本發(fā)明多肽的氨基酸序列內(nèi)。
相應(yīng)于第一方面，本發(fā)明的多核苷酸也編碼含有異源信號(hào)肽的雜前體多肽，其成熟成為本發(fā)明的多肽?！爱愒葱盘?hào)肽”意指不在本發(fā)明多肽的天然前體中存在的信號(hào)肽。
本發(fā)明的多核苷酸分子，其包括RNA、DNA或其修飾或其組合，具有各種應(yīng)用。例如DNA分子用于，(i)在重組宿主系統(tǒng)中生產(chǎn)所編碼多肽的方法中，(ii)構(gòu)建疫苗載體如痘病毒，其進(jìn)一步用于預(yù)防和/或治療衣原體感染的方法和組合物，(iii)作為疫苗試劑(以及RNA分子)，以裸露的形式或與遞送載體一起配制以及，(iv)構(gòu)建減毒衣原體菌株，其可過(guò)量表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸或者表達(dá)其非毒性，突變型蛋白。
因此，本發(fā)明的第二方面包括(i)含有本發(fā)明DNA分子的表達(dá)盒，其置于表達(dá)所需元件，也稱(chēng)作表達(dá)控制序列的控制下或者與其有效連接，特別是位于適當(dāng)啟動(dòng)子的控制下；(ii)含有本發(fā)明表達(dá)盒的表達(dá)載體；(iii)用本發(fā)明的表達(dá)盒和/或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核細(xì)胞，以及(iv)生產(chǎn)由本發(fā)明的多核苷酸所編碼的多肽或多肽衍生物的方法，其涉及在可使本發(fā)明DNA分子表達(dá)的條件下，培養(yǎng)用本發(fā)明的表達(dá)盒和/或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核細(xì)胞，以及從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所編碼的多肽或多肽衍生物。
重組表達(dá)系統(tǒng)選自原核和真核宿主。真核宿主包括酵母細(xì)胞(例如，釀酒酵母(Saccharonzyces cerevisiae)或畢赤酵母(Pichiapastoris))、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，COS1、NIH3T3或JEG3細(xì)胞)、節(jié)肢動(dòng)物細(xì)胞(例如，草地貪夜蛾(Spodoptera fruglperda)(SF9)細(xì)胞)以及植物細(xì)胞。優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是原核宿主如大腸桿菌。細(xì)菌和真核細(xì)胞可從許多不同來(lái)源中獲得，其包括本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的商業(yè)來(lái)源，例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Rockville，Maryland)。用于重組蛋白表達(dá)的細(xì)胞的商業(yè)來(lái)源也提供細(xì)胞使用的說(shuō)明。
表達(dá)系統(tǒng)的選擇取決于所表達(dá)多肽的期望特征。例如，其可用于生產(chǎn)以特定脂質(zhì)化(lipidated)型或任何其它型的本發(fā)明的多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)很容易地理解，雖然并非所有載體和表達(dá)控制序列以及宿主都能同等地很好地表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。但可根據(jù)下述指導(dǎo)方針，不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)以及不偏離本發(fā)明的范圍選擇載體、表達(dá)控制序列和宿主。
相對(duì)于選擇載體，必需選擇與將在其中存在和可能復(fù)制的載體相容的宿主。要考慮載體的拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力、其它蛋白如抗生素抗性的表達(dá)。在選擇表達(dá)控制序列時(shí)，要考慮許多變量。在這些重要的變量中要考慮序列的相對(duì)強(qiáng)度(例如，在各種條件下驅(qū)動(dòng)表達(dá)的能力)、控制序列功能的能力、有待表達(dá)的多核苷酸和控制序列之間的相容性(例如，考慮二級(jí)結(jié)構(gòu)以避免妨礙有效轉(zhuǎn)錄的發(fā)夾結(jié)構(gòu))。在選擇宿主時(shí)，選擇單細(xì)胞宿主，其與所選載體相容，耐受所表達(dá)產(chǎn)物的任何可能的毒性影響，如果這是期望的話，能夠有效地分泌所表達(dá)的產(chǎn)物，能夠表達(dá)期望構(gòu)象的產(chǎn)物，能夠很容易地按比例增加，以及能夠很容易地純化終產(chǎn)物。
表達(dá)盒的選擇取決于所選的宿主系統(tǒng)以及所表達(dá)的多肽的期望特征。通常，表達(dá)盒包括在所選宿主系統(tǒng)中有功能可以是組成型或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子；核糖體結(jié)合位點(diǎn)；如果需要的話，起始密碼子(ATG)；信號(hào)肽編碼區(qū)，例如脂質(zhì)化(lipidation)信號(hào)肽；本發(fā)明的DNA分子；終止密碼子；以及任選地3′終止區(qū)(翻譯和/或轉(zhuǎn)錄終止子)。信號(hào)肽編碼區(qū)鄰近本發(fā)明的多核苷酸并與正確的閱讀框相符。信號(hào)肽編碼區(qū)與編碼成熟多肽的DNA分子同源或異源，并且與用于表達(dá)的宿主的分泌器相容。將由本發(fā)明的DNA分子，單獨(dú)地或與信號(hào)肽一起構(gòu)成的可讀框置于啟動(dòng)子的控制下，以便在宿主系統(tǒng)中發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯。啟動(dòng)子和信號(hào)肽編碼區(qū)對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是廣泛已知和可獲得的，其包括，例如，可由阿拉伯糖誘導(dǎo)(啟動(dòng)子araB)并且在革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌中有功能的鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)(和衍生物)的啟動(dòng)子(如描述于美國(guó)專(zhuān)利No.5,028,530)；編碼噬菌體T7RNA聚合酶基因的啟動(dòng)子，其在許多表達(dá)T7聚合酶的大腸桿菌株中起作用(描述于美國(guó)專(zhuān)利No.4,952,496)；OspA脂化信號(hào)肽；以及RlpB脂質(zhì)化信號(hào)肽(Takase等，J.Bact.(1987)1695692)。
表達(dá)盒一般是表達(dá)載體的一部分，選擇能在所選表達(dá)系統(tǒng)中復(fù)制的表達(dá)載體。表達(dá)載體(例如，質(zhì)?；虿《据d體)可選自，例如，在Pouwels等(Cloning VectorsA Laboratory Manual1985，Supp.1987)中所描述的那些。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體可購(gòu)自各種商業(yè)來(lái)源。
用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中熟知的并且視所選宿主系統(tǒng)而定。
一旦表達(dá)，本發(fā)明的重組多肽(或多肽衍生物)在細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室中產(chǎn)生并保持，分泌/排泄到細(xì)胞外介質(zhì)或壁膜間隙，或者被包埋在細(xì)胞膜中。重組細(xì)胞培養(yǎng)物離心后，從細(xì)胞提取物或從上清液中回收基本上為純化型的多肽。一般地，重組多肽通過(guò)基于抗體的親和純化法或者通過(guò)可很容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員修改的其它熟知的方法進(jìn)行純化，如編碼多肽或其衍生物的多核苷酸與低親和結(jié)合區(qū)的融合。根據(jù)下述方法獲得用于通過(guò)免疫親和純化本發(fā)明多肽的有用的抗體。
本發(fā)明的多核苷酸也可用作疫苗。有兩個(gè)主要途徑，或者使用病毒的或細(xì)菌的或合成的遞送載體(即，活疫苗載體或微粒)或者施用游離型的基因，例如，插入到核酸載體中。根據(jù)下述方法評(píng)估本發(fā)明多核苷酸的治療或預(yù)防效能。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供(i)含有置于表達(dá)所需元件的控制下的本發(fā)明的DNA分子的疫苗載體如痘病毒；(ii)物質(zhì)組合物，其包括本發(fā)明的疫苗載體，以及稀釋劑或載體；具體地(iii)含有治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明疫苗載體的藥物組合物；(iv)在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗衣原體的免疫反應(yīng)的方法(例如，人；可選擇地，可在獸醫(yī)應(yīng)用中用于治療或預(yù)防動(dòng)物，例如，貓或鳥(niǎo)的衣原體感染的方法)，其涉及向哺乳動(dòng)物施用免疫原性有效量的本發(fā)明的疫苗載體以引起對(duì)衣原體的保護(hù)性或治療性免疫反應(yīng)；以及特別地，(v)預(yù)防和/或治療衣原體(例如，沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體、牲畜衣原體)感染的方法，其涉及向感染的個(gè)體施用預(yù)防或治療量的本發(fā)明的疫苗載體。
另外，本發(fā)明的另一個(gè)方面包括本發(fā)明的疫苗載體在制備預(yù)防和/或治療衣原體感染的藥物中的用途。
如本文所使用的，疫苗載體表達(dá)一種或幾種本發(fā)明的多肽或衍生物。疫苗載體可另外表達(dá)增強(qiáng)免疫反應(yīng)(佐劑效應(yīng))的細(xì)胞因子，如白介素-2(IL-2)或白介素-12(IL-12)。應(yīng)當(dāng)理解的是，將有待表達(dá)的各成分置于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所必需元件的控制下。
相應(yīng)于本發(fā)明另一方面的是包括幾種疫苗載體的組合物，其中的每一種都能表達(dá)本發(fā)明的多肽或衍生物。組合物也可包括能表達(dá)另外的衣原體抗原，或者亞基、片段、同系物、突變體或其衍生物，任選地連同或者細(xì)胞因子如IL-2或IL-12的疫苗載體。
用于在哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防感染的接種方法包括通過(guò)任何常規(guī)途徑施用本發(fā)明的疫苗載體的用途，特別是通過(guò)粘膜(例如，眼、鼻內(nèi)、口、胃、肺、腸、直腸、陰道或泌尿道)表面或通過(guò)非腸道(例如，皮下、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))途徑。優(yōu)選的途徑取決于疫苗載體的選擇。治療可以單劑量或每隔一段時(shí)間重復(fù)完成。適當(dāng)?shù)膭┝咳Q于技術(shù)人員所理解的各種參數(shù)，如疫苗載體本身、給藥途徑或被接種的哺乳動(dòng)物的情況(體重、年齡等)。
本領(lǐng)域中可利用的活疫苗載體包括病毒載體如腺病毒、痘病毒和α病毒，以及細(xì)菌載體，例如，志賀氏菌屬(Shigella)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、卡介苗(Bacille bilie de Calmette-Guerin)(BCG)以及鏈球菌屬(Streptococcus)。
腺病毒載體的實(shí)例，以及構(gòu)建能表達(dá)本發(fā)明DNA分子的腺病毒載體的方法描述于美國(guó)專(zhuān)利No.4,920,209。痘病毒載體包括牛痘和金絲雀痘病毒，分別描述于美國(guó)專(zhuān)利No.4,722,848和美國(guó)專(zhuān)利No.5,364,773。對(duì)于牛痘病毒載體(金絲雀疸)的描述見(jiàn)Taylor等(參考文獻(xiàn)13)。金絲雀痘載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有有限的復(fù)制或者不復(fù)制。
通常，用于治療或預(yù)防用途的疫苗病毒載體的劑量可從每公斤約1×104到約1×1011，有利地從約1×107到約1×1010，優(yōu)選地從約1×107到約1×109蝕斑形成單位。優(yōu)選地，通過(guò)非腸道途徑施用病毒載體；例如，分3個(gè)劑量，相隔四周。優(yōu)選地避免向含有本發(fā)明病毒載體的組合物中添加化學(xué)佐劑，因而將對(duì)病毒載體本身的免疫反應(yīng)降到最低。
甲病毒(Alphavirus)載體可包括Simliki Forest病毒載體(參考文獻(xiàn)16)、Sindbis病毒載體(參考文獻(xiàn)17)或Venezuelan馬腦炎病毒載體(參考文獻(xiàn)18)。裸RNA或質(zhì)粒DNA以及可含有復(fù)制缺陷甲病毒的重組顆粒可有效地用于免疫。
用作活的口服疫苗的非產(chǎn)毒霍亂弧菌突變體株是已知的。美國(guó)專(zhuān)利No.4,882,278描述了兩個(gè)ctxA等位基因中均缺失了大量編碼序列，結(jié)果不產(chǎn)生有功能的霍亂毒素的菌株。能表達(dá)由本發(fā)明DNA分子所編碼的多肽或多肽衍生物的霍亂菌株的有效疫苗劑量在適于所選給藥途徑的體積中含有約1×105到約1×109，優(yōu)選地約1×106到約1×108的活細(xì)菌。優(yōu)選的給藥途徑包括所有粘膜途徑；最優(yōu)選地，這些載體通過(guò)鼻內(nèi)或口服給藥。
減毒的鼠傷寒沙門(mén)氏菌株，通過(guò)基因工程改造以重組表達(dá)或不表達(dá)異源抗原，以及它們作為口服疫苗的用途描述于1998年12月22日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利5,851,519。優(yōu)選的給藥途徑包括所有粘膜途徑；最優(yōu)選地，這些載體通過(guò)鼻內(nèi)或口服給藥。
在本發(fā)明的上下文中，用作疫苗載體的其它減毒細(xì)菌株描述于1997年7月1日授予的美國(guó)專(zhuān)利5,643,771。
在細(xì)菌載體中，將本發(fā)明的多核苷酸插入到細(xì)菌基因組中或者作為質(zhì)粒的一部分保持游離狀態(tài)?？墒褂眉?xì)菌載體表達(dá)衣原體疫苗抗原或者將質(zhì)粒DNA等表達(dá)載體如遞送到宿主細(xì)胞中，其隨后在宿主細(xì)胞中表達(dá)并引發(fā)對(duì)衣原體抗原的免疫反應(yīng)。
包括本發(fā)明疫苗細(xì)菌載體的組合物可進(jìn)一步含有佐劑。許多佐劑對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。優(yōu)選的佐劑包括，但不限于鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁、水包油乳劑，皂苷佐劑如ISCOMs，細(xì)胞因子如白介素、干擾素、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物可以是預(yù)防性的(即，用于預(yù)防疾病)或治療性的(即，在感染后用于治療疾病)。用作疫苗的免疫原性組合物包括免疫學(xué)有效量的抗原或抗原的免疫原性片段。免疫學(xué)有效量意思是作為單劑量或作為系列劑量的一部分向個(gè)體施用的對(duì)預(yù)防或治療有效的量。術(shù)語(yǔ)治療有效量指使治療以達(dá)到好轉(zhuǎn)，或防止所關(guān)注的疾病或情況，或者顯示可檢測(cè)到的治療或預(yù)防效果的治療劑的量。對(duì)于本發(fā)明的目的，有效劑量將從1μg/kg到100μg/kg或者10μg/kg到50μg/kg。
免疫原性組合物和疫苗可通過(guò)非腸道施用，通過(guò)皮下注射、真皮內(nèi)或肌內(nèi)注射。可選擇地，可配制根據(jù)本發(fā)明所配制的免疫原性組合物并以在粘膜表面引起免疫反應(yīng)的方式遞送。因此，可通過(guò)，例如鼻或口(intagastric)途徑向粘膜表面施用免疫原性組合物?？蛇x擇地，包括栓劑和口服制劑的其它給藥方式也是可行的。對(duì)于栓劑，粘合劑和載體可包括，例如，polyalkalene glycois或甘油三酯。這種栓劑可由含有大約10％，優(yōu)選地大約1到2％的活性免疫原性成分的混合物組成?？诜苿┛砂ㄕＫ褂玫妮d體，如，藥物級(jí)的糖精、纖維素和碳酸鎂。這些組合物可采取溶液、懸液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋劑或粉劑的形式，含有大約1到95％的活性成分，優(yōu)選地大約20到75％。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供(i)一種物質(zhì)組合物，其包括本發(fā)明的多核苷酸，連同稀釋劑或載體；(ii)包括治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明多核苷酸的藥物組合物；(iii)在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗衣原體的免疫反應(yīng)的方法，通過(guò)施用免疫原性有效量的本發(fā)明的多核苷酸，引起對(duì)衣原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)；以及特別地，(iv)預(yù)防和/或治療衣原體(例如，沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體或牲畜衣原體)感染的方法，通過(guò)向感染個(gè)體施用預(yù)防或治療量的本發(fā)明的多核苷酸。另外，本發(fā)明的第四方面包括本發(fā)明的多核苷酸在制備用于預(yù)防和/或治療衣原體感染的藥物中的用途。優(yōu)選的用途包括將DNA分子置于用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的條件下，尤其在不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制并且基本上不能在哺乳動(dòng)物基因組中整合的質(zhì)粒中。
本發(fā)明的多核苷酸的用途包括它們作為疫苗施用給哺乳動(dòng)物，用于治療或預(yù)防性目的。這種多核苷酸以DNA的形式作為不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制并且不能整合到哺乳動(dòng)物基因組中的質(zhì)粒的一部分。一般地，將這種DNA分子置于適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制下。啟動(dòng)子以普遍存在地或組織特異性方式起作用。非組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(描述于美國(guó)專(zhuān)利No.4,168,062)和Rous肉瘤病毒啟動(dòng)子(描述于Norton & Coffin，Molec.Cell Biol.(1985)5281)。組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例是在肌肉細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的結(jié)蛋白啟動(dòng)子(Li & Paulin，J.Biol.Chem.(1993)26810403)。啟動(dòng)子的使用對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。有用的載體描述于許多出版物中，特別是WO 94/21797。
用作疫苗的本發(fā)明的多核苷酸編碼對(duì)應(yīng)多肽的前體或成熟型。在前體型中，信號(hào)肽可以是同源的或異源的。在后者的情況中，可使用真核前導(dǎo)序列。
如本文所使用的，本發(fā)明的組合物含有一種或幾種多核苷酸，任選擇地具有至少一個(gè)編碼另一衣原體抗原、或其片段、衍生物、突變體或類(lèi)似物的額外的多核苷酸。組合物也可含有編碼細(xì)胞因子，如白介素-2(IL-2)或白介素-12(IL-12)的額外的多核苷酸以便提高免疫反應(yīng)。將這些額外的多核苷酸置于用于表達(dá)的適當(dāng)?shù)目刂葡?。有利地是，本發(fā)明的DNA分子和/或額外的DNA分子包含在同一組合物中，存在于同一質(zhì)粒中。
在本發(fā)明多核苷酸治療劑的制備中使用制備和純化多核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。對(duì)于作為疫苗的用途，根據(jù)下面所概述的各種方法配制本發(fā)明的多核苷酸。
一種方法利用裸露型的多核苷酸，無(wú)任何遞送載體。將這種多核苷酸在生理學(xué)可接受的溶液，如無(wú)菌鹽或無(wú)菌緩沖鹽，有或沒(méi)有載體的溶液中簡(jiǎn)單地稀釋。當(dāng)存在載體時(shí)，載體優(yōu)選地是等滲、低滲或弱高滲的，并且具有相對(duì)低的離子強(qiáng)度，如由蔗糖溶液所提供的離子強(qiáng)度，例如，含有20％蔗糖的溶液。
可選擇的方法利用與輔助細(xì)胞攝取的試劑結(jié)合的多核苷酸。這種試劑的實(shí)例是(i)修飾細(xì)胞滲透性的化學(xué)制劑，如布比卡因(見(jiàn)，例如，WO 94/16737)，(ii)用于包封多核苷酸的脂質(zhì)體，或(iii)與多核苷酸結(jié)合的陽(yáng)離子脂質(zhì)或二氧化硅，金或鎢微粒。
陰離子和中性脂質(zhì)體是本領(lǐng)域中熟知的(見(jiàn)，例如，LiposomesAPractical Approach，RPC New Ed，IRL press(1990)，詳細(xì)描述了制備脂質(zhì)體的方法)并可用于傳遞大范圍的產(chǎn)物，包括多核苷酸。
陽(yáng)離子脂質(zhì)在本領(lǐng)域中也是熟知的，通常用于基因傳遞。這種脂質(zhì)包括也稱(chēng)為DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨)的LipofectinTM、DOTAP(1，2-雙(油酰氧)-3-(三甲銨)丙烷)、DDAB(二甲基雙十八烷基溴化銨)、DOGS(雙十八烷基酰胺甘氨酰精胺)以及膽固醇衍生物如DC-Chol(3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙基)氨甲酰基-膽固醇)。可在EP 187,702、WO 90/11092、美國(guó)專(zhuān)利No.5,283,185、WO91/15501、WO95/26356以及美國(guó)專(zhuān)利No.5,527,928中發(fā)現(xiàn)這些陽(yáng)離子脂質(zhì)的描述。優(yōu)選地與中性脂質(zhì)如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)結(jié)合使用的用于基因傳遞的陽(yáng)離子脂質(zhì)，如在WO 90/11092中所描述的作為實(shí)例。
含有陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制劑可任選地含有其它便于轉(zhuǎn)染的化合物。
如在WO 91/00359、WO 93/17706和Tang等(參考文獻(xiàn)19)中所描述的，使用金或鎢微粒進(jìn)行基因傳遞。使用無(wú)針注射裝置(“基因槍”)通過(guò)真皮內(nèi)或表皮內(nèi)途徑注射微顆粒包被的多核苷酸，如在美國(guó)專(zhuān)利No.4,945,050、美國(guó)專(zhuān)利No.5,015,580和WO 94/24263中所描述的那些。
在疫苗接受者中所用的DNA的量取決于，例如，DNA構(gòu)建體中所用啟動(dòng)子的強(qiáng)度、所表達(dá)的基因產(chǎn)物的免疫原性、有待給藥的哺乳動(dòng)物的情況(例如，體重、年齡以及哺乳動(dòng)物的總的健康)、給藥方式以及制劑的類(lèi)型。一般地，可向成年人施用從大約1μg到大約1mg，優(yōu)選地，從大約10μg到大約800μg，以及更優(yōu)選地，從大約25μg到大約250μg的治療或預(yù)防有效量。可以單劑量或每隔一段時(shí)間重復(fù)給藥。
給藥的途徑是疫苗領(lǐng)域中所用的任何常規(guī)途徑。作為總的指導(dǎo)，通過(guò)粘膜表面施用本發(fā)明的多核苷酸，例如，眼、鼻內(nèi)、肺、口、腸、直腸、陰道以及泌尿道表面；或者通過(guò)非腸道途徑，例如，通過(guò)靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、表皮內(nèi)或者肌內(nèi)途徑。給藥途徑的選擇取決于所選的制劑。將與布比卡因結(jié)合配制的多核苷酸有利地施用到肌肉內(nèi)。當(dāng)使用中性或陰離子脂質(zhì)體或陽(yáng)離子脂質(zhì)，如DOTMA或DC-Chol時(shí)，可通過(guò)靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)(噴霧)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)以及皮下途徑有利地注射該制劑?？赏ㄟ^(guò)肌內(nèi)、真皮內(nèi)或皮下途徑有利地施用裸露型的多核苷酸。
盡管不是絕對(duì)必需的，但是這種組合物也可含有佐劑。假如這樣的話，為了顯示佐劑的效果，優(yōu)選不需要伴隨給藥的全身佐劑，如，例如，QS21，其描述于美國(guó)專(zhuān)利No.5,057,546。
在本申請(qǐng)中所提供的序列信息能夠設(shè)計(jì)用于診斷目的的特異性核苷酸探針和引物。因此，本發(fā)明的第五方面提供核苷酸探針或引物，其具有在SEQ ID No1或3所示序列中所發(fā)現(xiàn)的序列或者具有從SEQID No1或3所示序列的遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性衍生的序列。
在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“探針”指DNA(優(yōu)選地單鏈)或RNA分子(或其修飾或其組合)，其在上述所定義的嚴(yán)緊條件下與具有SEQID No1的核苷酸分子，或者與SEQ ID No1或3同源的序列，或者與其互補(bǔ)或反義序列雜交。通常，探針顯著短于全長(zhǎng)序列。這種探針含有從大約5到大約100個(gè)，優(yōu)選地從大約10到大約80個(gè)核苷酸。特別是，探針具有與SEQ ID No1的一部分至少75％，優(yōu)選地至少85％，更優(yōu)選地至少95％同源，或者與這些序列互補(bǔ)的序列。探針可含有修飾的堿基，如肌苷、甲基-5-脫氧胞苷、脫氧尿苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷或者二氨基-2，6-嘌呤。也可修飾或取代糖或磷酸殘基。例如，可用聚酰胺取代脫氧核糖殘基，可用酯基取代磷酸殘基，如二磷酸、烷基、芳基膦酸酯以及硫代磷酸酯。另外，可通過(guò)包括烷基的這些基團(tuán)修飾核糖核苷酸上的2′-羥基。
可在診斷試驗(yàn)中使用本發(fā)明的探針，作為捕獲或檢測(cè)探針通過(guò)共價(jià)方法或者通過(guò)被動(dòng)吸附，直接地或間接地將這種捕獲探針常規(guī)地固定到固體支持物上。檢測(cè)探針通過(guò)選自下列的檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記放射性同位素，酶如過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶以及能水解產(chǎn)色的、熒光的或發(fā)光底物的酶，產(chǎn)色的、熒光的或發(fā)光的化合物，核苷酸堿基類(lèi)似物以及生物素。
本發(fā)明的探針用于任何常規(guī)的雜交技術(shù)，如點(diǎn)印跡、Southern印跡(Southern，J.Mol.Biol.(1975)98503)、northern印跡(除了RNA用作靶外，與Southern印跡相同)、或者夾心技術(shù)(Dunn等，Cell(1977)1223)。后者的技術(shù)涉及使用相互之間核苷酸序列至少部分不同的特異性捕獲探針和/或特異性檢測(cè)探針。
引物是通常大約10到大約40個(gè)核苷酸的探針，其用于在擴(kuò)增過(guò)程(例如，PCR)中，在延伸過(guò)程中，或者在反轉(zhuǎn)錄方法中引發(fā)DNA的酶促聚合。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法標(biāo)記在涉及PCR的診斷方法中所用的引物。
如本文所描述的，本發(fā)明也包括(i)包括本發(fā)明的用于檢測(cè)和/或鑒定生物材料中是否存在衣原體的探針的試劑；(ii)用于檢測(cè)和/或鑒定生物材料中是否存在衣原體的方法，其中(a)樣本回收自或來(lái)自生物材料，(b)從材料中提取DNA或RNA并變性，和(c)在嚴(yán)緊雜交條件下暴露于本發(fā)明的探針，例如，捕獲、檢測(cè)探針或兩者，以便檢測(cè)雜交；以及(iii)用于檢測(cè)和/或鑒定生物材料中是否存在衣原體的方法，其中(a)樣本回收自或來(lái)自生物材料，(b)從其中提取DNA，(c)將所提取的DNA用至少一條，優(yōu)選地兩條本發(fā)明的引物引發(fā)并通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，以及(d)產(chǎn)生所擴(kuò)增的DNA片段。
很顯然，SEQ ID No1、3、5或7的多核苷酸序列、其同系物和部分序列的公開(kāi)能夠獲得它們對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。因此，本發(fā)明的第六方面特征是具有由本發(fā)明多核苷酸編碼的氨基酸序列的基本上純化的多肽或多肽衍生物。
本文所使用的“基本上純化的多肽”定義為從其天然存在的環(huán)境中分離的多肽和/或不存在其合成環(huán)境中所存在的大多數(shù)多肽的多肽。例如，基本上純化的多肽是無(wú)胞質(zhì)多肽。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將很容易地理解，本發(fā)明的多肽可從自然來(lái)源，即，從衣原體菌株中純化，或者通過(guò)重組方法生產(chǎn)。
相應(yīng)于本發(fā)明的第六方面的是經(jīng)過(guò)修飾或處理以提高它們?cè)诎袆?dòng)物中的免疫原性的多肽、同系物或片段，其中多肽、同系物或片段旨在賦予抗衣原體的保護(hù)。這種修飾或處理包括用氨基酸衍生物如3-甲基組氨酸、4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等的氨基酸取代，在多肽、同系物或片段的制備后進(jìn)行的修飾或缺失，如氨基酸的游離氨基、羧基或羥基側(cè)鏈基團(tuán)的修飾。
通過(guò)篩選與引起抗具有SEQ ID No1、3、5或7氨基酸序列的參考多肽的抗血清的交叉反應(yīng)性，鑒定了具有特異抗原性的由本發(fā)明多核苷酸所編碼的同源多肽或多肽衍生物。該方法如下制備抗純化的參考多肽、融合多肽(例如，MBP、GST或His-tag系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物，在Invitrogen產(chǎn)品手冊(cè)中包含pcDNA3.1/Myc-His(+)A、B和C以及XpressTm系統(tǒng)蛋白純化的描述和使用說(shuō)明)，或預(yù)計(jì)具有抗原性的合成肽的單特異性超免疫抗血清。對(duì)于制備抗融合多肽的抗血清，那么使用兩個(gè)不同的融合系統(tǒng)。可根據(jù)許多方法測(cè)定特異性抗原性，包括下述Western印跡、點(diǎn)印跡和ELISA。
在Western印跡試驗(yàn)中，根據(jù)Laemmli(Nature(1970)227680)所描述的方法將作為純化制劑或大腸桿菌總提取物的篩選產(chǎn)物進(jìn)行SDS-Page電泳。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后，將材料進(jìn)一步與在從大約1∶5到大約1∶5000，優(yōu)選地從大約1∶100到大約1∶500的稀釋范圍內(nèi)稀釋的單特異性超免疫抗血清孵育。一旦與產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的條帶在上述范圍內(nèi)的任何稀釋液中顯示反應(yīng)性，則表明特異抗原性。
在ELISA試驗(yàn)中，將要篩選的產(chǎn)物優(yōu)選地用作包被抗原。盡管也可使用整個(gè)細(xì)胞提取物，但是優(yōu)選使用純化的制劑。簡(jiǎn)要地，將約10μg蛋白/ml的約100μl制劑分配到96孔聚碳酸酯ELISA平板的孔內(nèi)。將平板在37℃孵育2小時(shí)，然后在4℃過(guò)夜。將平板用含0.05％Tween 20的磷酸緩沖鹽(PBS/Tween緩沖液)沖洗。將孔用250μl含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS飽和以防止非特異性抗體結(jié)合。在37℃孵育1小時(shí)后，將平板用PBS/Tween緩沖液沖洗。將抗血清在含有0.5％BSA的PBS/Tween緩沖液中連續(xù)稀釋。每個(gè)孔中加入100μl稀釋液。將平板在37℃孵育90分鐘，沖洗并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行評(píng)估。例如，當(dāng)在兔中引起特異性抗體時(shí)，向孔中加入山羊抗兔過(guò)氧化物酶綴合物。孵育是在37℃進(jìn)行90分鐘并沖洗平板。反應(yīng)用適當(dāng)?shù)牡孜镲@色并通過(guò)比色法測(cè)量反應(yīng)(通過(guò)分光光度法測(cè)量吸光度)。在上述試驗(yàn)條件下，高于非免疫對(duì)照血清的O.D.值，顯示陽(yáng)性反應(yīng)。
在點(diǎn)印跡試驗(yàn)中，盡管也可使用整個(gè)細(xì)胞提取物，但是優(yōu)選純化的產(chǎn)物。簡(jiǎn)要地，將大約100μg/ml的產(chǎn)物溶液在50mM Tris-HCl(pH7.5)中連續(xù)稀釋兩倍。將每種稀釋液100μl應(yīng)用到裝在96孔點(diǎn)印跡裝置(Biorad)中的0.45μm硝酸纖維素膜上。通過(guò)向系統(tǒng)中應(yīng)用真空除去緩沖液。通過(guò)添加50mM Tris-HCl(pH 7.5)沖洗孔并將膜進(jìn)行風(fēng)干。將膜在封閉緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.5)0.15M NaCl，10g/L脫脂乳)中飽和并與從大約1∶50到大約1∶5000，優(yōu)選地大約1∶500的抗血清稀釋液孵育。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法顯示反應(yīng)。例如，當(dāng)使用兔抗體時(shí)，向孔中加入山羊抗兔過(guò)氧化物酶綴合物。在37℃孵育90分鐘，并沖洗印跡。反應(yīng)用適當(dāng)?shù)牡孜镲@色并終止。通過(guò)有色點(diǎn)的外觀目測(cè)反應(yīng)，例如，通過(guò)比色法。在上述試驗(yàn)條件下，一旦有色點(diǎn)與至少約1∶5，優(yōu)選地至少約1∶500的稀釋液相關(guān)，則顯示為陽(yáng)性反應(yīng)。
可根據(jù)下述方法評(píng)估本發(fā)明的多肽或衍生物的治療或預(yù)防效能。本發(fā)明的第七方面提供(i)一種組合物，其包括本發(fā)明的多肽，連同稀釋劑或載體；具體地(ii)含有治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明多肽的藥物組合物；(iii)在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗衣原體的免疫反應(yīng)的方法，即通過(guò)向哺乳動(dòng)物施用免疫原性有效量的本發(fā)明的多肽以引起對(duì)衣原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)；特別是，(iv)預(yù)防和/或治療衣原體(例如，沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體或牲畜衣原體)的方法，即通過(guò)向感染的個(gè)體施用預(yù)防或治療量的本發(fā)明的多肽。另外，本發(fā)明的第七方面包括本發(fā)明的多肽在制備用于預(yù)防和/或治療衣原體感染的藥物中的用途。
如在本文所使用的，通過(guò)疫苗領(lǐng)域中已知的常規(guī)途徑施用本發(fā)明的免疫原性組合物，特別是通過(guò)粘膜(例如，眼、鼻內(nèi)、肺、口、胃、腸、直腸、陰道或泌尿道)表面或通過(guò)非腸道(例如，皮下、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))途徑。給藥途徑的選擇取決于許多參數(shù)，如與多肽結(jié)合的佐劑。如果使用粘膜佐劑，那么優(yōu)選鼻內(nèi)或口服途徑。如果使用脂質(zhì)制劑或鋁化合物，那么優(yōu)選非腸道途徑，最優(yōu)選皮下或肌內(nèi)途徑。該選擇也取決于疫苗試劑的性質(zhì)。例如，最好向粘膜表面施用與CTB或LTB融合的本發(fā)明的多肽。
如本文所使用的，本發(fā)明的組合物包含一種或幾種本發(fā)明的多肽或衍生物。組合物可任選地含有至少一種另外的衣原體抗原，或者其亞基、片段、同系物、突變體或衍生物。
對(duì)于在本發(fā)明組合物中的用途，將多肽或其衍生物配制成或具有脂質(zhì)體，優(yōu)選地中性或陰離子脂質(zhì)體、微球體、ISCOMS、病毒樣顆粒(VLPs)或細(xì)菌菌蛻(EP 1158 966B1)以便于傳遞和/或提高免疫反應(yīng)。這些化合物對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很容易獲得。
以單劑量或者如果需要，每隔一段時(shí)間重復(fù)完成治療，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定。例如，給予引發(fā)劑量后以每周一次或每月一次的時(shí)間間隔強(qiáng)化三次。適當(dāng)?shù)膭┝咳Q于各種參數(shù)，包括受體(例如，成體或幼體)、特定的疫苗抗原、給藥的途徑和頻率、佐劑存在/缺乏或者佐劑的類(lèi)型、以及期望的效果(例如，保護(hù)和/或治療)，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。一般地，通過(guò)粘膜途徑以從大約10μg到大約500μg，優(yōu)選地從大約1μg到大約200μg的量施用本發(fā)明的疫苗抗原。對(duì)于非腸道給藥途徑，劑量通常不超過(guò)大約1mg，優(yōu)選地大約100μg。
當(dāng)用作疫苗試劑時(shí)，可將本發(fā)明的多核苷酸和多肽按順序地用作多步免疫過(guò)程的一部分。例如，哺乳動(dòng)物最初用本發(fā)明的疫苗載體如痘病毒引發(fā)，例如，通過(guò)非腸道途徑，然后用由疫苗載體所編碼的多肽強(qiáng)化兩次，例如，通過(guò)粘膜途徑。在另一個(gè)實(shí)例中，也使用與本發(fā)明的多肽或衍生物結(jié)合的脂質(zhì)體用于引發(fā)，使用本發(fā)明的可溶的多肽或衍生物，聯(lián)合粘膜佐劑(例如，LT)，通過(guò)粘膜進(jìn)行強(qiáng)化。
根據(jù)第七方面，本發(fā)明的多肽衍生物也用作檢測(cè)，例如血液樣本中是否存在抗衣原體抗體的診斷劑。這種多肽長(zhǎng)大約5到大約80，優(yōu)選地大約10到大約50個(gè)氨基酸。它們被標(biāo)記或未被標(biāo)記，視診斷方法而定。下面描述包括這種試劑的診斷方法。
一旦本發(fā)明的DNA分子表達(dá)，即可使用已知的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)生產(chǎn)并純化多肽或多肽衍生物。如上所述，可產(chǎn)生多肽或多肽衍生物，作為含有便于純化的融合尾的融合蛋白。融合產(chǎn)物用于免疫小哺乳動(dòng)物，例如，小鼠或兔子，以便產(chǎn)生抗多肽或多肽衍生物的抗體(單特異性抗體)。因此，本發(fā)明的第八方面提供結(jié)合本發(fā)明多肽或多肽衍生物的單特異性抗體。
“單特異性抗體”意指能與唯一的天然存在的衣原體多肽反應(yīng)的抗體。本發(fā)明的抗體是多克隆或單克隆抗體。單特異性抗體可以是重組的，例如，嵌合的(例如，由與人恒定區(qū)結(jié)合的鼠源的可變區(qū)構(gòu)成)、人源化的(人免疫球蛋白恒定區(qū)主鏈連同小鼠等動(dòng)物源的高變異區(qū))、和/或單鏈。多克隆和單特異性抗體也都可以是免疫球蛋白片段的形式，例如F(ab)2或Fab片段。本發(fā)明的抗體是任何同種型的抗體，例如，IgG或IgA，多克隆抗體是單同種型抗體或同種型抗體的混合物。
通過(guò)用包括所述多肽、同系物或片段的組合物免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗本發(fā)明的多肽、同系物或片段的抗體。這種抗體可以是多克隆或單克隆抗體。生產(chǎn)多克隆或單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。
本發(fā)明的抗體，其由本發(fā)明的多肽或多肽衍生物引起，并使用標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，例如，Western印跡分析、點(diǎn)印跡試驗(yàn)或ELISA。該抗體用于診斷方法中以檢測(cè)樣本，如生物樣本中是否存在衣原體抗原。該抗體也用于親和層析中以純化本發(fā)明的多肽或多肽衍生物。如在下面進(jìn)一步討論的，這種抗體可用于預(yù)防性和治療性被動(dòng)免疫方法。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供(i)用于檢測(cè)生物樣本中是否存在衣原體的試劑，其含有本發(fā)明的抗體、多肽或多肽衍生物；和(ii)用于檢測(cè)生物樣本中是否存在衣原體的診斷方法，即通過(guò)將生物樣本與本發(fā)明的抗體、多肽或多肽衍生物接觸，以便形成免疫復(fù)合體，以及通過(guò)檢測(cè)這種復(fù)合體以表明在樣本或樣本來(lái)源的生物體中是否存在衣原體。
本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將很容易地理解，無(wú)論使用哪一種，在樣本的成分和抗體、多肽或多肽衍生物之間都能形成免疫復(fù)合體，并在檢測(cè)復(fù)合體之前除去任何未結(jié)合的材料。應(yīng)當(dāng)理解的是，多肽試劑可用于檢測(cè)樣本，例如血液樣本中是否存在抗衣原體抗體，而本發(fā)明的抗體用于篩選樣本，如胃提取物或活檢中是否存在衣原體多肽。
對(duì)于診斷應(yīng)用，試劑(即，本發(fā)明的抗體、多肽或多肽衍生物)以游離狀態(tài)或被固定在固體支持物上，如試管、珠或本領(lǐng)域中任何其它常規(guī)所用的支持物。使用直接的或間接的方法實(shí)現(xiàn)固定。直接的方法包括支持物和試劑之間的被動(dòng)吸附(非共價(jià)結(jié)合)或共價(jià)結(jié)合。“間接方法”意指首先將與試劑相互作用的抗試劑化合物附著到固體支持物上。例如，如果使用多肽試劑，那么與其結(jié)合的抗體可作為抗試劑，只要其結(jié)合不參與生物樣本中抗體識(shí)別的表位即可。間接方法也可使用配體-受體系統(tǒng)，例如，將分子如維生素移植到多肽試劑上和將對(duì)應(yīng)的受體固定到固相上。這通過(guò)生物素-鏈霉抗生物素系統(tǒng)舉例說(shuō)明?？蛇x擇地，通過(guò)化學(xué)方法或者通過(guò)基因工程方法向試劑添加肽尾，并且通過(guò)被動(dòng)吸附或肽尾的共價(jià)鍵固定移植的或融合的產(chǎn)物。
試劑盒中可包括這種診斷試劑，也包括使用說(shuō)明。用檢測(cè)手段標(biāo)記試劑，當(dāng)其與靶結(jié)合時(shí)允許實(shí)施試劑的檢測(cè)。檢測(cè)工具可以是熒光劑，如熒光素異氰酸酯或熒光素異硫氰酸鹽，或者是酶，如辣根過(guò)氧化物酶或熒光素酶或堿性磷酸酶，或者是放射性元素，如125I或51Cr。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供從生物樣本中純化本發(fā)明的多肽或多肽衍生物的方法，其涉及對(duì)生物樣本進(jìn)行基于抗體的親和層析，其中抗體是本發(fā)明的單特異性抗體。
對(duì)于在本發(fā)明純化方法中的用途，抗體是多克隆或單克隆抗體，優(yōu)選地是IgG型抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)方法從抗血清中制備純化的IgG。常規(guī)層析支持物以及移植抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法描述于，例如，AntibodiesALaboratory Manual，D.Lane，E.Harlow，編(1988)和下面所概述的方法。
簡(jiǎn)要地，將生物樣本，如優(yōu)選地溶于緩沖液中的沙眼衣源體提取物，應(yīng)用到層析材料上，優(yōu)選地用稀釋生物樣本所用的緩沖液平衡以便使本發(fā)明的多肽或多肽衍生物(即，抗原)吸附到材料上。層析材料，如結(jié)合本發(fā)明抗體的凝膠或樹(shù)脂，是以束或柱的形狀。洗去未結(jié)合的成分，然后將抗原用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液洗脫，如甘氨酸緩沖液或含有離液劑的緩沖液，例如，鹽酸胍或高濃度鹽(例如，3M MgCl2)?；厥障疵摰酿s分并檢測(cè)是否存在抗原，例如，通過(guò)在280nm測(cè)定吸光度進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供(i)組合物，其包括本發(fā)明的單特異性抗體，連同稀釋劑或載體；(ii)包括治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的單特異性抗體的藥物組合物，以及(iii)治療或預(yù)防衣原體(例如，沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體或牲畜衣原體)感染的方法，即通過(guò)向感染的個(gè)體施用治療或預(yù)防量的本發(fā)明的單特異性抗體。另外，本發(fā)明的第十一方面包括本發(fā)明的單特異性抗體在制備用于治療或預(yù)防衣原體感染的藥物中的用途。
單特異性抗體是多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選地是IgA同種型抗體(主要地)。在被動(dòng)免疫中，向哺乳動(dòng)物的粘膜表面施用抗體，例如，胃粘膜，例如通過(guò)口服或通過(guò)胃內(nèi)，有利地，在存在碳酸氫鹽緩沖液時(shí)。可選擇地，進(jìn)行全身給藥時(shí)，不需要碳酸氫鹽緩沖液。本發(fā)明的單特異性抗體作為單一活性成分或者作為與至少一種對(duì)不同的衣原體多肽特異的單特異性抗體的混合物施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定所用抗體的量和具體的給藥方案。例如，一周內(nèi)每日施用大約100到1,000μg抗體。
使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)估治療或預(yù)防效能，例如，通過(guò)測(cè)量誘導(dǎo)的粘膜免疫反應(yīng)或誘導(dǎo)的保護(hù)性和/或治療免疫，使用，例如本文所公開(kāi)的衣原體小鼠模型。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將很容易地認(rèn)識(shí)到，模型中所用的衣原體菌株可用另一種衣原體菌株或血清變型替代。例如，優(yōu)選地在小鼠模型中使用沙眼衣原體菌株評(píng)估沙眼衣原體的DNA分子和多肽的效能。通過(guò)將衣原體感染的程度與對(duì)照組的程度進(jìn)行比較，確定保護(hù)作用。當(dāng)與對(duì)照組相比感染降低時(shí)，證明有保護(hù)作用?？墒褂媒y(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明與對(duì)照組的差異。對(duì)本發(fā)明的多核苷酸、疫苗載體、多肽及其衍生物以及抗體進(jìn)行這種評(píng)估。
在上述任何一種疫苗組合物中有用的佐劑如下。
用于非腸道施用的佐劑包括鋁化合物，如氫氧化鋁、磷酸鋁以及磷酸氫氧化鋁。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案將抗原用鋁化合物沉淀或吸附到鋁化合物上。在非腸道施用中使用其它佐劑，如RIBI(ImmunoChem，Hamilton，MT)。
用于粘膜施用的佐劑包括細(xì)菌毒素，例如，霍亂毒素(CT)、大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)、難辨梭菌(Clostridium difficile)毒素A和百日咳(pertussis)毒素(PT)、或者它們的組合，亞基，類(lèi)毒素或突變體，如天然霍亂毒素亞單位B(CTB)的純化制劑。片段、同系物、衍生物和與這些毒素中的任何一種的融合也是合適的，只要它們保留佐劑活性即可。優(yōu)選地，使用毒性降低的突變體。在粘膜施用中也使用其它佐劑，如細(xì)菌單磷酰脂質(zhì)A(MPLA)，例如，大腸桿菌、明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌(Salmonella minnesota)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)、或者弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)的MPLA；皂苷或聚交酯乙交酯(PLGA)微球體。
既可用于粘膜施用也可用于非腸道施用的佐劑包括聚磷腈(WO95/02415)、DC-chol(3b-(N-(N-N′-二甲基氨基甲烷)-氨基甲酰基)膽固醇)；美國(guó)專(zhuān)利No.5,283,185和WO96/14831)和QS-21(WO 88/09336)。
以常規(guī)方式生產(chǎn)含有本發(fā)明多核苷酸、多肽、多肽衍生物或抗體的本發(fā)明的任何藥物組合物。特別是，將其與藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體一起配制，例如，水或鹽溶液如磷酸緩沖鹽。一般地說(shuō)，根據(jù)施用的方式和途徑以及標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實(shí)踐，選擇稀釋劑或載體。
這里所顯示的和下面所詳細(xì)描述的數(shù)據(jù)證明，用編碼Mgp002基因的衣原體核酸分子的核酸免疫引起免疫反應(yīng)，并且產(chǎn)生對(duì)沙眼衣原體MoPn的肺攻擊感染的顯著的保護(hù)性免疫。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很顯而易見(jiàn)，本發(fā)明的各種實(shí)施方案在衣原體感染的接種、診斷和治療領(lǐng)域中具有許多應(yīng)用。下面進(jìn)一步介紹這些用途的非限制性討論。
實(shí)施例上述公開(kāi)的內(nèi)容概括地描述了本發(fā)明。通過(guò)參考下列具體實(shí)施例可獲得更全面的理解。描述這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明的目的，并不是為了限制本發(fā)明的范圍。認(rèn)為形式的改變和等同替換如同可建議或提供便于操作的方式的情況也應(yīng)該包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。盡管這里一直使用具體術(shù)語(yǔ)，但是這些術(shù)語(yǔ)旨在描述性的意思而不用于限制的目的。
實(shí)施例1本實(shí)施例舉例說(shuō)明用于免疫的質(zhì)粒載體的制備。
在含有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Eagle MEM中的Hela229細(xì)胞中培養(yǎng)沙眼衣原體小鼠肺炎(MoPn)分離物。收獲MoPn EBs并通過(guò)在4℃以43,000g，梯度密度離心60分鐘的步驟進(jìn)行純化。將純化的EBs用PBS沖洗兩次，以30,000g離心30分鐘，在蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸(SPG)緩沖液中重懸并冷凍在-70℃?zhèn)溆谩?br> 將編碼Mgp002基因的核酸分子框內(nèi)克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pCAMycHis中，Myc-His標(biāo)簽存在于載體中。該載體是由pcDNA3.1(-)Myc-His C(Invitrogen，San Diego)和質(zhì)粒VR1012(Vical)構(gòu)建的。在2000年9月21日公開(kāi)的PCT公開(kāi)WO 00/55326中公開(kāi)了構(gòu)建的細(xì)節(jié)。簡(jiǎn)要地，質(zhì)粒pcDNA3.1(-)Myc-His C(Invitrogen)用Spe I和Bam HI消化以除去CMV啟動(dòng)子并分離剩余的載體片段。由Spe I/Bam HI片段分離來(lái)自質(zhì)粒VR-1012(Vical)的CMV啟動(dòng)子和內(nèi)含子A。將片段連接起來(lái)產(chǎn)生質(zhì)粒pCA/Myc-His。
通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用包括NotI位點(diǎn)(有下劃線的)、起始密碼子(粗體)和MoPn的成熟Mgp002基因產(chǎn)物的N末端序列的5′引物(5′ATAAGAATGCGGCCGCCACC ATG GGA TTA TCTCGC CTA ATT 3′-SEQ ID No9)以及包括Kpn I位點(diǎn)(有下劃線的)的3′反向引物(5′GTTGGTACCGAGCTCGCTCCACTATTCTCATTAATAATCC 3′-SEQ 1D No10)從MoPn基因組DNA中擴(kuò)增全長(zhǎng)mgp002基因。反向引物與Mgp002基因的3′端互補(bǔ)，但是不含有終止密碼子。而是插入另外的核苷酸，導(dǎo)致與pCAMycHis的Myc-和His-tags的符合讀框的基因融合。瓊脂糖凝膠電泳后分離PCR產(chǎn)物，用Kpn I和Not I限制性消化并連接到載體pCAMycHis的Kpn I和NotI位點(diǎn)。在氨芐青霉素選擇下，將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHlOb中。為了證明正確的擴(kuò)增和克隆，對(duì)整個(gè)插入片段的DNA進(jìn)行測(cè)序。將所得的質(zhì)粒命名為pCACTMgp002。PCR產(chǎn)物具有圖1中所示的核酸序列(SEQ ID No1)以及代表全長(zhǎng)Mgp002基因的推定的氨基酸序列(SEQ ID No2)。
如上所述，用正向引物5′ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTGCGACTTCCCCCCCAGT 3′-SEQ ID No11和mgp002反向引物5′GTTGGTACCGAGCTCGCTCCACTATTCTCATTAATAATCC3′SEQ ID No12，也通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從MoPn基因組DNA中擴(kuò)增缺失信號(hào)序列的mgp002基因。將克隆到pCAMycHis中的所得質(zhì)粒鑒定為pCACTMgp002delta。缺失的推定的信號(hào)序列在圖1中用下劃線顯示，缺失信號(hào)序列的Mgp002基因具有在圖1中指出的在箭頭處開(kāi)始的核酸序列(SEQ ID No5)和推定的氨基酸序列(SEQ ID No6)。
類(lèi)似地，在圖2中顯示沙眼衣原體血清變型D的Mgp002基因的核酸序列(SEQ ID No3)和推定的全長(zhǎng)Mgp002基因的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID No4)，或者在圖2箭頭處顯示缺失信號(hào)序列的基因的核酸序列(SEQ ID No7)和推定的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID No8)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能意識(shí)到，可使用上面所概述的類(lèi)似技術(shù)獲得任何其它血清變型的任何其它序列。
實(shí)施例2本實(shí)施例顯示使用核酸載體的免疫研究的結(jié)果。
為了研究由核酸免疫所引起的免疫反應(yīng)是否在功能上有效，根據(jù)以前所描述的方法(參考文獻(xiàn)20)評(píng)估體內(nèi)保護(hù)效能。簡(jiǎn)要地說(shuō)，雌性Balb/c小鼠(4到5周齡)購(gòu)自Charles River Canada(St.Constant，Canada)。用根據(jù)實(shí)施例1中所描述的方法制備的質(zhì)粒DNA通過(guò)肌內(nèi)和鼻內(nèi)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，見(jiàn)圖3在0、2和4周的三個(gè)時(shí)間進(jìn)行免疫。對(duì)于每次免疫，使用27號(hào)針將200μl的總計(jì)200μg DNA注射到兩個(gè)四頭肌內(nèi)(每個(gè)注射部位100μg DNA)。在同一時(shí)間，用微量加液器將50μl的50μg DNA輸送到小鼠的鼻孔。液滴隨后被小鼠吸入。
如上所述，最后一次免疫后14天，通過(guò)鼻內(nèi)用2×103IFU的沙眼衣原體MoPn EB攻擊小鼠。簡(jiǎn)要地，乙醚麻醉后用微量加液器將25μl含有2×103IFU MoPn接種物的SPG遞送到小鼠的鼻孔上。液滴隨后被小鼠吸入。攻擊感染后每日測(cè)量體重，持續(xù)10天，作為衣原體誘導(dǎo)的發(fā)病率的測(cè)量值，見(jiàn)圖4。使用注射鹽水 或空載體(pCAMycHis)的小鼠作為陰性對(duì)照。感染后第3天，用Mgp002基因產(chǎn)物或截短型免疫的小鼠，喪失的體重顯著低于陰性對(duì)照組(圖4)。
在感染后第10天，處死小鼠并通過(guò)無(wú)菌方法分離它們的肺，在SPG緩沖液中用研磨機(jī)勻漿。將組織懸液在4℃以500g離心10分鐘，除去粗糙的組織和碎屑。將上清液冷凍到-70℃直到組織培養(yǎng)物用于檢驗(yàn)生物體的定量生長(zhǎng)。
對(duì)于DNA接種效率的更直接的測(cè)量，亞致死性肺感染后評(píng)估限制衣原體在體內(nèi)生長(zhǎng)的能力。在該感染模型系統(tǒng)中，攻擊后第10天是高峰生長(zhǎng)時(shí)間并選作用于比較各組小鼠間的肺滴度。如在圖5中所示，用Mgp002全長(zhǎng)基因產(chǎn)物DNA免疫的小鼠，其肺滴度(每200x視野的IFU)顯著低于(p＜0.001)陰性對(duì)照組(單獨(dú)用pCAMycHis和 鹽水組)。令人驚奇地，用Mgp002基因的截短型免疫的小鼠(圖5，圖B)顯示甚至比全長(zhǎng)基因更低的IFUs。
這些數(shù)據(jù)證明用Mgp002以及甚至該基因的截短型的核酸免疫能引起對(duì)沙眼衣原體MoPn的肺攻擊感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)也證明Mgp002基因中的保護(hù)性序列位于該基因的截短型中。
實(shí)施例3本實(shí)施例舉例說(shuō)明用于重組mgp002在大腸桿菌中表達(dá)的核酸載體的制備。
PCR擴(kuò)增所需的步驟、通過(guò)核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶修飾DNA產(chǎn)生用于DNA克隆的期望末端、連接以及細(xì)菌轉(zhuǎn)化都是本領(lǐng)域熟知的。所使用的標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的并由Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版；Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbo，New York以及由Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience；1987描述。
細(xì)菌在McCoy細(xì)胞中傳代后，從沙眼衣原體小鼠肺炎株(MoPn，也稱(chēng)作鼠衣原體(Chlamydia muridarum))中制備衣原體基因組DNA。
為了表達(dá)，從沙眼衣原體MoPn感染的McCoy細(xì)胞中收獲的總DNA中，擴(kuò)增具有其天然信號(hào)肽(由前18個(gè)密碼子編碼)的mgp002編碼序列，其中使用正向引物MoPn mgp002-F/+SP(5′-GAATTCGGATCCGATGGGATTATCTCGCCTA-3′)SEQ ID No13，以及反向引物MoPn mgp002-R(5′-ATTAAGAATGCGGCCGCTTTATCACTCCACTATTCT-3′)SEQ ID No14以及Advantage-HF2聚合酶混合物(Clontech)。正向引物引入編碼BamHI限制性位點(diǎn)(斜體字)的序列。反向引物引入NotI限制性位點(diǎn)(斜體字)和雙終止密碼子(互補(bǔ)鏈上有下劃線的)。將所得的PCR產(chǎn)物按順序地用BamHI和NotI限制性消化，并插入到pET30b(+)質(zhì)粒中，其也已經(jīng)用BamHI和NotI切割。將新的質(zhì)粒稱(chēng)作pET30b(+)mgp002+SP。在該構(gòu)建體中，表達(dá)具有N-末端His-Tag的mgp002+SP，其源自pET30b(+)載體內(nèi)編碼序列的上游。圖6顯示上述克隆步驟的示意圖?？衫妙?lèi)似的步驟制備沙眼衣原體血清變型D或任何其它血清變型株的MgpO02。除了添加的便于純化的N末端的組氨酸標(biāo)簽外，氨基酸序列具有與圖1中所示的相同序列(SEQ ID No2)。
為了重組mgp002蛋白的表達(dá)，使用含有表達(dá)載體pET30b(+)mgpO02+SP#l的大腸桿菌BL21(DE3)的過(guò)夜培養(yǎng)物(85ml)接種各含有500ml Luria-Bertani肉湯培養(yǎng)基的燒瓶，在37℃培養(yǎng)到A595達(dá)到0.8。通過(guò)添加IPTG到終濃度1mM，誘導(dǎo)mgp002表達(dá)為組氨酸標(biāo)記的蛋白，將培養(yǎng)物再培養(yǎng)4小時(shí)。然后將過(guò)夜表達(dá)的重組蛋白在考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE上進(jìn)行分析，并使用標(biāo)準(zhǔn)條件通過(guò)用抗組氨酸標(biāo)簽的單克隆抗體的免疫染色以證明表達(dá)。
實(shí)施例4本實(shí)施例舉例說(shuō)明使用固定的金屬親和層析(IMAC)從大腸桿菌中純化組氨酸標(biāo)記的重組Mgp002蛋白。
將實(shí)施例3的表達(dá)重組Mgp002的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物離心以沉淀細(xì)胞并與含有0.5％v/v Triton X-100的磷酸緩沖鹽(PBS；10mM磷酸緩沖液，pH 7.5，150mM NaCl)，以大約1g濕重/mL的比例(一般地20-30g/30mL)混合。將含有混合物的試管在冰上冷卻并用Branson超聲波儀以20-30％的輸出功率超聲3次，每次間隔1分鐘，中間冷卻1-2分鐘。將得到的溶液轉(zhuǎn)移到40mL Beckman離心管中并在BeckmanAvanti J30i離心機(jī)上在4℃，以10,000rpm離心15分鐘。將上清液輕輕倒出，將經(jīng)離心的沉淀在等體積的含有6M鹽酸胍的同一緩沖液中重懸。將混合物如上所述進(jìn)行超聲并離心，保留含有溶解的mgp002蛋白的上清液作為原料材料。
用于IMAC純化的柱是Amersham XK 50/20型，半徑2.5cm。將其用Amersham Pharmacia鰲合劑瓊脂糖凝膠速流(Fast Flow)填充到10cm高，柱體積(CV)為200ml。如果以前使用過(guò)，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明使柱再生并消毒；通過(guò)7CV的去離子水后，用1CV的0.1MNiCl2使柱帶電荷并用4CV PBS，pH 6.8平衡。
將柱以25mL/分的流速用4CV含有胍的上述緩沖液平衡。將500ml的樣本原料以25mL/分速度上樣，隨后3CV含有50mM咪唑的PBS洗滌。mgp002蛋白的洗脫受流經(jīng)柱的3CV含有300mM咪唑的PBS影響。保留洗脫餾分用于滲濾。
最后，使用截留10kDa標(biāo)稱(chēng)分子量的濾器，將洗脫液用Pall Minum切向流過(guò)濾裝置濃縮大約6倍。為了確保產(chǎn)品的可溶性，用大約10體積的含有10mM Tris-HCl，pH 8.5、150mM NaCl、0.8M L-精氨酸以及10mM二硫蘇糖醇的緩沖液將濃縮物在同一裝置中滲濾。這產(chǎn)生了適于配制到含或不含佐劑的免疫原性組合物或疫苗中的純化的重組Mgp002蛋白。
實(shí)施例5本實(shí)施例舉例說(shuō)明在免疫的CH3小鼠中對(duì)沙眼衣原體血清變型D生殖器攻擊的保護(hù)。
將實(shí)施例4的純化的重組Mgp002蛋白(20ug/劑量)與2.5ug/免疫劑量的ISCOM佐劑ISCOMATRIX(IMX)一起配制。用血清變型D沙眼衣原體的陰道內(nèi)攻擊后，通過(guò)測(cè)定生殖器沖洗液中的細(xì)菌負(fù)載來(lái)測(cè)量保護(hù)。
簡(jiǎn)要地，用每種溶于IMX的試驗(yàn)抗原免疫CH3雌性小鼠兩次。然后使用孕酮(狄波-普維拉)將動(dòng)物誘導(dǎo)到動(dòng)情期樣狀態(tài)，接著用沙眼衣原體血清變型D通過(guò)陰道內(nèi)進(jìn)行攻擊。在感染后的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行沖洗和擦洗并評(píng)估培養(yǎng)物中的內(nèi)含物形成單位(IFU)。任何時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性培養(yǎng)物表明認(rèn)為正在研究的動(dòng)物受到了感染。評(píng)估5個(gè)時(shí)間點(diǎn)以確定發(fā)生感染的水平。免疫方案顯示于下列表1中。
表1免疫方案
在第3、5、7、11和14天用2×50μl SPG緩沖液沖洗陰道腔，隨后用試子擦拭。將沖洗液和試子加到含有400μl SPG的試管中并置于冰上，將其冷凍用于后來(lái)的檢驗(yàn)或者立即檢驗(yàn)。在第34天，采集所有組小鼠的血，并將血清樣本送到Ausra Raudonikiene/KiristinBoehlke(Bld 17，rm 124)，在那里將樣本旋轉(zhuǎn)，除去血清并冷凍，直到檢驗(yàn)。
圖7顯示Mgp002蛋白免疫在第3天能顯著降低生殖道內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷，在第5天更少。這些結(jié)果證明mgp002的重組型能在攻擊后通過(guò)降低細(xì)菌負(fù)荷提供保護(hù)。原生小體(EB)是陽(yáng)性對(duì)照并且也能降低生殖道內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷。當(dāng)與僅給予佐劑和安慰劑的對(duì)照組比較時(shí)，這些結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Wilcoxonp＜0.05)。
實(shí)施例6本實(shí)施例舉例說(shuō)明在Mgp002免疫的Balb/c小鼠中對(duì)沙眼衣原體MoPn肺攻擊的保護(hù)。
根據(jù)上述實(shí)施例2中所描述的方法進(jìn)行肺攻擊。同實(shí)施例4中所描述的一樣，使用Mgp002蛋白免疫小鼠。簡(jiǎn)要地，通過(guò)肌內(nèi)(i.m)三次免疫小鼠(見(jiàn)圖3)，使用與200μg/免疫劑量的DC-Chol佐劑一起配制的實(shí)施例4的純化的重組Mgp002蛋白(25ug/劑量)。根據(jù)實(shí)施例2中所描述的方法，最后一次免疫后14天用2×103IFU的沙眼衣原體MoPn EB通過(guò)鼻內(nèi)攻擊小鼠。
在感染后第10天，處死小鼠并用無(wú)菌方法分離它們的肺，用研磨機(jī)在SPG緩沖液中勻漿。將組織懸液在4℃以500g離心10分鐘，除去粗糙的組織和碎屑。將上清液在-70℃冷凍，直到組織培養(yǎng)物用于檢驗(yàn)生物體的定量生長(zhǎng)。圖8證明當(dāng)與非免疫的小鼠相比時(shí)，用與另一種佐劑，DC-Chol一起配制的Mgp002重組蛋白免疫的小鼠也顯示顯著降低肺內(nèi)的衣原體負(fù)荷。這些結(jié)果在p＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
公開(kāi)概述在本公開(kāi)內(nèi)容的概述中，本發(fā)明提供一種用核酸，其包括DNA，免疫宿主，包括人類(lèi)，抗衣原體菌株，特別是沙眼衣原體感染所致疾病的方法，包括使用含有編碼衣原體菌株Mgp002基因產(chǎn)物的全長(zhǎng)或截短型的核苷酸序列以及影響Mgp002基因和截短型在宿主中表達(dá)的啟動(dòng)子的核酸載體，具體地是質(zhì)粒載體。Mgp002基因的全長(zhǎng)和截短型兩者都能在宿主中引起抗活衣原體攻擊的保護(hù)性免疫反應(yīng)。截短型引起甚至高于全長(zhǎng)型的保護(hù)性反應(yīng)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可進(jìn)行修飾。
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<221>CDS<222>(1)..(1698)<400>1atg gga tta tct cgc cta att tta ttt ggc tta ctt tct tta ccg ctc 48Met Gly Leu Ser Arg Leu Ile Leu Phe Gly Leu Leu Ser Leu Pro Leu1 5 10 15tca gca agc tgc gac ttc ccc ccc agt gtt tcc cag aag ata tta ttc 96Ser Ala Ser Cys Asp Phe Pro Pro Ser Val Ser Gln Lys Ile Leu Phe20 25 30ttg tgt caa aaa tct att cct caa gct ctg gag tcc tat ctt gag gca144Leu Cys Gln Lys Ser Ile Pro Gln Ala Leu Glu Ser Tyr Leu Glu Ala35 40 45tct aca acc tat caa caa cat aac ttt tct ata ttg cgc tta ata gct192Ser Thr Thr Tyr Gln Gln His Asn Phe Ser Ile Leu Arg Leu Ile Ala
50 55 60aag tca tac tta caa caa agt ctc ttt tct gaa gat gct tac gta cgc240Lys Ser Tyr Leu Gln Gln Ser Leu Phe Ser Glu Asp Ala Tyr Val Arg65 70 75 80aaa agc gca att att gga gcg ggg ctt tct ggc tca tct gag act cta288Lys Ser Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Thr Leu85 90 95gat cta ctg tct gaa tcc ata gaa aca cag gat ctt tat gag cag cta336Asp Leu Leu Ser Glu Ser Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu100 105 110ctt att tta aat gct gca ggc aat caa tta ggc aaa act tcc gat cgt384Leu Ile Leu Asn Ala Ala Gly Asn Gln Leu Gly Lys Thr Ser Asp Arg115 120 125ctt tta ttc aaa gga tta aca gca cct cat cct att att cgc ttg gaa432Leu Leu Phe Lys Gly Leu Thr Ala Pro His Pro Ile Ile Arg Leu Glu130 135 140gct gct tac cgt ctg gcc tgt atg aaa aac agt aaa gta agt gac tac480Ala Ala Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr145 150 155 160ctc tat tct ttt atc cac cag ctt cca gaa gaa atc caa aac tta gca528Leu Tyr Ser Phe Ile His Gln Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala165 170 175gca acg att ttt ttg cag ctc gaa acg gaa gaa gca gat gct tat gtt576Ala Thr Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Val180 185 190cat aga ctc ctg tct tct cct aat agt cta aca aga aac tat atg gct624His Arg Leu Leu Ser Ser Pro Asn Ser Leu Thr Arg Asn Tyr Met Ala195 200 205tat cta att gga gaa tat caa cag agg aga ttt ctt cca acg ctc cgc672Tyr Leu Ile Gly Glu Tyr Gln Gln Arg Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg210 215 220tcg ttg ctt acc agc gca gct cct tta gac caa gaa gga tct ttg tat720Ser Leu Leu Thr Ser Ala Ala Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ser Leu Tyr
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<221>CDS<222>(1)..(1698)<400>3atg gga cta tct cgt cta gcc ttc att agt ttc ctc tct ttt aca ctc 48Met Gly Leu Ser Arg Leu Ala Phe Ile Ser Phe Leu Ser Phe Thr Leu1 5 10 15tca gcc agc tgt gat ttt cct tcc tca gtt tct cag aga atc ttg ttt 96Ser Ala Ser Cys Asp Phe Pro Ser Ser Val Ser Gln Arg Ile Leu Phe20 25 30tct tgc cga aaa tca gtc cct caa gct cta gaa gcc tat ctc gaa gct144Ser Cys Arg Lys Ser Val Pro Gln Ala Leu Glu Ala Tyr Leu Glu Ala35 40 45tca gca act tat caa caa cac gat ttc tcc gta tta cgc gta ata gca192Ser Ala Thr Tyr Gln Gln His Asp Phe Ser Val Leu Arg Val Ile Ala50 55 60
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Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Ala Leu Glu Leu65 70 75 80ctg tct gag gct ata gaa acg caa gat ctc tat gag caa cta ctc att288Leu Ser Glu Ala Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ile85 90 95tta aat gct gca acc agc caa tta agc aaa act tct gac aaa ctt tta336Leu Asn Ala Ala Thr Ser Gln Leu Ser Lys Thr Ser Asp Lys Leu Leu100 105 110ttc aag gga tta aca gct tct cat cct gtc atc cgc tta gaa gct gct384Phe Lys Gly Leu Thr Ala Ser His Pro Val Ile Arg Leu Glu Ala Ala115 120 125tat cgt ctt gcc tgt atg aaa aat agc aag gta agt gat tac ctt tat432Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr Leu Tyr130 135 140tct ttt atc tac aag tta cca gaa gaa att caa aac cta gcg gca act480Ser Phe Ile Tyr Lys Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala Ala Thr145 150 155 160att ttc tta caa ctc gaa aca gaa gaa gct gat gct tat att cat cat528Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Ile His His165 170 175ttg ctc tct tct ccc aat aac ctg aca aga aac tat gtt gcc tat tta576Leu Leu Ser Ser Pro Asn Asn Leu Thr Arg Asn Tyr Val Ala Tyr Leu180 185 190att gga gag tac aaa caa aaa aga ttt ctt cca aca cta cgc tct tta624Ile Gly Glu Tyr Lys Gln Lys Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg Ser Leu195 200 205ctt aca agt gcc tct cct tta gat caa gaa ggc gct ttg tat gcg tta672Leu Thr Ser Ala Ser Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ala Leu Tyr Ala Leu210 215 220ggc aaa ctg gaa gac tct ggt agc tat cct aga att aaa gct cta agc720Gly Lys Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Pro Arg Ile Lys Ala Leu Ser225 230 235 240tct aga tcc aat cct gaa gta gta ctc gct gca gct cag aca tta tta768
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Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val Ser Lys420 425 430gct gca tta act cct gga gac cct atc att cgc gct tac gct aat cta1344Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala Ash Leu435 440 445gct tta tat aca atg acc aaa gat cct gag aaa aaa gct gtg cta tac1392Ala Leu Tyr Thr Met Thr Lys Asp Pro Glu Lys Lys Ala Val Leu Tyr450 455 460cga tat gct gaa caa tta ata gag gat acc att tta ttc aca gat gct1440Arg Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Glu Asp Thr Ile Leu Phe Thr Asp Ala465 470 475 480gaa aat ccg ctt ccc tct cca agc tct tct tat tta cgc tac caa gta1488Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Val485 490 495tcc cct gag acc cgc aca caa ctt atg cta gct att ttg gaa acc tta1536Ser Pro Glu Thr Arg Thr Gln Leu Met Leu Ala Ile Leu Glu Thr Leu500 505 510gtt tct tcc aaa acg gat gaa gat atc cgc gtt ttt ctt tcc cta atg1584Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser Leu Met515 520 525aaa aaa acc cat tac aaa aat atc ccg atc tta tca gga ttg tta atg1632Lys Lys Thr His Tyr Lys Ash Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu Leu Met530 535 540aga ata gtg gag1644Arg Ile Val Glu545<210>8<211>548<212>PRT<213>沙眼衣原體<400>8Met Cys Asp Phe Pro Ser Ser Val Ser Gln Arg Ile Leu Phe Ser Cys
1 5 10 15Arg Lys Ser Val Pro Gln Ala Leu Glu Ala Tyr Leu Glu Ala Ser Ala20 25 30Thr Tyr Gln Gln His Asp Phe Ser Val Leu Arg Val Ile Ala Glu Ser35 40 45Tyr Leu Gln Gln Ser Phe Leu Ser Glu Asp Thr Tyr Ile Arg Lys Ser50 55 60Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Ala Leu Glu Leu65 70 75 80Leu Ser Glu Ala Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ile85 90 95Leu Asn Ala Ala Thr Ser Gln Leu Ser Lys Thr Ser Asp Lys Leu Leu100 105 110Phe Lys Gly Leu Thr Ala Ser His Pro Val Ile Arg Leu Glu Ala Ala115 120 125Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr Leu Tyr130 135 140Ser Phe Ile Tyr Lys Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala Ala Thr145 150 155 160Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Ile His His165 170 175Leu Leu Ser Ser Pro Asn Asn Leu Thr Arg Asn Tyr Val Ala Tyr Leu
180 185 190Ile Gly Glu Tyr Lys Gln Lys Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg Ser Leu195 200 205Leu Thr Ser Ala Ser Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ala Leu Tyr Ala Leu210 215 220Gly Lys Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Pro Arg Ile Lys Ala Leu Ser225 230 235 240Ser Arg Ser Asn Pro Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gln Thr Leu Leu245 250 255Phe Leu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Asn Leu Cys260 265 270Gln Gln Lys Leu Leu Arg Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ser Gln275 280 285Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Tyr Asn Ala Thr Gln290 295 300Glu Glu Ile Arg Leu Asn Thr Ala Leu Ala Leu Val His Gln Gly Cys305 310 315 320Thr Asp Pro Gln Val Leu His Tyr Leu Thr Glu Ile Leu Glu Ser Lys325 330 335Val Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Thr Gly Lys Ala Ile340 345 350Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Thr Phe Pro Leu Met Ser Gln Glu Asp
355 360 365Lys Met Arg Thr Leu Ala Met Tyr Arg Val Ala Glu Asp Thr Ile Leu370 375 380Ser Ala Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asp Ala Tyr Leu Pro Tyr Leu Glu385 390 395 400Arg Ile Leu Ala Ser Gln Lys Thr Ile Leu Ala Ala Lys Ala Ile Ala405 410 415Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val Ser Lys420 425 430Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala Asn Leu435 440 445Ala Leu Tyr Thr Met Thr Lys Asp Pro Glu Lys Lys Ala Val Leu Tyr450 455 460Arg Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Glu Asp Thr Ile Leu Phe Thr Asp Ala465 470 475 480Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Val485 490 495Ser Pro Glu Thr Arg Thr Gln Leu Met Leu Ala Ile Leu Glu Thr Leu500 505 510Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser Leu Met515 520 525Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu Leu Met
530 535 540Arg Ile Val Glu545<210>9<211>41<212>DNA<213>沙眼衣原體<400>9ataagaatgc ggccgccacc atgtgcgact tcccccccag t 41<210>10<211>40<212>DNA<213>沙眼衣原體<400>10gttggtaccg agctcgctcc actattctca ttaataatcc 40<210>11<211>41<212>DNA<213>沙眼衣原體<400>11ataagaatgc ggccgccacc atgtgcgact tcccccccag t 41<210>12<211>40<212>DNA<213>沙眼衣原體<400>12gttggtaccg agctcgctcc actattctca ttaataatcc 40<210>13
<211>31<212>DNA<213>沙眼衣原體<400>13gaattcggat ccgatgggat tatctcgcct a31<210>14<211>36<212>DNA<213>沙眼衣原體<400>14attaagaatg cggccgcttt atcactccac tattct 361030
權(quán)利要求
1.經(jīng)分離并純化的核酸分子，其包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)、(b)、(c)或(d)多肽在氨基酸序列上至少75％相同。
2.經(jīng)分離并純化的核酸分子，其包括選自下列任何一種的核酸序列(a)SEQ ID No1；(b)SEQ ID No3；(c)SEQ ID No5；(d)SEQ ID No7；(e)包含來(lái)自(a)到(d)任何一種核酸序列中的至少38個(gè)連續(xù)核苷酸的序列；和(f)編碼通過(guò)保守氨基酸取代修飾而不喪失免疫原性，并且其與SEQ ID No1、3、5或7所編碼的多肽在氨基酸序列上至少75％相同的多肽的序列。
3.經(jīng)分離并純化的核酸分子，其包括與權(quán)利要求1核酸分子中的任何一種互補(bǔ)的核酸序列。
4.核酸分子，其包括編碼融合蛋白的核酸序列，所述的融合蛋白包括根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子所編碼的多肽以及另外的多肽。
5.權(quán)利要求4的核酸分子，其中所述另外的多肽是異源信號(hào)肽。
6.權(quán)利要求4的核酸分子，其中所述另外的多肽具有佐劑活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任何一項(xiàng)的核酸分子，其與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列有效地連接。
8.一種包括載體的疫苗，其中所述載體包含編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)中任何一項(xiàng)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(e)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用于使多肽在哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種控制序列有效地連接；其中疫苗提供抗衣原體所致疾病的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
9.權(quán)利要求8的疫苗，其中疫苗可任選地包括編碼另外多肽的額外核酸，其可提高對(duì)選自(a)到(f)中任何一種多肽的免疫反應(yīng)。
10.一種藥物組合物，其包括適于在疫苗中使用的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)中任何一項(xiàng)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(e)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用于使多肽在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種控制序列有效地連接。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物，其包括適于在疫苗中使用的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段。
12.權(quán)利要求10的藥物組合物，其包括適于在疫苗中使用的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(d)中任何一種的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)或(d)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
13.權(quán)利要求8的包括疫苗載體的疫苗，其中疫苗載體包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；和(d)SEQ ID No8。
14.權(quán)利要求8的包括疫苗載體的疫苗，其中疫苗載體包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段。
15.權(quán)利要求8的包括疫苗載體的疫苗，其中疫苗載體包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(d)中任何一種的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(d)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
16.預(yù)防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼選自下列任何一種的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(e)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用于多肽表達(dá)的一種或多種控制序列有效地連接。
17.權(quán)利要求16的用于預(yù)防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼選自下列任何一種多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；和(d)SEQ ID No8。
18.權(quán)利要求17的用于預(yù)防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼選自下列任何一種多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段。
19.權(quán)利要求17的用于預(yù)防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼選自下列任何一種多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾的(a)到(d)中任何一種的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)或(d)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
20.用權(quán)利要求7的核酸分子轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞宿主。
21.5到100個(gè)核苷酸的核酸探針，其在嚴(yán)緊條件下與SEQ IDNo1、3、5或7的核酸分子，或者其同系物或互補(bǔ)序列或反義序列雜交。
22.10到40個(gè)核苷酸的引物，其在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No1或3的核酸分子，或者其同系物或互補(bǔ)序列或反義序列雜交。
23.由權(quán)利要求1、2和4到7中任何一項(xiàng)的核酸序列所編碼的多肽。
24.生產(chǎn)權(quán)利要求7多肽的方法，其包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求21的單細(xì)胞宿主的步驟。
25.抗權(quán)利要求24中任何一種多肽的抗體。
26.一種疫苗，其包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求1、4到7中任何一項(xiàng)的第一多肽，以及藥學(xué)上可接受的載體，任選地包括提高對(duì)第一多肽的免疫反應(yīng)的第二多肽。
27.權(quán)利要求27的疫苗，其中第二多肽包括另外的衣原體多肽。
28.一種藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1、4到7中任何一項(xiàng)的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
29.一種藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求27或28的疫苗以及藥學(xué)上可接受的載體。
30.從衣原體菌株中分離的多核苷酸，選自(a)包括SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸；(b)包括SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包括SEQ ID NO5所示的核苷酸序列的多核苷酸；(d)包括SEQ ID NO7的核苷酸序列的多核苷酸；(e)與SEQ ID NO1、3、5或7的核苷酸序列至少95％同源的多核苷酸；和(f)在42℃，含有50％甲酰胺的6xSSC的嚴(yán)緊條件下，與包括SEQ ID NO1、3、5或7所示的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；其中向哺乳動(dòng)物施用免疫原性有效量的所述分離的多核苷酸，在所述哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗所述衣原體菌株感染的免疫反應(yīng)。
31.經(jīng)分離并純化的多肽分子，其包括選自下列任何一種的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽；其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽在氨基酸序列上至少75％相同。
32.權(quán)利要求31的多肽分子，進(jìn)一步包括異源信號(hào)肽。
33.一種疫苗，其包括選自下列任何一種的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)中任何一種多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾的(a)到(e)中任何一種的多肽，其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(e)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用于使多肽在哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種控制序列有效地連接，其中疫苗提供抗衣原體所致疾病的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
34.一種藥物組合物，其包括適于在疫苗中使用的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，以及選自下列任何一種的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和；(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(e)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
35.權(quán)利要求33的疫苗，進(jìn)一步包括佐劑。
36.權(quán)利要求35的疫苗，其中所述佐劑是ISCOM佐劑。
37.權(quán)利要求34的藥物組合物，其包括適于在疫苗中使用的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段。
38.一種預(yù)防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的選自下列任何一種多肽的步驟(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來(lái)自(a)到(d)多肽的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段；和；(f)通過(guò)保守性氨基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經(jīng)修飾的的多肽與對(duì)應(yīng)的(a)到(e)中任何一種的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
全文摘要
本發(fā)明提供用于一種用核酸，其包括DNA，免疫宿主，包括人類(lèi)抗由衣原體菌株，特別是沙眼衣原體感染所致疾病方法的核酸、蛋白質(zhì)和載體。該方法使用含有編碼衣原體菌株Mgp002多肽的核苷酸序列的載體，該核苷酸序列與影響基因產(chǎn)物在宿主中表達(dá)的啟動(dòng)子有效地連接。全長(zhǎng)Mgp002基因的截短型是有用的免疫原，用于保護(hù)抗衣原體感染所致疾病。本發(fā)明進(jìn)一步提供可用于保護(hù)抗由衣原體感染所致疾病的重組Mgp002蛋白。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1906299SQ200480040817
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者R·C·布倫哈姆, A·勞多尼基尼, S·加利錢(qián), A·穆?tīng)柖?申請(qǐng)人:圣諾菲·帕斯圖爾有限公司