專(zhuān)利名稱(chēng)：基因表達(dá)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及基因表達(dá)技術(shù)。
背景技術(shù)：
Hartl，1996，Nature，381，571-580將稱(chēng)為蛋白伴侶的一類(lèi)蛋白質(zhì)定義為如下蛋白質(zhì)，它結(jié)合并穩(wěn)定另一種蛋白質(zhì)在其它條件下不穩(wěn)定的構(gòu)象異構(gòu)體，并且通過(guò)控制結(jié)合和釋放來(lái)推動(dòng)其正確的體內(nèi)命運(yùn)，即折疊、寡聚物裝配、轉(zhuǎn)運(yùn)至特定亞細(xì)胞隔室、或通過(guò)降解而處置。
BiP(也稱(chēng)為GRP78、Ig主鏈結(jié)合蛋白和酵母中的Kar2p)是高豐度、約70kDa、屬于hsp70家族的蛋白伴侶，駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中，發(fā)揮輔助分泌系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊蛋白質(zhì)的功能，還有其它功能。
蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)是駐留在ER中，參與蛋白質(zhì)翻譯后加工過(guò)程中催化二硫鍵形成的伴侶蛋白。
關(guān)于天然和外來(lái)兩類(lèi)蛋白質(zhì)分泌的研究證明，由ER至高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)是限速步驟。證據(jù)指向BiP與正常蛋白質(zhì)的瞬時(shí)結(jié)合以及與突變或未折疊形式蛋白質(zhì)的更穩(wěn)定相互作用。結(jié)果是，BiP可能在溶解折疊前體和防止未折疊和未裝配蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮雙重作用。Robinson和Wittrup，1995，Biotechnol.Prog.，11，171-77檢驗(yàn)了啤酒糖酵母中外來(lái)蛋白質(zhì)分泌對(duì)BiP(Kar2p)和PDI蛋白質(zhì)水平的影響，發(fā)現(xiàn)外來(lái)分泌性蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期組成性表達(dá)將可溶性BiP和PDI降至Western分析不可檢出的水平。作為異源蛋白質(zhì)分泌的后果，ER蛋白伴侶和折疊酶水平的降低對(duì)于改善酵母表達(dá)/分泌系統(tǒng)的嘗試具有重要含意。
蛋白伴侶的表達(dá)受到許多機(jī)制的調(diào)控，包括未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(UPR)。
使用重組技術(shù)已經(jīng)證明，多個(gè)PDI基因拷貝提高宿主細(xì)胞中的PDI蛋白質(zhì)水平(Farquhar等人，1991，Gene，108，81-89)。
1993年12月23日發(fā)表的WO 93/25676最早提出了編碼PDI的基因和編碼異源二硫鍵鍵合蛋白質(zhì)的基因的共表達(dá)，作為提高異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量的手段。WO 93/25676報(bào)告了可以通過(guò)與PDI的共表達(dá)來(lái)提高antistasin和蜱抗凝蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。
這種策略已經(jīng)用于提高其它類(lèi)型蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。
Robinson等人，1994，Bio/Technology，12，381-384報(bào)告了啤酒糖酵母中重組的額外PDI基因拷貝可用于將人血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)B同型二聚體的重組表達(dá)提高10倍，將粟酒裂殖酵母酸性磷酸酶提高4倍。
Hayano等人，1995，F(xiàn)EBS Letters，377，505-511描述了人溶菌酶和PDI在酵母中的共表達(dá)。觀察到功能性溶菌酶的生成和分泌提高了約30-60％。
Shusta等人，1998，Nature Biotechnology，16，773-777報(bào)告了啤酒糖酵母中單鏈抗體片段(scFv)的重組表達(dá)可以通過(guò)在宿主細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)PDI而提高2-8倍。
Bao和Fukuhara，2001，Gene，272，103-110報(bào)告了酵母乳克魯維氏酵母中重組人血清清蛋白(rHSA)的表達(dá)和分泌可以通過(guò)與酵母PDI基因(KlPDI1)額外重組拷貝的共表達(dá)而提高15倍或更多。
為了生成包含PDI基因和異源蛋白質(zhì)的基因二者的共轉(zhuǎn)化酵母，WO93/25676講授了兩種基因可以是整合在染色體中的；一種可以是整合在染色體中，而一種存在于質(zhì)粒上；可以將每一種基因?qū)氩煌馁|(zhì)粒；或者可以將兩種基因?qū)胂嗤馁|(zhì)粒。WO 93/25676例示了具有整合在染色體中的PDI基因額外拷貝的酵母菌株中由質(zhì)粒pKH4α2表達(dá)antistasin(實(shí)施例16和17)；額外PDI基因拷貝存在于多拷貝酵母穿梭載體YEp24(Botstein等人，1979，Gene，8，17-24)上時(shí)由載體K991表達(dá)antistasin(實(shí)施例20)；和分別在GAL10和GAL1啟動(dòng)子的控制下由酵母穿梭載體pC1/1(Rosenberg等人，1984，Nature，312，77-80)表達(dá)antistasin和PDI基因二者。事實(shí)上，Robinson和Wittrup，1995，前述引用還使用GAL1-GAL10基因間區(qū)來(lái)表達(dá)紅細(xì)胞生成素，并得出結(jié)論，應(yīng)當(dāng)使用可緊密抑制的、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建用于分泌異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)酵母菌株，否則持續(xù)分泌的負(fù)面作用(即可檢測(cè)BiP和PDI降低)將在充滿(mǎn)大規(guī)模發(fā)酵罐所需要的細(xì)胞生長(zhǎng)許多代后占據(jù)支配地位。
本領(lǐng)域的后續(xù)工作確定了轉(zhuǎn)基因的染色體整合是將重組蛋白產(chǎn)量最大化的關(guān)鍵。
Robinson等人，1994，前述引用使用額外的整合在染色體中的PDI基因拷貝在PDGF和粟酒裂殖酵母酸性磷酸酶的表達(dá)中獲得了觀察到的增加。Robinson等人報(bào)告了使用多拷貝2μm表達(dá)載體來(lái)提高PDI蛋白質(zhì)水平的嘗試對(duì)異源蛋白質(zhì)分泌具有有害作用。
Hayano等人，1995，前述引用描述了將人溶菌酶和PDI的基因?qū)虢湍杆拗?，各自在分開(kāi)的線性化整合載體中，由此帶來(lái)染色體整合。
Shusta等人，1998，前述引用報(bào)告了在酵母系統(tǒng)中，將轉(zhuǎn)基因整合到宿主染色體中或使用附加型表達(dá)載體之間的選擇能夠大大影響分泌，而且，參照Parekh和Wittrup，1997，Biotechnol.Prog.，13，117-122，使用δ整合載體將scFv基因穩(wěn)定整合到宿主染色體中優(yōu)于使用基于2μm的表達(dá)質(zhì)粒。Parekh和Wittrup，前述引用先前講授了使用δ整合載體比基于2μm的表達(dá)載體將牛胰腺胰蛋白酶抑制物(BPTI)的表達(dá)提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。基于2μm的表達(dá)載體據(jù)說(shuō)對(duì)異源分泌性蛋白質(zhì)生產(chǎn)產(chǎn)生反面作用。
Bao和Fukuhara，2001，前述引用報(bào)告了“最初認(rèn)為可以將KlPDI1基因直接導(dǎo)入攜帶rHSA表達(dá)盒的多拷貝載體中。然而，發(fā)現(xiàn)這些構(gòu)建物嚴(yán)重影響酵母生長(zhǎng)和質(zhì)粒穩(wěn)定性。這驗(yàn)證了我們先前的發(fā)現(xiàn)，即多拷貝載體上的KlPDI1基因?qū)θ榭唆斁S氏酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)有害(Bao等人，2000)”。Bao等人，2000，Yeast，16，329-341，在上文引用的Bao和Fukuhara一節(jié)中提及時(shí)，報(bào)告了已經(jīng)將KlPDI1基因在多拷貝質(zhì)粒pKan707上導(dǎo)入乳克魯維氏酵母，且質(zhì)粒的存在致使菌株的生長(zhǎng)情況很差。Bao等人得出結(jié)論，即KlPDI1基因的過(guò)度表達(dá)對(duì)乳克魯維氏酵母細(xì)胞有毒。根據(jù)Bao等人的早期發(fā)現(xiàn)，Bao和Fukuhara選擇在宿主染色體上導(dǎo)入KlPDI1的單一副本。
與此背景相反，我們已經(jīng)令人驚訝的證明，與現(xiàn)有技術(shù)的建議相反，在酵母中在2μm家族多拷貝質(zhì)粒上共表達(dá)伴侶蛋白和異源蛋白質(zhì)的基因時(shí)，異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量有實(shí)質(zhì)提高。
發(fā)明描述本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，包括(a)提供包含2μm家族質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒包含編碼包含伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因；(b)在容許編碼伴侶蛋白的基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
(c)由培養(yǎng)物培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的異源蛋白質(zhì)；并(d)任選將由此純化的蛋白質(zhì)凍干。
在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(c)將由此表達(dá)的異源蛋白質(zhì)純化至商業(yè)可接受的純度水平或制藥學(xué)可接受的純度水平。
優(yōu)選的是，該方法還包括如下步驟將純化的異源蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑諸如制藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑一起配制，并任選以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了2μm家族質(zhì)粒作為表達(dá)載體通過(guò)在相同2μm家族質(zhì)粒上提供編碼異源蛋白質(zhì)的基因和編碼包含伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的基因用于提高真菌(優(yōu)選酵母)或脊椎動(dòng)物異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量的用途。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了包含編碼包含伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因的2μm家族質(zhì)粒，其中如果質(zhì)?；?μm質(zhì)粒，那么它是非整合載體。
本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了包含如上定義的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及重組改良形式的2μm家族質(zhì)粒。
已經(jīng)證明，某些密切相關(guān)的芽殖酵母(budding yeast)物種含有天然存在的環(huán)狀雙鏈DNA質(zhì)粒。這些質(zhì)粒統(tǒng)稱(chēng)為2μm家族質(zhì)粒，包括來(lái)自魯氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces rouxii，以前歸入雙孢接合糖酵母Zygosaccharomyces bisporus)的pSR1、pSB3或pSB4，來(lái)自拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)的pSB1或pSB2，來(lái)自發(fā)酵接合糖酵母(Zygosaccharomyces fermentati)的pSM1，來(lái)自果蠅克魯維氏酵母(Kluyveromyces drosophilarum)的pKD1，來(lái)自膜醭畢赤氏酵母(Pichiamembranaefaciens)的未命名質(zhì)粒(下文稱(chēng)為“pPM1”)，及來(lái)自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2μm質(zhì)粒和變體(諸如Scp1、Scp2和Scp3)(Volkert等人，1989，Microbiological Reviews，53，299；Murray等人，1988，J.Mol.Biol.，200，601；Painting等人，1984，J.Applied Bacteriology，56，331)。
作為一個(gè)質(zhì)粒家族，這些分子共享一系列共有特征，即它們通常在質(zhì)粒的對(duì)邊(opposite sides)具有兩個(gè)反向重復(fù)片段，具有6kb左右(范圍為4757至6615bp)的相似大小，三個(gè)開(kāi)放讀碼框其中一個(gè)編碼位點(diǎn)特異性重組酶(FLP)，和自主復(fù)制序列(ARS)，也稱(chēng)為復(fù)制起點(diǎn)(ori)，位于反向重復(fù)片段之一的末端附近(Futcher，1988，Yeast，4，27；Murray等人，前述引用；及Toh-e等人，1986，Basic Life Sci.，40，425)。盡管它們?nèi)狈杀鎰e的DNA序列同源性，然而它們共享的三個(gè)開(kāi)放讀碼框的分子構(gòu)造和功能保守性證明了家族成員之間的共有祖先聯(lián)系。
盡管可以在本發(fā)明中使用任何上述天然存在2μm家族質(zhì)粒，然而本發(fā)明不限于天然存在2μm家族質(zhì)粒的使用。為了本發(fā)明的目的，將2μm家族質(zhì)粒描述如下。
2μm家族質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA質(zhì)粒。它通常較小，諸如在排除重組插入序列時(shí)的3,000至10,000bp之間，優(yōu)選4,500至7,000bp之間。
2μm家族質(zhì)粒通常包含至少三個(gè)開(kāi)放讀碼框(“ORF”)，它們各自編碼在2μm家族質(zhì)粒作為多拷貝質(zhì)粒而穩(wěn)定維持中發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)。可以將由這三個(gè)ORF編碼的蛋白質(zhì)稱(chēng)為FLP、REP1和REP2。當(dāng)2μm家族質(zhì)粒沒(méi)有包含編碼FLP、REP1和REP2的所有三個(gè)ORF時(shí)，應(yīng)當(dāng)反式提供編碼缺失蛋白質(zhì)的ORF，或是在另一種質(zhì)粒上或是通過(guò)染色體整合。
“FLP”蛋白質(zhì)是能夠在受到FLP識(shí)別的反向重復(fù)序列之間催化位點(diǎn)特異重組的蛋白質(zhì)。該反向重復(fù)序列稱(chēng)為FLP重組靶(FRT)位點(diǎn)，且各自通常作為更大反向重復(fù)片段的一部分存在(見(jiàn)下文)。優(yōu)選的FLP蛋白質(zhì)包含由pSR1、pSB1、pSB2、pSB3、pSB4、pSM1、pKD1、pPM1和2μm質(zhì)粒其中一種質(zhì)粒編碼的FLP蛋白質(zhì)的序列，例如Volkert等人，前述引用；Murray等人，前述引用；及Painting等人，前述引用中所述。本發(fā)明還包括這些FLP蛋白質(zhì)的變體和片段。“片段”和“變體”指保留天然蛋白質(zhì)在相同F(xiàn)RT序列之間催化位點(diǎn)特異重組能力的那些。這些變體和片段常常與由pSR1、pSB1、pSB2、pSB3、pSB4、pSM1、pKD1、pPM1和2μm質(zhì)粒其中一種質(zhì)粒編碼的FLP蛋白質(zhì)具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更高同源性。不同的FLP蛋白質(zhì)可以具有不同的FRT序列特異性。典型的FRT位點(diǎn)可以包含側(cè)翼為反向重復(fù)序列的核心核苷酸序列。在2μm質(zhì)粒中，F(xiàn)RT核心序列的長(zhǎng)度是8個(gè)核苷酸且側(cè)翼反向重復(fù)序列的長(zhǎng)度是13個(gè)核苷酸(Volkert等人，前述引用)。然而，受到任何指定FLP蛋白質(zhì)識(shí)別的FRT位點(diǎn)可以與2μm質(zhì)粒FRT位點(diǎn)不同。
REP1和REP2是參與在細(xì)胞分裂過(guò)程中分配質(zhì)?？截惖牡鞍踪|(zhì)，而且可能還在FLP表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮作用。在來(lái)自不同2μm家族質(zhì)粒的REP1蛋白質(zhì)間觀察到可觀的序列趨異，而目前不可能在來(lái)自不同2μm家族質(zhì)粒的REP2蛋白質(zhì)間進(jìn)行序列對(duì)比。優(yōu)選的REP1和REP2蛋白質(zhì)包含由pSR1、pSB1、pSB2、pSB3、pSB4、pSM1、pKD1、pPM1和2μm質(zhì)粒其中一種質(zhì)粒編碼的REP1和REP2蛋白質(zhì)的序列，例如Volkert等人，前述引用；Murray等人，前述引用；及Painting等人，前述引用中所述。本發(fā)明還包括這些REP1和REP2蛋白質(zhì)的變體和片段。REP1和REP2的“片段”和“變體”指在由代替天然ORF的質(zhì)粒編碼時(shí)在合適酵母群內(nèi)不破壞質(zhì)粒的穩(wěn)定多拷貝維持的那些。這些REP1和REP2變體和片段常常分別與由pSR1、pSB1、pSB2、pSB3、pSB4、pSM1、pKD1、pPM1和2μm質(zhì)粒其中一種質(zhì)粒編碼的REP1和REP2蛋白質(zhì)具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更高同源性。
由質(zhì)粒上的ORF編碼的REP1和REP2蛋白質(zhì)必須是相容的。優(yōu)選的是，REP1和REP2蛋白質(zhì)具有由相同天然存在2μm家族質(zhì)粒諸如pSR1、pSB1、pSB2、pSB3、pSB4、pSM1、pKD1、pPM1和2μm質(zhì)粒編碼的REP1和REP2蛋白質(zhì)或其變體或片段的序列。
2μm家族質(zhì)粒通常包含兩個(gè)反向重復(fù)序列。反向重復(fù)片段可以是任何大小，只要它們各自含有FRT位點(diǎn)(見(jiàn)上文)。反向重復(fù)片段通常是高度同源的。它們可以共享超過(guò)50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高序列同一性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，它們是相同的。通常，反向重復(fù)片段的長(zhǎng)度各自是200至1000bp。優(yōu)選的反向重復(fù)序列可以各自具有200至300bp、300至400bp、400至500bp、500至600bp、600至700bp、700至800bp、800至900bp、或900至1000bp的長(zhǎng)度。特別優(yōu)選的反向重復(fù)片段是質(zhì)粒pSR1(959bp)、pSB1(675bp)、pSB2(477bp)、pSB3(391bp)、pSM1(352bp)、pKD1(346bp)、2μm質(zhì)粒(599bp)、pSB4和pPM1的那些。
反向重復(fù)片段的序列可以有所變化。然而，每個(gè)反向重復(fù)片段中FRT位點(diǎn)的序列應(yīng)當(dāng)與由質(zhì)粒編碼的FLP蛋白質(zhì)的特異性相容，從而使得所編碼FLP蛋白質(zhì)能夠發(fā)揮作用，即在質(zhì)粒的反向重復(fù)序列之間催化位點(diǎn)特異重組?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域知道的方法來(lái)測(cè)定反向重復(fù)序列之間的重組(及由此FLP蛋白質(zhì)識(shí)別質(zhì)粒內(nèi)FRT位點(diǎn)的能力)。例如，可以在有利于FLP表達(dá)的條件下對(duì)酵母細(xì)胞中的質(zhì)粒測(cè)定質(zhì)粒限制圖譜的變化，而這是由質(zhì)粒中一個(gè)區(qū)域相對(duì)于質(zhì)粒中另一個(gè)區(qū)域的取向變化引起的。若檢測(cè)出限制圖譜有變化，則指示FLP蛋白質(zhì)能夠識(shí)別質(zhì)粒中的FRT位點(diǎn)，且因此每個(gè)反向重復(fù)片段中的FRT位點(diǎn)與由質(zhì)粒編碼的FLP蛋白質(zhì)的特異性相容。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括FRT位點(diǎn)在內(nèi)的反向重復(fù)片段的序列衍生自與編碼FLP蛋白質(zhì)的ORF相同的2μm家族質(zhì)粒，諸如pSR1、pSB1、pSB2、pSB3、pSB4、pSM1、pKD1、pPM1或2μm質(zhì)粒。
反向重復(fù)片段通常以這樣一種方式位于2μm家族質(zhì)粒內(nèi)，使得在排除外源導(dǎo)入的序列諸如轉(zhuǎn)基因時(shí)，反向重復(fù)片段之間定義的兩個(gè)區(qū)域(如諸如在2μm質(zhì)粒中定義為UL和US)具有大致相似的大小。例如，兩個(gè)區(qū)域其中之一所具有的長(zhǎng)度可以相當(dāng)于另一個(gè)區(qū)域的長(zhǎng)度的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多、可多達(dá)100％。
2μm家族質(zhì)粒通常包含編碼FLP的ORF和以這樣一種方式并置的一個(gè)反向重復(fù)片段(任意的稱(chēng)為“IR1”，使之與下一段中提及的另一個(gè)反向重復(fù)片段有所區(qū)別)，使得IR1存在于FLP ORF的遠(yuǎn)端且沒(méi)有任何插入其間的編碼序列，例如在2μm質(zhì)粒中所看到的?！斑h(yuǎn)端”在此語(yǔ)境中指FLP ORF中與啟動(dòng)子起始其轉(zhuǎn)錄的末端相反的末端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)LP ORF的遠(yuǎn)端與IR1交疊。
2μm家族質(zhì)粒通常包含編碼REP2的ORF和以這樣一種方式并置的另一個(gè)反向重復(fù)片段(任意的稱(chēng)為“IR2”，使之與上一段中提及的IR1有所區(qū)別)，使得IR2存在于REP2 ORF的遠(yuǎn)端且沒(méi)有任何插入其間的編碼序列，例如在2μm質(zhì)粒中所看到的?！斑h(yuǎn)端”在此語(yǔ)境中指REP2 ORF中與啟動(dòng)子起始其轉(zhuǎn)錄的末端相反的末端。
在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼REP2和FLP的ORF可以存在于2μm家族質(zhì)粒的反向重復(fù)片段之間所定義的兩個(gè)區(qū)域中的相同區(qū)域上，該區(qū)域可以是兩個(gè)區(qū)域中的較大者或較小者(如果兩個(gè)區(qū)域的大小之間存在任何不平等的話)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼REP2和FLP的ORF可以由不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。
通常，2μm家族質(zhì)粒的反向重復(fù)片段之間定義的區(qū)域(如諸如在2μm質(zhì)粒中定義為UL和US)可以包含不超過(guò)兩種內(nèi)源基因，它們所編碼的蛋白質(zhì)在2μm家族質(zhì)粒作為多拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定維持中發(fā)揮功能。由此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，質(zhì)粒中反向重復(fù)片段之間定義的一個(gè)區(qū)域可以包含不超過(guò)編碼FLP和REP2；FLP和REP1；或REP1和REP2的ORF作為內(nèi)源編碼序列。
2μm家族質(zhì)粒通常包含復(fù)制起點(diǎn)(也稱(chēng)為自主復(fù)制序列-“ARS”)，它通常是雙向的。可以存在任何合適的ARS序列。酵母染色體復(fù)制起點(diǎn)典型的共有序列可能是合適的(Broach等人，1982，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，47，1165-1174；Williamson，1985，Yeast，1，1-14)。優(yōu)選的ARS包括由pSR1、pSB1、pSB2、pSB3、pSB4、pSM1、pKD1、pPM1和2μm質(zhì)粒分離的那些。
由此，優(yōu)選的2μm家族質(zhì)?？梢园幋aFLP、REP1和REP2的ORF、兩個(gè)反向重復(fù)序列(每個(gè)反向重復(fù)片段包含與所編碼FLP蛋白質(zhì)相容的FRT位點(diǎn))、和ARS序列。優(yōu)選的是，F(xiàn)RT位點(diǎn)衍生自與編碼FLP蛋白質(zhì)的序列相同的2μm家族質(zhì)粒。更加優(yōu)選的是，所編碼REP1和REP2蛋白質(zhì)的序列衍生自彼此相同的2μm家族質(zhì)粒。甚至更加優(yōu)選的是，F(xiàn)RT位點(diǎn)衍生自與所編碼FLP、REP1和REP2蛋白質(zhì)的序列相同的2μm家族質(zhì)粒。仍然更加優(yōu)選的是，編碼FLP、REP1和REP2的ORF的序列和反向重復(fù)片段(包括FRT位點(diǎn))的序列衍生自相同的2μm家族質(zhì)粒。此外，ARS位點(diǎn)可以衍生自與FLP、REP1和REP2的ORF及反向重復(fù)片段(包括FRT位點(diǎn))的序列其中一種或多種相同的2μm家族質(zhì)粒。
術(shù)語(yǔ)“衍生自”包括與衍生它的序列具有相同序列的序列。然而，還包括如上定義的它們的變體和片段。例如，具有衍生自2μm質(zhì)粒的FLP基因之序列的FLP基因可以具有與天然存在基因相比經(jīng)過(guò)修飾的啟動(dòng)子或其它調(diào)控序列。另外/或者，具有衍生自2μm質(zhì)粒的FLP基因之序列的FLP基因可以在開(kāi)放讀碼框中具有經(jīng)過(guò)修飾的核苷酸序列，它可以編碼與天然存在基因相同的蛋白質(zhì)，或者可以編碼經(jīng)過(guò)修飾的FLP蛋白質(zhì)。相同考慮應(yīng)用于2μm家族質(zhì)粒上具有衍生自特定來(lái)源的序列的其它序列。
任選的是，2μm家族質(zhì)?？梢园苌?μm質(zhì)粒中STB區(qū)域(也稱(chēng)為REP3)的區(qū)域，正如Volkert等人，前述引用中所定義的。本發(fā)明2μm家族質(zhì)粒中的STB區(qū)域可以包含兩個(gè)或多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，諸如3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多?；蛘撸梢圆淮嬖诖?lián)重復(fù)序列。串聯(lián)重復(fù)片段可以是任何大小，諸如長(zhǎng)度為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100bp或更長(zhǎng)。2μm質(zhì)粒STB區(qū)域中的串聯(lián)重復(fù)片段的長(zhǎng)度是62bp。串聯(lián)重復(fù)片段的序列是相同的并不重要?？梢猿惺茌p微的序列變異。由與REP1和REP2 ORF其中任一或二者相同的質(zhì)粒選擇STB區(qū)域可能是優(yōu)選的。認(rèn)為STB區(qū)域是順式作用元件且優(yōu)選是不轉(zhuǎn)錄的。
任選的是，2μm家族質(zhì)粒可以包含額外ORF，它所編碼的蛋白質(zhì)在2μm家族質(zhì)粒作為多拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定維持中發(fā)揮功能。額外的蛋白質(zhì)可以命名為RAF或D。在例如2μm質(zhì)粒和pSM1上可以看到編碼RAF或D基因的ORF。由此，RAF或D的ORF可以包含適于編碼由2μm質(zhì)?；騪SM1編碼的RAF或D基因OFR的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其變體和片段的序列。由此，本發(fā)明還包括2μm質(zhì)粒或pSM1的RAF或D基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的變體和片段。2μm質(zhì)粒或pSM1的RAF或D基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物“片段”和“變體”指在由2μm質(zhì)?；騪SM1代替天然ORF編碼時(shí)不破壞質(zhì)粒在合適酵母群中的穩(wěn)定多拷貝維持的那些。這些變體和片段通常與由2μm質(zhì)?；騪SM1編碼的RAF或D基因ORF的蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更高同源性。
天然存在2μm家族質(zhì)?？赡苁莾?yōu)選的。天然存在2μm家族質(zhì)粒指具有上述特征的任何質(zhì)粒，該質(zhì)粒是發(fā)現(xiàn)在酵母中天然存在的，即尚未經(jīng)過(guò)重組修飾以包含異源序列。優(yōu)選的是，天然存在2μm家族質(zhì)粒選自由魯氏接合糖酵母獲得的pSR1(編號(hào)X02398)、pSB3(編號(hào)X02608)或pSB4，由拜列氏接合糖酵母獲得的pSB1或pSB2(編號(hào)NC_002055或M18274)，由發(fā)酵接合糖酵母獲得的pSM1(編號(hào)NC_002054)，由果蠅克魯維氏酵母獲得的pKD1(編號(hào)X03961)，由膜醭畢赤氏酵母獲得的pPM1，或最優(yōu)選的是由啤酒糖酵母獲得的2μm質(zhì)粒(編號(hào)NC_001398或J01347)。此段中的編號(hào)指NCBI的保藏物。
2μm質(zhì)粒(

圖1)是6318bp雙鏈DNA質(zhì)粒，在大多數(shù)啤酒糖酵母菌株中是內(nèi)源的，每個(gè)單倍體基因組60-100個(gè)拷貝。2μm質(zhì)粒包含由兩個(gè)599bp反向重復(fù)序列分開(kāi)的小獨(dú)特(US)區(qū)和大獨(dú)特區(qū)(UL)。反向重復(fù)序列的位點(diǎn)特異重組導(dǎo)致A型和B型質(zhì)粒之間的體內(nèi)互變(Volkert和Broach，1986，Cell，46，541)。兩種形式的2μm質(zhì)粒只有它們獨(dú)特區(qū)的相對(duì)取向不同。
盡管來(lái)自啤酒糖酵母的克隆2μm質(zhì)粒(也稱(chēng)為Scp1)的DNA測(cè)序給出6318bp的大小(Hartley和Donelson，1980，Nature，286，860)，然而已知存在其它略微較小的2μm變體Scp2和Scp3，分別是稱(chēng)為STB的區(qū)域中125bp和220bp小段刪除的結(jié)果(Cameron等人，1977，Nucl.Acids Res.，4，1429；Kikuchi，1983，Cell，35，487；及Livingston和Hahne，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，3727)。在一項(xiàng)研究中，來(lái)自世界各地的天然糖酵母菌株中約80％含有與2μm同源的DNA(根據(jù)Southern印跡分析)(Hollenberg，1982，Current Topics in Microbiology and Immunobiology，96，119)。此外，在啤酒糖酵母和卡爾斯伯糖酵母中發(fā)現(xiàn)的天然2μm質(zhì)粒群內(nèi)存在變異(遺傳多態(tài)性)，NCBI序列(編號(hào)NC_001398)是一個(gè)實(shí)例。
2μm質(zhì)粒具有核定位，且展示高水平的有絲分裂穩(wěn)定性(Mead等人，1986，Molecular & General Genetics，205，417)。2μm質(zhì)粒的固有穩(wěn)定性源自質(zhì)粒編碼的拷貝數(shù)擴(kuò)增和分配機(jī)制，它在嵌合載體的開(kāi)發(fā)中可能受到損害(Futcher和Cox，1984，J.Bacteriol.，157，283；Bachmair和Ruis，1984，Monatshefte fr Chemie，115，1229)。將含有2μm質(zhì)粒的酵母菌株稱(chēng)為[cir+]，而將不含2μm質(zhì)粒的酵母菌株稱(chēng)為[cir0]。
2μm質(zhì)粒的US區(qū)含有REP2和FLP基因，而UL區(qū)含有REP1和D(也稱(chēng)為RAF)基因、STB基因座和復(fù)制起點(diǎn)(Broach和Hicks，1980，Cell，21，501；Sutton和Broach，1985，Mol.Cell.Biol.，5，2770)。Flp重組酶結(jié)合反向重復(fù)片段內(nèi)的FRT位點(diǎn)(Flp識(shí)別靶)以介導(dǎo)位點(diǎn)特異重組，這對(duì)于體內(nèi)天然質(zhì)粒擴(kuò)增和質(zhì)?？截悢?shù)控制是至關(guān)重要的(Senecoff等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，7270；Jayaram，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，5875)。Flp重組酶活性的變化能夠顯著影響2μm家族質(zhì)粒的拷貝數(shù)(Sleep等人，2001，Yeast，18，403；Rose和Broach，1990，MethodsEnzymol.，185，234)。Rep1和Rep2蛋白質(zhì)介導(dǎo)質(zhì)粒隔離，盡管它們的作用模式尚不清楚(Sengupta等人，2001，J.Bacteriol.，183，2306)。它們還抑制FLP基因的轉(zhuǎn)錄(Reynolds等人，1987，Mol.Cell.Biol.，7，3566)。
2μm質(zhì)粒的FLP和REP2基因由不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，而且它們之間顯然沒(méi)有定義的插入其間的序列。FLP和REP2轉(zhuǎn)錄本都在反向重復(fù)序列內(nèi)的相同序列基序處終止，分別在它們翻譯終止密碼子后24bp和178bp(Sutton和Broach，1985，Mol.Cell.Biol.，5，2770)。
在FLP的情況中，C端編碼序列也位于反向重復(fù)序列內(nèi)。此外，兩個(gè)反向重復(fù)序列在599bp上高度保守，認(rèn)為這種特征對(duì)于體內(nèi)有效的質(zhì)粒復(fù)制和擴(kuò)增是有利的，盡管只有FRT位點(diǎn)(少于65bp)對(duì)于體內(nèi)位點(diǎn)特異重組是必需的(Senecoff等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，7270；Jayaram，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，5875；Meyer-Leon等人，1984，ColdSpring Harbor Symposia On Quantitative Biology，49，797)。FLP的關(guān)鍵催化殘基是精氨酸308和酪氨酸343(其是必需的)，而組氨酸309和組氨酸345促進(jìn)鏈切割(Prasad等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，2189；Chen等人，1992，Cell，69，647；Grainge等人，2001，J.Mol.Biol.，314，717)。
在Rep2中描述了兩個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域。殘基15-58形成Rep1結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而殘基59-296含有自我締合和STB結(jié)合區(qū)(Sengupta等人，2001，J.Bacteriol.，183，2306)。
缺乏2μm質(zhì)粒的許多必需功能區(qū)但保留功能性順式元件ARS和STB的2μm質(zhì)粒的嵌合或大段刪除的突變衍生物不能在細(xì)胞分裂時(shí)在母細(xì)胞和子細(xì)胞之間有效分配。如果通過(guò)例如在宿主內(nèi)提供功能性2μm質(zhì)粒而反式提供這些功能即所謂的[cir+]宿主，那么這些質(zhì)粒就能這樣做。
先前已經(jīng)將目的基因插入2μm質(zhì)粒的UL區(qū)。例如，參閱EP 0 286 424中的質(zhì)粒pSAC3U1和圖2所示質(zhì)粒，它包含β-內(nèi)酰胺酶基因(用于氨芐青霉素抗性)、LEU2選擇標(biāo)記和寡核苷酸接頭，其中后兩種插入2μm樣非整合載體pSAC3的UL區(qū)內(nèi)唯一SnaBI位點(diǎn)(參閱EP 0 286 424)。在轉(zhuǎn)化到酵母中后，圖2所示質(zhì)粒遺失XbaI位點(diǎn)之間含有氨芐青霉素抗性基因的大腸桿菌DNA。這在Chinery和Hinchliffe，1989，Curr.Genet.，16，21和EP0 286 424中有所描述，其中這些類(lèi)型的載體稱(chēng)為“非整合載體”?？梢栽诮宇^內(nèi)的NotI位點(diǎn)中進(jìn)行其它多核苷酸插入(Sleep等人，1991，Biotechnology(NY)，9，183)。
本領(lǐng)域知道2μm質(zhì)粒中的候選插入位點(diǎn)，包括Rose和Broach，1990，Methods Enzymol.，185，234-279中描述的那些，諸如利用FLP中EcoRI處插入的質(zhì)粒pCV19、pCV20、CVneo，利用D中EcoRI作為插入位點(diǎn)的質(zhì)粒pCV21、pGT41和pYE，利用D中PstI作為插入位點(diǎn)的質(zhì)粒pHKB52，利用D中PstI和D中EcoRI處插入的質(zhì)粒pJDB248，利用D中PstI和FLP中EcoRI作為插入位點(diǎn)的質(zhì)粒pJDB219，利用FLP中ClaI處插入的質(zhì)粒G18、質(zhì)粒pAB18，利用D中PstI作為插入位點(diǎn)的質(zhì)粒pGT39和pA3、質(zhì)粒pYT11、pYT14和pYT11-LEU，及利用FLP中EcoRI作為插入位點(diǎn)的質(zhì)粒pTY39。其它2μm質(zhì)粒包括EP 0 286 424及Chinery和Hinchliffe，1989，Curr.Genet.，16，21-25中描述的pSAC3、pSAC3U1、pSAC3U2、pSAC300、pSAC310、pSAC3C1、pSAC3PL1、pSAC3SL4、和pSAC3SC1，它們還將PstI、EagI或SnaBI描述為適當(dāng)?shù)?μm插入位點(diǎn)。其它2μm質(zhì)粒包括pAYE255、pAYE316、pAYE443、pAYE522(Kerry-Williams等人，1998，Yeast，14，161-1690)、pDB2244(WO 00/44772)和pAYE329(Sleep等人，2001，Yeast，18，403-421)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一種或多種基因插入2μm家族質(zhì)粒，在ARS序列周?chē)姆寝D(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。例如，在由啤酒糖酵母獲得的2μm質(zhì)粒中，ARS序列周?chē)姆寝D(zhuǎn)錄區(qū)由D基因的末端延伸至ARS序列的開(kāi)端。Chinery和Hinchliffe，1989，Curr.Genet.，16，21-25中描述了SnaBI(復(fù)制起點(diǎn)序列ARS附近)中的插入。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，還可以在非轉(zhuǎn)錄區(qū)中進(jìn)行基因插入，位于由Chinery和Hinchliffe描述的SnaBI位點(diǎn)的附近位置。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，2μm家族質(zhì)粒中的REP2和FLP基因各自具有與之相鄰的反向重復(fù)片段，2μm家族質(zhì)粒中插入了一種或多種基因，位于REP2基因或FLP基因其中任一的最后一個(gè)功能性密碼子后面的第一個(gè)堿基和與所述基因相鄰的反向重復(fù)片段中FRT位點(diǎn)前面的最后一個(gè)堿基之間的區(qū)域內(nèi)。REP2基因或FLP基因其中任一的最后一個(gè)功能性密碼子指基因開(kāi)放讀碼框中位于基因啟動(dòng)子下游最遠(yuǎn)的密碼子，且如上定義其終止密碼子替代將導(dǎo)致質(zhì)粒多拷貝穩(wěn)定性的不可接受的損失。由此，通過(guò)插入多核苷酸序列插入、刪除或替代在任一基因中最后一個(gè)功能性密碼子下游的任何點(diǎn)破壞REP2或FLP基因不會(huì)導(dǎo)致不可接受的質(zhì)粒多拷貝穩(wěn)定性的損失。
例如，可以在密碼子59后面破壞2μm質(zhì)粒的REP2基因，而且可以在密碼子344后面破壞2μm質(zhì)粒的FLP基因，各自不會(huì)損害質(zhì)粒的多拷貝穩(wěn)定性?？梢酝ㄟ^(guò)在FLP或REP2基因其中任一中構(gòu)建質(zhì)粒突變體并遵循本文列出的測(cè)試方法測(cè)定質(zhì)粒是否保持多拷貝穩(wěn)定性，常規(guī)確定其它2μm家族質(zhì)粒中等價(jià)基因的最后一個(gè)功能性密碼子。
可以使用諸如Chinery和Hinchliffe，1989，Curr.Genet.，16，21-25中定義的測(cè)試方法來(lái)確定質(zhì)粒是否保持多拷貝穩(wěn)定性。對(duì)于在Chinery和Hinchliffe，1989，Curr.Genet.，16，21-25中定義的非選擇性培養(yǎng)基(YPD，也稱(chēng)為YEPD)中不生長(zhǎng)的酵母，可以使用其它合適的非選擇性培養(yǎng)基。質(zhì)粒穩(wěn)定性可以定義為在限定代數(shù)后對(duì)選擇標(biāo)記保持原養(yǎng)型的細(xì)胞百分比。代數(shù)優(yōu)選足以顯示對(duì)照質(zhì)粒諸如pSAC35或pSAC310之間的差異，或是顯示與這樣一種對(duì)照質(zhì)?？杀鹊姆€(wěn)定性。代數(shù)可以是1代、2代、3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、10代、11代、12代、13代、14代、15代、16代、17代、18代、19代、20代、25代、30代、35代、40代、45代、50代、60代、70代、80代、90代、100代或更多。優(yōu)選較高數(shù)目?？山邮艿馁|(zhì)粒穩(wěn)定性可以是1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或基本上100％。優(yōu)選較高百分比。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，即使質(zhì)?？赡茉诜沁x擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)具有低于100％的穩(wěn)定性，質(zhì)粒仍然能夠在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)使用。例如，實(shí)施例中描述的質(zhì)粒pDB2711在依照實(shí)施例1的測(cè)試方法測(cè)定穩(wěn)定性時(shí)只有10％是穩(wěn)定的，但是在選擇性生長(zhǎng)條件下在搖瓶培養(yǎng)中在重組運(yùn)鐵蛋白生產(chǎn)力中提供15倍增量。
由此，REP2基因最后一個(gè)功能性密碼子后面的第一個(gè)堿基和與所述基因相鄰的反向重復(fù)片段中FRT位點(diǎn)前面的最后一個(gè)堿基之間、更加優(yōu)選反向重復(fù)片段的第一個(gè)堿基和FRT位點(diǎn)前面的最后一個(gè)堿基之間、甚至更加優(yōu)選REP2基因翻譯終止密碼子后面且FRT位點(diǎn)前面最后一個(gè)堿基前面的位置處可以存在一種或多種基因插入。
另外/或者，F(xiàn)LP基因最后一個(gè)功能性密碼子后面的第一個(gè)堿基和與所述基因相鄰的反向重復(fù)片段中FRT位點(diǎn)前面的最后一個(gè)堿基之間、優(yōu)選反向重復(fù)片段的第一個(gè)堿基和FRT位點(diǎn)前面的最后一個(gè)堿基之間、更加優(yōu)選FLP編碼序列末端后面的第一個(gè)堿基和FRT位點(diǎn)前面的最后一個(gè)堿基之間、諸如FLP編碼序列末端后面的第一個(gè)堿基處可以存在一種或多種基因插入。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果2μm家族質(zhì)?；谄【铺墙湍傅?μm質(zhì)粒，那么它是本領(lǐng)域知道的非整合載體(例如參閱EP 286 424，將其內(nèi)容收入本文作為參考)。非整合載體可以是包含預(yù)定通過(guò)重組遺失的DNA序列、三對(duì)2μm FRT位點(diǎn)(其中一對(duì)位點(diǎn)取順向而另兩對(duì)取逆向)、和目的DNA序列(諸如大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)和細(xì)菌選擇標(biāo)記)的2μm質(zhì)粒載體，將要遺失的所述序列位于取順向的所述位點(diǎn)之間。
由此，將要遺失的序列可以包含選擇標(biāo)記DNA序列。
優(yōu)選的非整合載體包括額外攜帶下列各項(xiàng)的完整2μm質(zhì)粒(i)載體在細(xì)菌宿主中繁殖所必需的細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列；(ii)額外2μm FRT位點(diǎn)；和(iii)用于酵母轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記DNA序列；所述細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列和額外FRT位點(diǎn)存在于/創(chuàng)建在2μm質(zhì)粒的兩個(gè)反向重復(fù)序列其中之一中的限制性位點(diǎn)諸如XbaI處，所述額外FRT位點(diǎn)相對(duì)于所述一個(gè)重復(fù)序列的內(nèi)源FRT位點(diǎn)取順向，且所述細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列夾在額外FRT位點(diǎn)和所述一個(gè)重復(fù)序列的內(nèi)源FRT位點(diǎn)之間。在一種優(yōu)選的非整合載體中，所有細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列如上所述夾在中間。一種特別優(yōu)選的2μm質(zhì)粒載體本質(zhì)上具有EP 286424中所示pSAC3的構(gòu)造。
術(shù)語(yǔ)“非整合載體”在用于本文時(shí)還包括US 6,451,559中定義的質(zhì)粒，將其內(nèi)容收入本文作為參考。由此，非整合載體可以是除了編碼非酵母多肽的DNA序列以外，不含細(xì)菌(特別是大腸桿菌)復(fù)制起點(diǎn)或更優(yōu)選的是細(xì)菌(特別是大腸桿菌)序列的2μm載體，更優(yōu)選的是，除了編碼非酵母多肽的DNA序列以外，所述載體中的所有DNA是酵母衍生的DNA。
術(shù)語(yǔ)“蛋白伴侶”在用于本文時(shí)指如下蛋白質(zhì)，它結(jié)合并穩(wěn)定另一種蛋白質(zhì)在其它條件下不穩(wěn)定的構(gòu)象異構(gòu)體，并且通過(guò)控制結(jié)合和釋放來(lái)推動(dòng)其正確的體內(nèi)命運(yùn)，即折疊、寡聚物裝配、轉(zhuǎn)運(yùn)至特定亞細(xì)胞隔室、或通過(guò)降解而處置。因此，蛋白伴侶還指如下蛋白質(zhì)，它參與蛋白質(zhì)折疊，或是具有蛋白伴侶活性或參與未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答。本領(lǐng)域知道這類(lèi)伴侶蛋白，例如斯坦福基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Stanford Genome Database，SGD，http//yeastgenome.org)。優(yōu)選的蛋白伴侶是真核蛋白伴侶，尤其優(yōu)選酵母蛋白伴侶，包括AHA1、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、CPR3、CPR6、EPS1、ERO1、EUG1、FMO1、HCH1、HSP10、HSP12、HSP104、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP78、HSP82、JEM1、MDJ1、MDJ2、MPD1、MPD2、PDI1、PFD1、ABC1、APJ1、ATP11、ATP12、BTT1、CDC37、CPR7、HSC82、KAR2、LHS1、MGE1、MRS11、NOB1、ECM10、SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSC1、SSE2、SIL1、SLS1、ORM1、ORM2、PER1、PTC2、PSE1、UBI4和HAC1或截短的無(wú)內(nèi)含子HAC1(Valkonen等人，2003，Applied Environ.Micro.，69，2065)。
可用于本發(fā)明實(shí)踐的蛋白伴侶可以是●熱休克蛋白，諸如作為hsp70蛋白家族成員的蛋白質(zhì)(包括Kar2p、SSA和SSB蛋白質(zhì)，例如由SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSB1和SSB2編碼的蛋白質(zhì))、作為HSP90家族成員的蛋白質(zhì)、或作為HSP40家族成員的蛋白質(zhì)或參與其調(diào)控的蛋白質(zhì)(如Sillp)，包括DNA-J和DNA-J樣蛋白質(zhì)(如Jem1p、Mdj2p)；●作為核周蛋白/輸入蛋白蛋白質(zhì)家族成員的蛋白質(zhì)，諸如α或β核周蛋白/輸入蛋白蛋白家族，例如核周蛋白β蛋白PSE1；●作為Hjelmqvist等人，2002，Genome Biology，3(6)，research0027.1-0027.16描述的ORMDL家族成員的蛋白質(zhì)，諸如Orm2p；●天然位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中或分泌途徑中其它部位諸如高爾基體中的蛋白質(zhì)，例如天然在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)內(nèi)腔中特別是在分泌細(xì)胞中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)，諸如PD1；●作為錨定在ER中的跨膜蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，諸如Hjelmqvist等人，2002，前述引用描述的ORMDL家族的成員(例如Orm2p)；●在細(xì)胞溶膠中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)，諸如hsp70蛋白，包括SSA和SSB蛋白，例如由SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSB1和SSB2編碼的蛋白質(zhì)；●在細(xì)胞核、核被膜和/或細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)，諸如Pse1p；●對(duì)細(xì)胞存活而言必需的蛋白質(zhì)，諸如PDI或必需的核周蛋白蛋白質(zhì)，諸如Pse1p；●參與巰基氧化或二硫鍵形成、斷裂或異構(gòu)化的蛋白質(zhì)，或是催化蛋白質(zhì)中硫醇二硫化物互換反應(yīng)的蛋白質(zhì)，特別是在分泌和細(xì)胞表面蛋白的生物合成過(guò)程中，諸如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(如Pdi1p、Mpd1p)、同源物(如Eug1p)和/或相關(guān)蛋白質(zhì)(如Mpd2p、Fmo1p、Ero1p)；●參與蛋白質(zhì)合成、裝配或折疊的蛋白質(zhì)，諸如PDI和Ssa1p；●優(yōu)先或?qū)ｉT(mén)結(jié)合未折疊而非成熟蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，諸如hsp70蛋白，包括SSA和SSB蛋白，例如由SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSB1和SSB2編碼的蛋白質(zhì)；●防止蛋白質(zhì)前體在細(xì)胞溶膠中聚集的蛋白質(zhì)，諸如hsp70蛋白，包括SSA和SSB蛋白，例如由SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSB1和SSB2編碼的蛋白質(zhì)；●結(jié)合并穩(wěn)定損壞的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，例如Ssa1p；
●參與未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答或?qū)φT導(dǎo)未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答的試劑(諸如衣霉素和二硫蘇糖醇)提供升高的抗性的蛋白質(zhì)，諸如Hjelmqvist等人，2002，前述引用描述的ORMDL家族的成員(例如Orm2p)或參與壓力應(yīng)答的蛋白質(zhì)(如Ubi4p)；●作為輔伴侶蛋白的蛋白質(zhì)和/或間接參與蛋白質(zhì)折疊和/或未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答的蛋白質(zhì)(如hsp104p、Mdj1p)；●參與高分子核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，諸如Pse1p；●通過(guò)識(shí)別核定位序列和核輸出序列并與核孔復(fù)合體相互作用來(lái)介導(dǎo)高分子穿過(guò)核膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，諸如PSE1；●EP 0 746 611及Hillson等人，1984，Methods Enzymol.，107，281-292中描述的能夠再激活被擾亂核糖核酸酶針對(duì)RNA的核糖核酸酶活性的蛋白質(zhì)，諸如PDI；●具有酸性pI(例如4.0-4.5)的蛋白質(zhì)，諸如PDI；●作為Hsp70家族成員且優(yōu)選具有N端ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，諸如Ssa1p；●作為肽基脯氨酸順?lè)串悩?gòu)酶的蛋白質(zhì)(如Cpr3p、Cpr6p)；●與已知蛋白伴侶同源的蛋白質(zhì)(如Hsp10p)；●作為線粒體蛋白伴侶的蛋白質(zhì)(如Cpr3p)；●作為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核蛋白伴侶的蛋白質(zhì)(如Cns1p)；●作為膜結(jié)合蛋白伴侶的蛋白質(zhì)(如Orm2p、Fmo1p)；●具有蛋白伴侶激活物活性或蛋白伴侶調(diào)控活性的蛋白質(zhì)(如Aha1p、Hac1p、Hch1p)；●瞬時(shí)結(jié)合未成熟形式的多肽以引起正確折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和/或分泌的蛋白質(zhì)，包括高效易位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(如Lhs1p)或它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)(如Pse1p)所需要的蛋白質(zhì)；●參與蛋白質(zhì)復(fù)合體裝配和/或核糖體裝配的蛋白質(zhì)(如Atp11p、Pse1p、Nob1p)；●陪伴蛋白T復(fù)合體的蛋白質(zhì)(如Cct2p)；或●預(yù)折疊復(fù)合體的蛋白質(zhì)(如Pfd1p)。
一種優(yōu)選的蛋白伴侶是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)或其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)內(nèi)腔中具有催化二硫鍵形成的等價(jià)能力的片段或變體?！癙DI”包括EP 0 746611和Hillson等人，1984，Methods Enzymol.，107，281-292中描述的具有再激活被擾亂核糖核酸酶針對(duì)RNA的核糖核酸酶活性的能力的任何蛋白質(zhì)。
PDI指通常催化硫醇二硫化物互換反應(yīng)的酶，它是分泌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中的主要駐留蛋白質(zhì)成分。大量證據(jù)表明它在分泌性蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮作用(Freedman，1984，Trends Biochem.Sci.，9，438-41)，而且這得到了原位直接交聯(lián)研究的支持(Roth和Pierce，1987，Biochemistry，26，4179-82)。PDI缺陷的微粒體膜在共翻譯蛋白質(zhì)二硫鍵形成中顯示特異缺陷的發(fā)現(xiàn)(Bulleid和Freedman，1988，Nature，335，649-51)暗示該酶在分泌和細(xì)胞表面蛋白的生物合成過(guò)程中發(fā)揮天然二硫鍵形成催化物的功能。這種作用與已知的該酶在體外的催化特性是一致的；它催化硫醇二硫化物互換反應(yīng)，導(dǎo)致凈余蛋白質(zhì)二硫鍵形成、斷裂或異構(gòu)化，而且通常能夠在極其多種還原的、未折疊的蛋白質(zhì)底物中催化蛋白質(zhì)折疊和天然二硫鍵形成(Freedman等人，1989，Biochem.Soc.Symp.，55，167-192)。PDI還作為蛋白伴侶發(fā)揮作用，因?yàn)槿狈Ξ悩?gòu)酶活性的突變型PDI加速蛋白質(zhì)折疊(Hayano等人，1995，F(xiàn)EBS Letters，377，505-511)。最近，有報(bào)道說(shuō)巰基氧化而非二硫鍵異構(gòu)化是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在啤酒糖酵母中的主要功能(Solovyov等人，2004，J.Biol.Chem.，279(33)，34095-34100)。已經(jīng)知道該酶在數(shù)個(gè)物種中的DNA和氨基酸序列(Scherens等人，1991，Yeast，7，185-193；Farquhar等人，1991，Gene，108，81-89；EP 074 661；EP 0 293 793；EP 0 509 841)，而且關(guān)于由哺乳動(dòng)物肝臟純化至同質(zhì)的酶的作用機(jī)制的信息日益增加(Creighton等人，1980，J.Mol.Biol.，142，43-62；Freedman等人，1988，Biochem.Soc.Trans.，16，96-9；Gilbert，1989，Biochemistry，28，7298-7305；Lundstrom和Holmgren，1990，J.Biol.Chem.，265，9114-9120；Hawkins和Freedman，1990，Biochem.J.，275，335-339)。在目前涉及在細(xì)胞中作為蛋白質(zhì)折疊、裝配和易位的介導(dǎo)物的許多蛋白質(zhì)因子中(Rothman，1989，Cell，59，591-601)，PDI具有充分鑒定的催化活性。
宿主中內(nèi)源PDI基因的刪除或滅活導(dǎo)致不能生存的宿主的生成。換言之，內(nèi)源PDI基因是“必需”基因。
PDI易于由哺乳動(dòng)物組織分離，而且同質(zhì)的酶是具有特征性酸性pI(4.0-4.5)的二聚體(2×57kD)(Hillson等人，1984，前述引用)。還已經(jīng)由小麥和藻類(lèi)萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardii)(Kaska等人，1990，Biochem.J.，268，63-68)、大鼠(Edman等人，1985，Nature，317，267-270)、牛(Yamauchi等人，1987，Biochem.Biophys.Res.Comm.，146，1485-1492)、人(Pihlajaniemi等人，1987，EMBO J.，6，643-9)、酵母(Scherens等人，前述引用；Farquhar等人，前述引用)和雞(Parkkonen等人，1988，Biochem.J.，256，1005-1011)純化得到該酶。來(lái)自這些脊椎動(dòng)物物種的蛋白質(zhì)整個(gè)顯示高度的序列保守性，而且都顯示數(shù)項(xiàng)最初在大鼠PDI序列中注意到的總體特征(Edman等人，1985，前述引用)。
優(yōu)選的PDI序列包括來(lái)自人的那些和來(lái)自酵母物種諸如啤酒糖酵母的那些。
酵母蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶前體PDI1可以以基因庫(kù)編號(hào)CAA42373或BAA00723找到。它具有522個(gè)氨基酸的如下序列1 mkfsagavls wsslllassv faqqeavape dsavvklatd sfneyiqshd lvlaeffapw61 cghcknmape yvkaaetlve knitlaqidc tenqdlcmeh nipgfpslki fknsdvnnsi121 dyegprtaea ivqfmikqsq pavavvadlp aylanetfvt pvivqsgkid adfnatfysm181 ankhfndydf vsaenadddf klsiylpsam depvvyngkk adiadadvfe kwlqvealpy241 fgeidgsvfa qyvesglplg ylfyndeeel eeykplftel akknrglmnf vsidarkfgr301 hagnlnmkeq fplfaihdmt edlkyglpql seeafdelsd kivleskaie slvkdflkgd361 aspivksqei fenqdssvfq lvgknhdeiv ndpkkdvlvl yyapwcghck rlaptyqela421 dtyanatsdv liakldhten dvrgvviegy ptivlypggk ksesvvyqgs rsldslfdfi481 kenghfdvdg kalyeeaqek aaeeadadae ladeedaihd el候選酵母蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶序列可以以基因庫(kù)編號(hào)CAA38402找到。它具有530個(gè)氨基酸的如下序列1 mkfsagavls wsslllassv faqqeavape dsavvklatd sfneyiqshd lvlaeffapw61 cghcknmape yvkaaetlve knitlaqidc tenqdlcmeh nipgfpslki fknrdvnnsi121 dyegprtaea ivqfmikqsq pavavvadlp aylanetfvt pvivqsgkid adfnatfysm181 ankhfndydf vsaenadddf klsiylpsam depvvyngkk adiadadvfe kwlqvealpy241 fgeidgsvfa qyvesglplg ylfyndeeel eeykplftel akknrglmnf vsidarkfgr301 hagnlnmkeq fplfaihdmt edlkyglpql seeafdelsd kivleskaie slvkdflkgd361 aspivksqei fenqdssvfq lvgknhdeiv ndpkkdvlvl yyapwcghck rlaptyqela421 dtyanatsdv liakldhten dvrgvviegy ptivlypggk ksesvvyqgs rsldslfdfi481 kenghfdvdg kalyeeaqek aaeeaeadae aeadadaela deedaihdel這些序列的如下對(duì)比(基因庫(kù)編號(hào)CAA42373或BAA00723的序列在上，基因庫(kù)編號(hào)CAA38402的序列在下)顯示了這兩種序列之間的差異在于位置114處的單個(gè)氨基酸差異(以粗體突出顯示)，而且由基因庫(kù)編號(hào)CAA38402定義的序列在位置506-513處含有額外氨基酸EADAEAEA。
1 mkfsagavls wsslllassv faqqeavape dsavvklatd sfneyiqshd lvlaeffapw1 mkfsagavls wsslllassv faqqeavape dsavvklatd sfneyiqshd lvlaeffapw61 cghcknmape yvkaaetlve knitlaqidc tenqdlcmeh nipgfpslki fknsdvnnsi61 cghcknmape yvkaaetlve knitlaqidc tenqdlcmeh nipgfpslki fknrdvnnsi121 dyegprtaea ivqfmikqsq pavavvadlp aylanetfvt pvivqsgkid adfnatfysm121 dyegprtaea ivqfmikqsq pavavvadlp aylanetfvt pvivqsgkid adfnatfysm181 ankhfndydf vsaenadddf klsiylpsam depvvyngkk adiadadvfe kwlqvealpy181 ankhfndydf vsaenadddf klsiylpsam depvvyngkk adiadadvfe kwlqvealpy241 fgeidgsvfa qyvesglplg ylfyndeeel eeykplftel akknrglmnf vsidarkfgr241 fgeidgsvfa qyvesglplg ylfyndeeel eeykplftel akknrglmnf vsidarkfgr301 hagnlnmkeq fplfaihdmt edlkyglpql seeafdelsd kivleskaie slvkdflkgd301 hagnlnmkeq fplfaihdmt edlkyglpql seeafdelsd kivleskaie slvkdflkgd361 aspivksqei fenqdssvfq lvgknhdeiv ndpkkdvlvl yyapwcghck rlaptyqela361 aspivksqei fenqdssvfq lvgknhdeiv ndpkkdvlvl yyapwcghck rlaptyqela421 dtyanatsdv liakldhten dvrgvviegy ptivlypggk ksesvvyqgs rsldslfdfi421 dtyanatsdv liakldhten dvrgvviegy ptivlypggk ksesvvyqgs rsldslfdfi481 kenghfdvdg kalyeeaqek aaeea***** ***dadaela deedaihdel481 kenghfdvdg kalyeeaqek aaeeaeadae aeadadaela deedaihdel本發(fā)明還包括上述PDI序列的變體和片段，以及其它天然存在PDI序列的變體?！白凅w”在PDI的語(yǔ)境中指其中一個(gè)或多個(gè)位置存在或保守的或非保守的氨基酸插入、刪除、或替代的蛋白質(zhì)，只要這些變化產(chǎn)生其基本特性例如酶促活性(活性的類(lèi)型和特異性)、熱穩(wěn)定性、在某些pH范圍中的活性(pH穩(wěn)定性)沒(méi)有顯著變化的蛋白質(zhì)?！帮@著”在此語(yǔ)境中指本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為變體的特性仍然與最初的蛋白質(zhì)有所不同，但不是不明顯的。
“保守替代”指預(yù)定組合，諸如Val、Ile、Leu、Ala、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr、Gly、Ala；Lys、Arg、His；及Phe、Tyr、Trp。優(yōu)選的保守替代包括Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。
“變體”通常與衍生它的多肽具有至少25％、至少50％、至少60％或至少70％、優(yōu)選至少80％、更加優(yōu)選至少90％、甚至更加優(yōu)選至少95％、仍然更加優(yōu)選至少99％、最優(yōu)選至少99.5％的序列同一性。
可以使用合適的計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定兩種多肽之間的序列同一性百分比，正如下文所討論的。這些變體可以是天然的，或是使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白質(zhì)工程和定點(diǎn)誘變的方法人造的。
“片段”在PDI的語(yǔ)境中指一個(gè)或多個(gè)位置存在刪除的蛋白質(zhì)。由此，片段可以包含完整成熟PDI蛋白質(zhì)的完整序列的至多5％、10％、20％、30％、40％或50％、通?？筛哌_(dá)60％、更典型的是可高達(dá)70％、優(yōu)選可高達(dá)80％、更加優(yōu)選可高達(dá)90％、甚至更加優(yōu)選可高達(dá)95％、仍然更加優(yōu)選可高達(dá)99％。特別優(yōu)選的PDI蛋白質(zhì)的片段包含期望蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)完整結(jié)構(gòu)域。
PDI的片段或變體可以是在宿主細(xì)胞諸如啤酒糖酵母中重組表達(dá)時(shí)能夠補(bǔ)足宿主細(xì)胞中內(nèi)源編碼PDI基因的刪除的蛋白質(zhì)，而且可以是例如PDI的天然存在同系物，諸如由另一種生物體諸如另一種酵母或其它真菌、或另一種真核生物諸如人或其它脊椎動(dòng)物、或動(dòng)物或由植物編碼的同系物。
另一種優(yōu)選的蛋白伴侶是SSA1或其具有等價(jià)蛋白伴侶樣活性的片段或變體。SSA1，也稱(chēng)為YG100，位于啤酒糖酵母的染色體I上，且大小為1.93kb。
SSA1的一種已發(fā)表蛋白質(zhì)序列如下MSKAVGIDLGTTYSCVAHFANDRVDIIANDQGNRTTPSFVAFTDTERLIGDAAKNQAAMNPSNTVFDAKRLIGRNFNDPEVQADMKHFPFKLIDVDGKPQIQVEFKGETKNFTPEQISSMVLGKMKETAESYLGAKVNDAVVTVPAYFNDSQRQATKDAGTIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKKGKEEHVLIFDLGGGTFDVSLLFIEDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFIQEFKRKNKKDLSTNQRALRRLRTACERAKRTLSSSAQTSVEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCADLFRSTLDPVEKVLRDAKLDKSQVDEIVLVGGSTRIPKVQKLVTDYFNGKEPNRSINPDEAVAYGAAVQAAILTGDESSKTQDLLLLDVAPLSLGIETAGGVMTKLIPRNSTISTKKFEIFSTYADNQPGVLIQVFEGERAKTKDNNLLGKFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDVDSNGILNVSAVEKSTGKSNKITITNDKGRLSKEDIEKMVAEAEKFKEEDEKESQRIASKNQLESIAYSLKNTISEAGDKLEQADKDTVTKKAEETISWLDSNTTASKEEFDDKLKELQDIANPIMSKLYQAGGAPGGAAGGAPGGFPGGAPPAPEAEGPTVEEVDSSA1的一種已發(fā)表編碼序列如下，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以通過(guò)簡(jiǎn)并替代來(lái)修飾序列以獲得編碼相同蛋白質(zhì)產(chǎn)物的候選核苷酸序列ATGTCAAAAGCTGTCGGTATTGATTTAGGTACAACATACTCGTGTGTTGCTCACTTTGCTAATGATCGTGTGGACATTATTGCCAACGATCAAGGTAACAGAACCACTCCATCTTTTGTCGCTTTCACTGACACTGAAAGATTGATTGGTGATGCTGCTAAGAATCAAGCTGCTATGAATCCTTCGAATACCGTTTTCGACGCTAAGCGTTTGATCGGTAGAAACTTCAACGACCCAGAAGTGCAGGCTGACATGAAGCACTTCCCATTCAAGTTGATCGATGTTGACGGTAAGCCTCAAATTCAAGTTGAATTTAAGGGTGAAACCAAGAACTTTACCCCAGAACAAATCTCCTCCATGGTCTTGGGTAAGATGAAGGAAACTGCCGAATCTTACTTGGGAGCCAAGGTCAATGACGCTGTCGTCACTGTCCCAGCTTACTTCAACGATTCTCAAAGACAAGCTACCAAGGATGCTGGTACCATTGCTGGTTTGAATGTCTTGCGTATTATTAACGAACCTACCGCCGCTGCCATTGCTTACGGTTTGGACAAGAAGGGTAAGGAAGAACACGTCTTGATTTTCGACTTGGGTGGTGGTACTTTCGATGTCTCTTTGTTGTTCATTGAAGACGGTATCTTTGAAGTTAAGGCCACCGCTGGTGACACCCATTTGGGTGGTGAAGATTTTGACAACAGATTGGTCAACCACTTCATCCAAGAATTCAAGAGAAAGAACAAGAAGGACTTGTCTACCAACCAAAGAGCTTTGAGAAGATTAAGAACCGCTTGTGAAAGAGCCAAGAGAACTTTGTCTTCCTCCGCTCAAACTTCCGTTGAAATTGACTCTTTGTTCGAAGGTATCGATTTCTACACTTCCATCACCAGAGCCAGATTCGAAGAATTGTGTGCTGACTTGTTCAGATCTACTTTGGACCCAGTTGAAAAGGTCTTGAGAGATGCTAAATTGGACAAATCTCAAGTCGATGAAATTGTCTTGGTCGGTGGTTCTACCAGAATTCCAAAGGTCCAAAAATTGGTCACTGACTACTTCAACGGTAAGGAACCAAACAGATCTATCAACCCAGATGAAGCTGTTGCTTACGGTGCTGCTGTTCAAGCTGCTATTTTGACTGGTGACGAATCTTCCAAGACTCAAGATCTATTGTTGTTGGATGTCGCTCCATTATCCTTGGGTATTGAAACTGCTGGTGGTGTCATGACCAAGTTGATTCCAAGAAACTCTACCATTTCAACAAAGAAGTTCGAGATCTTTTCCACTTATGCTGATAACCAACCAGGTGTCTTGATTCAAGTCTTTGAAGGTGAAAGAGCCAAGACTAAGGACAACAACTTGTTGGGTAAGTTCGAATTGAGTGGTATTCCACCAGCTCCAAGAGGTGTCCCACAAATTGAAGTCACTTTCGATGTCGACTCTAACGGTATTTTGAATGTTTCCGCCGTCGAAAAGGGTACTGGTAAGTCTAACAAGATCACTATTACCAACGACAAGGGTAGATTGTCCAAGGAAGATATCGAAAAGATGGTTGCTGAAGCCGAAAAATTCAAGGAAGAAGATGAAAAGGAATCTCAAAGAATTGCTTCCAAGAACCAATTGGAATCCATTGCTTACTCTTTGAAGAACACCATTTCTGAAGCTGGTGACAAATTGGAACAAGCTGACAAGGACACCGTCACCAAGAAGGCTGAAGAGACTATTTCTTGGTTAGACAGCAACACCACTGCCAGCAAGGAAGAATTCGATGACAAGTTGAAGGAGTTGCAAGACATTGCCAACCCAATCATGTCTAAGTTGTACCAAGCTGGTGGTGCTCCAGGTGGCGCTGCAGGTGGTGCTCCAGGCGGTTTCCCAGGTGGTGCTCCTCCAGCTCCAGAGGCTGAAGGTCCAACCGTTGAAGAAGTTGATTAA
蛋白質(zhì)Ssa1p屬于Hsp70蛋白質(zhì)家族，而且駐留在細(xì)胞溶膠中。Hsp70具有執(zhí)行許多蛋白伴侶活性的能力；幫助蛋白質(zhì)合成、裝配和折疊；介導(dǎo)多肽易位至多種胞內(nèi)位置和分解蛋白質(zhì)聚集體(Backer和Craig，1994，Eur.J.Biochem.，219，11-23)。Hsp70基因高度保守，具有N端ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Hsp70蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)(主要是未折疊的)的肽主鏈相互作用。hsp70蛋白質(zhì)對(duì)肽的結(jié)合和釋放是依賴(lài)ATP的過(guò)程，而且伴隨著hsp70的構(gòu)象變化(Becher和Craig，1994，前述引用)。
細(xì)胞溶膠hsp70蛋白質(zhì)特別參與蛋白質(zhì)的合成、折疊和分泌(Becher和Craig，1994，前述引用)。在啤酒糖酵母中，已經(jīng)將細(xì)胞溶膠hsp70蛋白質(zhì)分成兩組，SSA(SSA 1-4)和SSB(SSB1和2)蛋白質(zhì)，它們?cè)诠δ苌媳舜私厝徊煌?。SSA家族是必需的，即為了維持細(xì)胞的存活，至少一種來(lái)自該組的蛋白質(zhì)必須是有活性的(Becher和Craig，1994，前述引用)。細(xì)胞溶膠hsp70蛋白質(zhì)優(yōu)先結(jié)合未折疊的和不成熟的蛋白質(zhì)。這說(shuō)明它們通過(guò)將蛋白質(zhì)前體在細(xì)胞溶膠中在裝配成多分子復(fù)合體前維持未折疊狀態(tài)和/或推動(dòng)它們易位至多種細(xì)胞器來(lái)防止其聚集(Becher和Craig，1994，前述引用)。SSA蛋白質(zhì)特別參與前體易位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的翻譯后生物發(fā)生和維持(Kim等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，12860-12865；Ngosuwan等人，2003，J.Biol.Chem.，278(9)，7034-7042)。已經(jīng)證明Ssa1p結(jié)合損壞的蛋白質(zhì)，使之穩(wěn)定于部分未折疊形式并容許發(fā)生重折疊或降解(Becher和Craig，1994，前述引用；Glover和Lindquist，1998，Cell，94，73-82)。
Demolder等人，1994，J.Biotechnol.，32，179-189報(bào)道了SSA1在酵母中的過(guò)度表達(dá)提高整合在染色體中的編碼人干擾素-β的重組基因的表達(dá)。沒(méi)有提出，如果由相同質(zhì)粒上的重組基因來(lái)編碼SSA1和人干擾素-β，那么將能夠?qū)崿F(xiàn)異源基因表達(dá)的增加。事實(shí)上，根據(jù)蛋白伴侶在酵母中過(guò)度表達(dá)領(lǐng)域的最新發(fā)展(如Robinson等人，1994，前述引用；Hayano等人，1995，前述引用；Shusta等人，1998，前述引用；Parekh和Wittrup，1997，前述引用；Bao和Fukuhara，2001，前述引用；及Bao等人，2000，前述引用)，為了提高異源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，技術(shù)人員將根本不愿由2μm家族質(zhì)粒來(lái)表達(dá)SSA1，比由2μm家族質(zhì)粒表達(dá)SSA1和異源蛋白質(zhì)二者低得多。
本發(fā)明還包括SSA1的變體和片段?！白凅w”在SSA1的語(yǔ)境中指具有天然SSA1的序列，只是一個(gè)或多個(gè)位置存在或保守的或非保守的氨基酸插入、刪除、或替代的蛋白質(zhì)，只要這些變化產(chǎn)生其基本特性例如酶促活性(活性的類(lèi)型和特異性)、熱穩(wěn)定性、在某些pH范圍中的活性(pH穩(wěn)定性)沒(méi)有顯著變化的蛋白質(zhì)?！帮@著”在此語(yǔ)境中指本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為變體的特性仍然與最初的蛋白質(zhì)有所不同，但不是不明顯的。
“保守替代”指預(yù)定組合，諸如Val、Ile、Leu、Ala、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr、Gly、Ala；Lys、Arg、His；及Phe、Tyr、Trp。優(yōu)選的保守替代包括Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。
SSA1的“變體”通常與天然SSA1的序列具有至少25％、至少50％、至少60％或至少70％、優(yōu)選至少80％、更加優(yōu)選至少90％、甚至更加優(yōu)選至少95％、仍然更加優(yōu)選至少99％、最優(yōu)選至少99.5％的序列同一性。
可以使用合適的計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定兩種多肽之間的序列同一性百分比，正如下文所討論的。這些變體可以是天然的，或是使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白質(zhì)工程和定點(diǎn)誘變的方法人造的。
“片段”在SSA1的語(yǔ)境中指具有天然SSA1的序列，只是一個(gè)或多個(gè)位置存在刪除的蛋白質(zhì)。由此，片段可以包含完整成熟SSA1蛋白質(zhì)的完整序列的至多5％、10％、20％、30％、40％或50％、通?？筛哌_(dá)60％、更典型的是可高達(dá)70％、優(yōu)選可高達(dá)80％、更加優(yōu)選可高達(dá)90％、甚至更加優(yōu)選可高達(dá)95％、仍然更加優(yōu)選可高達(dá)99％。特別優(yōu)選的SSA1蛋白質(zhì)的片段包含期望蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)完整結(jié)構(gòu)域。
SSA1的片段或變體可以是在宿主細(xì)胞諸如啤酒糖酵母中重組表達(dá)時(shí)能夠補(bǔ)足宿主細(xì)胞中內(nèi)源編碼SSA1基因(或其同系物)的刪除的蛋白質(zhì)，而且可以是例如SSA1的天然存在同系物，諸如由另一種生物體諸如另一種酵母或其它真菌、或另一種真核生物諸如人或其它脊椎動(dòng)物、或動(dòng)物或由植物編碼的同系物。
另一種優(yōu)選的蛋白伴侶是PSE1或其具有等價(jià)蛋白伴侶樣活性的片段或變體。
PSE1，也稱(chēng)為KAP121，是一種必需基因，位于染色體XIII上。
蛋白質(zhì)Pse1p的一種已發(fā)表蛋白質(zhì)序列如下
MSALPEEVNRTLLQIVQAFASPDNQIRSVAEKALSEEWITENNIEYLLTFLAEQAAFSQDTTVAALSAVLFRKLALKAPPSSKLMIMSKNITHIRKEVLAQIRSSLLKGFLSERADSIRHKLSDAIAECVQDDLPAWPELLQALIESLKSGNPNFRESSFRILTTVPYLITAVDINSILPIFQSGFTDASDNVKIAAVTAFVGYFKQLPKSEWSKLGILLPSLLNSLPRFLDDGKDDALASVFESLIELVELAPKLFKDMFDQIIQFTDMVIKNKDLEPPARTTALELLTVFSENAPQMCKSNQNYGQTLVMVTLIMMTEVSIDDDDAAEWIESDDTDDEEEVTYDHARQALDRVALKLGGEYLAAPLFQYLQQMITSTEWRERFAAMMALSSAAEGCADVLIGEIPKILDMVIPLINDPHPRVQYGCCNVLGQISTDFSPFIQRTAHDRILPALISKLTSECTSRVQTHAAAALVNFSEFASKDILEPYLDSLLTNLLVLLQSNKLYVQEQALTTIAFIAEAAKNKFIKYYDTLMPLLLNVLKVNNKDNSVLKGKCMECATLIGFAVGKEKFHEHSQELISILVALQNSDIDEDDALRSYLEQSWSRICRILGDDFVPLLPIVIPPLLITAKATQDVGLIEEEEAANFQQYPDWDVVQVQGKHIAIHTSVLDDKVSAMELLQSYATLLRGQFAVYVKEVMEEIALPSLDFYLHDGVRAAGATLIPILLSCLLAATGTQNEELVLLWHKASSKLIGGLMSEPMPEITQVYHNSLVNGIKVMGDNCLSEDQLAAFTKGVSANLTDTYERMQDRHGDGDEYNENIDEEEDFTDEDLLDEINKSIAAVLKTTNGHYLKNLENIWPMINTFLLDNEPILVIFALVVIGDLIQYGGEQTASMKNAFIPKVTECLISPDARIRQAASYIIGVCAQYAPSTYADVCIPTLDTLVQIVDFPGSKLEENRSSTENASAAIAKILYAYNSNIPNVDTYTANWFKTLPTITDKEAASFNYQFLSQLIENNSPIVCAQSNISAVVDSVIQALNERSLTEREGQTVISSVKKLLGFLPSSDAMAIFNRYPADIMEKVHKWFA*PSE1的一種已發(fā)表核苷酸編碼序列如下，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以通過(guò)簡(jiǎn)并替代來(lái)修飾序列以獲得編碼相同蛋白質(zhì)產(chǎn)物的候選核苷酸序列
ATGTCTGCTTTACCGGAAGAAGTTAATAGAACATTACTTCAGATTGTCCAGGCGTTTGCTTCCCCTGACAATCAAATACGTTCTGTAGCTGAGAAGGCTCTTAGTGAAGAATGGATTACCGAAAACAATATTGAGTATCTTTTAACTTTTTTGGCTGAACAAGCCGCTTTCTCCCAAGATACAACAGTTGCAGCATTATCTGCTGTTCTGTTTAGAAAATTAGCATTAAAAGCTCCCCCTTCTTCGAAGCTTATGATTATGTCCAAAAATATCACACATATTAGGAAAGAAGTTCTTGCACAAATTCGTTCTTCATTGTTAAAAGGGTTTTTGTCGGAAAGAGCTGATTCAATTAGGCACAAACTATCTGATGCTATTGCTGAGTGTGTTCAAGACGACTTACCAGCATGGCCAGAATTACTACAAGCTTTAATAGAGTCTTTAAAAAGCGGTAACCCAAATTTTAGAGAATCCAGTTTTAGAATTTTGACGACTGTACCTTATTTAATTACCGCTGTTGACATCAACAGTATCTTACCAATTTTTCAATCAGGCTTTACTGATGCAAGTGATAATGTCAAAATTGCTGCAGTTACGGCTTTCGTGGGTTATTTTAAGCAACTACCAAAATCTGAGTGGTCCAAGTTAGGTATTTTATTACCAAGTCTTTTGAATAGTTTACCAAGATTTTTAGATGATGGTAAGGACGATGCCCTTGCATCAGTTTTTGAATCGTTAATTGAGTTGGTGGAATTGGCACCAAAACTATTCAAGGATATGTTTGACCAAATAATACAATTCACTGATATGGTTATAAAAAATAAGGATTTAGAACCTCCAGCAAGAACCACAGCACTCGAACTGCTAACCGTTTTCAGCGAGAACGCTCCCCAAATGTGTAAATCGAACCAGAATTACGGGCAAACTTTAGTGATGGTTACTTTAATCATGATGACGGAGGTATCCATAGATGATGATGATGCAGCAGAATGGATAGAATCTGACGATACCGATGATGAAGAGGAAGTTACATATGACCACGCTCGTCAAGCTCTTGATCGTGTTGCTTTAAAGCTGGGTGGTGAATATTTGGCTGCACCATTGTTCCAATATTTACAGCAAATGATCACATCAACCGAATGGAGAGAAAGATTCGCGGCCATGATGGCACTTTCCTCTGCAGCTGAGGGTTGTGCTGATGTTCTGATCGGCGAGATCCCAAAAATCCTGGATATGGTAATTCCCCTCATCAACGATCCTCATCCAAGAGTACAGTATGGATGTTGTAATGTTTTGGGTCAAATATCTACTGATTTTTCA
CCATTCATTCAAAGAACTGCACACGATAGAATTTTGCCGGCTTTAATATCTAAACTAACGTCAGAATGCACCTCAAGAGTTCAAACGCACGCCGCAGCGGCTCTGGTTAACTTTTCTGAATTCGCTTCGAAGGATATTCTTGAGCCTTACTTGGATAGTCTATTGACAAATTTATTAGTTTTATTACAAAGCAACAAACTTTACGTACAGGAACAGGCCCTAACAACCATTGCATTTATTGCTGAAGCTGCAAAGAATAAATTTATCAAGTATTACGATACTCTAATGCCATTATTATTAAATGTTTTGAAGGTTAACAATAAAGATAATAGTGTTTTGAAAGGTAAATGTATGGAATGTGCAACTCTGATTGGTTTTGCCGTTGGTAAGGAAAAATTTCATGAGCACTCTCAAGAGCTGATTTCTATATTGGTCGCTTTACAAAACTCAGATATCGATGAAGATGATGCGCTCAGATCATACTTAGAACAAAGTTGGAGCAGGATTTGCCGAATTCTGGGTGATGATTTTGTTCCGTTGTTACCGATTGTTATACCACCCCTGCTAATTACTGCCAAAGCAACGCAAGACGTCGGTTTAATTGAAGAAGAAGAAGCAGCAAATTTCCAACAATATCCAGATTGGGATGTTGTTCAAGTTCAGGGAAAACACATTGCTATTCACACATCCGTCCTTGACGATAAAGTATCAGCAATGGAGCTATTACAAAGCTATGCGACACTTTTAAGAGGCCAATTTGCTGTATATGTTAAAGAAGTAATGGAAGAAATAGCTCTACCATCGCTTGACTTTTACCTACATGACGGTGTTCGTGCTGCAGGAGCAACTTTAATTCCTATTCTATTATCTTGTTTACTTGCAGCCACCGGTACTCAAAACGAGGAATTGGTATTGTTGTGGCATAAAGCTTCGTCTAAACTAATCGGAGGCTTAATGTCAGAACCAATGCCAGAAATCACGCAAGTTTATCACAACTCGTTAGTGAATGGTATTAAAGTCATGGGTGACAATTGCTTAAGCGAAGACCAATTAGCGGCATTTACTAAGGGTGTCTCCGCCAACTTAACTGACACTTACGAAAGGATGCAGGATCGCCATGGTGATGGTGATGAATATAATGAAAATATTGATGAAGAGGAAGACTTTACTGACGAAGATCTTCTCGATGAAATCAACAAGTCTATCGCGGCCGTTTTGAAAACCACAAATGGTCATTATCTAAAGAATTTGGAGAATATATGGCCTATGATAAACACATTCCTTTTAGATAATGAACCAATTTTAGTCATTTTTGCATTAGTAGTGATTGGTGACTTGATTCAATATGGTGGCGAACAAACTGCTAGCATGAAGAACGCATTTATTCCAAAGGTTACCGAGTGCTTGATTTCTCCTGACGCTCGTATTCGCCAAGCTGCTTCTTATATAATCGGTGTTTGTGCCCAATACGCTCCATCTACATATGCTGACGTTTGCATACCGACTTTAGATACACTTGTTCAGATTGTCGATTTTCCAGGCTCCAAACTGGAAGAAAATCGTTCTTCAACAGAGAATGCCAGTGCAGCCATCGCCAAAATTCTTTATGCATACAATTCCAACATTCCTAACGTAGACACGTACACGGCTAATTGGTTCAAAACGTTACCAACAATAACTGACAAAGAAGCTGCCTCATTCAACTATCAATTTTTGAGTCAATTGATTGAAAATAATTCGCCAATTGTGTGTGCTCAATCTAATATCTCCGCTGTAGTTGATTCAGTCATACAAGCCTTGAATGAGAGAAGTTTGACCGAAAGGGAAGGCCAAACGGTGATAAGTTCAGTTAAAAAGTTGTTGGGATTTTTGCCTTCTAGTGATGCTATGGCAATTTTCAATAGATATCCAGCTGATATTATGGAGAAAGTACATAAATGGTTTGCATAA
PSE1基因的大小是3.25kb。Pse1p參與高分子的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(Seedorf和Silver，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，8590-8595)。該過(guò)程經(jīng)由包埋在核被膜中且由核孔蛋白構(gòu)成的核孔復(fù)合體(NPC)發(fā)生(Ryan和Wente，2000，Curr.Opin.Cell Biol.，12，361-371)。蛋白質(zhì)具有包含核輸入(核定位序列(NLS))和輸出(核輸出序列(NES))所需信息的特異序列(Pemberton等人，1998，Curr.Opin.Cell Biol.，10，392-399)。Pse1p是核周蛋白/輸入蛋白，分成α和β家族的一組蛋白質(zhì)。核周蛋白是通過(guò)識(shí)別NLS和NES并與NPC相互作用來(lái)介導(dǎo)高分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)核膜的可溶性轉(zhuǎn)運(yùn)因子(Seedorf和Silver，1997，前述引用；Pemberton等人，1998，前述引用；Ryan和Wente，2000，前述引用)。穿過(guò)核孔的易位是由GTP水解驅(qū)動(dòng)的，后者是由小GTP結(jié)合蛋白質(zhì)Ran催化的(Seedorf和Silver，1997，前述引用)。已經(jīng)將Pse1p鑒定為核周蛋白β。已經(jīng)在啤酒糖酵母中鑒定了14種核周蛋白β蛋白質(zhì)，其中只有4種是必需的。這可能是因?yàn)槎喾N核周蛋白可以介導(dǎo)一種高分子的轉(zhuǎn)運(yùn)(Isoyama等人，2001，J.Biol.Chem.，276(24)，21863-21869)。Pse1p定位于細(xì)胞核，位于核被膜，而且在某種程度上延伸至細(xì)胞質(zhì)。這說(shuō)明該蛋白質(zhì)移動(dòng)出入細(xì)胞核作為其轉(zhuǎn)運(yùn)功能的一部分(Seedorf和Silver，1997，前述引用)。Pse1p參與轉(zhuǎn)錄因子(Isoyama等人，2001，前述引用；Ueta等人，2003，J.Biol.Chem.，278(50)，50120-50127)、組蛋白(Mosammaparast等人，2002，J.Biol.Chem.，277(1)，862-868)、和核糖體蛋白質(zhì)(在它們裝配成核糖體前)(Pemberton等人，1998，前述引用)的核輸入。它還介導(dǎo)mRNA由細(xì)胞核的輸出。核周蛋白識(shí)別并結(jié)合在RNA結(jié)合蛋白上找到的NES，該RNA結(jié)合蛋白在RNA由細(xì)胞核輸出前將其包被(Seedorf和Silver，1997，前述引用；Pemberton等人，1998，前述引用)。
由于高分子的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于正確進(jìn)行細(xì)胞周期是至關(guān)重要的，因此核轉(zhuǎn)運(yùn)因子諸如Pse1p成為生長(zhǎng)控制的新型候選靶(Seedorf和Silver，1997，前述引用)。
已經(jīng)證明啤酒糖酵母中Pse1p(蛋白質(zhì)分泌增強(qiáng)子)的過(guò)度表達(dá)提高一系列生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)分泌水平(Chow等人，1992，J.Cell.Sci.，101(3)，709-719)。沒(méi)有提出，如果由相同質(zhì)粒上的重組基因來(lái)編碼PSE1和異源蛋白質(zhì)，那么將能夠?qū)崿F(xiàn)異源基因表達(dá)的增加。事實(shí)上，根據(jù)蛋白伴侶在酵母中過(guò)度表達(dá)領(lǐng)域的最新發(fā)展(如Robinson等人，1994，前述引用；Hayano等人，1995，前述引用；Shusta等人，1998，前述引用；Parekh和Wittrup，1997，前述引用；Bao和Fukuhara，2001，前述引用；及Bao等人，2000，前述引用)，為了提高異源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，技術(shù)人員將根本不會(huì)嘗試由2μm家族質(zhì)粒來(lái)表達(dá)PSE1，比由2μm家族質(zhì)粒表達(dá)PSE1和異源蛋白質(zhì)二者低得多。
本發(fā)明還包括PSE1的變體和片段。“變體”在PSE1的語(yǔ)境中指具有天然PSE1的序列，只是其中一個(gè)或多個(gè)位置存在或保守的或非保守的氨基酸插入、刪除、或替代的蛋白質(zhì)，只要這些變化產(chǎn)生其基本特性例如酶促活性(活性的類(lèi)型和特異性)、熱穩(wěn)定性、在某些pH范圍中的活性(pH穩(wěn)定性)沒(méi)有顯著變化的蛋白質(zhì)?！帮@著”在此語(yǔ)境中指本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為變體的特性仍然與最初的蛋白質(zhì)有所不同，但不是不明顯的。
“保守替代”指預(yù)定組合，諸如Val、Ile、Leu、Ala、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr、Gly、Ala；Lys、Arg、His；及Phe、Tyr、Trp。優(yōu)選的保守替代包括Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。
PSE1的“變體”通常與天然PSE1的序列具有至少25％、至少50％、至少60％或至少70％、優(yōu)選至少80％、更加優(yōu)選至少90％、甚至更加優(yōu)選至少95％、仍然更加優(yōu)選至少99％、最優(yōu)選至少99.5％的序列同一性。
可以使用合適的計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定兩種多肽之間的序列同一性百分比，正如下文所討論的。這些變體可以是天然的，或是使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白質(zhì)工程和定點(diǎn)誘變的方法人造的。
“片段”在PSE1的語(yǔ)境中指具有天然PSE1的序列，只是一個(gè)或多個(gè)位置存在刪除的蛋白質(zhì)。由此，片段可以包含完整成熟PSE1蛋白質(zhì)的完整序列的至多5％、10％、20％、30％、40％或50％、通?？筛哌_(dá)60％、更典型的是可高達(dá)70％、優(yōu)選可高達(dá)80％、更加優(yōu)選可高達(dá)90％、甚至更加優(yōu)選可高達(dá)95％、仍然更加優(yōu)選可高達(dá)99％。特別優(yōu)選的PSE1蛋白質(zhì)的片段包含期望蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)完整結(jié)構(gòu)域。
PSE1的片段或變體可以是在宿主細(xì)胞諸如啤酒糖酵母中重組表達(dá)時(shí)能夠補(bǔ)足宿主細(xì)胞中內(nèi)源PSE1基因的刪除的蛋白質(zhì)，而且可以是例如PSE1的天然存在同系物，諸如由另一種生物體諸如另一種酵母或其它真菌、或另一種真核生物諸如人或其它脊椎動(dòng)物、或動(dòng)物或由植物編碼的同系物。
另一種優(yōu)選的蛋白伴侶是ORM2或其具有等價(jià)蛋白伴侶樣活性的片段或變體。
ORM2，也稱(chēng)為YLR350W，位于啤酒糖酵母基因組的染色體XII上(位置828729至829379)，且編碼與酵母蛋白質(zhì)Orm1p具有相似性的進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)。Hjelmqvist等人，2002，Genome Biology，3(6)，research0027.1-0027.6報(bào)告了ORM2屬于包括三種人類(lèi)基因(ORMDL1、ORMDL2和ORMDL3)以及微孢子蟲(chóng)、植物、果蠅、尾索動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中的同系物的基因家族。有報(bào)道說(shuō)ORMDL基因編碼錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的跨膜蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)Orm2p是針對(duì)誘導(dǎo)未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答的試劑的抗性所需要的。Hjelmqvist等人，2002，前述引用報(bào)告了兩種啤酒糖酵母ORMDL同系物(ORM1和ORM2)的雙重敲除導(dǎo)致生長(zhǎng)速率降低和針對(duì)衣霉素(tunicamycin)和二硫蘇糖醇的敏感性增加。
Orm2p的一種已發(fā)表序列如下MIDRTKNESPAFEESPLTPNVSNLKPFPSQSNKISTPVTDHRRRRSSSVISHVEQETFEDENDQQMLPNMNATWVDQRGAWLIHIVVIVLLRLFYSLFGSTPKWTWTLTNMTYIIGFYIMFHLVKGTPFDFNGGAYDNLTMWEQINDETLYTPTRKFLLIVPIVLFLISNQYYRNDMTLFLSNLAVTVLIGWPKLGITHRLRISIPGITGRAQIS*上述蛋白質(zhì)在啤酒糖酵母中是由如下編碼核苷酸序列編碼的，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以通過(guò)簡(jiǎn)并替代來(lái)修飾序列以獲得編碼相同蛋白質(zhì)產(chǎn)物的候選核苷酸序列ATGATTGACCGCACTAAAAACGAATCTCCAGCTTTTGAAGAGTCTCCGCTTACCCCCAATGTGTCTAACCTGAAACCATTCCCTTCTCAAAGCAACAAAATATCCACTCCAGTGACCGACCATAGGAGAAGACGGTCATCCAGCGTAATATCACATGTGGAACAGGAAACCTTCGAAGACGAAAATGACCAGCAGATGCTTCCCAACATGAACGCTACGTGGGTCGACCAGCGAGGCGCGTGGTTGATTCATATCGTCGTAATAGTACTCTTGAGGCTCTTCTACTCCTTGTTCGGGTCGACGCCCAAATGGACGTGGACTTTAACAAACATGACCTACATCATCGGATTCTATATCATGTTCCACCTTGTCAAAGGTACGCCCTTCGACTTTAACGGTGGTGCGTACGACAACCTGACCATGTGGGAGCAGATTAACGATGAGACTTTGTACACACCCACTAGAAAATTTCTGCTGATTGTACCCATTGTGTTGTTCCTGATTAGCAACCAGTACTACCGCAACGACATGACACTATTCCTCTCCAACCTCGCCGTGACGGTGCTTATTGGTGTCGTTCCTAAGCTGGGAATTACGCATAGACTAAGAATATCCATCCCTGGTATTACGGGCCGTGCTCAAATTAGTTAG本發(fā)明還包括ORM2的變體和片段。“變體”在ORM2的語(yǔ)境中指具有天然ORM2的序列，只是其中一個(gè)或多個(gè)位置存在或保守的或非保守的氨基酸插入、刪除、或替代的蛋白質(zhì)，只要這些變化產(chǎn)生其基本特性例如酶促活性(活性的類(lèi)型和特異性)、熱穩(wěn)定性、在某些pH范圍中的活性(pH穩(wěn)定性)沒(méi)有顯著變化的蛋白質(zhì)?！帮@著”在此語(yǔ)境中指本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為變體的特性仍然與最初的蛋白質(zhì)有所不同，但不是不明顯的。
“保守替代”指預(yù)定組合，諸如Val、Ile、Leu、Ala、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr、Gly、Ala；Lys、Arg、His；及Phe、Tyr、Trp。優(yōu)選的保守替代包括Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。
ORM2的“變體”通常與天然ORM2的序列具有至少25％、至少50％、至少60％或至少70％、優(yōu)選至少80％、更加優(yōu)選至少90％、甚至更加優(yōu)選至少95％、仍然更加優(yōu)選至少99％、最優(yōu)選至少99.5％的序列同一性。
可以使用合適的計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定兩種多肽之間的序列同一性百分比，正如下文所討論的。這些變體可以是天然的，或是使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白質(zhì)工程和定點(diǎn)誘變的方法人造的。
“片段”在ORM2的語(yǔ)境中指具有天然ORM2的序列，只是一個(gè)或多個(gè)位置存在刪除的蛋白質(zhì)。由此，片段可以包含完整成熟ORM2蛋白質(zhì)的完整序列的至多5％、10％、20％、30％、40％或50％、通常可高達(dá)60％、更典型的是可高達(dá)70％、優(yōu)選可高達(dá)80％、更加優(yōu)選可高達(dá)90％、甚至更加優(yōu)選可高達(dá)95％、仍然更加優(yōu)選可高達(dá)99％。特別優(yōu)選的ORM2蛋白質(zhì)的片段包含期望蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)完整結(jié)構(gòu)域。
ORM2的片段或變體可以是在宿主細(xì)胞諸如啤酒糖酵母中重組表達(dá)時(shí)能夠補(bǔ)足宿主細(xì)胞中內(nèi)源ORM2基因的刪除的蛋白質(zhì)，而且可以是例如ORM2的天然存在同系物，諸如由另一種生物體諸如另一種酵母或其它真菌、或另一種真核生物諸如人或其它脊椎動(dòng)物、或動(dòng)物或由植物編碼的同系物。
可以以下文關(guān)于編碼異源蛋白質(zhì)的基因討論的同樣方式形成編碼包含蛋白伴侶之序列的蛋白質(zhì)的基因，特別強(qiáng)調(diào)ORF與調(diào)控區(qū)的組合。
術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”在用于本文時(shí)包括所有天然的和非天然的蛋白質(zhì)、多肽和肽?！爱愒吹鞍踪|(zhì)”指不是天然由2μm家族質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)，還可以描述為“非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)”。為了方便，術(shù)語(yǔ)“異源蛋白質(zhì)”和“非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)”在整篇本申請(qǐng)中同義使用。因此，優(yōu)選的是，異源蛋白質(zhì)不是由如下任一質(zhì)粒編碼的FLP、REP1、REP2、或RAF/D蛋白質(zhì)自魯氏接合糖酵母獲得的pSR1、pSR3或pSR4，自拜列氏接合糖酵母獲得的pSB1或pSB2，自發(fā)酵接合糖酵母獲得的pSM1，自果蠅克魯維氏酵母獲得的pKD1，自膜醭畢赤氏酵母獲得的pPM1，及自啤酒糖酵母獲得的2μm質(zhì)粒。
編碼異源蛋白質(zhì)的基因包含編碼異源蛋白質(zhì)的多核苷酸序列(通常符合任何指定生物體的標(biāo)準(zhǔn)密碼子使用率)，稱(chēng)為開(kāi)放讀碼框(“ORF”)?；蚩梢灶~外包含一些不編碼開(kāi)放讀碼框的多核苷酸序列(稱(chēng)為“非編碼區(qū)”)。
基因中的非編碼區(qū)可以包含一種或多種與ORF可操作連接的調(diào)控序列，它們?nèi)菰S開(kāi)放讀碼框的轉(zhuǎn)錄和/或由此得到的轉(zhuǎn)錄本的翻譯。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”指調(diào)控(即提高或降低)與之可操作連接的ORF的表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的序列。調(diào)控區(qū)通常包括啟動(dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等等。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，調(diào)控區(qū)的選擇將取決于預(yù)定的表達(dá)系統(tǒng)。例如，啟動(dòng)子可以是組成性的或誘導(dǎo)型的，而且可以是細(xì)胞或組織類(lèi)型特異的或非特異的。
合適調(diào)控區(qū)的長(zhǎng)度可以是5bp、10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、220bp、240bp、260bp、280bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp或更長(zhǎng)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，編碼蛋白伴侶諸如PDI的基因可以額外包含非編碼區(qū)和/或調(diào)控區(qū)。這些非編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)不限于通常與蛋白伴侶ORF相關(guān)的天然非編碼區(qū)和/或調(diào)控區(qū)。
如果表達(dá)系統(tǒng)是酵母諸如啤酒糖酵母的話，那么適合于啤酒糖酵母的啟動(dòng)子包括與PGK1基因、GAL1或GAL10基因、TEF1、TEF2、PYK1、PMA1、CYC1、PHO5、TRP1、ADH1、ADH2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、葡糖激酶的基因、α-交配因子信息素、a-交配因子信息素有關(guān)的啟動(dòng)子、PRB1啟動(dòng)子、PRA1啟動(dòng)子、GPD1啟動(dòng)子、和涉及部分5’調(diào)控區(qū)與部分其它啟動(dòng)子5’調(diào)控區(qū)或與上游激活位點(diǎn)(如EP-A-258 067的啟動(dòng)子)的雜合體的雜合啟動(dòng)子。
本領(lǐng)域眾所周知合適的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。如果宿主細(xì)胞是真核的話，那么轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)優(yōu)選衍生自真核基因的3’側(cè)翼序列，它包含轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的正確信號(hào)。合適的3’側(cè)翼序列可以是例如與所用表達(dá)控制序列天然相連的那些，即可以與啟動(dòng)子相對(duì)應(yīng)?；蛘?，它們可以是不同的。在那種情況中，且如果宿主是酵母優(yōu)選啤酒糖酵母的話，那么優(yōu)選啤酒糖酵母ADH1、ADH2、CYC1、或PGK1基因的終止信號(hào)。
可能有利的是，異源基因的啟動(dòng)子和開(kāi)放讀碼框諸如蛋白伴侶PDI1的那些的側(cè)翼是轉(zhuǎn)錄終止序列，使得轉(zhuǎn)錄終止序列位于啟動(dòng)子和開(kāi)放讀碼框的上游和下游兩處，從而防止轉(zhuǎn)錄通讀進(jìn)入相鄰基因，諸如2μm基因，反之亦然。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在酵母諸如啤酒糖酵母中偏愛(ài)的調(diào)控序列包括酵母啟動(dòng)子(如啤酒糖酵母PRB1啟動(dòng)子)，正如EP 431 880中所講授的；和轉(zhuǎn)錄終止子，優(yōu)選來(lái)自糖酵母ADH1的終止子，正如EP 60 057中所講授的。優(yōu)選的是，載體中摻入至少兩個(gè)翻譯終止密碼子。
可能有利的是，在非編碼區(qū)中摻入超過(guò)一個(gè)編碼翻譯終止密碼子的DNA序列，諸如UAA、UAG或UGA，從而將翻譯通讀降至最低，并由此避免延長(zhǎng)的、非天然融合蛋白的生成。優(yōu)選翻譯終止密碼子UAA。
術(shù)語(yǔ)“可操作連接”在其含義中包括調(diào)控序列位于基因的任何非編碼區(qū)內(nèi)，使之與開(kāi)放讀碼框形成如下關(guān)系，即容許調(diào)控區(qū)以其預(yù)定方式對(duì)ORF發(fā)揮作用。由此，與ORF“可操作連接”的調(diào)控區(qū)以這樣一種方式安置，使得調(diào)控區(qū)能夠在與調(diào)控序列相容的條件下以預(yù)定方式影響ORF的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)是分泌性的。在那種情況中，可以在開(kāi)放讀碼框中包含編碼分泌前導(dǎo)序列的序列，例如WO 90/01063中講授的，它包含天然HSA分泌前導(dǎo)的大部分，加上啤酒糖酵母α-交配因子分泌前導(dǎo)的一小部分。
或者，異源蛋白質(zhì)可以是胞內(nèi)的。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)包含真核蛋白質(zhì)或其片段或變體的序列。合適的真核生物包括真菌、植物和動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)，諸如酵母蛋白質(zhì)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)是動(dòng)物蛋白質(zhì)。例示性的動(dòng)物包括脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物。例示性的脊椎動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，諸如人和非人哺乳動(dòng)物。
由此，異源蛋白質(zhì)可以包含酵母蛋白質(zhì)的序列。例如，它可以包含來(lái)自與衍生2μm家族質(zhì)粒相同的宿主的酵母蛋白質(zhì)的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)方面的方法、用途或質(zhì)?？梢园幋a超過(guò)一種異源蛋白質(zhì)、超過(guò)一種蛋白伴侶、或超過(guò)一種異源蛋白質(zhì)和超過(guò)一種蛋白伴侶的DNA序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)可以包含清蛋白、單克隆抗體、鬼臼亞乙苷(etoposide)、血清蛋白質(zhì)(諸如血液凝結(jié)因子)、antistasin、蜱抗凝肽(tick anticoagulant peptide)、運(yùn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、內(nèi)皮抑制素(endostatin)、抑管張素(angiostatin)、膠原蛋白、免疫球蛋白或基于免疫球蛋白的分子或二者片段(如Small Modular ImmunoPharmaceuticalTM(小模塊免疫藥物，“SMIP”)或dAb、Fab′片段、F(ab′)2、scAb、scFv或scFv片段)、Kunitz結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(諸如WO 03/066824中所描述的，含或不含清蛋白融合體)、干擾素、白介素、IL10、IL11、IL2、干擾素α的各個(gè)種類(lèi)和亞類(lèi)、干擾素β的各個(gè)種類(lèi)和亞類(lèi)、干擾素γ的各個(gè)種類(lèi)和亞類(lèi)、瘦蛋白(leptin)、CNTF、CNTFA×15、IL1受體拮抗物、紅細(xì)胞生成素(EPO)和EPO模擬物、血小板生成素(TPO)和TPO模擬物、prosaptide、藍(lán)藻抗病毒蛋白N(cyanovirin-N)，5-螺旋、T20肽、T1249肽、HIV gp41、HIV gp120、尿激酶、尿激酶原、tPA、水蛭素、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、甲狀旁腺激素、胰島素原、胰島素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、胰島素樣生長(zhǎng)因子、降鈣素、生長(zhǎng)激素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、腫瘤壞死因子、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、FGF、前體和活性形式的凝血因子包括但不限于纖溶酶原、纖維蛋白原、凝血酶、前凝血酶、凝血酶原、von Willebrand氏因子、α1-抗胰蛋白酶、纖溶酶原激活物、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X(jué)和因子X(jué)III、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、LACI、血小板衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)、葡萄糖氧化酶、血清膽堿酯酶、抑酶肽(aprotinin)、淀粉狀蛋白前體蛋白(amyloid precursor)、inter-α胰蛋白酶抑制物(inter-alpha typsin)、抗凝血酶III、脫脂載脂蛋白各個(gè)種類(lèi)、蛋白C、蛋白S或任何上述的變體或片段的序列。
“變體”在上文所列蛋白質(zhì)的語(yǔ)境中指其中一個(gè)或多個(gè)位置存在或保守的或非保守的氨基酸插入、刪除、或替代的蛋白質(zhì)，只要這些變化產(chǎn)生其基本特性例如酶促活性或受體結(jié)合(活性的類(lèi)型和特異性)、熱穩(wěn)定性、在某些pH范圍中的活性(pH穩(wěn)定性)沒(méi)有顯著變化的蛋白質(zhì)。“顯著”在此語(yǔ)境中指本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為變體的特性仍然與最初的蛋白質(zhì)有所不同，但不是不明顯的。
“保守替代”指預(yù)定組合，諸如Val、Ile、Leu、Ala、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr、Gly、Ala；Lys、Arg、His；及Phe、Tyr、Trp。優(yōu)選的保守替代包括Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。
“變體”通常與衍生它的多肽具有至少25％、至少50％、至少60％或至少70％、優(yōu)選至少80％、更加優(yōu)選至少90％、甚至更加優(yōu)選至少95％、仍然更加優(yōu)選至少99％、最優(yōu)選至少99.5％的序列同一性。
可以使用合適的計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定兩種多肽之間的序列同一性百分比，例如威斯康星大學(xué)(University of Wisconsin)遺傳計(jì)算小組(GeneticComputing Group)的GAP程序，而且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，同一性百分比是關(guān)于其序列得到最佳對(duì)比的多肽計(jì)算得出的。
或者，可以使用Clustal W程序(Thompson等人，1994，Nucleic Acids Res.，22(22)，4673-80)來(lái)進(jìn)行對(duì)比?？梢允褂萌缦聟?shù)●快速成對(duì)對(duì)比參數(shù)K-tuple(詞)大??；1，窗口大?。?，缺口罰分；3，最高對(duì)角線數(shù)目；5。評(píng)分方法x百分比。
●多重對(duì)比參數(shù)缺口打開(kāi)罰分；10，缺口延伸罰分；0.05。
●評(píng)分矩陣BLOSUM。
這些變體可以是天然的，或是使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白質(zhì)工程和定點(diǎn)誘變的方法人造的。
“片段”在上文所列蛋白質(zhì)的語(yǔ)境中指一個(gè)或多個(gè)位置存在刪除的蛋白質(zhì)。由此，片段可以包含完整成熟多肽的完整序列的至多5％、10％、20％、30％、40％或50％。通常，片段包含完整期望多肽的完整序列的可高達(dá)60％、更典型的是可高達(dá)70％、優(yōu)選可高達(dá)80％、更加優(yōu)選可高達(dá)90％、甚至更加優(yōu)選可高達(dá)95％、仍然更加優(yōu)選可高達(dá)99％。特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)的片段包含該蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)完整結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)包含清蛋白或其片段或變體的序列。
“清蛋白”包括包含由任何來(lái)源獲得的清蛋白蛋白質(zhì)之序列的蛋白質(zhì)。通常，來(lái)源指哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，血清清蛋白指人血清清蛋白(“HSA”)。術(shù)語(yǔ)“人血清清蛋白”包括具有在人類(lèi)中天然存在的氨基酸序列的血清清蛋白及其變體的含義。優(yōu)選的是，清蛋白具有WO 90/13653中公開(kāi)的氨基酸序列或其變體?？梢酝ㄟ^(guò)用于分離與人類(lèi)基因?qū)?yīng)的cDNA的已知方法獲得HSA編碼序列，正如例如EP 73 646和EP 286 424中所公開(kāi)的。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，“清蛋白”包含牛血清清蛋白的序列。術(shù)語(yǔ)“牛血清清蛋白”包括具有在牛中天然存在的氨基酸序列的血清清蛋白(例如來(lái)自Swissprot編號(hào)P02769)及其變體的含義，正如下文所定義的。術(shù)語(yǔ)“牛血清清蛋白”還包括全長(zhǎng)牛血清清蛋白或其變體的片段的含義，正如下文所定義的。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，清蛋白包含由來(lái)自犬(如參閱Swissprot編號(hào)P49822)、豬(如參閱Swissprot編號(hào)P08835)、山羊(如可由Sigma以產(chǎn)品編號(hào)A2514或A4164獲得)、火雞(如參閱Swissprot編號(hào)O73860)、狒狒(如可由Sigma以產(chǎn)品編號(hào)A1516獲得)、貓(如參閱Swissprot編號(hào)P49064)、雞(如參閱Swissprot編號(hào)P19121)、卵清蛋白(如雞卵清蛋白)(如參閱Swissprot編號(hào)P01012)、驢(如參閱Swissprot編號(hào)P39090)、豚鼠(如可由Sigma以產(chǎn)品編號(hào)A3060、A2639、O5483或A6539獲得)、倉(cāng)鼠(如可由Sigma以產(chǎn)品編號(hào)A5409獲得)、馬(如參閱Swissprot編號(hào)P35747)、獼猴(如參閱Swissprot編號(hào)Q28522)、小鼠(如參閱Swissprot編號(hào)O89020)、鴿子(如Khan等人，2002，Int.J.Biol.Macromol.，30(3-4)，171-8所定義的)、兔(如參閱Swissprot編號(hào)P49065)、大鼠(如參閱Swissprot編號(hào)P36953)和綿羊(如參閱Swissprot編號(hào)P14639)的血清清蛋白其中之一衍生(具有其序列)的清蛋白的序列，且包括其變體和片段，正如下文所定義的。
已知清蛋白的許多天然存在的突變形式。Peters，1996，《All AboutAlbuminBiochemistry，Genetics and Medical Applications》，Academic PressInc.，San Diego，California，第170-181頁(yè)描述了許多。如上定義的變體可以是這些天然存在變體之一。
“變體清蛋白”指其中一個(gè)或多個(gè)位置存在或保守的或非保守的氨基酸插入、刪除、或替代的清蛋白蛋白質(zhì)，只要這些變化產(chǎn)生其至少一項(xiàng)基本特性例如結(jié)合活性(活性的類(lèi)型和特異性，如與膽紅素結(jié)合)、滲透性(滲透壓、膠體滲透壓)、在某些pH范圍中的表現(xiàn)(pH穩(wěn)定性)沒(méi)有顯著變化的清蛋白蛋白質(zhì)?！帮@著”在此語(yǔ)境中指本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為變體的特性仍然與最初的蛋白質(zhì)有所不同，但不是不明顯的。
“保守替代”指預(yù)定組合，諸如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來(lái)制備這些變體，正如通過(guò)1981年11月24日發(fā)布給Stevens的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,302,386中公開(kāi)的定點(diǎn)誘變，收入本文作為參考。
通常，清蛋白變體與天然存在的清蛋白具有超過(guò)40％、通常至少50％、更加典型的是至少60％、優(yōu)選至少70％、更加優(yōu)選至少80％、仍然更加優(yōu)選至少90％、甚至更加優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少98％或更高序列同一性?？梢允褂煤线m的計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定兩種多肽之間的序列同一性百分比，例如威斯康星大學(xué)(University of Wisconsin)遺傳計(jì)算小組(Genetic ComputingGroup)的GAP程序，而且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，同一性百分比是關(guān)于其序列得到最佳對(duì)比的多肽計(jì)算得出的?；蛘呖梢允褂肅lustal W程序(Thompson等人，1994)來(lái)進(jìn)行對(duì)比。可以使用如下參數(shù)快速成對(duì)對(duì)比參數(shù)K-tuple(詞)大?。?，窗口大?。?，缺口罰分；3，最高對(duì)角線數(shù)目；5。評(píng)分方法x百分比。M多重對(duì)比參數(shù)缺口打開(kāi)罰分；10，缺口延伸罰分；0.05。評(píng)分矩陣BLOSUM。
術(shù)語(yǔ)“片段”如上所用包括全長(zhǎng)清蛋白或其變體的任何片段，只要至少一項(xiàng)基本特性例如結(jié)合活性(活性的類(lèi)型和特異性，如與膽紅素結(jié)合)、滲透性(滲透壓、膠體滲透壓)、在某些pH范圍中的表現(xiàn)(pH穩(wěn)定性)沒(méi)有顯著變化?！帮@著”在此語(yǔ)境中指本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為變體的特性仍然與最初的蛋白質(zhì)有所不同，但不是不明顯的。片段的長(zhǎng)度通常是至少50個(gè)氨基酸。片段可以包含清蛋白的至少一個(gè)完整亞結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)作為重組蛋白表達(dá)HSA的結(jié)構(gòu)域(Dockal，M.等人，1999，J.Biol.Chem.，274，29303-29310)，其中結(jié)構(gòu)域I定義為由氨基酸1-197組成，結(jié)構(gòu)域II定義為由氨基酸189-385組成，而結(jié)構(gòu)域III定義為由氨基酸381-585組成。存在結(jié)構(gòu)域的部分交疊是因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)域I和II之間、結(jié)構(gòu)域II和III之間存在延伸的α-螺旋結(jié)構(gòu)(h10-h1)(Peters，1996，前述引用，表2-4)。HSA還包含六個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(亞結(jié)構(gòu)域IA、IB、IIA、IIB、IIIA和IIIB)。亞結(jié)構(gòu)域IA包含氨基酸6-105，亞結(jié)構(gòu)域IB包含氨基酸120-177，亞結(jié)構(gòu)域IIA包含氨基酸200-291，亞結(jié)構(gòu)域IIB包含氨基酸316-369，亞結(jié)構(gòu)域IIIA包含氨基酸392-491，而亞結(jié)構(gòu)域IIIB包含氨基酸512-583。片段可以包含如上定義的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域或亞結(jié)構(gòu)域的整個(gè)或部分，或是那些結(jié)構(gòu)域和/或亞結(jié)構(gòu)域的任意組合。
在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)包含運(yùn)鐵蛋白或其變體或片段的序列。術(shù)語(yǔ)“運(yùn)鐵蛋白”在用于本文時(shí)包括運(yùn)鐵蛋白家族的所有成員(Testa，《(Proteins of iron metabolism》，CRC Press，2002；Harris和Aisen，《Iron carriers and iron proteins》，第5卷，Physical Bioinorganic Chemistry，VCH，1991)及其衍生物，諸如運(yùn)鐵蛋白、運(yùn)鐵蛋白突變體(Mason等人，1993，Biochemistry，32，5472；Mason等人，1998，Biochem.J.，330(1)，35)、截短的運(yùn)鐵蛋白、運(yùn)鐵蛋白葉(Mason等人，1996，Protein Expr.Purif.，8，119；Mason等人，1991，Protein Expr.Purif.，2，214)、乳鐵蛋白、乳鐵蛋白突變體、截短的乳鐵蛋白、乳鐵蛋白葉(lobe)、或任何上述與其它肽、多肽或蛋白質(zhì)的融合體(Shin等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，2820；Ali等人，1999，J.Biol.Chem.，274，24066；Mason等人，2002，Biochemistry，41，9448)。
運(yùn)鐵蛋白可以是人運(yùn)鐵蛋白。術(shù)語(yǔ)“人運(yùn)鐵蛋白”在用于本文時(shí)指與衍生自人的運(yùn)鐵蛋白不能區(qū)別或是其變體或片段的物質(zhì)?！白凅w”包括或保守的或非保守的插入、刪除和替代，其中這些變化不顯著改變運(yùn)鐵蛋白的有用的配體結(jié)合或免疫原性特性。
本發(fā)明包括運(yùn)鐵蛋白的突變體。這些突變體可以具有改變的免疫原性。例如，運(yùn)鐵蛋白突變體可以展示改良的(如降低的)糖基化?？梢酝ㄟ^(guò)添加/消除氨基酸糖基化共有序列來(lái)修飾運(yùn)鐵蛋白分子的N連接糖基化模式，諸如N-X-S/T，在N、X、或S/T的任何或所有位置。對(duì)運(yùn)鐵蛋白突變體可以改變其與金屬離子和/或其它蛋白質(zhì)諸如運(yùn)鐵蛋白受體的天然結(jié)合。下文例示了以這種方式修飾的運(yùn)鐵蛋白突變體的一個(gè)實(shí)例。
本發(fā)明還包括人運(yùn)鐵蛋白或人運(yùn)鐵蛋白類(lèi)似物的天然存在多態(tài)變體。通常，人運(yùn)鐵蛋白的變體或片段具有人運(yùn)鐵蛋白的配體結(jié)合活性(例如鐵結(jié)合)的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、或50％(優(yōu)選至少80％、90％或95％)，重量對(duì)重量。可以通過(guò)分光光度法測(cè)定運(yùn)鐵蛋白或測(cè)試樣品的鐵結(jié)合活性，對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)量它們沒(méi)有鐵和滿(mǎn)載鐵狀態(tài)的470nm∶280nm吸光度比值。試劑應(yīng)當(dāng)不含鐵，除非另有說(shuō)明?？梢酝ㄟ^(guò)在0.1M檸檬酸鹽、0.1M醋酸鹽、10mM EDTA pH4.5中透析由運(yùn)鐵蛋白或測(cè)試樣品中清除鐵。蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)以約20mg/ml溶于100mM HEPES、10mM NaHCO3pH8.0。測(cè)量在水中稀釋的脫鐵運(yùn)鐵蛋白(Calbiochem，CN Biosciences，Nottingham，UK)的470nm∶280nm吸光度比值，從而能夠通過(guò)分光光度法精確測(cè)定280nm吸光度(0％鐵結(jié)合)。將191mg次氮基三乙酸溶于2ml 1M NaOH，然后添加2ml 0.5M氯化鐵，由此制備20mM次氮基三乙酸鐵(FeNTA)溶液。用去離子水稀釋至50ml。添加充分過(guò)量的新鮮制備的20mM FeNTA使脫鐵運(yùn)鐵蛋白滿(mǎn)載鐵(100％鐵結(jié)合)，然后在100mM HEPES、10mM NaHCO3pH8.0中徹底透析全運(yùn)鐵蛋白，從而在測(cè)量470nm∶280nm吸光度比值前清除剩余FeNTA。用測(cè)試樣品重復(fù)此流程，它應(yīng)當(dāng)是最初不含鐵，并將最終比值與對(duì)照進(jìn)行比較。
另外，可以使用包含任何上述的單一或多重異源融合體；或是與清蛋白、運(yùn)鐵蛋白或免疫球蛋白或其變體或片段的一種或多種異源融合體。這些融合體包括清蛋白N端融合體、清蛋白C端融合體及WO 01/79271例示的清蛋白N端和C端共融合體、以及運(yùn)鐵蛋白N端融合體、運(yùn)鐵蛋白C端融合體及運(yùn)鐵蛋白N端和C端共融合體。
美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2003/0221201和US2003/0226155；Shin等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，2820；Ali等人，1999，J.Biol.Chem.，274，24066；Mason等人，2002，Biochemistry，41，9448給出了運(yùn)鐵蛋白融合體的實(shí)例，將它們的內(nèi)容收入本文作為參考。
技術(shù)人員還將領(lǐng)會(huì)，任何其它基因的開(kāi)放讀碼框或變體或部分或其中任一可用作本發(fā)明中使用的開(kāi)放讀碼框。例如，開(kāi)放讀碼框可以編碼包含任何序列的蛋白質(zhì)，它可以是天然蛋白質(zhì)(包括酶原)、或天然蛋白質(zhì)的變體、或片段(它可以是例如結(jié)構(gòu)域)；或是完全人工合成的蛋白質(zhì)；或是不同蛋白質(zhì)(天然的或合成的)的單一或多重融合體。不排他的，這些蛋白質(zhì)可以來(lái)自WO 01/79258、WO 01/79271、WO 01/79442、WO 01/79443、WO 01/79444和WO 01/79480中提供的列表或其變體或片段；將其公開(kāi)書(shū)收入本文作為參考。盡管這些專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁┝岁P(guān)于清蛋白融合配偶體的內(nèi)容的列表，本發(fā)明不受此限制，而且出于本發(fā)明的目的，可以單獨(dú)提供其中所列的任何蛋白質(zhì)或者以清蛋白、免疫球蛋白Fc區(qū)、運(yùn)鐵蛋白、乳鐵蛋白或任何其它蛋白質(zhì)或任何上述的片段或變體的融合配偶體的形式，作為期望多肽。
異源蛋白質(zhì)可以是有治療活性的蛋白質(zhì)。換言之，它可以具有公認(rèn)的對(duì)個(gè)體諸如人的醫(yī)學(xué)效果。本領(lǐng)域眾所周知許多不同類(lèi)型的有治療活性的蛋白質(zhì)。
異源蛋白質(zhì)可以包含在酵母中有效引起分泌的前導(dǎo)序列。
為了由宿主細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)，已經(jīng)使用或開(kāi)發(fā)了許多天然的或人造的多肽信號(hào)序列(也稱(chēng)為分泌前區(qū))。信號(hào)序列知道新生蛋白質(zhì)通向?qū)⒌鞍踪|(zhì)由細(xì)胞輸出至周?chē)囵B(yǎng)基或在有的情況中是周質(zhì)空間中的細(xì)胞器。信號(hào)序列通常(盡管不是必須的)位于初級(jí)翻譯產(chǎn)物的N端，而且通常(盡管不是必須的)在分泌過(guò)程中由蛋白質(zhì)上切除而產(chǎn)生“成熟的”蛋白質(zhì)。
在有些蛋白質(zhì)的情況中，在切除信號(hào)序列后最初分泌的實(shí)體在其N(xiāo)端包含額外氨基酸，稱(chēng)為“原”(pro)序列，而中間實(shí)體稱(chēng)為“蛋白質(zhì)原”。這些原序列可能輔助最終蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊和變成功能性的，而且通常在然后切除。在其它情況中，原區(qū)僅僅為酶提供切割位點(diǎn)以切除前-原區(qū)，而不知道具有其它功能。
原序列可以在蛋白質(zhì)由細(xì)胞分泌的過(guò)程中或者在由細(xì)胞輸出到周?chē)囵B(yǎng)基或周質(zhì)空間中后切除。
無(wú)論它們是像信號(hào)(即前，pre)序列或前-原分泌序列，將指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的多肽序列都稱(chēng)為前導(dǎo)序列。蛋白質(zhì)的分泌是涉及翻譯、易位和翻譯后加工的動(dòng)態(tài)加工，而且這些步驟中的一個(gè)或多個(gè)步驟可能不必在另一個(gè)步驟啟動(dòng)或完成前完成。
關(guān)于在真核物種諸如酵母啤酒糖酵母、接合糖酵母物種、乳克魯維氏酵母和巴斯德畢赤氏酵母中生成蛋白質(zhì)，已知的前導(dǎo)序列包括來(lái)自啤酒糖酵母酸性磷酸酶蛋白質(zhì)(Pho5p)(見(jiàn)EP 366 400)、轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)(Suc2p)(見(jiàn)Smith等人，1985，Science，229，1219-1224)和熱休克蛋白-150(Hsp150p)(見(jiàn)WO 95/33833)的那些。另外，已經(jīng)使用了來(lái)自啤酒糖酵母交配因子α-1蛋白質(zhì)(MFα-1)和來(lái)自人溶菌酶和人血清清蛋白(HSA)蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列，后者尤其已經(jīng)用于分泌人清蛋白，盡管不是排他的。WO 90/01063公開(kāi)了MFα-1與HSA前導(dǎo)序列的融合體，相對(duì)于MFα-1前導(dǎo)序列的使用，它有利的降低了人清蛋白雜質(zhì)片段的生成。本申請(qǐng)的實(shí)施例中還公開(kāi)了經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列，而且讀者將領(lǐng)會(huì)，那些前導(dǎo)序列可用于運(yùn)鐵蛋白以外的蛋白質(zhì)。另外，可以使用天然運(yùn)鐵蛋白前導(dǎo)序列來(lái)指導(dǎo)運(yùn)鐵蛋白和其它異源蛋白質(zhì)的分泌。
如果蛋白伴侶是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，那么優(yōu)選的是，異源蛋白質(zhì)在其成熟形式中包含二硫鍵。二硫鍵可以是分子內(nèi)的和/或分子間的。
異源蛋白質(zhì)可以是商業(yè)上有用的蛋白質(zhì)。有些異源表達(dá)的蛋白質(zhì)預(yù)期與它們?cè)谄渲斜磉_(dá)的細(xì)胞相互作用，從而對(duì)細(xì)胞的活性帶來(lái)有益的效果。這些蛋白質(zhì)憑其自身并不是商業(yè)上有用的。商業(yè)上有用的蛋白質(zhì)指對(duì)它們?cè)谄渲斜磉_(dá)的細(xì)胞具有離體效用的蛋白質(zhì)。無(wú)論如何，熟練讀者將領(lǐng)會(huì)，商業(yè)上有用的蛋白質(zhì)還可以對(duì)表達(dá)它作為異源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞具有生物學(xué)效果，但是該效果不是在其中表達(dá)蛋白質(zhì)的主要或唯一原因。
在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是異源蛋白質(zhì)不是β-內(nèi)酰胺酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是異源蛋白質(zhì)不是antistasin。然而，讀者將領(lǐng)會(huì)，這兩項(xiàng)附帶條件都不排除編碼β-內(nèi)酰胺酶或antistasin的基因存在于本發(fā)明的2μm家族質(zhì)粒上，只是編碼異源蛋白質(zhì)的基因編碼β-內(nèi)酰胺酶和/或antistasin以外的蛋白質(zhì)。
可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，諸如Sambrook等人，《MolecularCloningALaboratory Manual》，2001，第3版(將其內(nèi)容收入本文作為參考)中所描述的來(lái)制備質(zhì)粒，即通過(guò)插入編碼蛋白伴侶的基因并插入編碼異源蛋白質(zhì)的基因來(lái)修飾本領(lǐng)域知道的2μm家族質(zhì)粒。例如，這樣一種方法涉及經(jīng)粘端的連接?？梢酝ㄟ^(guò)合適的限制酶的作用在用于插入的DNA片段和質(zhì)粒上生成相容粘端。這些末端將經(jīng)由互補(bǔ)堿基配對(duì)而快速退火，而且可以通過(guò)DNA連接酶的作用來(lái)關(guān)閉剩余的切口。
另一種方法使用合成的雙鏈寡核苷酸接頭和銜接頭。通過(guò)消除突出的3’末端并補(bǔ)平凹入的3’末端的噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I生成具有平端的DNA片段。可以通過(guò)T4DNA連接酶將含有指定限制酶的識(shí)別序列的合成接頭和平端雙鏈DNA碎片與末端補(bǔ)平的DNA片段連接。然后用合適的限制酶消化它們以生成粘端，并與具有相容末端的表達(dá)載體連接。銜接頭也是化學(xué)合成的DNA片段，它含有一個(gè)用于連接的平端，但也具有一個(gè)預(yù)先形成的粘端。或者，可以在存在或不含一種或多種合成雙鏈寡核苷酸(任選含有粘端的)時(shí)通過(guò)DNA連接酶的作用將DNA片段連接到一起。
可以通過(guò)商業(yè)途經(jīng)由許多來(lái)源獲得含有多種限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)的合成接頭，包括Sigma-Genosys Ltd，London Road，Pampisford，Cambridge，United Kingdom。
2μm家族質(zhì)粒中的合適插入位點(diǎn)包括但不限于上文所述那些。
本發(fā)明還提供了包含上文定義的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任何類(lèi)型的細(xì)胞。優(yōu)選細(xì)菌和酵母宿主細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞可用于克隆目的。酵母宿主細(xì)胞可用于表達(dá)質(zhì)粒中存在的基因。
在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，諸如糖酵母、克魯維氏酵母、或畢赤氏酵母屬的成員，諸如優(yōu)選啤酒糖酵母、乳克魯維氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母和膜醭畢赤氏酵母、或魯氏接合糖酵母、拜列氏接合糖酵母、發(fā)酵接合糖酵母、或果蠅克魯維氏酵母。
宿主細(xì)胞類(lèi)型可以選擇與所用質(zhì)粒類(lèi)型的相容性。由一種酵母類(lèi)型獲得的質(zhì)?？梢栽谄渌湍割?lèi)型中得到維持(Irie等人，1991，Gene，108(1)，139-144；Irie等人，1991，Mol.Gen.Genet.，225(2)，257-265)。例如，來(lái)自魯氏接合糖酵母的pSR1可以在啤酒糖酵母中維持。優(yōu)選的是，宿主細(xì)胞與所用2μm相容(如下質(zhì)粒的詳盡描述見(jiàn)下文)。例如，如果質(zhì)粒是基于pSR1、pSB3或pSB4的，那么合適的酵母細(xì)胞是魯氏接合糖酵母；如果質(zhì)粒是基于pSB1或pSB2的，那么合適的酵母細(xì)胞是拜列氏接合糖酵母；如果質(zhì)粒是基于pSM1的，那么合適的酵母細(xì)胞是發(fā)酵接合糖酵母；如果質(zhì)粒是基于pKD1的，那么合適的酵母細(xì)胞是果蠅克魯維氏酵母；如果質(zhì)粒是基于pPM1的，那么合適的酵母細(xì)胞是膜醭畢赤氏酵母；如果質(zhì)粒是基于2μm質(zhì)粒的，那么合適的酵母細(xì)胞是啤酒糖酵母或卡爾斯伯糖酵母。特別優(yōu)選的是，質(zhì)粒是基于2μm質(zhì)粒的，且酵母細(xì)胞是啤酒糖酵母。
如果本發(fā)明的2μm質(zhì)粒包含具有衍生自該天然存在質(zhì)粒之序列的基因FLP、REP1和REP2中的一種、兩種或優(yōu)選三種，那么可以將它說(shuō)成是“基于”該天然存在質(zhì)粒的。
利用參與蛋白質(zhì)O-糖基化的一種或多種蛋白質(zhì)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷的酵母，例如通過(guò)破壞基因編碼序列，可能是特別有利的。
重組表達(dá)的蛋白質(zhì)可能由生產(chǎn)宿主細(xì)胞進(jìn)行不想要的翻譯后修飾。例如，清蛋白蛋白質(zhì)序列不含N-連接糖基化的任何位點(diǎn)，且沒(méi)有報(bào)道說(shuō)在自然條件下受到O-連接糖基化的修飾。然而，發(fā)現(xiàn)在許多酵母物種中生成的重組人清蛋白(“rHA”)可以受到O-連接糖基化的修飾，通常涉及甘露糖。甘露糖化清蛋白能夠結(jié)合凝集素伴刀豆球蛋白A。由酵母生成的甘露糖化清蛋白的數(shù)量可以通過(guò)使用一種或多種PMT基因缺陷的酵母菌株而降低(WO94/04687)。實(shí)現(xiàn)這一目的的最方便方式是創(chuàng)建其基因組具有缺陷使得Pmt蛋白質(zhì)之一的水平降低的酵母。例如，編碼序列或調(diào)控區(qū)(或調(diào)節(jié)PMT基因之一表達(dá)的另一種基因)中可以存在缺失、插入或轉(zhuǎn)座，使得生成少許Pmt蛋白質(zhì)或不生成。或者，可以轉(zhuǎn)化酵母以生成抗Pmt試劑，諸如抗Pmt抗體。
如果使用啤酒糖酵母以外的酵母，那么破壞啤酒糖酵母PMT基因的一種或多種等價(jià)基因也是有利的，例如在巴斯德畢赤氏酵母或乳克魯維氏酵母中。由啤酒糖酵母分離的PMT1(或任何其它PMT基因)的序列可用于鑒定或破壞在其它真菌物種中編碼相似酶促活性的基因。WO 94/04687中描述了乳克魯維氏酵母PMT1同系物的克隆。
有利的是，酵母具有HSP150和/或YAP3基因的缺失，正如WO 95/33833和WO 95/23857中分別講授的。
可以經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將如上定義的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主。關(guān)于原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，參閱例如Cohen等人，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110及Sambrook等人，2001，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY。酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化參閱Sherman等人，1986，《Methods In Yeast Genetics，A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor，NY。也可以使用Beggs，1978，Nature，275，104-109的方法。EP 251744、EP 258 067和WO 90/01063中概括講授了用于轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母的方法，將它們都收入本文作為參考。關(guān)于脊椎動(dòng)物細(xì)胞，可用于轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞的試劑例如磷酸鈣和DEAE-右旋糖苷或脂質(zhì)體配劑可以由Stratagene Cloning System或Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD 20877，USA獲得。
電穿孔也可用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，而且在本領(lǐng)域眾所周知用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和脊椎動(dòng)物細(xì)胞。Becker和Guarente，1990，Methods Enzymol.，194，182中公開(kāi)了通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化酵母的方法。
一般而言，質(zhì)粒不會(huì)轉(zhuǎn)化所有的宿主，因此必須選擇得到轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。由此，質(zhì)粒可以包含選擇標(biāo)記，包括但不限于細(xì)菌選擇標(biāo)記和/或酵母選擇標(biāo)記。典型的細(xì)菌選擇標(biāo)記是β-內(nèi)酰胺酶基因，盡管本領(lǐng)域還知道許多其它的。典型的酵母選擇標(biāo)記包括LEU2、TRP1、HIS3、HIS4、URA3、URA5、SFA1、ADE2、MET15、LYS5、LYS2、ILV2、FBA1、PSE1、PDI1和PGK1。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，其染色體刪除或滅活將導(dǎo)致宿主不可存活的任何基因，即所謂的必需基因，都可用作選擇標(biāo)記，如果在質(zhì)粒上提供功能性基因的話，正如PGK1在pgk1酵母菌株中所證明的(Piper和Curran，1990，Curr.Genet.，17，119)。合適的必需基因可以在斯坦?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)(StanfordGenome Database，SGD，http//db.yeastgenome.org)中找到。為了提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性且沒(méi)有需要在特定選擇性條件下培養(yǎng)細(xì)胞的缺點(diǎn)，在遭到刪除或滅活時(shí)不會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)缺陷(生物合成)需求的任何必需基因產(chǎn)物(如PDI1、PSE1、PGK1或FBA1)可用作如下宿主細(xì)胞中質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒穩(wěn)定性提高且沒(méi)有要求在特定選擇性條件下培養(yǎng)細(xì)胞的缺點(diǎn)，該宿主細(xì)胞在缺乏該質(zhì)粒時(shí)不能生成該基因產(chǎn)物?！盃I(yíng)養(yǎng)缺陷(生物合成)需求”包括可以通過(guò)添加或修改生長(zhǎng)培養(yǎng)基而補(bǔ)足的缺陷。因此，優(yōu)選的“必需標(biāo)記基因”在本發(fā)明的內(nèi)容中指在宿主細(xì)胞中遭到刪除或滅活時(shí)導(dǎo)致不能通過(guò)添加或修改生長(zhǎng)培養(yǎng)基而補(bǔ)足的缺陷的基因。
另外，依照本發(fā)明第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)方面其中任一的質(zhì)?？梢园^(guò)一種選擇標(biāo)記。
一種選擇技術(shù)涉及將編碼轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的可選擇性狀的DNA序列標(biāo)記與任何必需的控制元件一起摻入表達(dá)載體。這些標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，及用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素(即β-內(nèi)酰胺酶)抗性基因。或者，這些可選擇性狀的基因可以在用于共轉(zhuǎn)化期望宿主細(xì)胞的另一種載體上。
鑒定成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞的另一種方法涉及培養(yǎng)通過(guò)導(dǎo)入本發(fā)明質(zhì)粒而生成的細(xì)胞，任選容許表達(dá)重組多肽(即由質(zhì)粒上的多核苷酸序列編碼且對(duì)于宿主細(xì)胞是異源的多肽，就該宿主不天然生成該多肽而言)?？梢允斋@并裂解細(xì)胞，并使用諸如Southern，1975，J.Mol.Biol.，98，503或Berent等人，1985，Biotech.，3，208描述的方法或者本領(lǐng)域常用的DNA和RNA分析的其它方法對(duì)它們的DNA或RNA內(nèi)容檢查重組序列的存在。或者，可以使用抗體來(lái)檢查轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中多肽的存在。
當(dāng)重組DNA能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)，除了直接檢驗(yàn)重組DNA的存在以外，可以通過(guò)眾所周知的免疫學(xué)方法來(lái)確認(rèn)成功的轉(zhuǎn)化。例如，用表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生成展示適當(dāng)抗原性的蛋白質(zhì)。收獲懷疑得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的樣品并使用合適的抗體檢驗(yàn)蛋白質(zhì)。
由此，除了得到轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞自身以外，本發(fā)明還涵蓋那些細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，優(yōu)選單克隆(克隆同質(zhì)的)培養(yǎng)物，或是由單克隆培養(yǎng)物衍生的培養(yǎng)物?；蛘?，轉(zhuǎn)化細(xì)胞自身可以代表工業(yè)/商業(yè)或制藥學(xué)有用的產(chǎn)品且可以無(wú)需進(jìn)一步純化就使用，或者可以由培養(yǎng)物培養(yǎng)基純化，且任選以適合于它們的預(yù)定工業(yè)/商業(yè)或制藥學(xué)用途的方式與載體或稀釋劑一起配制，且任選以適合于該用途的方式包裝和展示。例如，可以將全細(xì)胞固定化；或用于將細(xì)胞培養(yǎng)物直接噴灑到突起的部分(process)、農(nóng)作物或其它期望目標(biāo)上/中。類(lèi)似的，全細(xì)胞，諸如酵母細(xì)胞，可以以膠囊的形式用于極其多種應(yīng)用，諸如香料、香精和藥物。
可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的且考慮到本文公開(kāi)的講授的適當(dāng)條件下將經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞培養(yǎng)足夠時(shí)間，從而容許由質(zhì)粒編碼的蛋白伴侶和異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。
培養(yǎng)基可以是非選擇性的，或是對(duì)質(zhì)粒的維持施加選擇壓力。
由此生成的異源蛋白質(zhì)可以是存在于胞內(nèi)，或者如果分泌的話，存在于培養(yǎng)物培養(yǎng)基和/或宿主細(xì)胞周質(zhì)空間中。
步驟“由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的異源蛋白質(zhì)”任選包括細(xì)胞固定化、細(xì)胞分離和/或細(xì)胞破裂，但是總是包括細(xì)胞固定化、分離和/或破裂以外至少一個(gè)其它純化步驟。
本領(lǐng)域眾所周知細(xì)胞固定化技術(shù)，諸如使用藻酸鈣珠裝入細(xì)胞。類(lèi)似的，本領(lǐng)域眾所周知細(xì)胞分離技術(shù)，諸如離心、過(guò)濾(如錯(cuò)流過(guò)濾)、膨脹床層析等等。同樣的，本領(lǐng)域眾所周知細(xì)胞破裂技術(shù)，包括玻珠研磨、超聲處理、酶促暴露等等。
至少一個(gè)其它純化步驟可以是本領(lǐng)域已知的適于蛋白質(zhì)純化的任何其它步驟。例如，WO 92/04367“基質(zhì)衍生染料的清除”、EP 464 590“酵母衍生著色劑的清除”、EP 319 067“清蛋白向親脂相的堿沉淀和后續(xù)應(yīng)用”及描述完整純化過(guò)程的WO 96/37515、US 5 728 553和WO 00/44772中公開(kāi)了用于回收重組表達(dá)清蛋白的純化技術(shù)(都收入本文作為參考)。
可以通過(guò)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可用于純化這些蛋白質(zhì)的任何技術(shù)由培養(yǎng)物培養(yǎng)基純化清蛋白以外的蛋白質(zhì)。
這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸或溶劑萃取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析、凝集素層析、濃縮、稀釋、pH調(diào)節(jié)、滲濾、超濾、高效液相層析(“HPLC”)、反相HPLC、電導(dǎo)率調(diào)節(jié)等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用任何一種或多種上述技術(shù)進(jìn)一步純化由此分離的蛋白質(zhì)達(dá)到商業(yè)或工業(yè)可接受的純度水平。商業(yè)或工業(yè)可接受的純度水平包括提供濃度為至少0.01g.L-1、0.02g.L-1、0.03g.L-1、0.04g.L-1、0.05g.L-1、0.06g.L-1、0.07g.L-1、0.08g.L-1、0.09g.L-1、0.1g.L-1、0.2g.L-1、0.3g.L-1、0.4g.L-1、0.5g.L-1、0.6g.L-1、0.7g.L-1、0.8g.L-1、0.9g.L-1、1g.L-1、2g.L-1、3g.L-1、4g.L-1、5g.L-1、6g.L-1、7g.L-1、8g.L-1、9g.L-1、10g.L-1、15g.L-1、20g.L-1、25g.L-1、30g.L-1、40g.L-1、50g.L-1、60g.L-1、70g.L-1、80g.L-1、90g.L-1、100g.L-1、150g.L-1、200g.L-1、250g.L-1、300g.L-1、350g.L-1、400g.L-1、500g.L-1、600g.L-1、700g.L-1、800g.L-1、900g.L-1、1000g.L-1或更高的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的是，將異源蛋白質(zhì)純化以達(dá)到制藥學(xué)可接受的純度水平。如果蛋白質(zhì)基本上不含熱原且能夠以制藥學(xué)有效數(shù)量施用而不引起與該蛋白質(zhì)的活性無(wú)關(guān)的醫(yī)學(xué)效應(yīng)，那么它具有制藥學(xué)可接受的純度水平。
由此生成的異源蛋白質(zhì)可利用任何它的已知功效，在清蛋白的情況中，包括靜脈內(nèi)施用于患者以治療重度燒傷、休克和失血、補(bǔ)充培養(yǎng)基、及在其它蛋白質(zhì)的配劑中作為賦形劑。
雖然有可能單獨(dú)施用通過(guò)本發(fā)明方法獲得的在治療上有用的異源蛋白質(zhì)，但是優(yōu)選作為與一種或多種可接受載體或稀釋劑一起的藥物配劑的形式提供。就與期望蛋白質(zhì)相容且對(duì)其接受者無(wú)害而言，載體或稀釋劑必須是“可接受的”。通常，載體或稀釋劑是無(wú)菌且不含熱原的水或鹽水。
任選的是，以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)，諸如藥片、膠囊、注射液等形式。
本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供了重組編碼包含PDI之序列的蛋白質(zhì)和基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。“基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)”指運(yùn)鐵蛋白或運(yùn)鐵蛋白家族的任何其它成員(如乳鐵蛋白)或其變體或片段，包括上文所述類(lèi)型。由此，本發(fā)明還提供了重組PDI基因用于提高基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)的用途。
PDI基因可以在質(zhì)粒上提供，諸如上文所述2μm家族質(zhì)粒?；蛘?，PDI基因可以整合在染色體中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PDI基因在內(nèi)源編碼PDI基因的基因座處整合在染色體中，優(yōu)選沒(méi)有破壞內(nèi)源PDI基因的表達(dá)。在此內(nèi)容中，“沒(méi)有破壞內(nèi)源PDI基因的表達(dá)”指盡管來(lái)自?xún)?nèi)源PDI基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)量由于整合有些降低可能是可接受的(且優(yōu)選沒(méi)有降低)，但是經(jīng)修飾宿主細(xì)胞中PDI蛋白質(zhì)產(chǎn)量的總水平由于來(lái)自?xún)?nèi)源和整合PDI基因的表達(dá)的聯(lián)合效果而相對(duì)于宿主細(xì)胞在整合事件前的PDI蛋白質(zhì)生產(chǎn)水平提高了。
編碼基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)的基因可以在質(zhì)粒上提供，諸如上文所述2μm家族質(zhì)粒，或者可以整合在染色體中，諸如在內(nèi)源編碼PDI基因的基因座處，優(yōu)選沒(méi)有破壞內(nèi)源PDI基因的表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，PDI基因整合在染色體中且編碼基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)的基因在質(zhì)粒上提供。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PDI基因在質(zhì)粒上提供且編碼基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)的基因整合在染色體中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PDI基因和編碼基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)的基因二者都整合在染色體中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PDI基因和編碼基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)的基因二者都在質(zhì)粒上提供。
如上所述，Bao等人，2000，Yeast，16，329-341報(bào)道了過(guò)度表達(dá)乳克魯維氏酵母PDI基因KlPDI1對(duì)乳克魯維氏酵母細(xì)胞有毒。與此背景相反，我們令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，不僅有可能過(guò)度表達(dá)PDI和其它蛋白伴侶且沒(méi)有Bao等人報(bào)告的有害后果，而且可以在相同細(xì)胞中重組過(guò)度表達(dá)兩種不同蛋白伴侶且能夠提高異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，達(dá)到比單獨(dú)表達(dá)任一蛋白伴侶所獲得的更高的水平，而非有毒。這是未預(yù)料到的。相反，根據(jù)Bao等人的講授，將會(huì)認(rèn)為兩種蛋白伴侶的過(guò)度表達(dá)將會(huì)比過(guò)度表達(dá)一種甚至更加有毒。此外，更加本發(fā)明的早期發(fā)現(xiàn)，預(yù)計(jì)通過(guò)與單一蛋白伴侶的共表達(dá)所獲得的異源蛋白質(zhì)表達(dá)的提高將是所用細(xì)胞系統(tǒng)可能的最高水平。因此，特別令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，通過(guò)兩種不同蛋白伴侶與異源蛋白質(zhì)的共表達(dá)能夠獲得還要更多的異源蛋白質(zhì)表達(dá)提高。
因此，作為本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，包括提供包含編碼包含第一伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因、編碼包含第二伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的第二重組基因和編碼異源蛋白質(zhì)的第三重組基因的宿主細(xì)胞(諸如上文所定義的)，其中第一和第二蛋白伴侶是不同的；在容許第一、第二和第三基因表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并任選由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的異源蛋白質(zhì)；還任選將由此純化的蛋白質(zhì)凍干。
該方法還包括如下步驟將純化的異源蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起配制，并任選以上文所述方式以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“重組基因”包括作為“孤立”可表達(dá)序列獨(dú)立操作以生成所編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，或者聯(lián)合宿主內(nèi)內(nèi)源序列操作(諸如通過(guò)整合到內(nèi)源序列中以生成與內(nèi)源序列不同的核酸序列)以引起靶蛋白質(zhì)表達(dá)提高的所導(dǎo)入的核酸序列。
第一和第二蛋白伴侶可以是上文討論的蛋白伴侶，而且是在相同宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)提供相加效應(yīng)以提高異源蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白伴侶組合。“相加效應(yīng)”包括第一和第二重組基因與第三重組基因同時(shí)共表達(dá)時(shí)宿主細(xì)胞中異源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平比其中(i)第一重組基因與第三重組基因在缺乏第二重組基因的表達(dá)時(shí)共表達(dá)和(ii)第二重組基因與第三重組基因在缺乏第一重組基因的表達(dá)時(shí)共表達(dá)的相同系統(tǒng)更高的含義。
一種優(yōu)選的蛋白伴侶是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。另一種優(yōu)選的蛋白伴侶是ORM2或其片段或變體。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二蛋白伴侶是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和ORM2或其片段或變體。
第一、第二和第三重組基因可以各自個(gè)別存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上(諸如2μm家族質(zhì)粒，如上所述)，或者整合在宿主細(xì)胞基因組的染色體中。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，可以使用質(zhì)粒和整合在染色體中的第一、第二和第三重組基因的任意組合。例如，第一、第二和第三重組基因可以各自個(gè)別存在于質(zhì)粒上，而且這可以是相同質(zhì)?；虿煌|(zhì)粒?；蛘?，第一重組基因可以存在于質(zhì)粒上，而第二和第三重組基因可以整合在宿主細(xì)胞基因組的染色體中?；蛘?，第一和第二重組基因可以存在于質(zhì)粒上，而第三重組基因可以整合在宿主細(xì)胞基因組的染色體中。或者，第一和第三重組基因可以存在于質(zhì)粒上，而第二重組基因可以整合在宿主細(xì)胞基因組的染色體中?；蛘撸谝缓偷诙亟M基因可以整合在宿主細(xì)胞基因組的染色體中，而第三重組基因可以存在于質(zhì)粒上?；蛘?，第一、第二和第三重組基因可以各自個(gè)別整合在宿主細(xì)胞基因組的染色體中。
特別優(yōu)選的質(zhì)粒是上文關(guān)于本發(fā)明較早方面所定義的那些。因此，本發(fā)明還提供了上文定義的質(zhì)粒，其中質(zhì)粒包含編碼不同蛋白伴侶的兩種不同基因(第一和第二重組基因)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，質(zhì)?？梢赃€包含編碼異源蛋白質(zhì)諸如上文描述的異源蛋白質(zhì)的基因(第三重組基因)。
在本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供了用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)諸如上文關(guān)于本發(fā)明較早方面定義的異源蛋白質(zhì)的方法，包括提供包含編碼包含ORM2或其變體之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因和編碼異源蛋白質(zhì)的第二重組基因的宿主細(xì)胞；在容許第一和第二基因表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的異源蛋白質(zhì)；并任選將由此純化的蛋白質(zhì)凍干；還任選將純化的異源蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起配制；還任選以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。
在上文討論的方式中，宿主細(xì)胞還可以包含編碼ORM2的候選蛋白伴侶或其變體之序列的蛋白質(zhì)的另一種重組基因。
可以由質(zhì)粒且任選由相同質(zhì)粒表達(dá)第一和第二重組基因其中任一或二者。也可以由質(zhì)粒、優(yōu)選由與第一和第二重組基因其中任一或二者相同的質(zhì)粒表達(dá)包含ORM2的候選蛋白伴侶或其變體之序列的蛋白質(zhì)的另一種重組基因。質(zhì)?？梢允?μm家族質(zhì)粒，諸如2μm質(zhì)粒。
在第七個(gè)方面，本發(fā)明還提供了編碼蛋白質(zhì)ORM2或其變體的核酸序列通過(guò)宿主細(xì)胞內(nèi)核酸序列和重組基因的共表達(dá)用于提高宿主細(xì)胞中由宿主細(xì)胞中的重組基因編碼的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量的用途?？梢杂伤拗骷?xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒且優(yōu)選由相同質(zhì)粒表達(dá)核酸序列和編碼異源蛋白質(zhì)的重組基因其中任一或二者。在上文討論的方式中，宿主細(xì)胞還可以包含編碼ORM2的候選蛋白伴侶或其變體之序列的蛋白質(zhì)的重組基因，它可以位于宿主細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上，優(yōu)選在與核酸序列和編碼異源蛋白質(zhì)的重組基因其中任一或二者相同的質(zhì)粒上。合適的質(zhì)粒包括2μm家族質(zhì)粒，諸如2μm質(zhì)粒，正如上文所討論的。
在本發(fā)明的第八個(gè)方面，還提供了質(zhì)粒作為表達(dá)載體通過(guò)在相同質(zhì)粒上提供編碼異源蛋白質(zhì)的重組基因和編碼ORM2或其變體的基因用于提高異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量的用途。在上文討論的方式中，質(zhì)粒還可以包含編碼ORM2的候選蛋白伴侶或其變體的基因。合適的質(zhì)粒包括2μm家族質(zhì)粒，諸如2μm質(zhì)粒，正如上文所討論的。
因此，在第九個(gè)方面，本發(fā)明還提供了包含編碼蛋白質(zhì)ORM2或其變體或片段的第一基因和編碼異源蛋白質(zhì)的第二基因的質(zhì)粒、優(yōu)選表達(dá)質(zhì)粒，正如上文所討論的。質(zhì)粒還可以包含編碼ORM2的候選蛋白伴侶或其變體的第三基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第三基因編碼包含蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶之序列的蛋白質(zhì)。
我們已經(jīng)證明，由質(zhì)粒攜帶的編碼包含“必需”蛋白伴侶諸如PDI之序列的蛋白質(zhì)的基因可用于在如下宿主細(xì)胞中穩(wěn)定維持質(zhì)粒，該宿主細(xì)胞在缺乏該質(zhì)粒時(shí)不生成該蛋白伴侶，且同時(shí)提高由宿主細(xì)胞內(nèi)的重組基因編碼的異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。該系統(tǒng)是有利的，因?yàn)樗菰S用戶(hù)將需要質(zhì)粒攜帶的重組基因的數(shù)目降至最低。例如，典型的現(xiàn)有技術(shù)的質(zhì)粒攜帶使得質(zhì)粒能夠在宿主細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中穩(wěn)定維持的標(biāo)記基因(諸如上文所描述的)。除了實(shí)現(xiàn)期望效果所需要的任何其它基因以外，還需要在質(zhì)粒上維持這些標(biāo)記基因。然而，質(zhì)粒中摻入外源DNA序列的能力是有限的，因此將實(shí)現(xiàn)期望效果所需要的序列插入的數(shù)目降至最低是有利的。此外，有些標(biāo)記基因(諸如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因)需要在特定條件下進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)程以獲得標(biāo)記基因的效果。這些特定條件對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)或蛋白質(zhì)生產(chǎn)可能不是最佳的，或是可能需要使用低效/無(wú)效的或過(guò)度昂貴的培養(yǎng)系統(tǒng)。
為了提高異源蛋白質(zhì)表達(dá)的目的，我們發(fā)現(xiàn)，出于提高宿主細(xì)胞中異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量和質(zhì)粒上選擇標(biāo)記的任務(wù)這雙重目的，有可能使用重組編碼包含“必需”蛋白伴侶之序列的蛋白質(zhì)的基因，其中質(zhì)粒存在于如下細(xì)胞內(nèi)，該細(xì)胞在缺乏該質(zhì)粒時(shí)不能生成該蛋白伴侶。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于它將需要質(zhì)粒攜帶的重組基因數(shù)目降至最低。該系統(tǒng)還具有如下優(yōu)點(diǎn)，即可以在不必為任何標(biāo)記基因而改動(dòng)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞而不會(huì)損害質(zhì)粒穩(wěn)定性。例如，可以在豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)使用該系統(tǒng)生成的宿主細(xì)胞，這可能比常用于給予營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因其效果的極限培養(yǎng)基更加經(jīng)濟(jì)。
因此，在第十個(gè)方面，本發(fā)明還提供了包含如下質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒包含編碼必需蛋白伴侶的基因，其中在缺乏該質(zhì)粒時(shí)該宿主細(xì)胞不能生成該蛋白伴侶。優(yōu)選的是，在缺乏該質(zhì)粒時(shí)，該宿主細(xì)胞不能存活。宿主細(xì)胞還可以包含編碼異源蛋白質(zhì)的重組基因，諸如上文關(guān)于本發(fā)明較早方面所描述的那些。
在第十一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了包含編碼必需蛋白伴侶的基因作為唯一選擇標(biāo)記的質(zhì)粒。質(zhì)粒還可以包含編碼異源蛋白質(zhì)的基因。質(zhì)?？梢允?μm家族質(zhì)粒。
在第十二個(gè)方面，本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟提供包含如下質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒包含編碼必需蛋白伴侶的基因，其中在缺乏該質(zhì)粒時(shí)該宿主細(xì)胞不能生成該蛋白伴侶且其中該宿主細(xì)胞還包含編碼異源蛋白質(zhì)的重組基因；在容許必需蛋白伴侶和異源蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并任選由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的異源蛋白質(zhì)；還任選將由此純化的蛋白質(zhì)凍干。
該方法還包括如下步驟將純化的異源蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起配制，并任選以上文討論的方式以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法涉及在非選擇性培養(yǎng)基諸如豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
我們還令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，不同PDI基因具有在特定培養(yǎng)條件下將異源蛋白質(zhì)表達(dá)提高不同數(shù)量的能力。具體而言，正如實(shí)施例8中所討論的，我們發(fā)現(xiàn)在極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞時(shí)，SKQ2n PDI1基因提供比S288c PDI1基因更高的異源蛋白質(zhì)表達(dá)。
SKQ2n PDI1和S288c PDI1基因所編碼的蛋白質(zhì)之間的唯一差異是SKQ2n在位置506-513(參照基因庫(kù)編號(hào)CAA38402定義的位置，見(jiàn)上文)處包含額外氨基酸EADAEAEA。
圖94中給出的序列對(duì)比顯示了所用基因序列之間的差異，而且可以概括如下●SKQ2n的啟動(dòng)子包含一連串的14個(gè)“TA”重復(fù)，而S288c的啟動(dòng)子只具有12個(gè)“TA”重復(fù)；●Ser41在SKQ2n中由TCT編碼，但在S288c中由TCC編碼；●Glu44在SKQ2n中由GAA編碼，但在S288c中由GAG編碼；●Leu262在SKQ2n中由TTG編碼，但在S288c中由TTA編碼；●Asp514在SKQ2n中由GAC編碼，但同源Asp506在S288c中由GAT編碼；●SKQ2n的終止子序列含有一連串的8個(gè)連續(xù)的“A”堿基，而S288c的終止子序列含有一連串的7個(gè)連續(xù)的“A”堿基且在與SKQ2n基因中位置1880等價(jià)的位置不包含“A”堿基；●SKQ2n的終止子序列在位置1919具有“C”，而S288c的終止子序列在等價(jià)位置具有“T”。
可能有利的是，在選擇的PDI基因中包含SKQ2n基因的任何或所有上述特征，從而在極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞時(shí)實(shí)現(xiàn)所觀察到的異源蛋白質(zhì)表達(dá)的提高。
因此，在第十三個(gè)方面，還提供了編碼蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的核苷酸序列，通過(guò)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)核苷酸序列用于提高宿主細(xì)胞中異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，該宿主細(xì)胞在極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中編碼蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的核苷酸序列的特征為它具有至少一項(xiàng)下列特征●所述核苷酸包含具有天然PDI啟動(dòng)子或其功能性變體之序列的啟動(dòng)子且包含一連串的14個(gè)“TA”重復(fù)；或●所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶通常在參照基因庫(kù)編號(hào)CAA38402定義的位置506-513處包含氨基酸EADAEAEA或其保守替代變體；或●所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的殘基Ser41是由密碼子TCT編碼的；或●所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的殘基Glu44是由密碼子GAA編碼的；或●所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的殘基Leu262是由密碼子TTG編碼的；或●所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的殘基Asp514是由密碼子GAC編碼的；或●所述核苷酸序列包含具有天然PDI終止子或其功能性變體之序列的終止子序列，且包含一連串的8個(gè)連續(xù)“A”堿基和/或在位置1919(參照天然SKQ2n終止子序列的位置1919定義)處包含堿基“C”。
在第十四個(gè)方面，本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟提供包含編碼蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶且具有如上定義的核酸序列之序列的重組基因的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞還包含編碼異源蛋白質(zhì)的重組基因；在容許蛋白質(zhì)二硫鍵和異源蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下在極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并任選由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的異源蛋白質(zhì)；還任選將由此純化的蛋白質(zhì)凍干；還任選將純化的異源蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起配制；還任選以上文討論的方式以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。
可以以上文關(guān)于本發(fā)明其它實(shí)施方案所描述的方式提供編碼PDI和異源蛋白質(zhì)的基因。
我們還發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)修飾控制蛋白伴侶表達(dá)水平的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控依照本發(fā)明其它方面的重組提供的蛋白伴侶的效果。令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)，在有些情況中，較短的啟動(dòng)子導(dǎo)致異源蛋白質(zhì)表達(dá)提高。不受理論束縛，我們認(rèn)為這是因?yàn)樵谠缇鸵暂^高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中重組蛋白伴侶的表達(dá)能夠引起細(xì)胞自身超載異源表達(dá)的蛋白質(zhì)，由此實(shí)現(xiàn)異源蛋白質(zhì)總體產(chǎn)量的少許提高或不提高。在那些情況中，與截短的啟動(dòng)子一起提供重組蛋白伴侶基因可能是有益的。
因此，在本發(fā)明的第十五個(gè)方面，提供了包含與編碼蛋白伴侶(諸如上文描述的那些)的編碼序列可操作連接的啟動(dòng)子序列的多核苷酸(諸如上文定義的質(zhì)粒)，通過(guò)宿主細(xì)胞內(nèi)多核苷酸序列的表達(dá)用于提高宿主細(xì)胞(諸如上文描述的那些)中異源蛋白質(zhì)(諸如上文描述的那些)的表達(dá)，其中所述啟動(dòng)子的特征為它達(dá)到了比編碼序列與其天然存在啟動(dòng)子可操作連接時(shí)所達(dá)到的改良的，諸如更高或更低，蛋白伴侶表達(dá)水平。
在第十六個(gè)方面，本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟提供包含如下重組基因的宿主細(xì)胞，該重組基因包含與編碼蛋白伴侶的編碼序列可操作連接的啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子的特征為它達(dá)到了比編碼序列與其天然存在啟動(dòng)子可操作連接時(shí)所達(dá)到的更低的蛋白伴侶表達(dá)水平，且所述宿主細(xì)胞還包含編碼異源蛋白質(zhì)的重組基因；在容許蛋白伴侶和異源蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并任選由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的異源蛋白質(zhì)；還任選將由此純化的蛋白質(zhì)凍干；還任選將純化的異源蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起配制；還任選以上文討論的方式以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。
由本申請(qǐng)的實(shí)施例顯而易見(jiàn)的是，重組表達(dá)的PDI和基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)的組合提供了令人驚訝的高水平運(yùn)鐵蛋白表達(dá)。例如，在包含染色體編碼重組PDI基因的系統(tǒng)中運(yùn)鐵蛋白表達(dá)提供了2倍增量(與沒(méi)有染色體編碼重組PDI基因的對(duì)照相比)。該增量比包含編碼人清蛋白的重組基因代替重組運(yùn)鐵蛋白基因的等價(jià)系統(tǒng)大5倍。
宿主可以是任何細(xì)胞類(lèi)型，諸如原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌)或真核細(xì)胞。優(yōu)選的真核細(xì)胞包括真菌細(xì)胞，諸如酵母細(xì)胞，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。上文討論了例示性的酵母細(xì)胞。例示性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人細(xì)胞。
可以培養(yǎng)上文描述的宿主細(xì)胞以生成重組的基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)。可以由培養(yǎng)物分離由此生成的基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)，并純化，優(yōu)選達(dá)到制藥學(xué)可接受的純度水平，例如使用本領(lǐng)域知道的和/或上文列舉的技術(shù)。可以將純化的基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)與制藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑一起配制，并可以以單位劑量形式提供。
現(xiàn)在將參照下列非限制性實(shí)施例和附圖例示本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述圖1、2、4、6至15、22、25、27至52、57至71、74、75、77至79、81至83、85至91、95和96顯示了各種質(zhì)粒圖譜。
圖3顯示了質(zhì)粒插入位點(diǎn)。
圖5顯示了含有PDI編碼序列的DNA片段的限制圖譜。
圖16顯示了伴有PDI1過(guò)度表達(dá)的提高的重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)分泌的火箭免疫電泳(RIE)測(cè)定結(jié)果。將冷凍的酵母原種在10mlBMMD搖瓶培養(yǎng)中培養(yǎng)4天，每個(gè)孔加載5μl上清液。每塊火箭免疫電泳凝膠(50ml)使用40μl山羊多克隆抗運(yùn)鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。A＝對(duì)照菌株[pSAC35]，雙份搖瓶；B＝對(duì)照菌株[pDB2536]，雙份搖瓶；C＝對(duì)照菌株[pDB2711]，未摻水至用水稀釋40倍；D＝對(duì)照菌株[pDB2931]，雙份搖瓶；E＝對(duì)照菌株[pDB2929]，未摻水至用水稀釋40倍。
圖17顯示了伴有和沒(méi)有PDI1過(guò)度表達(dá)的重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)分泌的RIE分析結(jié)果。將冷凍的酵母原種在10ml BMMD搖瓶培養(yǎng)中培養(yǎng)4天，每個(gè)孔加載5μl上清液。來(lái)自每種菌株的兩份單獨(dú)培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行雙份上樣。每塊火箭免疫電泳凝膠(50ml)使用40μl山羊多克隆抗運(yùn)鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。A＝對(duì)照菌株[pSAC35]；B＝對(duì)照菌株[pDB2536]；C＝對(duì)照菌株[pDB2711]；D＝對(duì)照菌株[pDB2931]；E＝對(duì)照菌株[pDB2929]。
圖18顯示了伴有和沒(méi)有PDI1過(guò)度表達(dá)的重組運(yùn)鐵蛋白分泌的SDS-PAGE分析結(jié)果。將BMMD搖瓶培養(yǎng)物培養(yǎng)4天，在含GelCodeBlue試劑(Pierce)的非還原性SDS-PAGE(4-12％ NuPAGE，MOPS緩沖液，InVitrogen)上分析10μl上清液。SeeBlue Plus2標(biāo)志物(InVitrogen)。1＝pDB2536；2＝pDB2536；3＝pDB2711；4＝pDB2711；5＝pDB2931；6＝pDB2931；7＝pDB2929；8＝pDB2929；9＝pSAC35對(duì)照。
圖19顯示了來(lái)自具有PDI1額外整合拷貝的啤酒糖酵母菌株的重組運(yùn)鐵蛋白分泌的RIE分析。以每孔5μl加載5天BMMD搖瓶培養(yǎng)物上清液。菌株含有1)pSAC35(陰性對(duì)照)；2)pDB2536(重組非糖基化運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q))；或3)pDB2506(與質(zhì)粒pDB2536相同但運(yùn)鐵蛋白ORF編碼在位置413和611處不含N→Q突變的運(yùn)鐵蛋白，即重組糖基化運(yùn)鐵蛋白)。每個(gè)孔含有衍生自各個(gè)轉(zhuǎn)化子的樣品。標(biāo)準(zhǔn)物是100、50、20、10、5和2mg.L-1的人血漿全運(yùn)鐵蛋白(Calbiochem)。
圖20顯示了來(lái)自在搖瓶培養(yǎng)中培養(yǎng)的菌株A[pDB2536]和菌株A[pDB2506]的重組運(yùn)鐵蛋白分泌的RIE分析。以每孔5μl雙份加載5天BMMD或YEPD搖瓶培養(yǎng)物上清液。
圖21顯示了由在搖瓶培養(yǎng)中培養(yǎng)的菌株A[pDB2536]和菌株A[pDB2506]分泌的重組運(yùn)鐵蛋白的SDS-PAGE分析。將培養(yǎng)物在BMMD中培養(yǎng)5天，在SDS-PAGE(4-12％ NuPAGETM，MOPS緩沖液，InVitrogen)上分析30μl上清液，用GelCode Blue試劑(Pierce)染色。1)菌株A[pDB2536]轉(zhuǎn)化子1；2)菌株A[pDB2536]轉(zhuǎn)化子2；3)菌株A[pSAC35]對(duì)照；4)菌株A[pDB2506]轉(zhuǎn)化子1；5)SeeBlue Plus2蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物(只有近似分子量)。
圖23顯示了由具有不同PDI1拷貝數(shù)的啤酒糖酵母菌株分泌的重組運(yùn)鐵蛋白的RIE。以每孔5μl加載3天BMMD搖瓶培養(yǎng)物上清液。每塊火箭免疫電泳凝膠(50ml)使用30μl山羊多克隆抗運(yùn)鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。(A)來(lái)自啤酒糖酵母對(duì)照菌株[pDB2711]或[pDB2712]的上清液；(B)來(lái)自菌株A[pDB2536]的上清液；(C)來(lái)自對(duì)照菌株[pDB2536]的上清液。
圖24顯示了由具有不同PDI1拷貝數(shù)的啤酒糖酵母菌株分泌的重組運(yùn)鐵蛋白的SDS-PAGE分析。4-12％NuPAGE還原性凝膠在每道加載30μl 3天BMMD搖瓶培養(yǎng)物上清液后以MOPS緩沖液(InVitrogen)運(yùn)行。(泳道1)來(lái)自對(duì)照菌株[pDB2536]的上清液；(泳道2)來(lái)自菌株A[pDB2536]的上清液；(泳道3-6)來(lái)自對(duì)照菌株[pDB2711]或[pDB2712]的上清液；(泳道7)分子量標(biāo)志物(SeeBlue Plus2，InVitrogen)。
圖26顯示了由伴有和沒(méi)有額外PDI1共表達(dá)的啤酒糖酵母菌株分泌的重組運(yùn)鐵蛋白的RIE。將酵母接種10ml YEPD搖瓶，并于30℃培養(yǎng)4天?；鸺庖唠娪灸z的每個(gè)孔加載5μl培養(yǎng)物上清液。血漿Tf標(biāo)準(zhǔn)物濃度以μg/ml計(jì)。20μl山羊抗Tf/50ml瓊脂糖。沉淀素用考馬斯藍(lán)染色。
圖53顯示了與具有不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子的PDI1基因共表達(dá)時(shí)不同啤酒糖酵母菌株中rHA表達(dá)的RIE分析。將酵母接種10ml YEPD搖瓶，并于30℃培養(yǎng)4天?；鸺庖唠娪灸z的每個(gè)孔加載4μl培養(yǎng)物上清液。rHA標(biāo)準(zhǔn)物濃度以μg/ml計(jì)。400μl山羊抗HA(Sigma產(chǎn)品A-1151，重懸于5ml水)/50ml瓊脂糖。沉淀素用考馬斯藍(lán)染色。
圖54顯示了與具有不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子的PDI1基因共表達(dá)時(shí)不同啤酒糖酵母菌株中rHA表達(dá)的RIE分析。將酵母接種10ml YEPD搖瓶，并于30℃培養(yǎng)4天?；鸺庖唠娪灸z的每個(gè)孔加載4μl培養(yǎng)物上清液。rHA標(biāo)準(zhǔn)物濃度以μg/ml計(jì)。400μl山羊抗HA(Sigma產(chǎn)品A-1151，重懸于5ml水)/50ml瓊脂糖。沉淀素用考馬斯藍(lán)染色。
圖55顯示了與不同PDI1構(gòu)建物共表達(dá)時(shí)rTF表達(dá)的RIE分析。將酵母接種10ml BMMD搖瓶，并于30℃培養(yǎng)4天。含有25μl山羊抗Tf/50ml的火箭免疫電泳凝膠的每個(gè)孔加載5μl培養(yǎng)物上清液。血漿Tf標(biāo)準(zhǔn)物濃度以μg/ml計(jì)。沉淀素用考馬斯藍(lán)染色。
圖56顯示了與不同PDI1構(gòu)建物共表達(dá)時(shí)rTF表達(dá)的RIE分析。將酵母接種10ml YEPD搖瓶，并于30℃培養(yǎng)4天。含有25μl山羊抗Tf/50ml的火箭免疫電泳凝膠的每個(gè)孔加載5μl培養(yǎng)物上清液。血漿Tf標(biāo)準(zhǔn)物濃度以μg/ml計(jì)。沉淀素用考馬斯藍(lán)染色。
圖72顯示了伴有和沒(méi)有共表達(dá)重組PDI1的rHA融合蛋白的RIE分析。將經(jīng)清蛋白融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的YBX7接種10ml BMMD搖瓶，并于30℃培養(yǎng)4天?；鸺庖唠娪灸z的每個(gè)孔加載4μl培養(yǎng)物上清液。rHA標(biāo)準(zhǔn)物濃度以μg/ml計(jì)。200μl山羊抗HA(Sigma產(chǎn)品A-1151，重懸于5ml水)/50ml瓊脂糖。沉淀素用考馬斯藍(lán)染色。
圖73顯示了伴有和沒(méi)有表達(dá)質(zhì)粒上存在的PDI1基因的重組清蛋白融合體分泌的SDS-PAGE分析。將酵母接種10ml BMMD搖瓶，并于30℃以200rpm培養(yǎng)4天。在含GelCodeBlue試劑(Pierce)的非還原性SDS-PAGE(4-12％NuPAGE，MES緩沖液，InVitrogen)上分析30μl上清液。1＝SeeBluePlus2標(biāo)志物(InVitrogen)；2＝1μg rHA；3＝制管張素-rHA；4＝制管張素-rHA+PDI1；5＝內(nèi)皮抑制素-rHA；6＝內(nèi)皮抑制素-rHA+PDI1；7＝DX-890-(GGS)4GG-rHA；8＝DX-890-(GGS)4GG-rHA+PDI1；9＝DPI-14-(GGS)4GG-rHA；10＝DPI-14-(GGS)4GG-rHA+PDI1；11＝AxokineTM(CNTFA×15)-(GGS)4GG-rHA(Lambert等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，4652-4657)；12＝AxokineTM(CNTFA×15)-(GGS)4GG-rHA+PDI1。
圖76顯示了RIE分析，證明來(lái)自由基于2μm的質(zhì)粒共表達(dá)ORM2的啤酒糖酵母的運(yùn)鐵蛋白分泌提高了。每個(gè)孔加載5μl 4天搖瓶培養(yǎng)物上清液。標(biāo)準(zhǔn)物是25、20、15、10、5μg/ml的人血漿全運(yùn)鐵蛋白(Calbiochem)，每個(gè)孔加載5μl。每塊火箭免疫電泳凝膠(50ml)使用20μl山羊多克隆抗運(yùn)鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。
圖80顯示了RIE分析，證明來(lái)自由基于2μm的質(zhì)粒共表達(dá)PSE1的啤酒糖酵母的運(yùn)鐵蛋白分泌提高了。每個(gè)孔加載5μl 4天搖瓶培養(yǎng)物上清液。標(biāo)準(zhǔn)物是25、20、15、10、5μg/ml的人血漿全運(yùn)鐵蛋白(Calbiochem)，每個(gè)孔加載5μl。每塊火箭免疫電泳凝膠(50ml)使用20μl山羊多克隆抗運(yùn)鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。
圖84顯示了RIE分析，證明來(lái)自由基于2μm的質(zhì)粒共表達(dá)SSA1的啤酒糖酵母的運(yùn)鐵蛋白分泌提高了。每個(gè)孔加載5μl 4天搖瓶培養(yǎng)物上清液。標(biāo)準(zhǔn)物是25、20、15、10、5μg/ml的人血漿全運(yùn)鐵蛋白(Calbiochem)，每個(gè)孔加載5μl。每塊火箭免疫電泳凝膠(50ml)使用20μl山羊多克隆抗運(yùn)鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。
圖92顯示了RIE結(jié)果。將用由pDB3078分離的1.40kb NotI/PstIpdi1::TRP1破壞DNA片段轉(zhuǎn)化成色氨酸原養(yǎng)型的DXY1 trp1Δ[pDB2976]、DXY1 trp1Δ[pDB2977]、DXY1 trp1Δ[pDB2978]、DXY1 trp1Δ[pDB2979]、DXY1 trp1Δ[pDB2980]或DXY1 trp1Δ[pDB2981]接種10ml YEPD搖瓶。將轉(zhuǎn)化子于30℃以200rpm培養(yǎng)4天?；鸺庖唠娪灸z的每個(gè)孔加載4μl培養(yǎng)物上清液。rHA標(biāo)準(zhǔn)物濃度以μg/ml計(jì)。700μl山羊抗HA(Sigma產(chǎn)品A-1151，重懸于5ml水)/50ml瓊脂糖。沉淀素用考馬斯藍(lán)染色。(*)指示選擇用于進(jìn)一步分析的分離物。
圖93顯示了RIE結(jié)果。將DXY1[pDB2244]、DXY1[pDB2976]、DXY1trp1Δpdi1::TRP1[pDB2976]、DXY1[pDB2978]、DXY1 trp1Δpdi1::TRP1[pDB2978]、DXY1[pDB2980]、DXY1 trp1Δpdi1::TRP1[pDB2980]、DXY1[pDB2977]、DXY1 trp1Δpdi1::TRP1[pDB2977]、DXY1[pDB2979]、DXY1trp1Δpdi1::TRP1[pDB2979]、DXY1[pDB2981]和DXY1 trp1Δpdi1::TRP1[pDB2981]接種10ml YEPD搖瓶，并于30℃以200rpm培養(yǎng)4天?；鸺庖唠娪灸z的每個(gè)孔加載4μl培養(yǎng)物上清液。rHA標(biāo)準(zhǔn)物濃度以μg/ml計(jì)。800μl山羊抗HA(Sigma產(chǎn)品A-1151，重懸于5ml水)/50ml瓊脂糖。沉淀素用考馬斯藍(lán)染色。(*)指示選擇用于進(jìn)一步分析的分離物。
圖94顯示了具有長(zhǎng)啟動(dòng)子的KSQ2n和S288c基因序列的序列對(duì)比，正如實(shí)施例6中所述。
實(shí)施例將兩類(lèi)表達(dá)盒用于例示來(lái)自啤酒糖酵母的重組人運(yùn)鐵蛋白突變體(N413Q、N611Q)的分泌。一類(lèi)使用經(jīng)修飾HSA(pre)/MFα1(pro)前導(dǎo)序列(稱(chēng)為“經(jīng)修飾融合前導(dǎo)”序列)。第二類(lèi)表達(dá)盒只使用經(jīng)修飾HSA(pre)前導(dǎo)序列。
“經(jīng)修飾融合前導(dǎo)”的24個(gè)氨基酸的序列是MKWVFIVSILFLFSSAYSRSLDKR。
經(jīng)修飾HSA(pre)前導(dǎo)序列的18個(gè)氨基酸的序列是MKWVFIVSILFLFSSAYS。
使用含有和不含啤酒糖酵母PDI基因PDI1額外拷貝的2μm表達(dá)載體在啤酒糖酵母中研究了使用這兩種盒的運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)表達(dá)。
實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)將寡核苷酸CF86和CF87(見(jiàn)下文)的0.5mM溶液退火，生成52bp接頭，并導(dǎo)入2μm質(zhì)粒pSAC35的US區(qū)，位于599bp反向重復(fù)片段的XcmI位點(diǎn)處。一個(gè)XcmI位點(diǎn)在REP2翻譯終止密碼子后面51bp處切割，而由于與反向重復(fù)片段的交疊，另一個(gè)XcmI位點(diǎn)在FLP編碼序列末端前面127bp處切割(見(jiàn)圖3)。此DNA接頭含有核心區(qū)“SnaBI-PacI-FseI/SfiI-SmaI-SnaBI”，它編碼pSAC35缺乏的限制位點(diǎn)。
XcmI接頭(CF86+CF87)SfiI--------------PacI SnaBI----------------SnaBI FseI SmaI--------------- ------CF86 GGAGTGGTA CGTATTAATT AAGGCCGGCC AGGCCCGGGT ACGTACCAAT TGACF87 TCCTCACCAT GCATAATTAA TTCCGGCCGG TCCGGGCCCA TGCATGGTTA AC將質(zhì)粒pSAC35用XcmI部分消化，由0.7％(w/v)瓊脂糖凝膠分離線性11kb片段，與CF86/CF87 XcmI接頭(未摻水的、10-1和10-2稀釋度)連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子，并篩選能夠通過(guò)SmaI消化而線性化的質(zhì)粒的存在。通過(guò)限制酶分析，鑒定出pDB2688(圖4)在REP2后面的XcmI位點(diǎn)中克隆了接頭。使用寡核苷酸引物CF88、CF98和CF99(表1)進(jìn)行的DNA測(cè)序驗(yàn)證了插入含有正確的接頭序列。
表1寡核苷酸測(cè)序引物
使用改良的醋酸鋰法(Sigma酵母轉(zhuǎn)化試劑盒，YEAST-1，方案2；Ito等人，1983，J.Bacterol.，153，163；Elble，1992，Biotechniques，13，18)，將酵母菌株轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在BMMD瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化子，然后點(diǎn)接到BMMD瓊脂板上。通過(guò)添加等體積的無(wú)菌40％(w/v)海藻糖，由10mlBMMD搖瓶培養(yǎng)物(24小時(shí)，30℃，200rpm)制備冷凍海藻糖原種。
Sleep等人，2002，Yeast，18，403描述了YEPD和BMMD的組成。YEPS和BMMS的組成與YEPD和BMMD相似，只是以2％(w/v)蔗糖替代2％(w/v)葡萄糖作為唯一的初始碳源。
將啤酒糖酵母PDI1基因克隆到pDB2688的XcmI接頭中。PDI1基因(圖5)是在來(lái)自含有PDI1基因的較大啤酒糖酵母基因組SKQ2n DNA片段(在US 6,291,205中描述的質(zhì)粒pMA3aC7中提供，在Crouzet和Tuite，1987，Mol.Gen.Genet.，210，581-583及Farquhar等人，1991，見(jiàn)上文中也描述成克隆C7)的1.9kb SacI-SpeI片段上克隆的，它已經(jīng)克隆到Y(jié)Iplac211(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)中，而且具有含SacI限制位點(diǎn)的合成DNA接頭，該接頭插入PDI1基因3′非翻譯區(qū)中唯一Bsu36I位點(diǎn)處。用T4 DNA聚合酶處理1.9kb SacI-SpeI片段，以填充SpeI的5′突出并切除SacI的3′突出。此PDI1片段包含翻譯起始密碼子上游的212bp PDI1啟動(dòng)子和翻譯終止密碼子下游的148bp。將它與經(jīng)SmaI線性化/小牛小腸堿性磷酸酶處理的pDB2688連接以生成質(zhì)粒pDB2690(圖6)，其中PDI1基因以與REP2相同的方向轉(zhuǎn)錄。用pDB2690將啤酒糖酵母菌株轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。
然后將人運(yùn)鐵蛋白突變體(N413A、N611Q)的表達(dá)盒克隆到pDB2690的NotI位點(diǎn)中以生成pDB2711(圖7)。pDB2711中的表達(dá)盒含有啤酒糖酵母PRB1啟動(dòng)子、HSA/MFα融合前導(dǎo)序列(EP 387319；Sleep等人，1990，Biotechnology(N.Y.)，8，42)，后面是人運(yùn)鐵蛋白突變體(N413Q、N611Q)的編碼序列和啤酒糖酵母ADH1終止子。通過(guò)將相同表達(dá)盒插入pSAC35的NotI位點(diǎn)，類(lèi)似構(gòu)建質(zhì)粒pDB2536。
pDB2536和PDB2711中使用的“經(jīng)修飾融合前導(dǎo)”序列包含經(jīng)修飾的HSA-pre序列和MFa1-pro序列。所用候選前導(dǎo)序列是經(jīng)修飾HSA-pre序列，它是通過(guò)消除MFα1-pro序列的6個(gè)殘基而由經(jīng)修飾融合前導(dǎo)序列衍生的。
pDB2515(圖8)中的經(jīng)修飾融合前導(dǎo)序列用寡核苷酸CF154和CF155突變，以刪除MFα1-pro區(qū)的6個(gè)殘基(RSLDKR)。這是依照Stratagene的QuickChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖械牟僮髡f(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。pDB2515是含有pDB2529(見(jiàn)下文)的2940bp NotI-HindIII(部分)DNA片段的大腸桿菌克隆載體pGEM-7Z(-)(Promega)，所述片段連接在PspOM1和HindIII位點(diǎn)之間。
CF1545′-GTTCTTGTTCTCCTCTGCTTACTCTGTCCCTGATAAAACTGTGAGATGG-3′CF1555′-CCATCTCACAGTTTTATCAGGGACAGAGTAAGCAGAGGAGAACAAGAAC-3′用突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，并選擇氨芐青霉素抗性菌落。通過(guò)EcoRI和BglII雙重消化來(lái)篩選來(lái)自這些菌落的質(zhì)粒DNA。隨后在pDB2921(圖9)中在前導(dǎo)序列兩側(cè)AflII和BamHI位點(diǎn)之間的386bp區(qū)域上驗(yàn)證了經(jīng)修飾HSA-pre前導(dǎo)的正確DNA序列。分離此386bpAflII-BamHI片段，并與通過(guò)BamHI部分消化及AflII和小牛小腸堿性磷酸酶完全消化制備的來(lái)自pDB2529(圖10)的6081bp AflII和BamHI片段連接。pDB2529是含有pDB2536的運(yùn)鐵蛋白表達(dá)盒的大腸桿菌克隆載體pBST(+)(Sleep等人，2001，Yeast，18，403-441)，所述表達(dá)盒克隆在唯一NotI位點(diǎn)中。這生成了pDB2928(圖11)，它是由用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化得到的氨芐青霉素抗性大腸桿菌DH5α細(xì)胞分離的。
由pDB2928分離3256bp NotI表達(dá)盒。它含有PRB1啟動(dòng)子、經(jīng)修飾HSA-pre前導(dǎo)序列的編碼序列，后面是運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)和ADH1終止子。將它連接到基于2μm的載體pSAC35和pDB2690的NotI位點(diǎn)中，以生成表達(dá)質(zhì)粒pDB2929、pDB2930、pDB2931和pDB2932(圖12-15)。在pDB2929和pDB2931中，運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)序列以與LEU2相同的方向轉(zhuǎn)錄，而在pDB2930和pDB2932中，轉(zhuǎn)錄方向相反。
實(shí)施例2運(yùn)鐵蛋白的表達(dá)用所有運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)表達(dá)質(zhì)粒將啤酒糖酵母菌株轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型，并制備冷凍原種。
將菌株在50ml錐形瓶中在10ml BMMD培養(yǎng)基中于30℃以200rpm培養(yǎng)4天。通過(guò)火箭免疫電泳(RIE，參閱Weeke，B.，1976，“Rocketimmunoelectrophoresis”，N.H.Azelsen、J.Kroll和B.Weeke編的《A manual ofquantitative immunoelectrophoresis.Methods and applications》，Universitetsforlaget，Oslo，Norway)、反相高效液相層析(RP-HPLC)(表2)和膠態(tài)考馬斯藍(lán)染色的非還原性SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)比較分泌到培養(yǎng)物上清液中的重組運(yùn)鐵蛋白的滴度。估計(jì)啤酒糖酵母PDI1過(guò)度表達(dá)時(shí)所分泌重組運(yùn)鐵蛋白的增量超過(guò)10倍。
表2
RIE分析指示，存在PDI1額外拷貝時(shí)提高的運(yùn)鐵蛋白分泌是大約15倍(圖16)。根據(jù)RIE分析，經(jīng)修飾HSA-pre前導(dǎo)序列的增量似乎略微大于經(jīng)修飾融合前導(dǎo)序列(圖17)。
通過(guò)RP-HPLC分析測(cè)定出，關(guān)于運(yùn)鐵蛋白分泌的增量，經(jīng)修飾融合前導(dǎo)序列達(dá)到18倍，而經(jīng)修飾HSA-pre前導(dǎo)序列達(dá)到15倍(表2)。
圖18顯示了由具有和沒(méi)有額外PDI1表達(dá)的啤酒糖酵母分泌的重組運(yùn)鐵蛋白的SDS-PAGE比較。
用于測(cè)定運(yùn)鐵蛋白表達(dá)的RP-HPLC方法柱50×4.6mm Phenomenex Jupiter C4 300，5μm柱溫45℃流速1ml.min-1
峰檢測(cè)214nm處UV吸光度HPLC流動(dòng)相A0.1％TFA，5％乙腈HPLC流動(dòng)相B0.1％TFA，95％乙腈梯度0至3分鐘 30％B3至13分鐘 30至55％B，線性梯度13至14分鐘 55％B14至15分鐘 55至30％B，線性梯度15至20分鐘 30％B注射通常100μl樣品，但是可以注射任何體積標(biāo)準(zhǔn)曲線注射0.1至10μg人運(yùn)鐵蛋白對(duì)峰面積用于所示結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線直至10μg成線性。
y＝530888.x+10526.7其中y＝峰面積，而x＝以μg計(jì)的數(shù)量。
(r2)0.999953，其中相關(guān)系數(shù)＝r。
實(shí)施例3PDI的染色體過(guò)度表達(dá)選擇啤酒糖酵母菌株A來(lái)調(diào)查來(lái)自質(zhì)粒pDB2506的重組糖基化運(yùn)鐵蛋白表達(dá)和來(lái)自質(zhì)粒pDB2536的重組非糖基化運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)的分泌。菌株A具有下列特征●整合在宿主PDI1染色體定位處的額外染色體整合PDI基因。
●將URA3基因和含有氨芐青霉素抗性基因的細(xì)菌DNA序列也整合到啤酒糖酵母基因組中，位于上述基因的插入位點(diǎn)處。
對(duì)照菌株沒(méi)有上述插入。
用pDB2506(重組運(yùn)鐵蛋白)、pDB2536(重組非糖基化運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q))或pSAC35(對(duì)照)將對(duì)照菌株[cir0]和菌株A[cir0]轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在BMMD瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子。
通過(guò)火箭免疫電泳(RIE)對(duì)每種菌株/質(zhì)粒組合測(cè)定BMMD搖瓶培養(yǎng)物中的運(yùn)鐵蛋白分泌的相對(duì)水平。圖19顯示了這兩種菌株都將這兩種糖基化和非糖基化重組運(yùn)鐵蛋白分泌到培養(yǎng)物上清液中。
由菌株A[pDB2506]和菌株A[pDB2536]分別分泌的這兩種糖基化和非糖基化運(yùn)鐵蛋白的水平似乎比由對(duì)照菌株分泌的水平高。由此，至少在搖瓶培養(yǎng)中，在菌株A中在PDI1基因座處整合到宿主基因組中的PDI1具有增強(qiáng)的運(yùn)鐵蛋白分泌。
此外，根據(jù)RIE，在對(duì)照菌株[pDB2536]和菌株A[pDB2536]之間觀察到的運(yùn)鐵蛋白分泌的增量似乎是至少100％增量。相反，對(duì)照菌株[pDB2305]和菌株A[pDB2305]之間的rHA單體分泌增量是大約20％(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，考慮到運(yùn)鐵蛋白具有19個(gè)二硫鍵，而比較而言rHA具有17個(gè)二硫鍵，由菌株A中PDI1額外拷貝引起的運(yùn)鐵蛋白分泌增量大得令人驚訝。對(duì)于由啤酒糖酵母分泌運(yùn)鐵蛋白家族的蛋白質(zhì)及其衍生物，PDI1基因的額外拷貝可能是特別有利的。
通過(guò)RIE對(duì)在BMMD和YEPD中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子比較由菌株A[pDB2536]和菌株A[pDB2506]分泌的運(yùn)鐵蛋白水平(圖20)。結(jié)果指示，通過(guò)在YEPD(10-20mg.L-1血清運(yùn)鐵蛋白等價(jià)物)和BMMD(比較而言2-5mg.L-1血清運(yùn)鐵蛋白等價(jià)物)中進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了這兩種非糖基化重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)和糖基化重組運(yùn)鐵蛋白滴度超過(guò)2倍的提高。在YEPD中觀察到的這兩種糖基化和非糖基化運(yùn)鐵蛋白滴度的提高說(shuō)明這兩種運(yùn)鐵蛋白表達(dá)載體在非選擇性培養(yǎng)條件下足夠穩(wěn)定，從而容許通常源自在YEPD中培養(yǎng)的預(yù)期生物量增加轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔头翘腔\(yùn)鐵蛋白生產(chǎn)力提高。
圖21顯示了由在BMMD搖瓶培養(yǎng)中培養(yǎng)的菌株A[pDB2536]分泌的非糖基化運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)和由菌株A[pDB2506]分泌的糖基化運(yùn)鐵蛋白的SDS-PAGE分析。與菌株A[pSAC35]相比，菌株A[pDB2536]樣品清楚顯示額外的蛋白質(zhì)條帶。此額外條帶在由對(duì)照菌株[pDB2536]分泌的重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)的預(yù)期位置處遷移。菌株A[pDB2506]培養(yǎng)物上清液在運(yùn)鐵蛋白的預(yù)期位置處似乎含有不同的蛋白質(zhì)條帶。這說(shuō)明分泌的重組運(yùn)鐵蛋白是異質(zhì)的，可能是由于Asp413和/或Asp611處的高甘露糖化。
實(shí)施例4比較來(lái)自含有pDB2711的啤酒糖酵母對(duì)照菌株的運(yùn)鐵蛋白分泌與來(lái)自啤酒糖酵母菌株A的運(yùn)鐵蛋白分泌質(zhì)粒pDB2711如上所述。質(zhì)粒pDB2712(圖22)也是由NotI盒生成的，只是方向與pDB2711相反。
用pDB2711和pDB2712將對(duì)照菌株啤酒糖酵母[cir0]轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在BMMD瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子，并制備對(duì)照菌株[pDB2711]的冷凍海藻糖原種。
在BMMD和YEPD這兩種搖瓶培養(yǎng)中比較對(duì)照菌株[pDB2711]、對(duì)照菌株[pDB2712]、菌株A[pDB2536]、對(duì)照菌株[pDB2536]和候選對(duì)照菌株[pDB2536]的重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)分泌。RIE指示，與具有兩個(gè)PDI1染色體拷貝的菌株A[pDB2536]和具有單個(gè)PDI1基因染色體拷貝的對(duì)照菌株[pDB2536]相比，具有多個(gè)附加體PDI1拷貝的對(duì)照菌株[pDB2711]在重組運(yùn)鐵蛋白分泌中實(shí)現(xiàn)了顯著提高(圖23)。對(duì)照菌株[pDB2711]和對(duì)照菌株[pDB2712]似乎將相似水平的rTf(N413Q、N611Q)分泌到培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中。對(duì)照菌株[pDB2711]和對(duì)照菌株[pDB2712]轉(zhuǎn)化子在BMMD和YEPD這兩種培養(yǎng)基中的的分泌水平較為一致，說(shuō)明質(zhì)粒穩(wěn)定性足夠?qū)崿F(xiàn)高水平的運(yùn)鐵蛋白分泌，甚至在非還原性條件下。這與先前關(guān)于重組PDGF-BB和HSA發(fā)表的數(shù)據(jù)相反，其中證明將PDI1導(dǎo)入多拷貝2μm質(zhì)粒對(duì)宿主有害。
表3來(lái)自高細(xì)胞密度發(fā)酵的重組運(yùn)鐵蛋白滴度
圖24顯示了由BMMD搖瓶培養(yǎng)中的對(duì)照菌株[pDB2711]、對(duì)照菌株[pDB2712]、菌株A[pDB2536]、對(duì)照菌株[pDB2536]和候選對(duì)照菌株[pDB2536]分泌的運(yùn)鐵蛋白的還原性SDS-PAGE分析。它顯示來(lái)自對(duì)照菌株[pDB2711]和對(duì)照菌株[pDB2712]的所有樣品在運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)的預(yù)期位置處具有高豐度蛋白質(zhì)條帶。來(lái)自不同菌株的運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)條帶的相對(duì)菌株強(qiáng)度說(shuō)明，菌株A[pDB2536]的產(chǎn)量比對(duì)照菌株[pDB2536]和候選對(duì)照菌株[pDB2536]高，但是在來(lái)自對(duì)照菌株[pDB2711]和對(duì)照菌株[pDB2712]的分泌中存在甚至更加顯著的提高。所觀察到的重組運(yùn)鐵蛋白分泌的提高伴隨著這些菌株中PDI1拷貝數(shù)的增加。這說(shuō)明Pdi1p水平在對(duì)照菌株、菌株A和候選對(duì)照菌株中限制運(yùn)鐵蛋白分泌，而且PDI1拷貝數(shù)增加是運(yùn)鐵蛋白分泌提高的原因。增加PDI1拷貝數(shù)能夠提高PDI1的穩(wěn)定狀態(tài)表達(dá)水平，從而提高Pdi1p活性的數(shù)量。有許多候選方法可用于實(shí)現(xiàn)此目的且不提高PDI基因的拷貝數(shù)，例如可以通過(guò)提高轉(zhuǎn)錄速率即通過(guò)使用更高效的啟動(dòng)子或者通過(guò)降低PDI1 mRNA的清除速率來(lái)提高穩(wěn)定狀態(tài)PDI1mRNA水平。或者，可以通過(guò)蛋白質(zhì)工程來(lái)提高Pdi1p蛋白質(zhì)的比活或周轉(zhuǎn)數(shù)。
根據(jù)GP-HPLC分析和SDS-PAGE分析這兩種測(cè)量，在高細(xì)胞密度發(fā)酵對(duì)照菌株[pDB2711]中，重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)產(chǎn)量是大約3g.L-1(表3)。這個(gè)生產(chǎn)水平比含有[pDB2536]的對(duì)照菌株、候選對(duì)照菌株或菌株A高數(shù)倍。此外，對(duì)于用于人體治療用途的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)而言，表達(dá)系統(tǒng)諸如對(duì)照菌株[pDB2711]比使用菌株A的有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈儾缓?xì)菌DNA序列。
結(jié)論在含有整合在酵母基因組中的PDI1基因額外拷貝的啤酒糖酵母菌株中調(diào)查了來(lái)自多拷貝表達(dá)質(zhì)粒(pDB2536)的重組運(yùn)鐵蛋白分泌。還在經(jīng)多拷貝表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的啤酒糖酵母中調(diào)查了運(yùn)鐵蛋白分泌，其中PDI1基因插入多拷貝附加型運(yùn)鐵蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pDB2711)。
與含有單個(gè)拷貝PDI1的菌株相比，在內(nèi)源PDI1基因座處具有整合在基因組中的PDI1基因額外拷貝的啤酒糖酵母菌株以升高的水平分泌重組運(yùn)鐵蛋白和非糖基化重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)。通過(guò)使用pDB2711實(shí)現(xiàn)了PDI1拷貝數(shù)的進(jìn)一步增加。根據(jù)SDS-PAGE和GP-HPLC分析的測(cè)量，在用pDB2711轉(zhuǎn)化的菌株的高細(xì)胞密度發(fā)酵中，重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)以大約3g.L-1的水平分泌。因此，增加PDI1基因拷貝數(shù)導(dǎo)致由啤酒糖酵母分泌的重組運(yùn)鐵蛋白的數(shù)量大大增加。
得出下列結(jié)論
1.在來(lái)自pDB2536(非糖基化運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q))和pDB2506(糖基化運(yùn)鐵蛋白)的重組運(yùn)鐵蛋白表達(dá)的搖瓶分析中，啤酒糖酵母菌株A比對(duì)照菌株以更高水平將這兩種重組運(yùn)鐵蛋白分泌到培養(yǎng)物上清液中。這要?dú)w功于整合在PDI1基因座處的PDI1額外拷貝。
2.在多拷貝表達(dá)質(zhì)粒上含有PDI1基因的對(duì)照菌株[pDB2711]在搖瓶培養(yǎng)和高細(xì)胞密度發(fā)酵這兩種情況中產(chǎn)生比菌株A[pDB2536]提高數(shù)倍的重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)分泌。
3.增加酵母諸如啤酒糖酵母中的PDI1拷貝數(shù)在異源蛋白質(zhì)諸如來(lái)自運(yùn)鐵蛋白家族的生產(chǎn)過(guò)程中將是有利的。
4.含有PDI1基因額外拷貝的基于pSAC35的質(zhì)粒對(duì)于來(lái)自運(yùn)鐵蛋白家族的蛋白質(zhì)及其衍生物諸如融合體、突變體、結(jié)構(gòu)域和截短形式的生產(chǎn)具有優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例5將PDI1基因插入2μm樣質(zhì)粒提高來(lái)自多種不同啤酒糖酵母菌株的重組運(yùn)鐵蛋白分泌如Rose和Broach，1990，Meth.Enzymol.，185，234-279所述，通過(guò)半乳糖誘導(dǎo)的來(lái)自Yep351-GAL-FLP1的FLP過(guò)度表達(dá)，消除啤酒糖酵母菌株JRY 188 cir+(National Collection of Yeast Cultures)和MT302/28B cir+(Finnis等人，1993，Eur.J.Biochem.，212，201-210)的天然2μm質(zhì)粒，分別生成啤酒糖酵母菌株JRY188 cir0和MT302/28B cir0。
用pDB2931(圖14)和pDB2929(圖12)將啤酒糖酵母菌株JRY188 cir0、MT302/28B cir0、S150-2B cir0(Cashmore等人，1986，Mol.Gen.Genet.，203，154-162)、CB11-63 cir0(Zealey等人，1988，Mol.Gen.Genet.，211，155-159)都轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在適當(dāng)補(bǔ)充的缺乏亮氨酸的極限培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。將每種菌株的轉(zhuǎn)化子接種50ml搖瓶中的10ml YEPD，并在定軌搖床中于30℃以200rpm培養(yǎng)4天。收獲培養(yǎng)物上清液，并通過(guò)火箭免疫電泳比較重組運(yùn)鐵蛋白滴度(圖26)。結(jié)果指示，來(lái)自所有酵母菌株的上清液中的運(yùn)鐵蛋白滴度在2μm質(zhì)粒中存在PDI1時(shí)(pDB2929)比不存在時(shí)(pDB2931)高。
實(shí)施例6在相同2μm樣質(zhì)粒上含有各種PDI1基因和各種異源蛋白質(zhì)表達(dá)盒的表達(dá)載體的構(gòu)建PDI1基因的PCR擴(kuò)增和克隆進(jìn)入YIplac211通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)自啤酒糖酵母S288c和啤酒糖酵母SKQ2n的PDI1基因，以生成具有含啟動(dòng)子序列的不同長(zhǎng)度5’-非翻譯區(qū)的DNA片段。PCR引物設(shè)計(jì)成容許將PCR產(chǎn)物克隆到Y(jié)Iplac211(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)的EcoRI和BamHI位點(diǎn)中。PCR引物中還摻入了額外限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)以便于后續(xù)克隆。表4描述了所構(gòu)建的質(zhì)粒，而表5給出了用于擴(kuò)增PDI1基因的PCR引物序列。表4描述了這些基于YIplac211的質(zhì)粒內(nèi)PDI1啟動(dòng)子長(zhǎng)度的差異。
pDB2939(圖27)是如下生成的用寡核苷酸引物DS248和DS250(表5)由啤酒糖酵母S288c基因組DNA PCR擴(kuò)增PDI1基因，然后用EcoRI和BamHI消化PCR產(chǎn)物，并將約1.98kb片段克隆到經(jīng)EcoRI和BamHI切割的YIplac211(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)中。pDB2939的DNA測(cè)序鑒定出來(lái)自DS248內(nèi)的“G”缺失，在表5中以粗體標(biāo)記。表6列出了用于對(duì)PDI1基因測(cè)序的寡核苷酸引物，它們是根據(jù)已發(fā)表的S288cPDI1基因序列設(shè)計(jì)的(染色體III上的PDI1/YCL043C，由坐標(biāo)50221至48653，加1000堿基對(duì)的上游序列和1000堿基對(duì)的下游序列。http//www.yeastgenome.org，基因庫(kù)編號(hào)NC001135)。
表4含有PDI1基因的基于YIplac211的質(zhì)粒
表5用于啤酒糖酵母PDI1基因的PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物
表6用于啤酒糖酵母PDI1基因的DNA測(cè)序的寡核苷酸引物
質(zhì)粒pDB2941(圖28)和pDB2942(圖29)是使用表4和5中描述的PCR引物并通過(guò)分別將約1.90kb和1.85kb EcoRI-BamHI片段克隆到Y(jié)Iplac211中而類(lèi)似構(gòu)建的。驗(yàn)證了pDB2941和pDB2942中PDI1基因的正確DNA序列。
由含有來(lái)自pMA3aC7(US 6,291,205)也稱(chēng)為克隆C7(Crouzet和Tuite，1987，見(jiàn)上文；Farquhar等人，1991，見(jiàn)上文)的PDI1基因的質(zhì)粒DNA PCR擴(kuò)增啤酒糖酵母SKQ2n PDI1基因序列。使用寡核苷酸引物DS248和DS250(表4和5)擴(kuò)增SKQ2n PDI1基因。用EcoRI和BamHI消化約2.01kb PCR產(chǎn)物，并連接到經(jīng)EcoRI和BamHI切割的YIplac211(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)中以生成質(zhì)粒pDB2943(圖30)。SKQ2n PDI1序列的5’端與補(bǔ)平的SpeI位點(diǎn)相似，延伸以包含EcoRI、SacI、SnaBI、PacI、FseI、SfiI和SmaI位點(diǎn)，3’端延伸至與補(bǔ)平的Bsu36I位點(diǎn)相似的位點(diǎn)，延伸以包含SmaI、SnaBI和BamHI位點(diǎn)。PDI1啟動(dòng)子長(zhǎng)度是約210bp。使用表6給出的寡核苷酸引物測(cè)定了PDI1片段的整個(gè)DNA序列。這證實(shí)了啤酒糖酵母菌株SKQ2n的PDI蛋白質(zhì)的編碼序列(NCBI編號(hào)CAA38402)的存在，但是在位置114具有絲氨酸殘基(而非先前發(fā)表的精氨酸殘基)。類(lèi)似的，與pDB2939中的啤酒糖酵母S288c序列的方式相似，pDB2943也在來(lái)自DS248序列內(nèi)具有“G”缺失，在表5中以粗體標(biāo)記。
質(zhì)粒pDB2963(圖31)和pDB2945(圖32)是使用表4和5中描述的PCR引物并通過(guò)分別將約1.94kb和1.87kb EcoRI-BamHI片段克隆到Y(jié)Iplac211中而類(lèi)似構(gòu)建的。驗(yàn)證了pDB2963和pDB2945中PDI1基因的預(yù)期DNA序列，其中氨基酸114位置處具有絲氨酸密碼子。在REP2后面的XcmI位點(diǎn)處具有插入的不同PDI1基因的基于pSAC35的rHA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了與不同PDI1基因共表達(dá)rHA，構(gòu)建基于pSAC35的質(zhì)粒(表7)。
表7用于共表達(dá)rHA的具有不同PDI1基因的基于pSAC35的質(zhì)粒
首先在2992bp NotI片段上分離來(lái)自pDB2243(圖33，如WO 00/44772中所述)的rHA表達(dá)盒，然后克隆到pDB2688(圖4)的NotI位點(diǎn)中，生成pDB2693(圖34)。將pDB2693用SnaBI消化，用小牛小腸堿性磷酸酶處理，并與來(lái)自pDB2943、pDB2963、pDB2945、pDB2939、pDB2941和pDB2942的含有PDI1基因的SnaBI片段連接。這生成了質(zhì)粒pDB2976至pDB2987(圖35至46)。將PDI1的轉(zhuǎn)錄方向與REP2相同的稱(chēng)為“取向A”，而將PDI1的轉(zhuǎn)錄方向與REP2相反的稱(chēng)為“取向B”(表7)。
在REP2后面的XcmI位點(diǎn)處具有插入的不同PDI1基因的基于pSAC35的運(yùn)鐵蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了與不同PDI1基因共表達(dá)重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)，構(gòu)建基于pSAC35的質(zhì)粒(表8)。
表8用于共表達(dá)運(yùn)鐵蛋白的具有不同PDI1基因的基于pSAC35的質(zhì)粒
為了實(shí)現(xiàn)此目的，首先通過(guò)載體主鏈的NotI消化和環(huán)化，由pDB2976、pDB2978和pDB2980刪除rHA表達(dá)的NotI表達(dá)盒。這生成了質(zhì)粒pDB3081(圖47)、pDB3083(圖48)和pDB3084(圖49)，如表9所述。
表9具有不同PDI1基因的基于pSAC35的質(zhì)粒
將來(lái)自pDB2928(圖1)的3256bp NotI片段克隆到pDB3081、pDB3083和pDB3084的NotI位點(diǎn)中，使得運(yùn)鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)錄方向與LEU2相同。這生成了質(zhì)粒pDB3085(圖50)、pDB3086(圖51)和pDB3087(圖52)，如表8所述。
實(shí)施例7PDI1基因在2μm樣質(zhì)粒中的插入和優(yōu)化提高多種不同啤酒糖酵母菌株的重組人血清清蛋白分泌使用改良的醋酸鋰法(Sigma酵母轉(zhuǎn)化試劑盒，YEAST-1，方案2；Ito等人，1983，J.Bacteriol.，153，163；Elble，1992，Biotechniques，13，18)，用pDB2244(WO 00/44772)、pDB2976(圖35)、pDB2978(圖37)或pDB2980(圖39)將啤酒糖酵母菌株JRY188 cir0、MT302/28B cir0、S150-2B cir0、CB11-63 cir0(上文都有描述)、AH22 cir0(Mead等人，1986，Mol.Gen.Genet.，205，417-421)和DS569 cir0(Sleep等人，1991，Bio/Technology，9，183-187)轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在具有適當(dāng)補(bǔ)充物的BMMD瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化子，然后點(diǎn)接到具有適當(dāng)補(bǔ)充物的BMMD瓊脂板上。
將每種菌株的轉(zhuǎn)化子接種50ml搖瓶中的10ml YEPD，并在定軌搖床中于30℃以200rpm培養(yǎng)4天。收獲培養(yǎng)物上清液，并通過(guò)火箭免疫電泳比較重組清蛋白滴度(圖53和54)。結(jié)果指示，來(lái)自所有酵母菌株的培養(yǎng)物上清液中的清蛋白滴度在2μm質(zhì)粒中存在PDI1時(shí)比不存在時(shí)(pDB2244)高。在質(zhì)粒上缺乏PDI1時(shí)培養(yǎng)物上清液中的清蛋白滴度取決于選擇哪種酵母菌株作為表達(dá)宿主，然而在大多數(shù)測(cè)試樣品中，在2μm質(zhì)粒中存在具有長(zhǎng)啟動(dòng)子(～210bp)的PDI1時(shí)(pDB2976)觀察到最大表達(dá)增量。通過(guò)縮短例如刪除調(diào)控位點(diǎn)來(lái)修飾PDI1啟動(dòng)子，具有控制改進(jìn)的影響。對(duì)于已知是高rHA生產(chǎn)菌株的一種酵母菌株(DS569)，較短啟動(dòng)子是最佳表達(dá)所優(yōu)選的。
實(shí)施例8在基于2μm的質(zhì)粒上共表達(dá)時(shí)不同PDI基因增強(qiáng)重組運(yùn)鐵蛋白分泌通過(guò)與具有長(zhǎng)啟動(dòng)子(～210bp)的啤酒糖酵母SKQ2n PDI1基因以及具有長(zhǎng)、中和短啟動(dòng)子(分別是～210bp、～140bp和～80bp)的啤酒糖酵母S288cPDI1的共表達(dá)，調(diào)查重組運(yùn)鐵蛋白(N413Q、N611Q)的分泌。
用pDB2931(不含PDI1的陰性對(duì)照質(zhì)粒)以及pDB2929、pDB3085、pDB3086和pDB3087(表8)將先前實(shí)施例(如實(shí)施例2)中使用的相同對(duì)照菌株轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在BMMD瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化子，并選擇5個(gè)菌落用于分析。將菌株在10ml BMMD和10ml YEPD搖瓶培養(yǎng)中于30℃以200rpm培養(yǎng)4天，并收獲培養(yǎng)物上清液，用于通過(guò)火箭免疫電泳進(jìn)行分析。
圖55顯示了在極限培養(yǎng)基(BMMD)中，具有長(zhǎng)啟動(dòng)子的啤酒糖酵母SKQ2n PDI1基因給出最高rTF(N413Q、N611Q)滴度。啤酒糖酵母S288cPD11基因給出較低rTF(N413Q、N611Q)，它隨著PDI1啟動(dòng)子長(zhǎng)度縮短進(jìn)一步降低。
圖56顯示了在豐富培養(yǎng)基(YEPD)中，具有長(zhǎng)啟動(dòng)子的啤酒糖酵母SKQ2n PDI1和啤酒糖酵母S288c PDI1基因給出相似rTF(N413Q、N611Q)生產(chǎn)水平。同樣，啤酒糖酵母S288c PDI1基因的啟動(dòng)子長(zhǎng)度越短，rTF(N413Q、N611Q)生產(chǎn)水平越低。
實(shí)施例9基于2μm的質(zhì)粒上的PDI1增強(qiáng)重組清蛋白融合體的分泌調(diào)查了具有長(zhǎng)啟動(dòng)子(～210bp)的啤酒糖酵母SKQ2n PDI1基因的共表達(dá)對(duì)重組清蛋白融合體表達(dá)的影響。
先前(WO 03/066085)描述了NotI N端內(nèi)皮抑制素-清蛋白表達(dá)盒(pDB2556)的構(gòu)建。大體如EP-A-286 424中公開(kāi)的和Sleep，D.等人，1991，Bio/Technology，9，183-187中描述的，通過(guò)“非整合”質(zhì)粒pSAC35提供適當(dāng)?shù)慕湍篙d體序列。由pDB2556分離3.54kb NotI N端內(nèi)皮抑制素-清蛋白表達(dá)盒，純化，并克隆到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的pSAC35中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB3099(圖57)。通過(guò)“非整合”質(zhì)粒pDB2690(圖6)提供適當(dāng)?shù)慕湍窹DI1載體序列。由pDB2556分離3.54kb NotI N端內(nèi)皮抑制素-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的pDB2690中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB3100(圖58)。
先前(WO 03/066085)描述了NotI N端制管張素-清蛋白表達(dá)盒(pDB2556)的構(gòu)建，正如基于pSAC35的酵母表達(dá)載體pDB2765(圖59)的構(gòu)建。由pDB2556分離3.77kb NotI N端制管張素-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的適當(dāng)酵母PDI1表達(dá)載體pDB2690中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB3107(圖60)。
先前(WO 03/066085)描述了NotI N端三環(huán)5-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒(pDB2771)的構(gòu)建，正如基于pSAC35的酵母表達(dá)載體pDB2773(圖61)的構(gòu)建。由pDB2771分離3.27kb NotI N端三環(huán)5-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的適當(dāng)酵母PDI1表達(dá)載體pDB2690中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB3104(圖62)。
先前(WO 03/066824)描述了NotI N端DX-890-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒(pDB2683)的構(gòu)建。通過(guò)“非整合”質(zhì)粒pSAC35提供適當(dāng)?shù)慕湍篙d體序列。由pDB2683分離3.20kb NotI N端DX-890-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的pSAC35中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB3101(圖63)。通過(guò)“非整合”質(zhì)粒pDB2690(圖6)提供適當(dāng)?shù)慕湍窹DI1載體序列。由pDB2683分離3.20kb NotI N端DX-890-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的pDB2690中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB3102(圖64)。
先前(WO 03/066824)描述了NotI N端DPI-14-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒(pDB2666)的構(gòu)建，正如基于pSAC35的酵母表達(dá)載體pDB2679(圖65)的構(gòu)建。由pDB2666分離3.21kb NotI N端DPI-14-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的適當(dāng)酵母PDI1表達(dá)載體pDB2690中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB3103(圖66)。
使用標(biāo)準(zhǔn)條件，使用針對(duì)外顯子1和外顯子2的下列引物分別擴(kuò)增兩個(gè)外顯子，由人基因組DNA克隆CNTF。
外顯子1引物5′-CTCGGTACCCAGCTGACTTGTTTCCTGG-3′；和5′-ATAGGATTCCGTAAGAGCAGTCAG-3′外顯子2引物5′-GTGAAGCATCAGGGCCTGAAC-3′；和5′-CTCTCTAGAAGCAAGGAAGAGAGAAGGGAC-3′這兩個(gè)片段都在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行連接，然后使用引物5′-CTCGGTACCCAGCTGACTTGTTTCCTGG-3′和5′-CTCTCTAGAAGCAAGGAAGAGAGAAGGGAC-3′通過(guò)PCR再次擴(kuò)增，并克隆到載體pCR4(Invitrogen)中。為了生成AxokineTM(正如Lambert等人，2001，PNAS，98，4652-4657中所公開(kāi)的)，采用定點(diǎn)誘變來(lái)導(dǎo)入C17A(TGT→GCT)和Q63R(CAG→AGA)突變。DNA測(cè)序還揭示了沉默T→C替代V85V(GTT→GTC)的存在，正如WO 2004/015113中所述。
使用單鏈寡核苷酸MH33和MH36通過(guò)PCR擴(kuò)增AxokineTM cDNA，生成約0.58kb PCR片段。
MH335′-ATGCAGATCTTTGGATAAGAGAGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCC-3′MH365′-CACCGGATCCACCCCCAGTCTGATGAGAAGAAATGAAACGAAGGTCATGG-3′這是用FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)在50μl反應(yīng)中完成的，首先于95℃保溫4分鐘，后續(xù)25個(gè)PCR循環(huán)(95℃30秒，55℃30秒，72℃60秒)。在1％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色后，在10μl樣品中觀察到預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化剩余PCR產(chǎn)物，并用BamHI和BglII完全消化。由溴化乙啶染色的1％瓊脂糖凝膠上切下近似預(yù)期大小的DNA并純化。
質(zhì)粒pDB2573X提供了合適的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子，以及與人清蛋白N端融合的合適分泌前導(dǎo)序列和編碼部分(GGS)4GG肽接頭的DNA序列。先前(WO 03/066824)描述了pDB2573X的構(gòu)建。
將0.57kb經(jīng)BamHI和BglII消化的PCR產(chǎn)物與經(jīng)BamHI、BglII和小牛小腸堿性磷酸酶消化的pDB2573X連接，生成質(zhì)粒pDB2617(圖95)，并使用寡核苷酸引物CF84、CF85、PRB和DS229驗(yàn)證了PCR生成片段和相鄰序列的正確DNA序列。
CF845′-CCTATGTGAAGCATCAGGGC-3′CF855′-CCAACATTAATAGGCATCCC-3′FRB5′-CGTCCCGTTATATTGGAG-3′DS2295′-CTTGTCACAGTTTTCAGCAGATTCGTCAG-3′用NdeI和NotI消化質(zhì)粒pDB2617，并由瓊脂糖凝膠純化用于AxokineTM-(GGS)4GG-清蛋白分泌的3.586kb NotI表達(dá)盒。
通過(guò)“非整合”質(zhì)粒pSAC35提供適當(dāng)?shù)慕湍篙d體序列。由pDB2671分離3.586kb NotI N端AxokineTM-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的pSAC35中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB2618(圖96)。通過(guò)“非整合”質(zhì)粒pDB2690(圖6)提供適當(dāng)?shù)慕湍窹DI1載體序列。由pDB2617分離3.586kbNotI N端AxokineTM-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的pDB2690中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB3106(圖68)。
使用單鏈寡核苷酸CF68和CF69通過(guò)PCR擴(kuò)增人IL10 cDNA(NCBI編號(hào)NM_000572)。
CF685′-GCGCAGATCTTTGGATAAGAGAAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCAC-3′
CF695′-GCTTGGATCCACCGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTAGGCTTCTATGTAG-3′將0.43kb DNA片段用BamHI完全消化且用BglII部分消化，并分離0.42kb BglII-BamHI DNA片段。
質(zhì)粒pDB2573X提供了合適的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子，以及與人清蛋白N端融合的合適分泌前導(dǎo)序列和編碼部分(GGS)4GG肽接頭的DNA序列。先前(WO 03/066824)描述了pDB2573X的構(gòu)建。
將質(zhì)粒pDB2573X用BamHI和BglII完全消化，分離6.21kb DNA片段，并用小牛小腸堿性磷酸酶處理，然后與0.42kb BglII-BamHI N端IL10 cDNA連接，生成pDB2620(圖69)。通過(guò)“非整合”質(zhì)粒pSAC35提供適當(dāng)?shù)慕湍篙d體序列。由pDB2620分離3.51kb NotI N端IL10-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的pSAC35中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB2621(圖70)。通過(guò)“非整合”質(zhì)粒pDB2690(圖6)提供適當(dāng)?shù)慕湍窹DI1載體序列。由pDB2620分離3.51kb NotI N端IL10-(GGS)4GG-清蛋白表達(dá)盒，純化，并連接到經(jīng)NotI消化且經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的pDB2690中，生成以與LEU2選擇標(biāo)記相同取向含有NotI表達(dá)盒的質(zhì)粒pDB3105(圖71)。
使用改良的醋酸鋰法(Sigma酵母轉(zhuǎn)化試劑盒，YEAST-1，方案2；Ito等人，1983，J.Bacterol.，153，163；Elble，1992，Biotechniques，13，18)，將與先前實(shí)施例所用相同的對(duì)照酵母菌株轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在BMMD瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化子，然后點(diǎn)接到BMMD瓊脂板上。由10ml BMMD搖瓶培養(yǎng)物(24小時(shí)，30℃，200rpm)制備冷凍海藻糖原種。
將每種菌株的轉(zhuǎn)化子接種50ml搖瓶中的10ml BMMD，并在定軌搖床中于30℃以200rpm培養(yǎng)4天。收獲培養(yǎng)物上清液，并通過(guò)火箭免疫電泳比較重組清蛋白融合體滴度(圖72)。結(jié)果指示，來(lái)自酵母菌株的培養(yǎng)物上清液中的清蛋白融合體滴度在2μm質(zhì)粒中存在PDI1時(shí)比不存在時(shí)高。
通過(guò)SDS-PAGE分析進(jìn)一步研究了通過(guò)火箭免疫電泳檢測(cè)到的清蛋白融合體的表達(dá)提高。將表達(dá)各種清蛋白融合體的YBX7的BMMD搖瓶培養(yǎng)物在定軌搖床中于30℃以200rpm培養(yǎng)4天。通過(guò)SDS-PAGE分析培養(yǎng)物上清液的樣品(圖73)。觀察到具有所研究清蛋白融合體預(yù)期大小的蛋白質(zhì)條帶，且豐度提高。
實(shí)施例10基于2μm的質(zhì)粒上的啤酒糖酵母ORM2與重組運(yùn)鐵蛋白的共表達(dá)將來(lái)自啤酒糖酵母S288c的ORM2基因克隆到在UL區(qū)中NotI位點(diǎn)處含有rTf(N413Q、N611Q)表達(dá)盒的基于pSAC35的質(zhì)粒上REP2后面的XcmI位點(diǎn)中。
質(zhì)粒pDB2965(圖74)是通過(guò)將來(lái)自pDB2928(圖11)的含有rTf(N413Q、N611Q)表達(dá)盒的3256bp NotI片段插入pDB2688(圖4)的NotI位點(diǎn)而構(gòu)建的。將pDB2688通過(guò)NotI消化而線性化，并用堿性磷酸酶進(jìn)行處理。將來(lái)自pDB2928的rTf表達(dá)盒克隆到pDB2688的NotI位點(diǎn)中，生成以與LEU2相同的方向轉(zhuǎn)錄運(yùn)鐵蛋白基因的pDB2965。
使用寡核苷酸引物GS11和GS12(表10)，使用Expand高保真PLUS PCR系統(tǒng)(Roche)，通過(guò)PCR由啤酒糖酵母S288c基因組DNA擴(kuò)增ORM2基因。
表10用于啤酒糖酵母蛋白伴侶的PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物
引物設(shè)計(jì)成在正向引物的5′端摻入SnaBI和PacI限制性識(shí)別位點(diǎn)，而在反向引物的5′端摻入SnaBI和FseI限制性識(shí)別位點(diǎn)，用于克隆到載體pDB2965的XcmI位點(diǎn)處的接頭中。在如下條件下進(jìn)行PCR200μM dNTP混合物、2.5U Expand HiFi酶混合物、1x Expand HiFi反應(yīng)緩沖液、0.8μg基因組DNA；1個(gè)循環(huán)的94℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)的94℃30秒、55℃30秒、72℃3分鐘，和1個(gè)循環(huán)的72℃7分鐘。使用0.4μM每種引物。將所需1195bpPCR產(chǎn)物和pDB2965載體用PacI和FseI消化，連接到一起，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子。通過(guò)由氨芐青霉素抗性克隆分離的質(zhì)粒DNA的限制酶分析鑒定含有ORM2的構(gòu)建物。制備了四種質(zhì)?？寺。琾DB3090、pDB3091、pDB3092和pBD3093，它們都在限制性分析過(guò)程中具有相同的預(yù)期DNA片段模式(圖75)。
選擇啤酒糖酵母對(duì)照菌株和菌株A(如實(shí)施例3所述)來(lái)調(diào)查運(yùn)鐵蛋白和ORM2基因由基于2μm的質(zhì)粒共表達(dá)時(shí)對(duì)運(yùn)鐵蛋白分泌的影響。將對(duì)照菌株和菌株A用質(zhì)粒pDB3090、pDB3092和pBD3093以及含有rTf(N413Q、N611Q)表達(dá)盒但沒(méi)有ORM2的對(duì)照質(zhì)粒pDB2931(圖14)轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在BMMD瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子，并點(diǎn)接到BMMD瓊脂上，用于后續(xù)分析。
為了調(diào)查ORM2共表達(dá)對(duì)運(yùn)鐵蛋白分泌的影響，將含有ORM2/運(yùn)鐵蛋白共表達(dá)質(zhì)粒的菌株接種10ml選擇性(BMMD)和非選擇性(YEPD)液體培養(yǎng)基。然后將搖瓶培養(yǎng)物于30℃搖動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)4天。通過(guò)火箭免疫電泳(RIE)測(cè)定運(yùn)鐵蛋白分泌的相對(duì)水平(圖76)。
在BMMD和YEPS這兩種培養(yǎng)基中，由對(duì)照菌株[pDB3090]和對(duì)照菌株[pDB3092]分泌的運(yùn)鐵蛋白水平都高于對(duì)照菌株[pDB2931]的水平。類(lèi)似的，在BMMD和YEPS這兩種培養(yǎng)基中，由菌株A[pDB3090]和菌株A[pDB3093]二者分泌的運(yùn)鐵蛋白水平都高于菌株A[pDB2931]的水平。來(lái)自所有菌株A轉(zhuǎn)化子的運(yùn)鐵蛋白分泌高于在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對(duì)照菌株轉(zhuǎn)化子。菌株A在基因組中含有PDI1的額外拷貝，它增強(qiáng)了運(yùn)鐵蛋白分泌。因此，在菌株A中，ORM2和PDI1表達(dá)的升高對(duì)運(yùn)鐵蛋白分泌具有累積效應(yīng)。
實(shí)施例11基于2μm的質(zhì)粒上的啤酒糖酵母PSE1與重組運(yùn)鐵蛋白的共表達(dá)將來(lái)自啤酒糖酵母S288c的PSE1基因克隆到在UL區(qū)中NotI位點(diǎn)處含有rTf(N413Q、N611Q)表達(dá)盒的基于pSAC35的質(zhì)粒上REP2后面的XcmI位點(diǎn)中。
使用寡核苷酸引物CED009和CED010(表10)，使用Expand高保真PCR試劑盒(Roche)，通過(guò)PCR由啤酒糖酵母S288c基因組DNA擴(kuò)增3.25kb野生型PSE1基因。引物設(shè)計(jì)成在5′端摻入BamHI限制性識(shí)別位點(diǎn)，以便于克隆到載體pUC19中。在如下條件下進(jìn)行PCR1個(gè)循環(huán)的94℃2分鐘，10個(gè)循環(huán)的94℃15秒、45℃30秒、68℃4分30秒，20個(gè)循環(huán)的94℃15秒、45℃30秒、68℃4分30秒(每個(gè)循環(huán)增加5秒)，和1個(gè)循環(huán)的68℃10分鐘。將所需PCR產(chǎn)物用BamHI消化，并連接到經(jīng)BamHI消化并用堿性磷酸酶處理的pUC19中，生成構(gòu)建物pDB2848(圖77)。與來(lái)自染色體XIII上PSE1/YMR308C(坐標(biāo)892220至888951，加1000堿基對(duì)的上游序列和1000堿基對(duì)的下游序列，http//www.yeastgenome.org處的糖酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù))的序列進(jìn)行比較后，pDB2848的測(cè)序結(jié)果證實(shí)了擴(kuò)增的序列就是預(yù)期的啤酒糖酵母S288c PSE1。然后通過(guò)BamHI消化由pDB2848切下PSE1基因，并將由此產(chǎn)生的4096bp片段用酚氯仿抽提，用乙醇沉淀，并用DNA聚合酶Klenow片段處理以填充5′突出。將質(zhì)粒pDB2965(圖74)通過(guò)SnaBI消化而線性化，并用堿性磷酸酶進(jìn)行處理。連接線性化的pDB2965載體和PSE1插入片段，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子。通過(guò)由氨芐青霉素抗性克隆分離的質(zhì)粒DNA的限制酶分析鑒定得出，質(zhì)粒pDB3097(圖78)和pDB3098(圖79)含有PSE1基因。在pDB3097中，PSE1基因以與REP2相同的方向轉(zhuǎn)錄，而在pDB3098中，PSE1基因以與REP2相反的方向轉(zhuǎn)錄。
將啤酒糖酵母對(duì)照菌株用質(zhì)粒pDB3097和pBD3098以及含有rTf(N413Q、N611Q)表達(dá)盒但沒(méi)有PSE1的對(duì)照質(zhì)粒pDB2931(圖14)轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在BMMD瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子，并點(diǎn)接到BMMD瓊脂上，用于后續(xù)分析。
為了調(diào)查PSE1表達(dá)對(duì)運(yùn)鐵蛋白分泌的影響，將含有PSE1/運(yùn)鐵蛋白共表達(dá)質(zhì)粒的菌株接種裝有10ml選擇性(BMMD)液體培養(yǎng)基的燒瓶。然后將搖瓶培養(yǎng)物于30℃搖動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)4天。通過(guò)火箭免疫電泳(RIE)測(cè)定運(yùn)鐵蛋白分泌的相對(duì)水平(圖80)。
在BMMD培養(yǎng)基中，由對(duì)照菌株[pDB3097]和對(duì)照菌株[pDB3098]分泌的運(yùn)鐵蛋白水平高于對(duì)照菌株[pDB2931]的水平。因此，來(lái)自基于2μm的質(zhì)粒的PSE1表達(dá)提高來(lái)自啤酒糖酵母的運(yùn)鐵蛋白分泌。在pDB3097和pDB3098中，以相對(duì)于REP2的任意方向轉(zhuǎn)錄的PSE1基因都提高運(yùn)鐵蛋白分泌。
實(shí)施例12基于2μm的質(zhì)粒上的啤酒糖酵母SSA1與重組運(yùn)鐵蛋白的共表達(dá)將來(lái)自啤酒糖酵母S288c的SSA1基因克隆到在UL區(qū)中NotI位點(diǎn)處含有rTf(N413Q、N611Q)表達(dá)盒的基于pSAC35的質(zhì)粒上REP2后面的XcmI位點(diǎn)中。
使用寡核苷酸引物CED037和CED038(表10)，使用Expand高保真PCR試劑盒(Roche)，通過(guò)PCR由啤酒糖酵母S288c基因組DNA擴(kuò)增1.93kbSSA1基因。引物設(shè)計(jì)成在它們的5′端摻入SphI限制性識(shí)別位點(diǎn)，以便于克隆到載體pUC19中。在如下條件下進(jìn)行PCR1個(gè)循環(huán)的94℃10分鐘，35個(gè)循環(huán)的94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃5分鐘，和1個(gè)循環(huán)的72℃10分鐘。將所需PCR產(chǎn)物用SphI消化，然后連接到經(jīng)SphI消化并用堿性磷酸酶處理的pUC19中，生成構(gòu)建物pDB2850(圖81)。pDB2850的測(cè)序結(jié)果證實(shí)了染色體I上SSA1/YAL005C(坐標(biāo)141433至139505，加1000堿基對(duì)的上游序列和1000堿基對(duì)的下游序列，糖酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)http//www.yeastgenome.org中公布的)的預(yù)期序列。
通過(guò)SphI消化由pDB2850切下SSA1基因，并將由此產(chǎn)生的2748bp片段用酚氯仿抽提，用乙醇沉淀，并用T4DNA聚合酶處理以切除3′突出。將質(zhì)粒pDB2965通過(guò)SnaBI消化而線性化，并用小牛小腸堿性磷酸酶進(jìn)行處理。連接線性化的pDB2965載體和SSA1插入片段，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子。通過(guò)由氨芐青霉素抗性克隆分離的質(zhì)粒DNA的限制酶分析鑒定了SSA1構(gòu)建物pDB3094(圖82)和pDB3095(圖83)。在pDB3094中，SSA1基因以與REP2相同的方向轉(zhuǎn)錄，而在pDB3095中，SSA1基因以與REP2相反的方向轉(zhuǎn)錄。
將啤酒糖酵母對(duì)照菌株用質(zhì)粒pDB3094和pBD3095以及含有rTf(N413Q、N611Q)表達(dá)盒但沒(méi)有SSA1的對(duì)照質(zhì)粒pDB2931(圖14)轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在BMMD瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子，并點(diǎn)接到BMMD瓊脂上，用于后續(xù)分析。
為了調(diào)查SSA1表達(dá)對(duì)運(yùn)鐵蛋白分泌的影響，將含有SSA1/運(yùn)鐵蛋白共表達(dá)質(zhì)粒的菌株接種裝有10ml選擇性(BMMD)液體培養(yǎng)基的燒瓶。然后將搖瓶培養(yǎng)物于30℃搖動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)4天。通過(guò)火箭免疫電泳(RIE)測(cè)定運(yùn)鐵蛋白分泌的相對(duì)水平(圖84)。
在BMMD培養(yǎng)基中，由對(duì)照菌株[pDB3095]分泌的運(yùn)鐵蛋白水平高于對(duì)照菌株[pDB2931]和對(duì)照菌株[pDB3094]的水平。因此，來(lái)自基于2μm的質(zhì)粒的SSA1表達(dá)提高來(lái)自啤酒糖酵母的運(yùn)鐵蛋白分泌。在pDB3094中，以相對(duì)于REP2的相反方向轉(zhuǎn)錄的SSA1基因提高運(yùn)鐵蛋白分泌。
實(shí)施例13PDI1基因破壞，連同基于2μm的質(zhì)粒上的PDI1基因，提高重組清蛋白分泌和質(zhì)粒穩(wěn)定性表11中所列單鏈寡核苷酸DNA引物設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增酵母PDI1編碼區(qū)上游的一個(gè)區(qū)域和酵母PDI1編碼區(qū)下游的另一個(gè)區(qū)域。
表11寡核苷酸引物
使用衍生自S288c的基因組DNA作為模板，引物DS299和DS300通過(guò)PCR擴(kuò)增PDI1的5’區(qū)，而引物DS301和DS302擴(kuò)增PDI1的3’區(qū)。PCR條件如下1μl S288c模板DNA(0.01ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl)、5μl 10X緩沖液(Fast Start Taq+Mg，Roche)、1μl 10mM dNTP混合物、5μl每種引物(2μM)、0.4μl Fast Start Taq，用水補(bǔ)至50μl。使用Perkin-Elmer熱循環(huán)儀9700進(jìn)行PCR。條件是于95℃變性4分鐘[保持HOLD]，然后[循環(huán)CYCLE]于95℃變性30秒、于45℃退火30秒、于72℃延伸45秒，20個(gè)循環(huán)，然后[保持HOLD]于72℃10分鐘，再然后[保持HOLD]4℃。用NotI和HindIII切割0.22kb PDI1 5＇PCR產(chǎn)物，而用HindIII和PstI切割0.34kb PDI1 3＇PCR產(chǎn)物。
將質(zhì)粒pMCS5(Hoheisel，1994，Biotechniques，17，456-460)(圖85)用HindIII完全消化，用T4 DNA聚合酶加dNTP混合物補(bǔ)平末端，并重新連接，生成pDB2964(圖86)。
將質(zhì)粒pDB2964用HindIII消化，用小牛小腸堿性磷酸酶處理，并與經(jīng)NotI和HindIII消化的0.22kbp PDI1 5＇PCR產(chǎn)物和經(jīng)HindIII和PstI消化的0.34kb PDI1 3′PCR產(chǎn)物連接，生成pDB3069(圖87)，并用正向和反向通用引物以及DNA測(cè)序引物DS303、DS304、DS305和DS306(表11)進(jìn)行測(cè)序。
引物DS234和DS235(表12)用于由YIplac204(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)擴(kuò)增經(jīng)修飾的TRP1標(biāo)記基因，在PCR產(chǎn)物的兩個(gè)末端摻入HindIII限制性位點(diǎn)。PCR條件如下1μl模板YIplac204(0.01ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl)、5μl 10X緩沖液(Fast Start Taq+Mg，Roche)、1μl 10mM dNTP混合物、5μl每種引物(2μM)、0.4μl Fast Start Taq，用水補(bǔ)至50μl。使用Perkin-Elmer熱循環(huán)儀9600進(jìn)行PCR。條件是于95℃變性4分鐘[保持HOLD]，然后[循環(huán)CYCLE]于95℃變性30秒、于45℃退火30秒、于72℃延伸90秒，20個(gè)循環(huán)，然后[保持HOLD]于72℃10分鐘，再然后[保持HOLD]4℃。將0.86kb PCR產(chǎn)物用HindIII消化，并克隆到pMCS5的HindIII位點(diǎn)中，生成pDB2778(圖88)。限制酶分析和使用通用正向和反向引物以及DS236、DS237、DS238和DS239(表12)進(jìn)行的測(cè)序證實(shí)了經(jīng)修飾TRP1基因的序列是正確的。
表12寡核苷酸引物
通過(guò)HindIII消化由pDB2778分離0.86kb TRP1基因，并克隆到pDB3069的HindIII位點(diǎn)中，生成pDB3078(圖89)和pDB3079(圖90)。通過(guò)NotI/PstI消化由pDB3078或pDB3079分離1.41kb pdi1::TRP1破壞DNA片段。
以這樣一種方式構(gòu)建摻入TRP1刪除(trp1Δ)的酵母菌株，即一旦構(gòu)建trp1Δ，基因組中不應(yīng)當(dāng)剩下與TRP1標(biāo)記基因(pDB2778)的同源性，從而防止未來(lái)含TRP1構(gòu)建物和TRP1基因座之間的同源重組。為了實(shí)現(xiàn)由選定宿主菌株的基因組完全清除天然TRP1序列，設(shè)計(jì)寡核苷酸，用于擴(kuò)增整合載體YIplac204(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)上存在的TRP1標(biāo)記基因外側(cè)的TRP1基因5′UTR和3′UTR區(qū)域。YIplac204 TRP1標(biāo)記基因與天然/染色體TRP1基因有所不同，即通過(guò)定點(diǎn)誘變清除了內(nèi)部HindIII、PstI和XbaI位點(diǎn)(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)。YIplac204經(jīng)修飾TRP1標(biāo)記基因是由1.453kb補(bǔ)平基因組片段EcoRI片段構(gòu)建的，它含有TRP1基因且只有TRP1啟動(dòng)子的102bp(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)。盡管這是較短的啟動(dòng)子序列，然而顯然它足以補(bǔ)足trp1營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)。只由位于TRP1ORF起點(diǎn)5’102bp處的EcoRI位點(diǎn)上游的DNA序列用于創(chuàng)建5′TRP1 UTR。3′UTR的選擇較不苛刻，只要它在功能性經(jīng)修飾TRP1標(biāo)記3’端的外側(cè)，選擇的是翻譯終止密碼子下游85bp。
設(shè)計(jì)并構(gòu)建單鏈寡核苷酸DNA引物，以擴(kuò)增TRP1基因的5′UTR和3′UTR區(qū)，使得在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，限制酶位點(diǎn)將添加到后期克隆步驟中將要用到的PCR產(chǎn)物的末端。使用S288c基因組DNA作為模板，引物DS230和DS231(表12)通過(guò)PCR擴(kuò)增TRP1的5′區(qū)域，而引物DS232和DS233(表12)擴(kuò)增TRP1的3′區(qū)域。PCR條件如下1μl模板S288c基因組DNA(0.01ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl)、5μl 10X緩沖液(Fast StartTaq+Mg，Roche)、1μl 10mM dNTP混合物、5μl每種引物(2μM)、0.4μl FastStart Taq，用水補(bǔ)至50μl。使用Perkin-Elmer熱循環(huán)儀9600進(jìn)行PCR。條件是于95℃變性4分鐘[保持HOLD]，然后[循環(huán)CYCLE]于95℃變性30秒、于45℃退火45秒、于72℃延伸90秒，20個(gè)循環(huán)，然后[保持HOLD]于72℃10分鐘，再然后[保持HOLD]4℃。
將0.19kb TRP1 5′UTR PCR產(chǎn)物用EcoRI和HindIII切割，而將0.2kbTRP1 3′UTR PCR產(chǎn)物用BamHI和HindIII切割，并連接到用BamHI/EcoRI線性化的pAYE505中，生成質(zhì)粒pDB2777(圖91)。WO 95/33833中描述了pAYE505的構(gòu)建。使用設(shè)計(jì)成由質(zhì)粒主鏈引發(fā)并對(duì)所克隆插入片段測(cè)序的正向和反向引物進(jìn)行的DNA測(cè)序證實(shí)了在這兩種情況中所克隆的TPP1基因5′和3′UTR序列具有預(yù)期DNA序列。質(zhì)粒pDB2777含有TRP1破壞的片段，它包含衍生自TRP1 5′和3′UTR的序列的融合體。通過(guò)EcoRI完全消化由pDB2777切下此0.383kb TRP1破壞片段。
使用改良的醋酸鋰法(Sigma酵母轉(zhuǎn)化試劑盒，YEAST-1，方案2；Ito等人，1983，J.Bacteriol.，153，163；Elble，1992，Biotechniques，13，18)，將酵母菌株DXY1(Kerry-Williams等人，1998，Yeast，14，161-169)用清蛋白表達(dá)質(zhì)粒pDB2244轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型，生成酵母菌株DXY1[pDB2244]。WO 00/44772中描述了清蛋白表達(dá)質(zhì)粒pDB2244的構(gòu)建。在BMMD瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化子，然后點(diǎn)接到BMMD瓊脂板上。由10mlBMMD搖瓶培養(yǎng)物(24小時(shí)，30℃，200rpm)制備冷凍海藻糖原種。
如Toyn等人，2000，Yeast，16，553-560所述，使用摻入了對(duì)立選擇性色氨酸類(lèi)似物5-氟氨茴酸(5-FAA)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，將DXY1[pDB2244]用來(lái)自pDB2777的0.383kb EcoRI TRP1破壞DNA片段轉(zhuǎn)化成色氨酸自養(yǎng)型。挑取對(duì)5-FAA的毒性作用有抗性的菌落，并在第二輪5-FAA板上劃線，以確認(rèn)它們確實(shí)耐受5-FAA并由任何背景生長(zhǎng)中選擇出來(lái)。然后將生長(zhǎng)的那些菌落再次點(diǎn)接到BMMD和BMMD加色氨酸上，以鑒定哪些是色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。
然后選擇證明是色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌落，用于通過(guò)YCplac22(Gietz和Sugino，1988，Gene，74，527-534)轉(zhuǎn)化進(jìn)行進(jìn)一步分析，以查明哪些分離物是trp1。
使用橫跨TRP1基因座的PCR擴(kuò)增來(lái)確認(rèn)trp-表型是由于該區(qū)域中的缺失。由鑒定為耐受5-FAA且不能在未添加色氨酸的極限培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的分離物制備基因組DNA。如下完成用引物CED005和CED006(表12)對(duì)基因組TRP1基因座的PCR擴(kuò)增1μl模板基因組DNA、5μl 10X緩沖液(Fast StartTaq+Mg，Roche)、1μl 10mM dNTP混合物、5μl每種引物(2μM)、0.4μl FastStart Taq，用H2O補(bǔ)至50μl。使用Perkin-Elmer熱循環(huán)儀9600進(jìn)行PCR。條件是于94℃變性10分鐘[保持HOLD]，然后[循環(huán)CYCLE]于94℃變性30秒、于55℃退火30秒、于72℃延伸120秒，40個(gè)循環(huán)，然后[保持HOLD]于72℃10分鐘，再然后[保持HOLD]4℃。對(duì)野生型TRP1基因座的PCR擴(kuò)增導(dǎo)致大小為1.34kb的PCR產(chǎn)物，而跨越已刪除TRP1區(qū)的擴(kuò)增導(dǎo)致小0.84kb即位于0.50kb處的PCR產(chǎn)物。PCR分析鑒定得出DXY1衍生的trp-菌株(DXY1 trp1Δ[pDB2244])具有預(yù)期的刪除事件。
如Sleep等人，1991，Bio/Technology，9，183-187所述，消除酵母菌株DXY1 trp1Δ[pDB2244]的表達(dá)質(zhì)粒pDB2244。使用改良的醋酸鋰法(Sigma酵母轉(zhuǎn)化試劑盒，YEAST-1，方案2；Ito等人，1983，J.Bacteriol.，153，163；Elble，1992，Biotechniques，13，18)，將DXY1 trp1Δcir0用pDB2244、pDB2976、pDB2977、pDB2978、pDB2979、pDB2980或pDB2981再次轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。在補(bǔ)充了色氨酸的BMMD瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化子，然后點(diǎn)接到補(bǔ)充了色氨酸的BMMD瓊脂板上。由10ml補(bǔ)充了色氨酸的BMMD搖瓶培養(yǎng)物(24小時(shí)，30℃，200rpm)制備冷凍海藻糖原種。
使用改良的醋酸鋰法(Sigma酵母轉(zhuǎn)化試劑盒，YEAST-1，方案2；Ito等人，1983，J.Bacteriol.，153，163；Elble，1992，Biotechniques，13，18)，用通過(guò)NotI/PstI消化由pDB3078分離的1.41kb pdi1::TRP1破壞DNA片段，將酵母菌株DXY1 trp1Δ[pDB2976]、DXY1 trp1Δ[pDB2977]、DXY1 trp1Δ[pDB2978]、DXY1 trp1Δ[pDB2979]、DXY1 trp1Δ[pDB2980]或DXY1 trp1Δ[pDB2981]轉(zhuǎn)化成色氨酸原養(yǎng)型。在BMMD瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化子，然后點(diǎn)接到BMMD瓊脂板上。
將每種菌株的6個(gè)轉(zhuǎn)化子接種50ml搖瓶中的10ml YEPD，并在定軌搖床中于30℃以200rpm培養(yǎng)4天。收獲培養(yǎng)物上清液和細(xì)胞生物量。由色氨酸原養(yǎng)型和DXY1[pDB2244]制備基因組DNA(Lee，1992，Biotechniques，12，677)。如下完成用引物DS236和DS303(表11和12)對(duì)基因組PDI1基因座的PCR擴(kuò)增1μl模板基因組DNA、5μl 10X緩沖液(Fast StartTaq+Mg，Roche)、1μl 10mM dNTP混合物、5μl每種引物(2μM)、0.4μl FastStart Taq，用H2O補(bǔ)至50μl。使用Perkin-Elmer熱循環(huán)儀9700進(jìn)行PCR。條件是于94℃變性4分鐘[保持HOLD]，然后[循環(huán)CYCLE]于94℃變性30秒、于50℃退火30秒、于72℃延伸60秒，30個(gè)循環(huán)，然后[HOLD]于72℃10分鐘，再然后[HOLD]4℃。對(duì)野生型PDI1基因座的PCR擴(kuò)增導(dǎo)致沒(méi)有PCR產(chǎn)物，而跨越已刪除PDI1區(qū)的擴(kuò)增導(dǎo)致PCR產(chǎn)物0.65kbp。PCR分析鑒定得出測(cè)試的所有36個(gè)潛在pdi1::TRP1菌株都具有預(yù)期的pdi1::TRP1刪除。
通過(guò)火箭免疫電泳比較了重組清蛋白滴度(圖92)。在每個(gè)組內(nèi)，DXY1trp1Δ[pDB2976]、DXY1 trp1Δ[pDB2978]、DXY1 trp1Δ[pDB2980]、DXY1trp1Δ[pDB2977]和DXY1 trplΔ[pDB2979]的所有6個(gè)pdi1::TRP1破壞子(disruptant)都具有非常相似的rHA生產(chǎn)力。只有DXY1 trp1Δ[pDB2981]的6個(gè)pdi1::TRP1破壞子顯示rHA表達(dá)滴度的變化。將圖92中所示6個(gè)pdi1::TRP1破壞子涂布到Y(jié)EPD瓊脂上以分離單菌落，并再次點(diǎn)接到BMMD瓊脂上。
將DXY1 trp1Δ pdi1::TRP1[pDB2976]、DXY1 trp1Δpdi1::TRP1[pDB2978]、DXY1 trp1Δpdi1::TRP1[pDB2980]、DXY1 trp1Δpdi1::TRP1[pDB2977]、DXY1 trp1Δpdi1::TRP1[pDB2979]和DXY1 trp1Δpdi1::TRP1[pDB2981]以及DXY1[pDB2244]、DXY1[pDB2976]、DXY1[pDB2978]、DXY1[pDB2980]、DXY1[pDB2977]、DXY1[pDB2979]和DXY1[pDB2981]的3個(gè)單細(xì)胞分離物接種50ml搖瓶中的10ml YEPD，并在定軌搖床中于30℃以200rpm培養(yǎng)4天。收獲培養(yǎng)物上清液，并通過(guò)火箭免疫電泳比較重組清蛋白滴度(圖93)。將圖93中所示13個(gè)野生型PDI1和pdi1::TRP1破壞子涂布到Y(jié)EPD瓊脂上以分離單菌落。然后將來(lái)自每種菌株的100個(gè)單細(xì)胞化菌落再次點(diǎn)接到含有山羊抗HSA抗體的BMMD瓊脂或YEPD瓊脂上以檢測(cè)重組清蛋白的表達(dá)(Sleep等人，1991，Bio/Technology，9，183-187)，并對(duì)每個(gè)菌落的Leu+/rHA+、Leu+/rHA-、Leu-/rHA+或Leu-/rHA-表型評(píng)分(表13)。
表13
這些數(shù)據(jù)指示，當(dāng)PDI1基因在沒(méi)有染色體編碼PDI的宿主菌株中用作質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記時(shí)，甚至在非選擇性培養(yǎng)基諸如例示的豐富培養(yǎng)基中，質(zhì)粒保持得到提高。
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的方法，包括(a)提供包含2μm家族質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒包含編碼包含伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的基因和編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的基因；(b)在容許編碼包含伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的基因和編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并(c)由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括如下步驟將純化的非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起配制，并任選以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。
3.2μm家族質(zhì)粒作為表達(dá)載體通過(guò)在相同2μm家族質(zhì)粒上提供編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的基因和編碼伴侶蛋白的基因用于提高真菌(優(yōu)選酵母)或脊椎動(dòng)物非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)產(chǎn)量的用途。
4.包含編碼包含伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的基因和編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的基因的2μm家族質(zhì)粒，其中如果質(zhì)?；?μm質(zhì)粒，那么它是非整合載體。
5.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述蛋白伴侶具有真菌蛋白伴侶(優(yōu)選酵母蛋白伴侶)或哺乳動(dòng)物蛋白伴侶(優(yōu)選人蛋白伴侶)的序列。
6.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述蛋白伴侶包含由如下任何之一編碼的蛋白質(zhì)的序列AHA1、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、CPR3、CPR6、EPS1、ERO1、EUG1、FMO1、HCH1、HSP10、HSP12、HSP104、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP78、HSP82、JEM1、MDJ1、MDJ2、MPD1、MPD2、PDI1、PFD1、ABC1、APJ1、ATP11、ATP12、BTT1、CDC37、CPR7、HSC82、KAR2、LHS1、MGE1、MRS11、NOB1、ECM10、SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSC1、SSE2、SIL1、SLS1、UBI4、ORM1、ORM2、PER1、PTC2、PSE1和HAC1或截短的無(wú)內(nèi)含子的HAC1。
7.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述蛋白伴侶是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，或是包含由PSE1、ORM2或SSA1編碼的蛋白質(zhì)或其變體或片段的序列。
8.依照權(quán)利要求1、2、5、6或7任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞還表達(dá)編碼與由所述質(zhì)粒編碼的第一蛋白伴侶不同的蛋白伴侶的第二重組基因。
9.依照權(quán)利要求8的方法，其中編碼蛋白伴侶的第二重組基因整合在染色體中。
10.依照權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包含兩種編碼不同蛋白伴侶的不同基因，其中一種基因是如權(quán)利要求8定義的編碼蛋白伴侶的第二重組基因。
11.依照權(quán)利要求8至10任一項(xiàng)的方法、用途或質(zhì)粒，其中一種蛋白伴侶是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。
12.依照權(quán)利要求8至11任一項(xiàng)的方法、用途或質(zhì)粒，其中一種蛋白伴侶是ORM2。
13.依照權(quán)利要求8或9的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述兩種蛋白伴侶是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和ORM2。
14.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)包含在酵母中有效引起分泌的前導(dǎo)序列。
15.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)是真核蛋白質(zhì)或其片段或變體，優(yōu)選脊椎動(dòng)物或真菌(諸如酵母)蛋白質(zhì)。
16.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)是商業(yè)上有用的蛋白質(zhì)。
17.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)包含選自清蛋白、單克隆抗體、鬼臼亞乙苷、血清蛋白質(zhì)(諸如血液凝結(jié)因子)、antistasin、蜱抗凝肽、運(yùn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、內(nèi)皮抑制素、抑管張素、膠原蛋白、免疫球蛋白或基于免疫球蛋白的分子或二者任一的片段(如dAb、Fab′片段、F(ab′)2、scAb、scFv或scFv片段)、Kunitz結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、干擾素、白介素、IL10、IL11、IL2、干擾素α的各個(gè)種類(lèi)和亞類(lèi)、干擾素β的各個(gè)種類(lèi)和亞類(lèi)、干擾素γ的各個(gè)種類(lèi)和亞類(lèi)、瘦蛋白、CNTF、CNTFAX15(AxokineTM)、IL1受體拮抗物、紅細(xì)胞生成素(EPO)和EPO模擬物、血小板生成素(TPO)和TPO模擬物、prosaptide、藍(lán)藻抗病毒蛋白N，5-螺旋、T20肽、T1249肽、HIV gp41、HIV gp120、尿激酶、尿激酶原、tPA、水蛭素、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、甲狀旁腺激素、胰島素原、胰島素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、胰島素樣生長(zhǎng)因子、降鈣素、生長(zhǎng)激素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、腫瘤壞死因子、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、FGF、前體和活性形式的凝血因子包括但不限于纖溶酶原、纖維蛋白原、凝血酶、前凝血酶、凝血酶原、von Willebrand氏因子、α1-抗胰蛋白酶、纖溶酶原激活物、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X(jué)和因子X(jué)III、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、LACI、血小板衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)、葡萄糖氧化酶、血清膽堿酯酶、抑酶肽、淀粉狀蛋白前體蛋白、inter-α胰蛋白酶抑制物、抗凝血酶III、脫脂載脂蛋白各個(gè)種類(lèi)、蛋白C、蛋白S或任何上述的變體或片段的序列。
18.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)包含清蛋白或其變體或片段的序列。
19.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)包含運(yùn)鐵蛋白家族成員，優(yōu)選運(yùn)鐵蛋白或乳鐵蛋白，或其變體或片段的序列。
20.依照任何前述權(quán)利要求的方法、用途或質(zhì)粒，其中所述非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)包括融合蛋白，諸如清蛋白或運(yùn)鐵蛋白家族成員或其中任一的變體或片段與另外的蛋白質(zhì)的序列直接或間接融合的融合蛋白。
21.包含任何前述權(quán)利要求定義的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
22.依照權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中由質(zhì)粒編碼的蛋白伴侶是必需基因。
23.依照權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，其中在缺乏所述質(zhì)粒時(shí)，所述宿主細(xì)胞不能生成所述蛋白伴侶。
24.依照權(quán)利要求21至23任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，它是酵母細(xì)胞。
25.依照權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，其中所述質(zhì)?；趐SR1、pSB3或pSB4且所述酵母細(xì)胞是魯氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces rouxii)；所述質(zhì)?；趐SB1或pSB2且所述酵母細(xì)胞是拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)；所述質(zhì)?；趐SM1且所述酵母細(xì)胞是發(fā)酵接合糖酵母(Zygosaccharomyces fermentati)；所述質(zhì)?；趐KD1且所述酵母細(xì)胞是果蠅克魯維氏酵母(Kluyveromyces drosophilarum)；所述質(zhì)?；趐PM1且所述酵母細(xì)胞是膜醭畢赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)；或所述質(zhì)粒基于2μm質(zhì)粒且所述酵母細(xì)胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)或卡爾斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)。
26.依照權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，其中所述質(zhì)?；?μm質(zhì)粒且所述酵母細(xì)胞是啤酒糖酵母或卡爾斯伯糖酵母。
27.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞是權(quán)利要求21至26任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞。
28.依照權(quán)利要求27的方法，其中所述宿主細(xì)胞是權(quán)利要求23或依賴(lài)它的任何其它權(quán)利要求定義的宿主細(xì)胞。
29.權(quán)利要求27的方法，其中步驟(b)涉及在非選擇性培養(yǎng)基諸如豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
30.用于生產(chǎn)非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的方法，包括(a)提供包含編碼包含第一伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因、編碼包含第二伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的第二重組基因和編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的第三重組基因的宿主細(xì)胞，其中第一和第二蛋白伴侶是不同的；(b)在容許第一、第二和第三基因表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并(c)任選由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)；并(d)任選將由此純化的蛋白質(zhì)凍干。
31.權(quán)利要求30的方法，還包括如下步驟將純化的非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起配制，并任選以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。
32.依照權(quán)利要求30或31的方法，其中第一和第二蛋白伴侶包含由如下任何之一編碼的蛋白質(zhì)的序列AHA1、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、CPR3、CPR6、EPS1、ERO1、EUG1、FMO1、HCH1、HSP10、HSP12、HSP104、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP78、HSP82、JEM1、MDJ1、MDJ2、MPD1、MPD2、PDI1、PFD1、ABC1、APJ1、ATP11、ATP12、BTT1、CDC37、CPR7、HSC82、KAR2、LHS1、MGE1、MRS11、NOB1、ECM10、SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSC1、SSE2、SIL1、SLS1、UBI4、ORM1、ORM2、PER1、PTC2、PSE1和HAC1或截短的無(wú)內(nèi)含子的HAC1。
33.依照權(quán)利要求30至33任一項(xiàng)的方法，其中第一蛋白伴侶是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。
34.依照權(quán)利要求30至34任一項(xiàng)的方法，其中第二蛋白伴侶是ORM2。
35.依照權(quán)利要求30至34任一項(xiàng)的方法，其中第一或第二蛋白伴侶至少其一是由整合在染色體中的重組基因編碼的。
36.依照權(quán)利要求30至35任一項(xiàng)的方法，其中第一或第二蛋白伴侶至少其一是由質(zhì)粒上的基因編碼的。
37.依照權(quán)利要求36的方法，其中所述質(zhì)粒是如權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)定義的質(zhì)粒。
38.包含編碼包含蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因和編碼包含基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)之序列的蛋白質(zhì)的第二重組基因的宿主細(xì)胞。
39.編碼包含蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)之序列的蛋白質(zhì)的重組基因用于提高基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)的用途。
40.依照權(quán)利要求38的宿主細(xì)胞或依照權(quán)利要求39的用途，其中基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)包含運(yùn)鐵蛋白或運(yùn)鐵蛋白家族任何其它成員(如乳鐵蛋白)或其變體或片段或包含運(yùn)鐵蛋白或其變體或片段的融合蛋白的序列。
41.依照權(quán)利要求38至40任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中編碼包含蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因在質(zhì)粒上提供。
42.依照權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞或用途，其中所述質(zhì)粒是2μm家族質(zhì)粒。
43.依照權(quán)利要求38至40任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞或用途，其中編碼包含蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因整合在染色體中。
44.依照權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞或用途，其中編碼包含蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因在內(nèi)源編碼PDI基因的基因座處整合在染色體中，優(yōu)選沒(méi)有破壞內(nèi)源PDI基因的表達(dá)。
45.依照權(quán)利要求38至44任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞或用途，其中編碼包含基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)之序列的蛋白質(zhì)的第二重組基因在質(zhì)粒上提供。
46.依照權(quán)利要求45的宿主細(xì)胞或用途，其中所述質(zhì)粒是2μm家族質(zhì)粒。
47.依照權(quán)利要求38至44任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞或用途，其中編碼包含基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)之序列的蛋白質(zhì)的第二重組基因整合在染色體中。
48.依照權(quán)利要求47的宿主細(xì)胞或用途，其中編碼包含基于運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)之序列的蛋白質(zhì)的第二重組基因在內(nèi)源編碼PDI基因的基因座處整合在染色體中，優(yōu)選沒(méi)有破壞內(nèi)源PDI基因的表達(dá)。
49.用于生產(chǎn)非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的方法，包括(a)提供包含編碼包含ORM2或其變體或片段之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因和編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的第二重組基因的宿主細(xì)胞；并(b)在容許第一和第二基因表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
50.權(quán)利要求49的方法，還包括如下步驟將純化的非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起配制，并任選以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。
51.依照權(quán)利要求49或50的方法，其中編碼包含ORM2或其變體或片段之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因整合在宿主細(xì)胞的染色體中。
52.依照權(quán)利要求49或50的方法，其中編碼包含ORM2或其變體或片段之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因位于質(zhì)粒上。
53.包含編碼包含ORM2或其變體或片段之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因和編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的第二重組基因的宿主細(xì)胞。
54.編碼包含ORM2或其變體或片段之序列的蛋白質(zhì)的重組基因用于提高宿主細(xì)胞中非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)表達(dá)的用途。
55.包含編碼包含ORM2或其變體或片段之序列的蛋白質(zhì)的第一重組基因和編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的第二重組基因的質(zhì)粒。
56.依照權(quán)利要求55的質(zhì)粒，它是2μm家族質(zhì)粒。
57.依照權(quán)利要求49至56任一項(xiàng)的方法、用途、宿主細(xì)胞或質(zhì)粒，其中所述非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)如權(quán)利要求14至20任一項(xiàng)的定義。
58.包含如下質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒包含編碼必需蛋白伴侶的基因，其中在缺乏所述質(zhì)粒時(shí)，所述宿主細(xì)胞不能生成所述蛋白伴侶，該質(zhì)粒還包含編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的重組基因，諸如權(quán)利要求14至20任一項(xiàng)中定義的非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)。
59.依照權(quán)利要求58的宿主細(xì)胞，其中在缺乏所述質(zhì)粒時(shí)，所述細(xì)胞不能存活。
60.權(quán)利要求58或59的宿主細(xì)胞，其中所述蛋白伴侶是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。
61.包含編碼必需蛋白伴侶的基因作為唯一選擇標(biāo)記的質(zhì)粒。
62.權(quán)利要求61的質(zhì)粒，還包含編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的基因，諸如權(quán)利要求14至20任一項(xiàng)中定義的非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)。
63.權(quán)利要求61或62的質(zhì)粒，它是2μm家族質(zhì)粒。
64.用于生產(chǎn)非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟(a)提供權(quán)利要求58至60任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞；并(b)在容許必需蛋白伴侶和非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求61至63任一項(xiàng)定義的質(zhì)粒。
66.權(quán)利要求64或65的方法，其中步驟(b)是通過(guò)在非選擇性培養(yǎng)基諸如豐富或復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞來(lái)進(jìn)行的。
67.編碼蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的核苷酸序列通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核苷酸序列用于提高宿主細(xì)胞中非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)表達(dá)的用途，該宿主細(xì)胞是在選擇性培養(yǎng)基諸如極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，其中編碼蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的核苷酸序列的特征為它具有至少一項(xiàng)下列特征(a)所述核苷酸包含具有天然PDI啟動(dòng)子或其功能性變體之序列的啟動(dòng)子且包含一連串的14個(gè)“TA”重復(fù)；(b)所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在參照基因庫(kù)編號(hào)CAA38402定義的位置506-513處通常包含氨基酸序列EADAEAEA或其保守替代變體；(c)所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的殘基Ser41是由密碼子TCT編碼的；(d)所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的殘基Glu44是由密碼子GAA編碼的；(e)所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的殘基Leu262是由密碼子TTG編碼的；(f)所編碼的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的殘基Asp514是由密碼子GAC編碼的；或(g)所述核苷酸序列包含具有天然PDI終止子或其功能性變體之序列的終止子序列，且包含一連串的8個(gè)連續(xù)“A”堿基和/或在位置1919(參照(a)提供包含編碼蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶且具有權(quán)利要求67定義的核苷酸序列之序列的重組基因的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞還包含編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的重組基因；并(b)在容許蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下在極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
69.包含與編碼蛋白伴侶的編碼序列可操作連接的啟動(dòng)子序列的多核苷酸通過(guò)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該多核苷酸用于提高宿主細(xì)胞中非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)表達(dá)的用途，其中所述啟動(dòng)子的特征是它所達(dá)到的蛋白伴侶表達(dá)水平比所述編碼序列與其天然存在啟動(dòng)子可操作連接時(shí)所達(dá)到的低。
70.用于生產(chǎn)非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟(a)提供包含如下重組基因的宿主細(xì)胞，該重組基因包含與編碼蛋白伴侶的編碼序列可操作連接的啟動(dòng)子序列，其中所述啟動(dòng)子的特征是它所達(dá)到的蛋白伴侶表達(dá)水平比所述編碼序列與其天然存在啟動(dòng)子可操作連接時(shí)所達(dá)到的低，且宿主細(xì)胞還包含編碼非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)的重組基因；并(b)在容許蛋白伴侶和非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
71.權(quán)利要求1的方法，還包括如下步驟將由此純化的蛋白質(zhì)凍干。
72.權(quán)利要求49、64、68或70的方法，還包括如下步驟由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)。
73.權(quán)利要求72的方法，還包括如下步驟將由此純化的蛋白質(zhì)凍干。
74.權(quán)利要求72或73的方法，還包括如下步驟將純化或凍干的非2μm家族質(zhì)粒蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起配制。
75.權(quán)利要求74的方法，還包括如下步驟以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，包括(a)提供包含2μm家族質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒包含編碼包含伴侶蛋白之序列的蛋白質(zhì)的基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因；(b)在容許編碼伴侶蛋白的基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并(c)由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化由此表達(dá)的異源蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/67GK1922325SQ200480042021
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月23日
發(fā)明者達(dá)雷爾·斯利普, 吉利恩·沙特爾沃思, 克里斯托弗·J·A·芬尼斯 申請(qǐng)人:達(dá)爾塔生物技術(shù)有限公司