專利名稱：通過靜電疊層自組裝設(shè)計用于薄膜、涂層和微囊的納米制造中的多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過靜電疊層自組裝(〃ELBL〃)在適當(dāng)表面上進(jìn)行超 薄多層薄膜的制造(fabrications更具體i也本發(fā)明涉及通過ELBL 設(shè)計用于薄膜、涂層和微囊(microcapsules)的納米制造
(Nanofabrication)的多肽的方法，以及該方法在生物醫(yī)學(xué)和其他 領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
ELBL是已經(jīng)建立的技術(shù)，其中超薄薄膜通過改變電性相反的 (oppositely-charged)聚合電角軍質(zhì)(polyelectrolytes)的吸附 而被組裝。該過程是基于在每層沉積之后薄膜表面電荷的逆轉(zhuǎn)。圖1 顯示了一般的ELBL過程的示意圖電性相反的聚離子(陽離子聚離 子10和陰離子聚離子11)的薄膜在負(fù)電性平面12上逐層組裝；表 面電荷在每層沉積之后逆轉(zhuǎn)。重復(fù)該過程直至形成所需厚度的薄 膜。結(jié)合的物理基礎(chǔ)是靜電學(xué)一重力和核力實際上沒有起作用。因 為該過程的通用性和相對簡單性，ELBL允許很多不同類型的物質(zhì)在 很多不同類型的表面上沉積。因此，存在大量可能有用的物質(zhì)和表面的組合。關(guān)于ELBL的一般性討論包括它的歷史參見Ynri Lvov，
"Electrostatic Layer-byHLayer Assembly of Proteins and Polyions〃 in /^r。tei" ylrc力jYectt/re.' i>2ter/s".a7 #。_/ec〃7s_r y^5"柳/l/y朋o7 J鵬o6j7j'zs tio/ 歷'c^ecA^CLZog/"， Y. Lvov & H.
M!3hwald編輯(New York: Marcel Dekker， 1999)， pp. 125-167，其 在這里通過引用將其整體并入本文。
ELBL最近已經(jīng)成為納米技術(shù)領(lǐng)域的焦點，因為它可以被用來制 造厚度完全小于1微米的薄膜。另外，ELBL允許對薄膜制造過程的 特殊控制，實現(xiàn)了納米級材料的使用，并允許納米級的結(jié)構(gòu)修飾。 因為每層的厚度都在幾納米或更少的層次上，取決于所使用的材料 的類型和特定的吸附過程，所以能夠形成可精確重復(fù)厚度的多層組
許多合成的聚合電解質(zhì)已經(jīng)在ELBL應(yīng)用中被采用，包括聚(苯 乙烯磺酸)鈉(〃PSS〃)、聚(丙烯胺鹽酸)(〃PAH〃)、聚(二甲基二 烯丙基氯化銨)("PDDA〃)、聚(丙烯酰胺-共-二甲基二烯丙基氯化 銨)、聚(乙烯亞胺)(〃PEI〃)、聚(丙烯酸)(〃PAA〃)、聚(茴香烯磺 酸)、聚(乙烯磺酸鹽)(〃PVS〃)he聚(乙烯磺酸)。然而，這類物質(zhì) 并非普遍用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，因為它們是抗原性或毒性的。
蛋白質(zhì)，作為帶有具有可電離基團(tuán)的側(cè)鏈的聚合物，能夠被用 于ELBL中用于各種應(yīng)用，包括生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。已經(jīng)在ELBL中使
用的蛋白質(zhì)的例子包括細(xì)胞色素c;雞蛋蛋清溶菌酶、免疫球蛋白G、
肌紅蛋白、血紅蛋白和血清白蛋白(i&V)。然而，對于使用蛋白 質(zhì)用于該目的還存在困難。這些困難包括對多層結(jié)構(gòu)的有限的控制
(因為蛋白質(zhì)表面是高度不規(guī)則的且蛋白質(zhì)一般不會吸附于規(guī)則結(jié) 構(gòu)的表面)、.對pH的限制(由于pH依賴性的蛋白質(zhì)溶解度和結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定性)、當(dāng)使用外源性蛋白時缺乏生物相容性和放大生產(chǎn)的成本
(如果基因還沒有被克隆)；除非所述蛋白質(zhì)在容易獲得的來源(例 如，牛)中是相同的，否則蛋白質(zhì)將必須從它預(yù)期應(yīng)用的生物體中 獲得，這使得蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)的成本是禁止性的。.相反，多肽一般比蛋白質(zhì)小且比較不復(fù)雜，構(gòu)成極好的一類用
于ELBL組裝的材料，而且通過ELBL制造的多肽薄膜結(jié)構(gòu)將有用于 廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明提供了通過ELBL設(shè)計薄膜、涂層和微囊的納米 制造的多肽的方法。使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽將表現(xiàn)幾個有用的 性質(zhì)，包括但不限于完全確定的一級結(jié)構(gòu)、在水溶液中最低限度 的二級結(jié)構(gòu)、單分散性、每單位長度完全受控制的凈電荷、根據(jù)需 要形成交聯(lián)的能力、逆轉(zhuǎn)交聯(lián)形成的能力、形成更有組織的薄膜(比 使用蛋白質(zhì)可能形成的)和相對廉價的大規(guī)模生產(chǎn)成本(假定基因 設(shè)計、合成、克隆和宿主表達(dá)于大腸桿菌(S co7i')或酵母中，或 者肽合成)。
已經(jīng)顯示使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽可以用于薄膜結(jié)構(gòu)的 ELBL，所述薄膜結(jié)構(gòu)在生物醫(yī)學(xué)技術(shù)、食品技術(shù)和環(huán)境技術(shù)中具有 定向或可能的應(yīng)用。這類多肽可以用來例如制造人工紅細(xì)胞、給藥 裝置和抗微生物薄膜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于在氨基酸序列信息中識別用于在ELBL中使用 的具有確定長度和中性pH下的凈電荷的"序列基元(sequence motifs)"以及用于記錄所需數(shù)目的基序的新方法。所述方法包括 如下步驟(a)獲得來自特定生物體的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列； (b)定位所述氨基酸序列中的起始氨基酸；(c)檢查所述起始氨 基酸和所述隨后n個氨基酸以確定具有與所述某一極性相反的極性 的荷電氨基酸的數(shù)目；(d)如果具有與所述某一極性相反的極性的 所述荷電氨塞酸的數(shù)目—是一或更多，從步驟g繼續(xù)該方法；(e)檢 查所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸以確定具有所述某一極性 的荷電氨基酸的數(shù)目；(f)如果具有所述某一極性的荷電氨基酸的 數(shù)目等于或大于x，記錄由所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸組 成的所述氨基酸序列基元；(g)定位所述氨基酸序列中另一個起始 氨基酸；和(h)從步驟c開始重復(fù)所述方法直至所述所需數(shù)目的氨基酸序列基元已經(jīng)被識別或者所述氨基酸序列中的所有氨基酸已 經(jīng)作為步驟C中的所述起始氨基酸被使用；其中X大于或約等于n
的一半。
本發(fā)明還提供了設(shè)計用于ELBL中的多肽的新型方法，包括步 驟(a)使用前段提到的步驟來識別并記錄一個或多個具有某一極 性的凈電荷的氨基酸序列基元和(b)連接多個所述被記錄的氨基酸 序列基元以制造多肽。
本發(fā)明還提供了設(shè)計用在ELBL中的多肽的新型方法，該方法包 括如下步驟(a)重新設(shè)計多個氨基酸序列基元，其中所述氨基酸 序列基元由n個氨基酸組成，其中至少x個氨基酸是帶正電且沒有 一個氨基酸是帶負(fù)電，或者其中至少x個氨基酸是帶負(fù)電且沒有一 個氨基酸是帶正電，其中x是大于或約等于n的一半；和(b)連接 所述多個所述氨基酸序列基元。氨基酸序列基元可以包含20個普通 氨基酸或非天然氨基酸，所述氨基酸可以是左旋(L-氨基酸)也可 以是右旋(D-氨基酸)。
本發(fā)明還提供了一種薄膜，該薄膜包括多個多肽層，所述多肽 層具有交替的電荷，其中所述多肽包含至少一個由n個氨基酸組成 的氨基酸序列基元，其中至少x個氨基酸帶正電且沒有一個氨基酸 帶負(fù)電，或者其中至少x個氨基酸帶負(fù)電且沒有一個氨基酸帶正電， 其中x大于或約等于n的一半。這些多肽中的基元可以使用上述任 一方法來選擇。 '
本發(fā)明還提供了使用半胱氨酸或其他含巰基的氨基酸類型來 "鎖定(lock)"和"解鎖(unlock)"多肽ELBL薄膜多層的方法。 該方法使薄膜在極端PH下一保持穩(wěn)定,對由所設(shè)計的多肽納米制造的 薄膜的機(jī)械穩(wěn)定性和擴(kuò)散性質(zhì)產(chǎn)生較強控制并增加了它們在廣泛應(yīng) 用中的效用。


圖1是ELBL —般過程的示意圖。
圖2是使用本發(fā)明方法在人類氨基酸序列信息中識別的氨基酸 序列基元的累積二級結(jié)構(gòu)傾向性圖，與105個隨機(jī)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)
傾向性分布相比較。
圖3 (a)顯示了由石英晶體微量天平技術(shù)(〃QCM")所監(jiān)測到的關(guān) 于根據(jù)本發(fā)明設(shè)計的氨基酸序列組合的吸附數(shù)據(jù)。
圖3 (b)顯示了由QCM監(jiān)測到的關(guān)于根據(jù)本發(fā)明設(shè)計的不同氨 基酸序列組合的吸附數(shù)據(jù)的比較。
圖3 (c)顯示了關(guān)于根據(jù)本發(fā)明設(shè)計并制造的氨基酸序列的吸 附質(zhì)量(納克)對層數(shù)的圖。
圖4 (a)描述了根據(jù)本發(fā)明半胱氨酸鎖定方法的內(nèi)層二硫鍵。
圖4 (b)描述了根據(jù)本發(fā)明半胱氨酸鎖定方法的中間層二硫鍵。
圖4 (c)描述了由根據(jù)本發(fā)明方法設(shè)計的多肽所制造的微囊中 二硫鍵的氧化和還原。
圖5是在現(xiàn)有氨基酸序列信息中識別具有用于ELBL的適當(dāng)?shù)撵o 電性質(zhì)的氨基酸序列基元的本發(fā)明的選擇方法的示意圖。
圖6顯示了在可獲得的人類氨基酸序列數(shù)據(jù)中識別的非多余序 列基元的數(shù)目。
圖7顯示了來自水性介質(zhì)的聚L-谷氨酸和聚L-賴氨酸的ELBL 吸附作為離子強度的函數(shù)。
圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明方法設(shè)計的多肽的吸附，用于探測二硫 鍵形成的效果的實驗。
圖9顯示了在參考圖8所討論的酸性pH下的薄膜分解過程中材 料保留的百分比。
圖10顯示了在涉及重新設(shè)計的含有半胱氮酸的多肽的實驗的酸 性pH分解步驟中材料損失的百分比。圖11 (a)描述了肽的溶液結(jié)構(gòu)在薄膜組裝上的作用，顯示了聚
L-谷氨酸和聚L-賴氨酸的組裝行為是如何依賴pH的。針對吸附層標(biāo) 繪出QCM共振頻率。聚L-谷氨酸的平均分子量是84600 Da，而聚L-賴氨酸的平均分子量是84000 Da>數(shù)字指的是pH值。E二Glu， K二Lys。 用于組裝的肽濃度是2 mg/mL。
圖11 (b)描述了肽的溶液結(jié)構(gòu)在薄膜組裝上的作用，顯示了聚 L-谷氨酸和聚L-賴氨酸的溶液結(jié)構(gòu)是如何依賴pH的。平均摩爾殘基 橢圓率被標(biāo)繪為pH的函數(shù)。肽濃度是0.05 mg/mL。
圖12顯示了不同長度的聚合電解質(zhì)的吸附數(shù)據(jù)，說明長聚合電 解質(zhì)比短的吸附更好。
具體實施方式
A.術(shù)語解釋
為了在隨后描述中的方便，術(shù)語采納以下解釋。然而，這些解 釋僅僅意為示例性的。它們不是意欲當(dāng)術(shù)語在整個說明書中被描述 或提及時來限制這些術(shù)語。
更正確的，這些解釋意味著要包括如這里所描述或主張的術(shù)語 的其他方面和/或例子。
這里使用的"生物相容性"表示在攝食、皮膚接觸或引入血液. 后沒有引起不利的健康影響。這里使用的"免疫應(yīng)答"表示人類免 疫系統(tǒng)對血液中物質(zhì)存在的響應(yīng)。免疫應(yīng)答能以多種方式表征，例 如，通過增加血液中識別某一抗原的抗體的數(shù)目(抗體是由免疫系統(tǒng) 生成的蛋白質(zhì)，抗原是引發(fā)免疫應(yīng)答的實體)。人體通過增加血液中 抗體的數(shù)目來對抗感染和抑制再感染。特異性免疫應(yīng)答在一定程度 上取決于個體，盡管普遍的應(yīng)答模式是標(biāo)準(zhǔn)的。
這里使用的"表位"表示被抗體識別的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。通常， 表位將位于蛋白質(zhì)的表面上。"連續(xù)表位"是包括成排的幾個氨基 酸的表位，不是包括與折疊蛋白質(zhì)發(fā)生接觸的氨基酸殘基的表位。這里使用的"序列基元"和"基序"表示使用本發(fā)明方法識別 的給定殘基數(shù)目的氨基酸序列。在優(yōu)選實施方案中，所述殘基數(shù)目 是7。
這里使用的"氨基酸序列"和"序列"表示至少兩個氨基酸殘 基長度的任意長度的多肽鏈。
這里使用的"殘基"表示聚合物中的氨基酸，這是由此形成所 述聚合物的氨基酸單體的殘基。多肽合成包括水解一在氨基酸加入 多肽鏈時"丟失"單個水分子。
這里使用的"設(shè)計的多肽"表示使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽，
術(shù)語"肽"和"多肽"被互換使用。這里使用的"一級結(jié)〗
i示
多肽鏈中線性的氨基酸序列，"二級結(jié)構(gòu)"表示由非共價相互作用 (通常為氫鍵)包括穩(wěn)定的或多或少有規(guī)則的結(jié)構(gòu)類型一例子包括 a-螺旋、折疊和3-轉(zhuǎn)角。
這里使用的"氨基酸"不限于20種天然存在的氨基酸；如上下 文許可，該術(shù)語還指D-氨基酸、L-氨基酸和非天然氨基酸。
這里使用的"非天然氨基酸"表示不同于20種天然存在的氨基 酸的氨基酸。下述三字母簡稱在這里用來代表20種普通氨基酸
Ala:賴氨酸 Glu-谷氨酸 His二組氨酸 Leu二亮氨酸 Pro:脯氨酸 Ser二絲氨酸 Trp^色氨酸 B.發(fā)明描述
Phe二苯丙氨酸
Ile二異亮氨酸
Met:蛋氨酸
Gl『谷氨酰胺
T'hr二蘇氨酸
Tyr二酪氨酸
Asp二天冬氨酸
Gly二賴氨酸
Lys二賴氨酸
As『天冬酰胺
Arg^精氨酸
Val4頸氨酸
本發(fā)明提供了用于通過薄膜、涂層和微囊的ELBL進(jìn)行納米制造 的多肽的設(shè)計方法，用于在生物醫(yī)學(xué)和其他領(lǐng)域的應(yīng)用。該方法包括5個主要的設(shè)計關(guān)注(1)多肽的靜電性質(zhì)；(2)多肽的物理結(jié)
構(gòu)；(3)從多肽制造的薄膜的物理穩(wěn)定性；(4)多肽和薄膜的生物 相容性；和(5)多肽和薄膜的生物活性。第一個設(shè)計關(guān)注，靜電學(xué)， 可能是最重要的，因為這是ELBL的基礎(chǔ)。沒有適當(dāng)?shù)碾姾尚再|(zhì)，多 肽將不溶于水溶液中并不能用于薄膜的ELBL納米制造。我們已經(jīng)設(shè) 計了新型的方法用于識別氨基酸序列信息中具有適合于ELBL的靜電 性質(zhì)的氨基酸序列基元。
用于ELBL的多肽的二級結(jié)構(gòu)也是重要的，因為薄膜的物理性 質(zhì)，包括它的穩(wěn)定性，將取決于肽的溶液結(jié)構(gòu)如何轉(zhuǎn)變?yōu)樗诒∧?中的結(jié)構(gòu)。圖ll描述了某些多肽的溶液結(jié)構(gòu)如何與薄膜組裝相關(guān)。 (a)顯示了聚L-谷氨酸和聚L-賴氨酸的組裝行為是如何依賴pH 的。明顯的，a-螺旋構(gòu)型與沉積材料的相關(guān)程度高于3-折疊構(gòu)型。 這一行為的精確的分子解釋有待闡明。(b)表示這些肽的溶液結(jié)構(gòu) 是如何依賴pH的。在pH4.2下，聚L-谷氨酸大多是ct-螺旋，與聚 L-賴氨酸在pH 10.5下相同。兩種多肽在pH7.3下都是大多為無結(jié) 構(gòu)的線團(tuán)狀構(gòu)型。
余下的關(guān)注涉及多肽薄膜的應(yīng)用。在實施本發(fā)明中，將根據(jù)特 定應(yīng)用的設(shè)計要求或多或少的將權(quán)重放在這些其他關(guān)注上。通過使 用本發(fā)明的選擇方法以在氨基酸序列信息中識別具有適當(dāng)?shù)碾姾商?征的氨基酸序列基元并利用其他設(shè)計關(guān)注以選擇特定基序，能夠設(shè) 計應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和其他領(lǐng)域的適合于ELBL制造的納米結(jié)構(gòu)薄膜的 多肽?；蛘?，可以使用本發(fā)明的方法重新設(shè)計用于在ELBL中使用的 多肽。所述重新設(shè)計的方法基本上與在現(xiàn)有氨基酸序列信息中識別 基序的方法相同，除了-氨基酸序列基元中每個殘基是由實施^v員選 定而非在特定生物體的基因組或蛋白組信息中識別的完整基序。必 須強調(diào)的是，關(guān)于新生多肽的設(shè)計，本發(fā)明所舉出的基本的多肽設(shè) 計原則不依賴于所涉及的氨基酸是否為20種天然存在的氨基酸、非 天然氨基酸或它們的一些新型組合。而且，D-氨基酸和L-氨基酸都 能夠被使用。本發(fā)明的設(shè)計關(guān)注在下面更詳細(xì)的討論。1.靜電學(xué)
我們已經(jīng)設(shè)計了用于在氨基酸序列信息中識別具有適合用于
ELBL的靜電性質(zhì)的氨基酸序列基元的方法。使用該方法，我們已經(jīng)
在人類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)一編碼人體中所有已知蛋白質(zhì)的基因組的蛋白
質(zhì)翻譯一中識別了 88315個非多余氨基酸序列基元。在其他地方， 該信息可在美國國立生物技術(shù)信息中心(〃NCBI〃)網(wǎng) 站http:〃ww. ncbi. nlm. nih. gov公開獲得。這類信息隨人類基因 組的進(jìn)一步分析而被經(jīng)常更新。隨著這類信息的增加，在人類序列 信息中通過本發(fā)明的選擇方法能夠被識別為具有用于ELBL的適當(dāng)?shù)?靜電性質(zhì)的氨基酸序列基元的數(shù)目也將增加。對于任何生物體而言 都是同樣的。被接受的生化和物理學(xué)原理以及下面描述的實驗結(jié)果 表明，被識別的序列基元將對于用于ELBL結(jié)構(gòu)的納米制造的多肽的 設(shè)計是有用的。
關(guān)鍵的選擇標(biāo)準(zhǔn)是在中性pH (pH7，接近人類血液的pH)下每 單位長度的平均電荷。另外，有幾個結(jié)構(gòu)的優(yōu)選。首先，優(yōu)選的是 每個氨基酸序列基元由僅7個殘基組成。'
a.基序中殘基的總數(shù)
在優(yōu)化生物相容性、物理結(jié)構(gòu)和非多余序列基元數(shù)目的努力 中，長度為7的基序在可獲得的氨基酸序列數(shù)據(jù)中被選擇。如下討 論的，優(yōu)選地，在每個序列基元中至少半數(shù)氨基酸殘基是荷電的。 而且，優(yōu)選地，在每個基序中的所有荷電殘基是相同的電荷。這些 要求保證每個基序可充分溶解于含水溶劑并在中性pH下具有足以用 于ELBL的電荷。因為只有相對小百分比的氨基酸類型是荷電的，隨
著給定氨基酸序歹l」長度的增加而機(jī)率下降，所述序列將具有足夠比 例的適當(dāng)?shù)睾呻姷陌被嵊糜贓LBL。對于長度為7的基序，4個荷
電氨基酸是優(yōu)選的最小量，因為少于4個電荷產(chǎn)生嚴(yán)重下降的肽溶 解度和下降的對ELBL的控制。
關(guān)于生物相容性'(下面進(jìn)一步討論)，每個被識別的序列基元 是足夠長的以在7個殘基上構(gòu)成連續(xù)表位(相關(guān)于設(shè)計的肽可能被引入其中的生物體的可能的免疫應(yīng)答)，但不是長至完全符合在蛋 白質(zhì)表面上和其內(nèi)部的殘基；電荷要求幫助確保序列基元在折疊蛋 白質(zhì)的表面出現(xiàn)；荷電殘基不能形成于折疊蛋白的核心。相反，非 常短的基序可能對于機(jī)體而言是隨機(jī)的序列或者非特別"自我"的 序列，并因此引發(fā)免疫應(yīng)答。盡管用于生成抗體的肽的理想長度是 一些爭論點，但大部分肽抗原的長度范圍從12至16個殘基。9個殘 基或更短的肽可以是有效的抗原；長于12或16個氨基酸的肽可以 含有多個表位(Angeletti， R. H. (1999) Design of Useful P印tide Antigens, / A'om 7.化c力.10:2-10，其因此通過引用整體并入 本文)。因此，為最小化抗原性，可以優(yōu)選短于12以和更好的短于9 個殘基的肽。
優(yōu)選的基序不應(yīng)該太長的另外一個原因為最小化二級結(jié)構(gòu)的 形成。二級結(jié)構(gòu)降低了多肽(見下文)和由它們制成的薄膜的物理 結(jié)構(gòu)的控制。
而且，當(dāng)每個基序的殘基數(shù)目為7時發(fā)現(xiàn)了最大數(shù)目的非多余 基序。圖6顯示了在可獲得的人類氨基酸序列信息中的非多余基序 的數(shù)目。陽性基序的最大數(shù)目是對于5個氨基酸長度，而陰性基序 的最大數(shù)目是對于7個殘基長度。陽性和陰性基序的最大數(shù)目對于5 和7是大約相同的。因此，7個殘基的基序長度似乎將最大化非多余 基序的數(shù)目。
由于所有的上述原因，7個殘基是以優(yōu)化用于ELBL的多肽設(shè)計 的優(yōu)選的基序長度。然而，有可能在一些情況下，稍微更短的或稍 微更長的基序也將同樣起作用。例如，可以采用5或6個殘基長度 的基序，而長度處于8-15個殘基級別的基序也可能是有效的。
b.荷電殘基的數(shù)目
第二，優(yōu)選地至少4個荷正電的(堿性的)氨基酸(Arg、 His 或Lys)或至少4個荷負(fù)電的(酸性的)氨基酸(Glu或Asp)在中性 pH下存在于每個7殘基的基序中。在致力于保證中性pH下足夠高的 電荷密度時，不贊成正電荷和負(fù)電荷的組合。然而，同時含有陽性氨基酸和陰性氨基酸的基序可能用于ELBL。例如，稍微更長的(討
論9個殘基)基序可以具有6個荷正電的氨基酸和1個荷負(fù)電的氨 基酸。重要的是電荷之差一整個肽必須在中性pH下是或者足夠荷正 電或足夠荷負(fù)電的。然而，所述基序的優(yōu)選的實施方案將只含有Glu 或Asp或者只含有Arg、 His或Lys作為荷電氮基酸(盡管其他非荷 電氨基酸可能并且通常是形成基序的部分)，除非非天然氨基酸被 允許作為酸性或堿性氨基酸。
圖5是顯示在用于識別具有適當(dāng)?shù)撵o電性質(zhì)的氨基酸序列的選 擇過程中所涉及的步驟的流程圖。假定只有20種普通氮基酸被涉 及。如果尋找荷負(fù)電的基序，所述過程從定位序列數(shù)據(jù)中的氨基酸 開始。該氨基酸將被稱為"起始氨基酸"，因為它是用于分析周圍 氨基酸的起始點(即，它將開始所述基序)。接下來，對起始氨基 酸和隨后6個殘基檢査Arg、 His或Lys的出現(xiàn)。如果一個或多個 Arg、 His或L,ys位于這7個氨基酸中，該過程在另一個起始氨基酸 重新開始。如果沒有發(fā)現(xiàn)Arg、 His或Lys，對這7個氨基酸檢查以 確定Glu禾卩/或Asp出現(xiàn)的數(shù)目。如果Glu和/或Asp在這7個殘基 中出現(xiàn)至少4次，則該序列基序被編入目錄。所述選擇過程對荷正 電的氨基酸基本相同，除了分別地Glu和Asp被Arg、 His和Lys所 取代以及Lys被Glu和A印所取代之外。顯然，也可以在氨基酸序 列的起始端(氨基末端)開始該方法并進(jìn)行至結(jié)束端(羧基末端)， 或者，可選地，可以在隨機(jī)位點開始并隨機(jī)地或者系統(tǒng)地以任一方 向完成序列中所有的氨基酸。而且，可以使用該方法來識別序列信 息中含有非天然氨基酸的基序，例如，如果密碼子被用來代表各非 天然氨基酸類型。在這種情況下，可以搜尋分別代替Glu和Asp以 及Arg、 His和Lys的非天然的酸性或堿性氨基酸。
其余的設(shè)計關(guān)注，即物理結(jié)構(gòu)、物理穩(wěn)定性、生物相容性和生 物功能性，主要涉及將使用設(shè)計的多肽的特定應(yīng)用。如上所述，將 根據(jù)特定應(yīng)用所需的肽性質(zhì)在設(shè)計過程中或多或少地權(quán)衡這些關(guān) 注。2.物理結(jié)構(gòu)
關(guān)于氨基酸序列基元的一個設(shè)計關(guān)注是它們形成二級結(jié)構(gòu)的傾 向性，特別是a-螺旋或P-折疊。我們已經(jīng)在幾個途徑尋求控制、 顯著最小化所設(shè)計的多肽在含水介質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)，以最大化對薄 膜層制造的控制。首先，優(yōu)選地所述序列基序是相對短的，因為長 基序更容易在溶液中采用穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。第二，我們在多肽設(shè)計 的優(yōu)選實施方案中的每個基序之間設(shè)置了甘氮酸殘基。甘氨酸具有 非常低的a -螺旋傾向性和非常低的3 -折疊傾向性，使其積極地非 常不利于甘氨酸和其鄰近氨基酸在水溶液中形成規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)。 脯氨酸在一些方面具有類似的性質(zhì)并能夠作為甘氨酸的替代物被用 來連接基序。第三，我們已經(jīng)尋求最小化所設(shè)計的多肽自身的a-螺 旋或e -折疊傾向性，通過關(guān)注累積a -螺旋傾向性小于7. 5和累積 0 -折疊傾向性小于8的基序f累積"傾向性表示基序中所有氨基酸 的a-螺旋或e-折疊傾向性的總和)。然而，在一些情況下，具有高 幾分的累積a -螺旋傾向性和/或0 -折疊傾向性的氮基酸序列將可 能適合用于ELBL，因為基序間的Gly (或Pro)殘基將在抑制穩(wěn)定的 二級結(jié)構(gòu)在所設(shè)計的多肽形成中起關(guān)鍵作用。
事實上，在某些應(yīng)用中可能希望多肽的傾向性以形成相對高級 的二級結(jié)構(gòu)作為薄膜制造的特殊設(shè)計特征;如上所述，依然必須滿足 對ELBL的必要的靜電電荷要求。為了能夠選擇具有所需二級結(jié)構(gòu)傾 向性的氨基酸序列我們首先使用Chou和Fasman的方法(見P. Chou 和G. Fasman歷oc力e組'^jy 13:211 (1974)，其全部內(nèi)容通過引用 并入本文)為全部20個氨基酸計算了二級結(jié)構(gòu)傾向性，利用來自超 過1800個高分辨率的X射線晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)信息(1334個含有a -螺旋和1221含有3折疊股(e-strands))。結(jié)構(gòu)選自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù) 庫(Protein DataBank，公共可獲得的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫)，基于(a) 結(jié)構(gòu)測定方法(X-射線衍射)；(b)分辨率(好于2.0 A)—這里的"分 辨率"指如在Rayleigh標(biāo)準(zhǔn)中能夠分辨的最小尺寸；和(c)結(jié)構(gòu)多樣 性(被用來計算各種氨基酸的螺旋和折疊傾向性的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)之間少于50%的序列同一性)。其原理是選擇由最可靠的方法學(xué)所確 定的高分辨率結(jié)構(gòu)并通過具有相似結(jié)構(gòu)而不偏移傾向性計算。接下 來，使用個人計算機(jī)中的隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器生成100000個非多余性隨
機(jī)序列用于比較。然后，我們計算了使用上面VII(B)(1)部分中描述 的選擇方法所識別的88315個氨基酸序列(59385個非多余性堿性序 列基元和28930個非多余性酸性序列基元)的二級結(jié)構(gòu)傾向性。然 后將所述隨機(jī)序列的傾向性與所選擇的序列的傾向性進(jìn)行比較。圖2 顯示了在這些序列基元中的二級結(jié)構(gòu)形成的分布。圖2中的矩形突 出了我們已經(jīng)識別為最小限度可能形成基于二級結(jié)構(gòu)傾向性的二級 結(jié)構(gòu)的序列基元。
3.物理穩(wěn)定性
另外一個設(shè)計關(guān)注是多肽ELBL薄膜的穩(wěn)定性的控制。離子鍵、 氫鍵、范德華(vanderWaals)相互作用和疏水性相互作用為ELBL 薄膜提供了一些盡管相對有限的穩(wěn)定性。相反，共價的二硫鍵可以 提供特殊的結(jié)構(gòu)強度。我們已經(jīng)設(shè)計了使用半胱氨酸(或一些其他 類型的含巰基氨基酸)來"鎖定"和"解鎖"相鄰的ELBL薄膜多肽 層的新型方法。該方法使多肽納米制造的薄膜能夠在極端pH下保持 穩(wěn)定，產(chǎn)生對其機(jī)械穩(wěn)定性和擴(kuò)散性質(zhì)的較強控制(關(guān)于由非多肽 聚合電解質(zhì)制成的多層薄膜的多孔性的討論，參見Caruso， F.， Niikura， K. ， Furlong, N. and 0kahata (1997) Zs收扁'rl3:3427 以及Caruso， F. ， Furlong, N. ， Ariga， K. ， Ichinose， L禾口 Kunitake， T. (1998) Z朋^M/ir 14:4559，兩者在這里都通過引用整體并入本 文)。而且，在所設(shè)計的多肽的序列基元中整合入半胱氨酸(或一些 其他類型的含巰基氨基酸)實現(xiàn)了相對短的肽在薄膜制造中的使 用，由于分子間二硫鍵的形成。沒有半胱氨酸，這種肽一般不能生 成足夠穩(wěn)定的薄膜(見圖12，如下討論)。因此，我們新穎的半胱氨 酸的使用將避免需要在大部分可能的應(yīng)用中生成昂貴的長類型的設(shè) 計的多肽。這將特別有利于要在被包裹的材料上制造薄膜的情況， 所述材料如小的藥物晶體、小球狀的血紅蛋白晶體或含有血紅蛋白的溶液。對于其中薄膜物理穩(wěn)定性是重要的應(yīng)用，含有半胱氨酸(或 一些其他類型的含巰基氨基酸)的氨基酸序列基元可以選自使用上 述方法識別的基序文庫，或者使用上述原理進(jìn)行重新設(shè)計。然后， 能夠根據(jù)所選自或設(shè)計的氨基酸序列基元設(shè)計并形成多肽。 一旦多 肽被化學(xué)合成或在宿主生物體中生成，則在還原劑存在完成含有半 胱氨酸的肽的ELBL組裝，以防止過早的二硫鍵形成。緊接著組裝， 還原劑被去除并加入氧化劑。在氧化劑存在下，半胱氨酸殘基之間 形成二硫鍵，從而一起"鎖定"含有它們的多肽層。
該"鎖定"方法可以使用下面的特定的微囊制造的例子來進(jìn)一 步描述。首先，含有半胱氨酸的設(shè)計的多肽被用來在適當(dāng)荷電的球
形表面上通過ELBL制造多層，正常在中性pH下并含有二硫蘇糖醇 ("DTT")(—種還原劑)的水溶液中。接下來，通過過濾、滲濾或其 他現(xiàn)有技術(shù)中已知的類似方法去除DTT，引起胱氨酸形成配對的半胱 氨酸側(cè)鏈并從而穩(wěn)定薄膜。如果肽多層被構(gòu)建在含有希望包裹的物 質(zhì)(例如晶狀體物質(zhì))的核心顆粒上，所述制造過程是完全的并且 能夠隨后使所述核心顆粒在被包裹的環(huán)境中溶解，例如通過pH的改 變。然而，如果所述多層被構(gòu)建在"對照劑"核心顆粒上，則所述 核心必須被去除。當(dāng)例如三聚氰胺甲醛顆粒("MF〃)時， 一般通過降 低pH溶解核心一溶解是酸催化的。隨著核心的溶解，溶液的pH被 調(diào)至4其中肽多聚陰離子上的部分電荷使微囊可半滲透的(compare Lvov等人(2001) Ze"ez^ 1: 125，其由此整體并入本文)。
接下來，lOmM的DTT被加至微囊溶液以減少胱氨酸至半胱氨酸。然 后微囊可以被"裝填"，通過將它們轉(zhuǎn)移至將要被包裹的材料的濃 縮溶液，例如，蛋白質(zhì)(ibid)。所述蛋白質(zhì)通過移下其濃度梯度而 進(jìn)入微囊。微囊化的蛋白質(zhì)通過去除還原劑和加入氧化劑而被"禁 閉"，從而促進(jìn)二硫鍵的形成。
本發(fā)明的半胱氨酸"鎖定"和"解鎖"的方法示意圖在圖4中 顯示。半胱氨酸能夠同時形成分子內(nèi)和分子間的二硫鍵。進(jìn)一步的，二硫鍵能夠在同一層或相鄰層中的分子間形成，取決于薄膜中含有 半胱氨酸的肽的位置。
參考圖4 (a)，堿性多肽2通過二硫鍵3在其中堿性肽含有半 胱氨酸的所有層中連接。插入層(圖中由半透明層4表示)的酸性 肽不含半胱氨酸。然而，如果酸性和堿性側(cè)鏈在周圍環(huán)境的pH下荷 電，則交替層繼續(xù)靜電相互吸引。參考圖4(b)， 二硫鍵在層間顯示。 這種結(jié)構(gòu)將在用于ELBL的酸性和堿性多肽(即交替層)同時含有半 胱氨酸并且所使用的方法已經(jīng)適合于二硫鍵形成的時候形成。參考 圖4(c)，還原和氧化反應(yīng)通過分別斷裂和形成二硫鍵3被用來調(diào)節(jié) 被包裹的化合物5的釋放，并從而調(diào)節(jié)顆粒通過囊壁的擴(kuò)散。
半胱氨酸"鎖定"和"解鎖"是調(diào)節(jié)ELBL薄膜結(jié)構(gòu)完整性和滲 透性的新穎方法?，F(xiàn)有技術(shù)已知戊二醛能夠被用來交聯(lián)蛋白質(zhì)，這 種化學(xué)物質(zhì)因此能夠被用來穩(wěn)定多肽薄膜。然而，戊二醛交聯(lián)是不 可逆的。相反，本發(fā)明的半胱氨酸"鎖定"和"解鎖"方法是可逆 的并因此提供了對結(jié)構(gòu)形成更好的控制，并且重要的是提供了能夠 使用本發(fā)明方法制造的薄膜和膠囊的應(yīng)用。血液是一種氧化環(huán)境。 因此，在某一生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，例如由設(shè)計的多肽所制造的人工紅 細(xì)胞或給藥系統(tǒng)，在二硫鍵形成后將Cys-交聯(lián)的多肽薄膜暴露于血 液或一些其他氧化環(huán)境不預(yù)期引起這些鍵的斷裂。最后，還應(yīng)該注 意，涉及非天然氨基酸的應(yīng)用將使用一些其他的含巰基氨基酸類型 取代Cys。例如，巰基能夠被加至P-氨基酸，如D，L-后-環(huán)己基丙酸；D，L-3-氨基丁酸；或5-(甲基硫)-3-氨基戊炔酸(見 http:〃www. synthatex. com)。
4.生物相容性
生物相容性是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的主要設(shè)計關(guān)注。在這類應(yīng)用 中，本發(fā)明的實施者將旨在識別會產(chǎn)生"免疫惰性"多肽的基因組 或蛋白組信息，特別是如果形成或包裹的對象將與循環(huán)血液接觸。 為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選地VII(B) (l)部分中討論的選自過程被用來分析血液蛋白的氨基酸序列。這將使最小化生物體免疫反應(yīng)的機(jī)率 最大化。
存在用于預(yù)測氨基酸序列抗原性的計算機(jī)算法。然而，這類方 法在現(xiàn)有技術(shù)中已知為至多是半可靠的。在本發(fā)明中，使用上面 VII (B) (l)部分中討論的選擇方法所識別的序列基元是高極性的。因 此，所述基元必須出現(xiàn)在天然狀態(tài)蛋白質(zhì)的表面，其中基元是所述 蛋白質(zhì)的部分。"表面"是折疊蛋白質(zhì)與溶劑相接觸的部分或因為 水的粒狀性質(zhì)而難以獨自接近溶劑的部分。"內(nèi)部"是折疊蛋白質(zhì) 因任何其他原因而難以接近溶劑的部分。折疊的球狀可溶性蛋白類 似有機(jī)晶體，內(nèi)部被稠密地包裹如在晶格中而外部與溶劑水相接 觸。因為它們的電荷性質(zhì)，使用本發(fā)明方法識別的多肽序列基元必 須主要(如果不是唯一地)發(fā)生在蛋白質(zhì)表面上。因此，當(dāng)所述蛋 白質(zhì)在血液中時，使用本發(fā)明的選擇方法在人類血液蛋白中識別的 所有序列基元總是與免疫系統(tǒng)有效地接觸。這適用于可以在血液中 數(shù)目增加的蛋白質(zhì)的所有構(gòu)型，包括變性狀態(tài)，因為這高度積極不 利于傳遞電荷從水介質(zhì)至低價電解質(zhì)(如存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部)。因 此，被接受的生化原理表明，使用本發(fā)明方法從血液蛋白設(shè)計的多 肽或者不會引發(fā)免疫應(yīng)答或者引發(fā)最低限度的免疫應(yīng)答。同樣的原 因，使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽應(yīng)該是可生物相容的。不僅是血液 蛋白中的那些，使用本發(fā)明的選擇方法從基因組數(shù)據(jù)中識別的所有 序列基元都應(yīng)該是可生物相容的，盡管免疫應(yīng)答或任何其他類型的 生物反應(yīng)的程度很可能依賴于序列基元的特定細(xì)節(jié)(因為基序所基 于的多肽序列實際存在于所述薄膜為之制造的生物體中，這種方法 將至少原則上同樣適合用于任何類型的生物體。例如，該方法可以 對獸醫(yī)科學(xué)具有重要價值)。免疫反應(yīng)和生物相容性對設(shè)計的肽在 生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的用途都是重要的，包括但不限于生產(chǎn)人工紅細(xì) 胞、給藥系統(tǒng)或用于制造生物相容性薄膜以包裹用于長期或短期引 入生物體的植入物的多肽。
5.生物活性在多肽薄膜、涂層或微囊的一些應(yīng)用中，可能想要調(diào)整多肽的 設(shè)計來包括用于某一結(jié)構(gòu)層(通常是最外層)的功能性結(jié)構(gòu)域。這 里的功能性結(jié)構(gòu)域是具有特定生物功能性(例如結(jié)合磷酸酪氯酸) 的蛋白質(zhì)的獨立地?zé)岱€(wěn)定區(qū)域?，F(xiàn)有技術(shù)中已知這種生物功能性可 以與多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)中的其他功能性整合，例如在張力蛋白中，其 包括磷酸酪氮酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域。在設(shè)計 的多肽中包括這種結(jié)構(gòu)域可以許多方式行使功能，包括但不限于特 異性配體結(jié)合、細(xì)胞內(nèi)靶向、生物傳感或生物催化。
C.使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽的用途
如上所述，適當(dāng)?shù)脑O(shè)計的多肽是用于ELBL的優(yōu)良材料，使用 ELBL制造的多肽薄膜結(jié)構(gòu)將有用于許多不同類型的應(yīng)用。使用本發(fā) 明方法設(shè)計的多肽已經(jīng)表明有用于薄膜結(jié)構(gòu)的ELBL，用于在生物醫(yī) 學(xué)技術(shù)、食品技術(shù)和環(huán)境技術(shù)中可能的應(yīng)用。例如，這種多肽能夠 被用來制造人工紅細(xì)胞。
1.人工紅細(xì)胞
許多不同的方法已經(jīng)被用于紅細(xì)胞替代物的開發(fā)。 一種方法涉 及全氟化碳的使用。全氟化碳乳劑包含能夠結(jié)合氧并傳遞它至組織 的合成的氟代烴。然而，該方法增加了網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞阻斷。全氟化 碳能夠在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中被捕捉，其可以導(dǎo)致不利后果。另外一種 方法關(guān)注于抗原偽裝，.其涉及使用被稱為聚乙二醇(PEG)的生物相 容性聚合物來包裹紅細(xì)脫PEG分子在所述細(xì)胞表面形成永久的共價 鍵，以便血液受體的抗體不將所述細(xì)胞識別為異質(zhì)的。例如，具有A 型血液的正常人的免疫系統(tǒng)將天然地具有識別B型紅細(xì)胞表面抗原 的抗體，導(dǎo)致細(xì)胞破壞。PEG與B型紅細(xì)胞表面的連接"偽裝"了細(xì) 胞的表面，以便它的表面抗原不能再被免疫系統(tǒng)識別且抗原性的異 質(zhì)紅細(xì)胞將不會被迅速摧毀(參見Pargaonkar， N. A. ， G. Sharma 禾口 K. K. Vistakula. (2001) "Artificial Blood: Current Research R印ort"，其由此通過引用被整體并入本文)。包括珠蛋白生成障礙性貧血在內(nèi)的需要重復(fù)的血液輸入的許多 疾病常常并發(fā)于針對"較小"紅細(xì)胞抗原的抗體的發(fā)展。該"同種 致敏"能夠致使這些患者幾乎不可能輸血，致使威脅生命的境地。 在體外測試中，PEG修飾的紅細(xì)胞表現(xiàn)出不觸發(fā)同種致敏并還可能有
用于同種致敏已經(jīng)發(fā)生的臨床表現(xiàn)(見Scott， M.D.等人(1997) 〃Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes, 〃 Z^roc. Jcad 6bZ USA. 94 (14): 7566—7571，
其由此通過引用整體并入本文)。
其他方法涉及純化的血紅蛋白。未經(jīng)修飾的無細(xì)胞的血紅蛋白 具有已知的局限性。這些包括對于有效的組織氧合作用而言過高的 氧親和力、對于臨床有效而言過短的血管內(nèi)腔中的半衰期和經(jīng)歷結(jié) 果為腎臟管狀損傷和毒性的分解成二聚體的趨勢。因為這些局限 性，被用來制備無細(xì)胞的紅細(xì)胞替代物的血紅蛋白必須被修飾。許 多修飾技術(shù)己經(jīng)被開發(fā)。血紅蛋白能夠使用如戊二醛的試劑被交聯(lián) (通過化學(xué)修飾形成兩個分子間的共價鍵)并聚合。這種修飾導(dǎo)致 Ps。(所有氧合位點的50%被占有吋的氧分壓)比正常血紅蛋白高的產(chǎn) 物并增加血槳半衰期至30小時。用于此目的的血紅蛋白的來源可以 是人類(過時的捐贈血液)、牛或人類重組體。經(jīng)修飾的血紅蛋白 的溶液從高度純化的血紅蛋白制備并通過各種生化過程提取以清除 磷脂、內(nèi)毒素和病毒污染物(見Nester， T.和Simpson, M (2000) "Transfusion medicine update, 〃 j57c (9t/ 5"z/力5"Z^zY〃fe51， 其由]t匕通 過引用整體并入本文)。Biopure公司(Cambridge, MA)已經(jīng)使用修飾 的血紅蛋白用于他們的產(chǎn)品Hemopure。
修飾的血紅蛋白溶液的主要的潛在不良作用是全身和肺循環(huán)血 管阻力的增加，其可以導(dǎo)致心臟指數(shù)的降低。心臟指數(shù)的降低可以 損害最佳的氧傳遞并超過氧運送溶液的優(yōu)點(見Kasper S. M.等人. (1998) 〃The effects of increased doses of bovine hemoglobin on hemodynamics and oxygen transport in patients undergoing preoperative hemodilution for elective abdominal aorticsurgery, 〃 j/ e5^力.勘s^: 87: 284-91 ，其由此通過引用整體并 入本文)。 一項研究已經(jīng)檢驗了這些溶液在不穩(wěn)定床上患者的急性復(fù) 蘇相中的效用。然而，研究的設(shè)計是差的，且溶液在影響最終患者 結(jié)果中的任何作用是不清楚的(見Koenigsberg D.等人.(1999) 〃The efficacy trial of diaspirin cross-linked hemoglobin in the treatment of severe traumatic hemorrhagic shock, 〃 Jcsd ^zzerg 6: 379-80，其由此通過引用整體并入本文)。
無細(xì)胞的血紅蛋白的許多問題可以通過使用人工膜包裹它而被 克服。脂質(zhì)體正在被用來包裹作為血液替代物而使用的血紅蛋白。 該方法在技術(shù)上是具挑戰(zhàn)性的，因為不僅必須血紅蛋白被制備，而 且它必須以相對高的濃度和收率被包裹。最終產(chǎn)物必須是無菌的并 且脂質(zhì)體必須在尺寸上相對均一。
包裹的血紅蛋白比無細(xì)胞的血紅蛋白具有幾個優(yōu)點。首先，人 工細(xì)胞膜保護(hù)血紅蛋白免受血漿中的降解和氧化力。第二，所述膜 保護(hù)脈管內(nèi)皮免受血紅蛋白的毒性作用。這些作用涉及亞鐵血紅素 的丟失、02游離基的生成和恥結(jié)合的血管收縮作用。第三，包裹大 大增加了血紅蛋白的循環(huán)持續(xù)性。而且，包裹的血紅蛋白能夠被冷 凍干燥用于方便儲存。
脂質(zhì)體包裹涉及磷脂，如在細(xì)胞膜中的磷脂。然而與脂質(zhì)體包 裹相關(guān)的一個主要問題是很難調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的平均尺寸和分布。另一 個問題是不像紅細(xì)胞，脂質(zhì)體通常是非常不穩(wěn)定的，由于他們通常 缺乏有組織的細(xì)胞骨架。而另外一個問題是脂質(zhì)體通常由磷脂的多 層組成(近期關(guān)于血液替代物發(fā)展的綜述出現(xiàn)于Stowell等人(2001) Progress in the development of RBC substitutes, 7ys/ s/k io; 41:287-299，其由此通過引用整體并入本文。還參見Chang， T. 1998 "Modified hemoglobin- based blood substitutes: cross linked, recombinant and encapsulated hemoglobin" ， Art//i"'sJ Ce7_Z 6"，p7 2:233-41，其由此通過引用整體并入本文)。采用了使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽的紅細(xì)胞替代物相對于現(xiàn)有 技術(shù)中已知的紅細(xì)胞替代物開發(fā)方法應(yīng)提供幾個優(yōu)點，包括但不限 于優(yōu)良的氧和二氧化碳結(jié)合功能性、較低的生產(chǎn)成本(大規(guī)模并因 此低成本的生產(chǎn)是可能的，因為細(xì)菌可以被用來大量生產(chǎn)肽并因為
肽ELBL能夠被自動化)、使用適當(dāng)?shù)难t蛋白制備方法作為ELBL 模板的可能性、多肽的生物可降解性、基于血液蛋白結(jié)構(gòu)的設(shè)計的 多肽的免疫"惰性"和設(shè)計的多肽薄膜所展現(xiàn)的超越脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定性。多肽ELBL組裝生成了半多孔薄膜，最小化了形成包裹方法 和使葡萄糖、氧、二氧化碳和各種代謝產(chǎn)物能夠通過作為脂雙層的 薄膜自由擴(kuò)散所需的材料量。相反，可能適合此目的的其他聚合物 具有不想要的不良作用一例如，多乳酸化合物降解成乳酸、導(dǎo)致肌 肉痛性痙攣的物質(zhì)和聚(苯乙烯磺酸)不是生物相容性的。
微囊可以由設(shè)計的多肽制造以包括血紅蛋白來作為紅細(xì)胞替代 物。血紅蛋白多肽微囊還可以被設(shè)計以包括酶，包括通常對紅細(xì)胞 功能是重要的超氧化物岐化酶、催化酶和高鐵血紅蛋白還原酶。而 且，納米制造的微囊可以被預(yù)測性地脫水，表明如這里描述制成的 人工紅細(xì)胞可以被脫水而無功能損失，特別因為血紅蛋白可以被低 壓凍干(即冷凍干燥)并被重新溶解而無功能損失，且聚離子薄膜 對于脫水作用是穩(wěn)定的。這對長期儲存、血液替代物運輸、戰(zhàn)場應(yīng) 用(特別是在遠(yuǎn)的地方)和空間探索是重要的。
使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽還能用于藥物遞送。
2.藥物遞送
"晶體"形式的適當(dāng)?shù)闹委熜晕镔|(zhì)的微米大小的"核心"可以 被設(shè)計的多肽包裹，生成的微囊可以用于藥物遞送。所述核心必須 在某些條件下(例如高pH或低溫)是不溶的并在某些條件下(其中 將出現(xiàn)控制釋放)是可溶的。晶體上的表面電荷可以通過C電勢測 量(用于測定液體介質(zhì)中膠體顆粒上靜電單元中的電荷)來測定。 微囊內(nèi)含物從微囊內(nèi)部釋放至外周環(huán)境的速率將取決于許多因素， 包括包裹外殼的厚度、外殼中使用的多肽、二硫鍵的存在、肽的交聯(lián)程度、溫度、離子強度和用來組裝肽的方法。通常，膠囊越厚， 釋放時間越長一原理類似于凝膠過濾色譜。已經(jīng)做了一些關(guān)于從
ELBL微囊緩釋釋放的工作(見Antipov， A. ， Sukhorukov， G. B.， Donath， E.和Miihwald， H. (2001),尸Ars. B， 105:2281-2284
禾口 Freemantle， M. (2002) Polyelectrolyte multilayers, C力e瓜 f/^. #e^， 80: 44-48，兩者在這里通過引用整體并入本文)。已經(jīng) 被使用的聚合電解質(zhì)是PSS、 PAH、 PAA、 PVS、 PEI和PDDA。使用本 發(fā)明方法設(shè)計的多肽應(yīng)該提供許多有關(guān)藥物遞送方面的優(yōu)點，包括 但不限于對微囊的物理、化學(xué)和生物學(xué)特征的控制；制備直徑小 于lmm的膠囊的能力，使膠囊適合于注射；引發(fā)免疫應(yīng)答的低的可 能性；膠囊的普遍高的生物相容性；如下所述通過改變所述層的厚 度和使用半胱氨酸對微囊擴(kuò)散性質(zhì)的控制；通過使用半胱氨酸(如 現(xiàn)有技術(shù)中已知的，游離巰基基團(tuán)、游離氨基基團(tuán)和游離羧基基團(tuán) 是用于特異性靶向的分子可以被連接的位點)中高反應(yīng)性的巰基基 團(tuán)修飾微囊表面或者通過在多肽設(shè)計中包括特異功能性結(jié)構(gòu)域來耙 向特定位點的能力；和微囊被細(xì)胞利用內(nèi)吞或胞飲而吸收的能力。
使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽還能用于抗微生物涂層。
3. 抗微生物涂層
本發(fā)明的方法能夠用來生產(chǎn)包括抗微生物肽的薄膜。例如，一 種適當(dāng)?shù)男蛄锌梢允谴嬖谟谌祟愔械母唤M蛋白5:
Asp Ser His Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr (SEQ ID NO: 8)。
在弱堿性pH下的正電荷優(yōu)勢使該序列非常適合于ELBL它可以 附加至使用本發(fā)明方法設(shè)計的肽，產(chǎn)生適合于在ELBL中使用的抗微 生物肽。該肽能夠被用作抗生物污垢涂層。例如，所述肽能夠被用 來在用于植入的裝置上形成涂層。
使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽還能在許多其他領(lǐng)域應(yīng)用。
4. 其他用途關(guān)于使用本發(fā)明方法設(shè)計的肽的其他可能的用途包括但不限于 食品蓋、包裝和分離層；食品箱、包、袋和標(biāo)簽；食品涂層；食品 成分微囊；藥物涂層、膠囊和微囊； 一次性食品供給商品(盤子、 杯子、刀叉餐具)；垃圾袋；用于肥料和殺蟲劑的水溶性袋；用于 肥料和殺蟲劑的微囊；農(nóng)業(yè)覆蓋物；紙涂層；釋放-充填包裝； 一次 性醫(yī)療產(chǎn)品難(如手套和大衣)；和一次性尿布。
D.制造
一旦氨基酸序列基元已經(jīng)從使用上面VII (B) (1)部分討論的方 法所識別的序列基元被選擇或者被重新設(shè)計，則使用現(xiàn)有技術(shù)中已 知的方法合成所設(shè)計的多肽，如使用固相合成和F-moc化學(xué)或異源 表達(dá)基因克隆和轉(zhuǎn)化。設(shè)計的多肽可以由肽合成公司(例如SynP印 公司(Dublin, California))合成，或者使用肽合成儀在實驗室生 成，或者通過重組方法生成。在一個實施方案中，設(shè)計的多肽由串 聯(lián)的單個氨基酸序列基元。在設(shè)計用于ELBL的多肽中，同樣的基序 可以被重復(fù)，或者不同的基序可以被連接。而且，如上所述，可以 包括功能性結(jié)構(gòu)域。其他不同于甘氨酸的氨基酸可以被用來連接序 列基元，不同于20種普通氨基酸的氨基酸可以被包括在基序本身 中，取決于多肽所需要的性質(zhì)。使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，其他 性質(zhì)同樣可以由設(shè)計要求所指定。例如，脯氨酸可以被包括用于轉(zhuǎn) 角形成，甘氨酸用于鏈靈活性，和組氨酸用于在接近中性pH下的pH 敏感的電荷性質(zhì)。"疏水性的"氨基酸也可以被包括一疏水性殘基 內(nèi)含物能夠在組裝行為中起作用并通過類似球形蛋白的疏水穩(wěn)定化 的方式促進(jìn)層的穩(wěn)定性。
雖然優(yōu)選的，制造的多肽有至少15個氨基酸長，但更優(yōu)選的， 制造的多肽至少有3.2個氨基酸長。此原因是，每分子的熵?fù)p失對于 短聚合物來說是如此在熱力學(xué)上不利的，以至于對荷相反電荷的表 面的吸附被抑制，即使多肽具有每單位長度1個電荷；長的聚合電 解質(zhì)比短的吸附更好。這在圖12中有所描述。被用于長度依賴性研 究的肽的平均分子量是1500--3000 M (聚L-谷氨酸， 〃小的〃)、3800Da(聚L-賴氨酸， 〃小的〃)、17000 Da(聚L-谷氨酸， 〃中的〃)、48100 Da (聚L-賴氨酸， 〃中的〃)、50300 Da (聚L-谷氨酸， 〃大的〃)和 222400 Da (聚L-賴氨酸， 〃大的〃)。圖12中顯示的數(shù)據(jù)清楚表明 ELBL依賴肽的長度。Cys的加入使相對小的肽能夠用于ELBL，因為 巰基基團(tuán)能夠被用來在多肽間形成二硫化物交聯(lián)。 E.實驗
1.實例1—基于人類血液蛋白序列的多肽的設(shè)計以及它們在多 肽薄膜制造中的應(yīng)用
為此工作，使用上面VII(B) (l)部分中描述的方法選擇氨基酸序 列以識別人類血液蛋白的一級結(jié)構(gòu)中的序列基元補體C3 (gi 1 68766)是陰離子序列基元的來源，而乳鐵傳遞蛋白(gi 14505043) 是陽性序列基元的來源。如上所討論的，血液蛋白序列被用來最小 化涉及所述多肽的裝置(包括，例如人工紅細(xì)胞)可能被引入其中的 患者的免疫應(yīng)答。原則上，該方法應(yīng)該可應(yīng)用于任何具有免疫系統(tǒng) 的生物體它不限于人類。多肽由SynP印公司(Dublin， California) 合成。所述多肽序列為
<formula>formula see original document page 31</formula>Tyr Arg Arg Arg Arg Ser Val Gin Gly Arg Arg Arg Arg Ser
Val Gin Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gin Gly Arg Arg Arg
Arg Ser Val Gin Gly Arg Arg Arg Arg Ser Gin Gly Arg
Arg Arg Arg Ser Val Gin (SEQ ID NO: 3)
氨基酸殘基由上述給定的三字母表示。 一個甘氨酸在各7殘基 基序之間被引入以抑制二級結(jié)構(gòu)的形成。甘氨酸被選擇用于此目 的，因為它允許在雙面角的結(jié)合中最大的可變性(見Ramachandran， G. N.禾口 Saisekharan， V. (1968)，疏伶。^'/ C力柳i^2r， 23:283, 其通過引用整體并入本文)并具有低螺旋傾向性(0. 677)和低折疊傾 向性(0.766)?；蛘?，根據(jù)計算的結(jié)構(gòu)傾向性脯氨酸可以取代基序間 的甘氨酸。另外，單個酪氨酸被包括在每個肽的N末端用于通過濃 度測定，通過在280nm處的UV吸收。
多肽被分別命名為SN1(SEQ ID NO: 2)、 SP2 (SEQ ID NO: 1)、 LN3(SEQ ID NO: 4)和LP4 (SEQ ID NO 3)，表示短陰性、短陽性、 長陰性和長陽性。這些序列非常不同于聚賴氨酸(一般在現(xiàn)有技術(shù) 中作為聚陽離子使用)和聚谷氨酸(一般在現(xiàn)有技術(shù)中作為聚陰離 子使用)，盡管其可商業(yè)獲得且不昂貴， 但其在溫和pH的條件下具 有高度a-螺旋傾向性且重要的是免疫反應(yīng)性的。在中性pH下，設(shè) 計的肽上計算的每單位長度的電荷對于SP和LP是0. 5靜電單位以 及對于SN和LN是0. 6靜電單位。陽性肽在某種程度上比陰性肽更 具疏水性，歸因于纈氨酸和精氨酸側(cè)鏈長烴的存在(如上所述，多 肽層間的疏水性相互作用能夠穩(wěn)定薄膜至一定程度)。所述長度與 已公開的研究一致，表明聚離子必須有大于20的荷電基團(tuán)(即天冬 氨酸和谷氨酸賴氨酸、精氨酸和組氨酸)以適合于ELBL(見Kabanov， V.和Zezin， A. (1984)尸wra^/ 7. 56:343和Kabanov， V.
(1994)尸Wy瓜5b7. 36: 143，兩者在這里通過引用整體并入本文)。
a.實驗說明
i.材料鍍銀的QCM電極(US工-System, Japan)具有在每側(cè)上的表面積 0.16 ± 0.01 cm2、共振頻率9 MHz (AT-cut)和長期穩(wěn)定性土2 Hz。 通過電噴射質(zhì)譜證實了多肽分子量。肽純度大于70 %。多肽緩沖液 為10 mM磷酸鈉或10 mM Tris-HCl， 1 mM DTT， 0. 1 mM疊氮化鈉，pH 7.4。所有不同于多肽的化學(xué)物質(zhì)均購自Sigma-Aldrich (USA)。
ii. 操作
使用成對的設(shè)計的多肽(一個陰性， 一個陽性)進(jìn)行實驗。使 用標(biāo)準(zhǔn)ELBL技術(shù)將由至少5個如上識別的SP2、 SN1、 LP4和LN3雙 層所組成的多層薄膜沉積在QCM共振器上(雙層由一層多聚陽離子 和一層多聚陰離子組成)。用于層吸附的多肽濃度是2 mg-Ml—1。已 知聚離子層的厚度對聚合電解質(zhì)濃度的依賴性不強(見Lvov, Y.和 Decher， G. (1994) frj^tsl/^; 39:628，其在這里通過引用
整體并入本文)；在O. 1-5 mg-M廣的濃度范圍內(nèi)，雙層厚度近乎獨 立于用于PSS/PAH的濃度。相反，多肽薄膜顯得比那些使用高分子 量PSS/PAH(使用利用已知的Sauerbrey方程的A/數(shù)據(jù)計算的質(zhì)量) 制造的薄膜厚度小很多；見Lvov， Y.和Decher，G. (1994) Crj^&"c^. 39:628。這緊隨根據(jù)沉積的質(zhì)量計算薄膜厚度，
如在現(xiàn)有技術(shù)中通常對蛋白質(zhì)所進(jìn)行的。圖3(c)中顯示的為設(shè)計的 多肽組裝所計算的厚度大于用于制造薄膜的肽的點對點長度。。DTT 以lmM被包括以抑制二硫鍵的形成。吸附時間為20分種。
在后續(xù)吸附循環(huán)之間共振器在純水中被沖洗1分種(去除大約 10-15%的弱吸附物質(zhì))并在N2氣流中干燥。然后，通過QCM直接測
量沉積肽的質(zhì)量。質(zhì)量測量包括一些水(盡管干燥)和低質(zhì)量離子 如K+、 Na+和CF。肽的相鄰層的部分相互滲透是很可能的(見Decher， G. (1997) ^cj.e/ ce 227:1232; Schmitt等人(1993) ifec2^/z oJec"7es 26:7058;和Korneev等人.(1995)腳幻'cs萬214:954);這對二硫 鍵"鎖定"效率可能是重要的。
iii. 結(jié)果在多肽吸附以及沖洗和干燥QCM共振器之后，測定共振器的共 振頻率。這實現(xiàn)了在吸附上的頻率轉(zhuǎn)換和在吸附質(zhì)量中的變化的計
算。頻率的降低表明吸附質(zhì)量的增加。結(jié)果在圖3 (a)和3 (b)中被 提供。圖3 (a)顯示了在不同緩沖液(10mM磷酸鈉，pH 7. 4， 1 mM DTT 和10 mM Tris-HC1， pH 7. 4， 1 mM DTT)中對LP4和LN3的吸附數(shù)據(jù) 的比較。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，顯然吸附數(shù)據(jù)更依賴于肽的性質(zhì)而非使用 的緩沖液的特定性質(zhì)。圖3(b)顯示了SP2、 SN1、 LP4和LN3的不同 組合(即SP2/SN1、 SP2/LN3、 LP4/SN1和LP4/LN3)在10mM磷酸鈉(pH 7.4和1 mM DTT)中的共振器頻率vs.吸收層(線只連接實驗數(shù)據(jù) 點)。如ELBL所要求的，這些組合的每一個都包括一個陽性多肽和 一個陰性多肽。圖3 (c)顯示了 SN1和LP4在10 mM Tris-HCl (pH 7. 4 和l mM DTT)中計算的吸附質(zhì)量vs.層數(shù)的圖(使用Sauerbrey方 程從實驗數(shù)據(jù)計算的)?？偽劫|(zhì)量(約5 lig)大致相當(dāng)于lnmol 的肽。用于此計算的方程是Am二一0.87 10—9A《其中m是質(zhì)量克， /是頻率Hz (見Lvov， Y. ， Ariga, K. ， Ichinose， L，禾口 Kunitake， T. (1995) / j瓜5bc. 117:6117和Sauerbrey, G. (1959) Z 155:206，兩者在這里通過引用并入本文)。薄膜厚度d
被估計為d 二一O. 016A/，其中d是nm(見Yuri Lvov， "Electrostatic Layer-by-Layer Assembly of Proteins and Polyions〃 in /^r。tei/7 Jrc力itecfi/re: ter/scia7 #。7eci/_/ar Ase/ffiWy J鵬oZ^7izstioz jS/oz^cA^oJogj, (Y. Lvov & H. Mu hwald編輯，2000) (New York: Dekker， 2000) pp. 125-167，其通 過引用并入本文)。圖3(c)中的線是對實驗數(shù)據(jù)點的線性匹配。數(shù)據(jù) 的線性是吸附過程中精確規(guī)則的組裝以及各吸附層中多肽大致均一 密度的合適的指標(biāo)。吸附伴隨一610 ± 60 Hz (陽離子)或一380 ± 40 Hz (陰離子)的頻移而發(fā)生。沉積多肽質(zhì)量的線性增長表明組裝 過程中初期吸附步驟的重復(fù)和多層制造過程的普遍成功。
iv.結(jié)論以上結(jié)果顯示使用本發(fā)明方法設(shè)計的多肽適合于ELBL，不管來
自PSS和PAH顯著的定性差別，靈活的同聚物在pH 7. 4下每單位長 度具有1個電荷。聚L-賴氨酸和聚L-谷氨酸上每單位長度的電荷在 pH 7. 4下為1，如PSS和PAH具有的，但這些多肽在各種條件下都 具有顯著的形成a -螺旋結(jié)果的傾向，使它們在需要對薄膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行 控制時明顯不適合于多層組裝。然而，本發(fā)明的單分散的多肽使實 施者能夠非常精確地知道正在被用于ELBL的材料的結(jié)構(gòu)。而且，聚 L-賴氨酸、聚L-谷氨酸、PSS和PAH的普通商業(yè)制劑在人類中引起 免疫應(yīng)答(g卩，是免疫原性的)。
因為如實驗所證明的，設(shè)計的多肽容易被吸附在相反電荷的表 面之上，所以沒有對"前體"層的需求。如現(xiàn)有技術(shù)已知的，"前 體"層被沉積在基質(zhì)上以提高弱吸附性物質(zhì)的吸附。前體層的缺乏 提高了聚離子薄膜的生物相容性(因為通常作為前體使用的聚合物 是免疫原性的)或允許比設(shè)計的多肽更低精確的對聚合物結(jié)構(gòu)或薄 膜結(jié)構(gòu)的控制。設(shè)計的多肽的多層在人類血液pH(7.4)下是穩(wěn)定的。
因此，所述多層應(yīng)該有用于廣泛的生物學(xué)應(yīng)用。設(shè)計的多肽(每 個多肽的每個殘基少于1個電荷)的吸附在2 mg/mL和低離子強度 下基本在少于10分種之內(nèi)完成。這意味著這些多肽能夠被用來快速 并相對容易地形成多層薄膜。在各層沉積之后使用N^)干燥所述肽 薄膜沒有影響組裝。'
干燥的進(jìn)行是為了得到準(zhǔn)確的QCM頻率測量，但不是組裝所需 要的。
薄膜組裝實驗在比血液低的離子強度下完成，但該過程產(chǎn)生與 在較高離子強度下性廣上類似的結(jié)果。主要的差別每個吸附層沉積— 的肽的量一離子強度越高，沉積的肽的量越大。這由圖7中的圖所 描述，其顯示了沉積的物質(zhì)的量作為離子強度的函數(shù)一所使用的肽 是聚L-谷氨酸和聚L-賴氨酸。QCM共振頻率是針對吸附層標(biāo)繪的。 聚L-谷氨酸的平均分子量是84600 Da，而聚L-賴氨酸的平均分子量 是84000 Da。用于組裝的肽濃度是2 mg/mL。數(shù)據(jù)表明鹽濃度(溶液的離子強度)影響了薄膜組裝。通常，每層沉積的物質(zhì)的量隨o-ioo
mMNaCl范圍內(nèi)的離子強度而增加。由于在相對高的每單位長度凈電 荷和低離子強度條件下使用設(shè)計的多肽的ELBL的基本特征似乎不依 賴于緩沖液的選擇，在人類血液的離子強度下預(yù)期有在性質(zhì)上的類 似結(jié)果。因此，緩沖液的選擇應(yīng)該不根本改變多層在其耙環(huán)境中的 穩(wěn)定性。然而，即使緩沖的選擇不影響多層的穩(wěn)定性，"鎖定"機(jī) 制作為穩(wěn)定膠囊的設(shè)計特征將是可獲得的。
陽性多肽比陰性多肽更明顯的沉積可能起因于陽性多肽在pH 7. 4下的每單位長度的較高電荷。沉積在每層中的物質(zhì)很可能符合為 中和下面的表面的電荷所需要的物質(zhì)。疏水相互作用也能夠幫助解 釋吸附行為的這一特征。
對于蛋白質(zhì)和其他聚合物的普通薄膜厚度的計算很可能對于短 多肽(計算的厚度是60-90 rm但10個多肽的累積長度約為120 nm) 是無效的。這很可能起因于相對短的多肽在吸附表面上的包裹的高 密度；該結(jié)果也符合薄膜厚度隨離子強度變化的發(fā)現(xiàn)，由于聚合物 的結(jié)構(gòu)性質(zhì)將發(fā)生變化并且經(jīng)由離子的電荷篩選將減少吸附肽之間 的層內(nèi)電荷斥力。這里討論的設(shè)計的多肽薄膜的厚度被估計為20-50 nm。
設(shè)計和制造循環(huán)的許多方面能夠被自動化。例如， 一種計算機(jī) 算法可以被用來優(yōu)化用于ELBL的肽的一級結(jié)構(gòu)，通過比較預(yù)測的肽 性質(zhì)和觀察到的物理性質(zhì)，包括溶液中結(jié)構(gòu)、吸附行為和薄膜在極 端pH下的穩(wěn)定性。而且， 一旦各個步驟的細(xì)節(jié)已經(jīng)被基本確定，多 肽薄膜組裝過程能夠被機(jī)械化。
2.實例2—涉及含有半胱氨酸的重新設(shè)計的多肽的實驗
a. 多月太
使用的多肽為Tyr Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys (SEQ ID NO: 5)
Tyr Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu (SEQ ID NO: 6)
不同于在這里描述的實驗中使用的其他多肽，這兩個不是使用 人類基因組信息設(shè)計的多肽；它們被設(shè)計的唯一 目的是評價在多肽 薄膜穩(wěn)定化中二硫鍵形成的作用。
b. 操作
AU實驗在室溫下進(jìn)行。所有使用QCM的組裝實驗在相同條件下 進(jìn)行，除了使用空氣代替氮氣來干燥即將經(jīng)歷氧化的樣品。組裝條 件是10mMTris-HCl， lOmMDTT， pH 7. 4。額定的肽濃度是2mg/ml。 形成的層數(shù)是14。
用于氧化樣品的二硫化物鎖定條件是10 mM Tris-HCl， 1% DMSO， 使用空氣飽和水，pH7.5。"鎖定"步驟持續(xù)6小時。
用于還原樣品的條件是IO mM Tris-HC1， 1 mM DTT，使用氮氣 飽和水，pH 7.5。該步驟持續(xù)6小時。
所有使用QCM的分解實驗在相同條件下進(jìn)行，除了使用空氣代 替氮氣干燥氧化樣品。分解條件是10 mM KC1， pH2.0。在干燥前使 用D.I沖洗樣品30秒鐘。
三個不同類型的實驗被進(jìn)行(1)還原一無處理在組裝后立 即進(jìn)行分解；(2)還原一6小時，如上所述用于還原樣品；和(3)氧 化一6小時，如上所述用于氧化樣品。
c. 結(jié)果
結(jié)果在圖10中描述。在首先的兩個實驗(都是還原)中，所有 的沉積物質(zhì)(IOO %)在50分種內(nèi)分解。相反，在氧化實驗中，在肽薄膜包被的QCM共振器在pH 2下保持5小時之后大量物質(zhì)保留。多
肽薄膜在酸性pH下的穩(wěn)定性由組裝條件決定；這樣，薄膜或膠囊的
穩(wěn)定性是通過使用多肽作為ELBL的聚合電解質(zhì)而成為可能的設(shè)計特 征。
d.結(jié)論
靜電力在一起保持電荷相反的設(shè)計的多肽層中起關(guān)鍵作用。在 酸性pH下，在一個肽上的凈電荷被中和且多肽薄膜由于靜電排斥而 分解。還原條件防止二硫鍵的形成。因此，層間的靜電吸引是在這 些條件下用于穩(wěn)定層的唯一的結(jié)合力。相反，在氧化條件下，二硫 鍵形成。在酸性pH下，二硫鍵抑制薄膜分解。結(jié)果表明酸性pH下 的層穩(wěn)定性直接受層內(nèi)和/或?qū)娱g的二硫鍵的形成一即同一層中的 分子間，相鄰層的分子間，或兩者一的影響。這通過圖10中顯示的 結(jié)果被描述一由于二硫化物鎖定，超過30 %的薄膜在酸性pH下保持 穩(wěn)定，不管在相對低的離子強度下的靜電排斥。具有更多半胱氨酸 殘基的肽被期望以進(jìn)一步提高二硫化物鎖定效率。而且，肽組裝條 件的調(diào)節(jié)將是設(shè)計具有所需物理以及化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的薄膜的重 要方面。
3.實例3—涉及含有半胱氨酸的設(shè)計的多肽的實驗 a.材料
該實驗的基本要素是石英晶體微量平衡儀器；鍍銀的共振器(9 MHz共振頻率);陰性48-殘基肽(LN3) (SEQ ID N0: 4);和下述序 列的稱為"SP5"的陽性48-殘基肽
Tyr Lys Gly丄y—S-丄yg Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys SLys Ser Cys His (SEQ ID NO: 7)
像上面VII(E) (l)部分中討論的其他設(shè)計的肽，使用上面 VII (B) (1)中描述的方法設(shè)計SP5以分析人類血液蛋白乳鐵傳遞蛋白 (gi 14505043)的氨基酸序列。ELBL緩沖液是10 mM Tris、 pH 7.4、10 mM NaCl和1 mM DTT。分解緩沖液是10 mM KCl、 pH 2。通過將 4mg各肽加入2mL上述緩沖溶液并調(diào)節(jié)各溶液至pH7. 4制備SP5和 LN3的2mL肽溶液；所述肽濃度為2 mg-ML—、
b. 用于監(jiān)測多肽層在QCM共振器上組裝的操作
還原操作如下(1)在肽吸附之前檢測并記錄共振器的頻率； (2)共振器被浸泡入SP5肽溶液中持續(xù)20分種；(3)共振器被浸泡 入SP5沖洗溶液中持續(xù)30秒鐘；(4)共振器從沖洗溶液中移出并使 用氮氣干燥；(5)記錄共振器的QCM共振頻率；(6)共振器被浸入 LN3肽溶液中持續(xù)20分種；(7)共振器被浸入LN3沖洗溶液中持續(xù) 30秒鐘；(8)共振器l從沖洗溶液中移出并使用氮氣干燥；(9)記 錄共振器的QCM共振頻率；(10)重復(fù)步驟2至9直至16層被吸附 至共振器上。
氧化操作與還原操作相同，除了共振器在D. I.水而非SP5緩沖 液或LN3緩沖液中沖洗，且在每次測量前使用空氣代替氮氣干燥。
c. 鎖定操作
還原操作如下共振器被至于含有l(wèi) mM DTT的水溶液中持續(xù)6 小時。DTT， 一種還原劑，抑制了二硫鍵的形成。
氧化操作如下共振器被至于空氣飽和的含有1 % DMSO的水溶 液中持續(xù)6小時。DMSO， 一種氧化劑，促進(jìn)了二硫鍵的形成。
d. 共振器上的分解
i. 溶液
還原條件如下10 mM KC1， 1 mM DTT， pH 2。 氧化條件如下10 mM KC1， 20% DMSO， pH 2。
ii. 用于分解的操作
還原操作如下(1)通過QCM測定并記錄共振器的初始共振頻 率；(2)共振器被浸泡入還原分解溶液5分種；(3)共振器在還原 緩沖溶液中沖洗30秒鐘；(4)共振器使用氮氣干燥；(5)通過QCM測定并記錄共振器的共振頻率；(6)重復(fù)步驟2至5用于在5、 10、 15、 20、 30、 60和90分種的時間讀數(shù)。
氧化操作與還原操作相同，除了共振器的沖洗在空氣飽和的D. I. 水而非還原緩沖液中進(jìn)行。
e. 結(jié)果
圖8顯示了在SP5和LN3的薄膜組裝過程中沉積的大致線性的 質(zhì)量增加。兩個共振器都顯示了在組裝過程中幾乎相同的質(zhì)量沉 積，不論組裝條件的差異。圖9顯示薄膜組裝過程中保留的材料的 比例。經(jīng)受氧化條件的層在酸性pH下顯示了最小的材料損失，有接 近90-95%的質(zhì)量保留。相反，經(jīng)受還原條件的層在暴露于酸性pH 的前5分種之內(nèi)損失了接近全部的胞膜材料。
f. 結(jié)論
結(jié)果表明，在酸性pH下，二硫鍵防止了層退化并保持層牢固地 在一起。在酸性pH下的層穩(wěn)定性直接受層內(nèi)和/或?qū)娱g二硫鍵的形 成的影響。二硫鍵形成依賴于相互間半胱氨酸殘基的濃度和親近。 增加多肽每單位鏈長的濃度將因此直接影響二硫鍵的形成和薄膜穩(wěn) 定性。增加用于薄膜組裝的緩沖溶液的離子強度通過增加每吸附循 環(huán)的沉積物質(zhì)的量和每層的厚度來影響薄膜中的半胱氨酸濃度。單 層中增加的半胱氨酸數(shù)目將以該方式增加形成的二硫鍵的數(shù)目并經(jīng) 氧化增加薄膜穩(wěn)定性。
本發(fā)明的其他實施方案是可能的且可以做出調(diào)整而不偏離本發(fā) 明的構(gòu)思和范圍。因此，上面的詳細(xì)描述不是要限制本發(fā)明。而且， 本發(fā)明的范圍通過所附權(quán)利要求來限定。
權(quán)利要求
1、一種用于在氨基酸序列信息中識別并記錄所需數(shù)目的用于在靜電疊層自組裝中使用的具有確定長度和某一極性凈電荷的氨基酸序列基元的方法，包括步驟a. 獲得來自特定生物體的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列；b. 定位所述氨基酸序列中的起始氨基酸；c. 檢查所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸以確定具有與所述某一極性相反的極性的荷電氨基酸的數(shù)目；d. 如果具有與所述某一極性相反的極性的所述荷電氨基酸的數(shù)目是一或更多，從步驟g繼續(xù)所述方法；e. 檢查所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸以確定具有所述某一極性的荷電氨基酸的數(shù)目；f. 如果具有所述某一極性的荷電氨基酸的數(shù)目等于或大于x，記錄由所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸組成的所述氨基酸序列基元；g. 定位所述氨基酸序列中另一個起始氨基酸；和h. 從步驟c開始重復(fù)所述方法直至所述所需數(shù)目的氨基酸序列基元已經(jīng)被識別或者所述氨基酸序列中的所有氨基酸已經(jīng)作為步驟c中的所述起始氨基酸被使用； 其中x大于或約等于n的一半。
2、 權(quán)利要求丄所述的方法，其中n為小于或等于11但大于或 等于3。
3、 權(quán)利要求l所述的方法，其中『8和x二5。
4、 權(quán)利要求l所述的方法，其中n-6和x二4。
5、 權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一個所述記錄的氨基酸序 列基元包含半胱氨酸。
6 、 一種用于設(shè)計用于在靜電疊層自組裝中使用的多肽的方法， 包括步驟a.使用下述步驟在氨基酸序列信息中識別并記錄一個或多 個具有確定長度和某一極性凈電荷的氨基酸序列基元i. 獲得來自特定生物體的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列；ii. 定位所述氨基酸序列中的起始氨基酸；iii. 檢查所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸以確定 具有與所述某一極性相反的極性的荷電氨基酸的數(shù)目；iv. 如果具有與所述某一極性相反的極性的所述荷電氨 基酸的數(shù)目是一或更多，從步驟vii繼續(xù)所述方法；v. 檢查所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸以確定具 有所述某一極性的荷電氨基酸的數(shù)目；vi. 如果具有所述某一極性的荷電氨基酸的數(shù)目等于或大于x，記錄由所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸組成 的所述氨基酸序列基元；vii. 定位所述氨基酸序列中另一個起始氨基酸；和viii. 從步驟iii開始重復(fù)所述方法直至所述所需數(shù)目 的氨基酸序列基元已經(jīng)被識別或者所述氮基酸序列中的所有 氨基酸已經(jīng)作為步驟iii中的所述起始氨基酸被使用；其中x大于或約等于n的一半；和b.連接多個所述被記錄的氨基酸序列基元以形成多肽。
7、 權(quán)利要求6所述的方法，其中n小于或等于11但大于或等 于3。
8、 權(quán)利要求6所述的方法，其中n=8和x二5。
9、 權(quán)利要求6所述的方法，其中n二6和x二4。
10、 權(quán)利要求6所述的方法，其中至少一個所述多個連接的氨 基酸序列基元包含半胱氨酸。
11、 權(quán)利要求6所述的方法，其中至少一個所述多個連接的氨 基酸序列基元具有小于7. 5的累積Ct -螺旋傾向性且累積3 -折疊傾 向性小于8。
12、 權(quán)利要求6所述的方法，進(jìn)一步包括在多肽中包括功能性結(jié)構(gòu)域的步驟。
13、 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述氨基酸序列來自所述生 物體的蛋白質(zhì)組。
14、 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述氨基酸序列來自所述生 物體的血液蛋白。
15、 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述生物體是人類。
16、 權(quán)利要求14所述的方法，其中至少一個所述多個連接的氨 基酸序列基元包括SEQ ID N0:1所描述的序列。
17、 權(quán)利要求14所述的方法，其中至少一個所述多個連接的氨 基酸序列基元包括SEQ工D N0:2所描述的序列。
18、 權(quán)利要求14所述的方法，其中至少一個所述多個連接的氨 基酸序列基元包括SEQ ID N0:3所描述的序列。
19、 權(quán)利要求14所述的方法，其中至少一個所述多個連接的氨 基酸序列基元包括SEQ ID N0:4所描述的序列。
20、 權(quán)利要求14所述的方法，其中至少一個所述多個連接的氨 基酸序列基元包括SEQ ID N0:7所描述的序列。
21、 一種薄膜，所述薄膜包括多個多肽層，所述多肽層具有交 替的電荷，其中至少一個所述多肽包含一個或多個由n個氨基酸組 成的氨基酸序列基元，其中至少x個氨基酸帶正電且沒有一個氨基 酸帶負(fù)電，或者其中至少x個氨基酸帶負(fù)電且沒有一個氨基酸帶正 電，其中x大于或約等于n的一半。
22、 權(quán)利要求21所述的薄膜，其中所述至少一個所述多肽包含 非天然氨基酸。
23、權(quán)利要求21所述的薄膜，其中所述薄膜進(jìn)一步包括至少一 種抗微生物多肽。
24.權(quán)利要求23所述的薄膜其中所述抗微生物多肽包括SEQ ID N0:8所描述的序列。
25、 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述至少一個所述多肽包含 功能性結(jié)構(gòu)域。
26、 權(quán)利要求21所述的薄膜，其中所述至少一個氨基酸序列基 元由下述方法識別a. 獲得來自特定生物體的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列；b. 定位所述氨基酸序列中的起始氨基酸；c. 檢查所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸以確定具有 與所述某一極性相反的極性的荷電氨基酸的數(shù)目；d. 如果具有與所述某一極性相反的極性的所述荷電氨基酸 的數(shù)目是一或更多，從步驟g繼續(xù)所述方法；e. 檢查所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸以確定具有 所述某一極性的荷電氨基酸的數(shù)目；f. 如果具有所述某一極性的荷電氨基酸的數(shù)目等于或大于 x，記錄由所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸組成的所述氮 基酸序列基元；g. 定位所述氨基酸序列中另一個起始氨基酸；和h. 從步驟c開始重復(fù)所述方法直至所述所需數(shù)目的氨基酸 序列基元已經(jīng)被識別或者所述氨基酸序列中的所有氨基酸—已經(jīng) 作為歩驟c中的所述起始氨基酸被使用；其中x大于或約等于n的一半。
27、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中n小于或等于12但大于或 等于4。
28、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中『9和x二5。
29、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中『7和f4。
30、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中所述至少一個氨基酸序列基 元包含半胱氨酸。
31、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中所述至少一個多個連接的氨 基酸序列基元具有小于7. 5的累積a -螺旋傾向性和小于8的累積P -折疊傾向性。
32、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中所述至少一個氨基酸序列基 元包括人類血液蛋白。
33、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中所述至少一個氨基酸序列基 元包括SEQ ID N0:1所描述的序列。
34、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中所述至少一個氨基酸序列基 元包括SEQ ID N0:2所描述的序列。
35、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中所述至少一個氨基酸序列基 元包括SEQ工D N0:3所描述的序列。
36、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中所述至少一個氨基酸序列基 元包括SEQ ID N0:4所描述的序列。
37、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中所述至少一個氨基酸序列基 元包括SEQ ID N0:7所描述的序列。
38、 權(quán)利要求26所述的薄膜，其中所述薄膜形成微囊。
39、 權(quán)利要求38所述的薄膜，其中所述微囊包括核心，所述核 心包括血紅蛋白。
40、 權(quán)利要求—39_所述的薄膜，其中所述血紅蛋白為結(jié)晶形式。
41、 權(quán)利要求39所述的薄膜，其中所述血紅蛋白為液體形式。
42、 權(quán)利要求38所述的薄膜，其中所述微囊包括核心，所述核 心包括治療性藥物。
43、 權(quán)利要求42所述薄膜，其中所述治療性藥物為結(jié)晶形式。
44、 權(quán)利要求42所述的薄膜，其中所述血紅蛋白為液體形式。
45、 權(quán)利要求26所述薄膜，其中所述薄膜形成于固體基質(zhì)上。
46、 權(quán)利要求45所述薄膜，其中所述固體基質(zhì)是微囊。
47、 權(quán)利要求45所述薄膜，其中所述基質(zhì)是醫(yī)學(xué)移植物。
48、 —種用于設(shè)計在靜電疊層自組裝中使用的多肽的方法，包a. 重新設(shè)計多個氨基酸序列基元，其中至少一個所述氨基 酸序列基元由n個氨基酸組成，其中至少x個氨基酸帶正 電且沒有一個氨基酸帶負(fù)電，或者其中至少x個氨基酸帶 負(fù)電且沒有一個氨基酸帶正電x大于或約等于n的一半； 和b. 連接所述多個所述氨基酸序列基元以形成多肽。
49、 權(quán)利要求48所述的方法，其中n小于或等于12但大于或 等于4。
50、 權(quán)利要求48所述的方法，其中『9和f5。
51、 權(quán)利要求48所述的方法，其中n二6和x二4。
52、 權(quán)利要求48所述的方法，其中所述至少一個氨基酸序列基 元具有小于7. 5的累積ct -螺旋傾向性和小于8的累積P -折疊傾向 性。
53、 權(quán)利要求48所述的方法，其中所述至少一個氨基酸序列基 元包含一種或多種非天然氨基酸。
54、 權(quán)利要求48所述的方法，其中所述至少一個氨基酸序列基 元包含右旋氨基酸。_ _
55、 權(quán)利要求48所述的方法，進(jìn)一步包括將至少一種抗微生物 肽與所述多個氨基酸序列基元連接的步驟。
56、 權(quán)利要求55所述的方法，其中所述至少一種抗微生物肽包 括SEQ ID N0:8所描述的序列。
57、 權(quán)利要求48所述的方法，進(jìn)一步包括在形成所述多肽中包 括功能性結(jié)構(gòu)域的步驟。
58、 一種用于控制多層薄膜的機(jī)械穩(wěn)定性和多孔性的方法，包括步驟提供多層薄膜的步驟，所述薄膜包括多個多肽層，所述多肽 層具有交替的電荷，其中至少一個所述多肽層包括一個或多個含有 游離巰基的氨基酸。
59、 權(quán)利要求58所述的方法，其中所述一個或多個含有游離巰 基的氨基酸是半胱氨酸。'
60、 權(quán)利要求59所述的方法，其中所述至少一組相鄰多肽層包
61、 權(quán)利要求58所述的方法，其中所述至少一個多肽層包含非 天然氨基酸。
62、 權(quán)利要求58所述的方法，其中至少一個所述多肽層包括抗 微生物肽。
63、 權(quán)利要求62所述的方法，其中所述抗微生物肽包括SEQID N0:8所描述的序列。
64、 權(quán)利要求58所述的方法，其中至少一個所述多肽層包括功 能性結(jié)構(gòu)域。
65、 權(quán)利要求58所述的方法，其中所述多肽包括至少一個由n 個氨基酸組成的氨基酸序列基元，其中至少x個氨基酸帶正電且沒 有一個氨基酸帶負(fù)電，或者其中至少x個氨基酸帶負(fù)電且沒有一個 氨基酸帶正電，其中x大于或約等于n的一半。
全文摘要
通過靜電疊層自組裝(ELBL)設(shè)計用于薄膜、涂層和微囊的納米制造的多肽的方法，用于在生物醫(yī)學(xué)和其他領(lǐng)域中的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK101421416SQ200480044450
公開日2009年4月29日 申請日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月22日
發(fā)明者唐納德·T·海尼 申請人:路易斯安那科技大學(xué)基金會