專利名稱：編碼具有合成噢哢類活性的蛋白質(zhì)的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)編碼具有以查耳酮類為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的基因及其應(yīng)用的發(fā)明。更詳細地說，本發(fā)明是有關(guān)編碼具有以查耳酮類為底物合成噢哢類活性的多酚氧化酶的基因及其應(yīng)用的發(fā)明。再詳細點說，本發(fā)明例如是有關(guān)編碼具有以查耳酮類為底物合成噢哢類活性的來自于金魚草的蛋白質(zhì)的基因及其應(yīng)用的發(fā)明。
背景技術(shù)：
花的顏色中，橙、紅、紫和青主要是由稱之花青甙的類黃酮產(chǎn)生的。黃色大多是由所謂類胡蘿卜素、ベタレイン的類黃酮以外的化合物產(chǎn)生的，但一部分植物的黃色是由類黃酮產(chǎn)生的。例如金魚草、深波葉補血草、牽?；ā⒋篼惢ā⑾灳?、菊芋、大波斯菊一部分品種中的花瓣中存在著屬于噢哢類的化合物(齊藤、バイオホルテイ1、49-57、1990)。
作為噢哢類已知有4’，6-二羥基-噢哢、4，4’，6-三羥基-噢哢、金魚草素、硫磺菊素、蠟菊噢哢等，金魚草中含有金魚草素和蠟菊噢哢、深波葉補血草中含有金魚草素、牽牛花中含有金魚草素、大麗花含有硫磺菊素、蠟菊含有蠟菊噢哢、菊芋含有硫磺菊素。
另外已知在菊科的金雞菊(コレオプシス)屬、向日葵屬、腫柄菊(テイトニア)屬、ジニア屬、ビギュエラ屬，杜鵑科的ウアツキニウム屬，莎草科的莎草屬，豆科的アカシア屬、紫檀(プテロカルプス)屬、soja屬，茜草科的コンロンカ屬的一部分也有噢哢類化合物存在于植物體中(類黃酮(The flavonoids)，J.B，Harbone編，1988，Chapman &Hall，340-342)。
雖然花青素甙的生物合成途徑正在深入地研究，而有關(guān)噢哢的生物合成，從其結(jié)構(gòu)看出4’，6-二羥基-噢哢可由2’，4，4’-三羥基查耳酮合成的，關(guān)于它的反應(yīng)也有報道說與過氧化物酶有關(guān)(Rathmel和Bendall，生物化學雜志(Biochem.J)127，125-132，1972)，但使用植物花瓣的提取液等明確測定噢哢的生物合成反應(yīng)的例子還沒有，闡明植物花瓣中發(fā)生了什么樣的反應(yīng)的報告也沒有。另外純化參與噢哢合成的酶的報告也沒有。
發(fā)明的公開在此本發(fā)明人試圖闡明噢哢的生物合成系統(tǒng)，提供控制植物、特別是植物花色的手段。
本發(fā)明人建立了使用含噢哢類的金魚草花瓣的粗提取液測定由查耳酮類合成噢哢類反應(yīng)的分析方法。此時生成的噢哢類并不是以前人們認為的4’，6-二羥基-噢哢，而是金魚草素，此次可測定的反應(yīng)是到目前為止人們還不知道的反應(yīng)。另外使用本分析方法從金魚草的花瓣可以將以查耳酮類為底物合成噢哢(金魚草素)的酶(金魚草素合成酶)純化至電泳上單一一條帶。使用該純化的酶樣品弄清了該酶的生物化學性質(zhì)。也確定了該酶的部分氨基酸序列。根據(jù)該氨基酸序列從來自金魚草花瓣的cDNA文庫得到了以查耳酮類為底物合成噢哢的噢哢合成酶的基因。
作為查耳酮類已知有四羥基查耳酮、五羥基查耳酮、紫鉚因、2’，4，4’-三羥基查耳酮等。
另外得到的基因在作為多酚氧化酶活性中心的銅的結(jié)合區(qū)域具有同源性。因此就已知的一種多酚氧化酶-酪氨酸酶是否具有由查耳酮合成噢哢活性進行確認時，明確了酪氨酸酶也具有合成噢哢活性。
因此本發(fā)明提供編碼具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的基因。進一步是提供編碼具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的多酚氧化酶的基因。再進一步是提供編碼具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的氨基酸序列如序列2所示的蛋白質(zhì)的基因。另外本發(fā)明還提供含有上述基因的載體。
另外本發(fā)明還提供經(jīng)上述載體轉(zhuǎn)化的宿主。該宿主既可以是微生物、植物細胞、動物細胞等細胞，也可以是植物體。
本發(fā)明還提供以培養(yǎng)上述細胞，或栽培上述植物為特征的噢哢合成酶、例如金魚草素合成酶的生成方法。生成的酶可以提取，還可以為了調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的顏色的色調(diào)使其發(fā)揮功能。這種情況下通過植物體內(nèi)生成的酶合成噢哢類，該噢哢類可以調(diào)節(jié)植物體、例如花的顏色。
因此本發(fā)明也提供植物花色的調(diào)節(jié)方法，其特征是將具有以查耳酮類為底物合成噢哢類活性的酶基因，例如金魚草素合成酶基因?qū)胫参锘蛑参锛毎?，使該基因表達，通過生成的酶在植物體內(nèi)合成噢哢類。另外本發(fā)明也提供象上述那樣花色被調(diào)節(jié)的植物。
另外本發(fā)明還提供噢哢類的合成方法，其特征是使上述的酶蛋白質(zhì)作用于作為底物色素的查耳酮類化合物。
本發(fā)明還提供上述基因編碼的酶蛋白質(zhì)。
附圖的簡單說明

圖1表示噢哢類和查耳酮類化合物的結(jié)構(gòu)式。
圖2表示噢哢生物合成的路線。
圖3表示在使用了SYP8-17的黃色金魚草的各個器官內(nèi)進行的RNA印跡雜交解析結(jié)果。
圖4表示在使用了SYP8-17的黃色金魚草花瓣的各個發(fā)育階段進行的RNA印跡雜交解析結(jié)果。
花瓣發(fā)育階段(Petal stage)1花蕾花瓣長達1厘米花瓣發(fā)育階段(Petal stage)2花蕾花瓣長1-1.5厘米花瓣發(fā)育階段(Petal stage)3花蕾花瓣長1.5-2.0厘米花瓣發(fā)育階段(Petal stage)4花蕾花瓣長2.0-2.5厘米花瓣發(fā)育階段(Petal stage)5花蕾花瓣長2.5-3.0厘米花瓣發(fā)育階段(Petal stage)6開花的花瓣長3.0厘米以上圖5表示在使用了SYP8-17的黃色、粉紅色、白色的各個金魚草花瓣進行的RNA印跡雜交解析結(jié)果。
圖6是表示由于添加噢哢合成酶SYP-8的抗體(抗SYP-8)以及其它的參照抗體(抗band A和抗β-半乳糖苷酶)引起的噢哢合成酶活性抑制情況圖。
圖7表示添加抗SYP8-IgG-Sepharose 4B時，上清中殘存的SYP8蛋白量。
發(fā)明的實施方案首先從黃色的金魚草的花瓣利用各種層析法純化金魚草素合成酶。然后按照常規(guī)方法解析金魚草素合成酶的部分氨基酸序列，合成對應(yīng)于這些氨基酸序列的寡核苷酸。
另外從同樣的金魚草的花瓣純化Poly A+RNA，利用常規(guī)方法建立cDNA文庫。
以黃色的金魚草花瓣的cDNA為模板，使用上述合成的寡核苷酸進行PCR，獲得對金魚草素合成酶特異的DNA片段。將該DNA片段亞克隆入載體中，構(gòu)建質(zhì)粒。
利用上述質(zhì)粒含有的插入DNA篩選上述的cDNA文庫，得到克隆。然后從該克隆分離質(zhì)粒，確定堿基序列。
已知具有酶活性的蛋白質(zhì)含有對其酶活性必需的區(qū)域和非必需的區(qū)域，非必需區(qū)域內(nèi)即使一個或多個氨基酸去除(缺失)、附加和/或由其它的氨基酸置換而被修飾，該酶活性仍能維持。因此本發(fā)明不只是包含氨基酸序列如序列2所示的蛋白質(zhì)，也包含具有在序列2所示氨基酸序列中除去或缺失、附加、和/或被其它氨基酸置換一個～數(shù)個氨基酸而修飾的氨基酸序列、而且維持以查耳酮類為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)，以及編碼該蛋白質(zhì)的基因。
另外已經(jīng)知道具有同一酶活性的蛋白質(zhì)有時會因等位基因變異而具有不同的氨基酸序列。進一步知道具有同一或同等酶活性的酶有多種分布，這些酶具有很高的氨基酸序列同源性。而且編碼這些蛋白質(zhì)的基因通過與本發(fā)明基因的雜交進行選擇是有可能的。因此本發(fā)明也包含在嚴格條件下與序列1所示堿基序列的核酸進行雜交的，而且編碼具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的基因，以及由該基因編碼的蛋白質(zhì)。
作為與序列1所示堿基序列的核酸進行雜交的，而且編碼具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的基因，無論是對編碼序列2記載的氨基酸序列的基因進行人工修飾過的基因，還是取自天然的基因都可以。取自天然的基因有從含有噢哢合成酶的植物、例如金魚草、深波葉補血草、牽牛花、大麗花、蠟菊、菊芋等得到的cDNA或基因組DNA。雜交的嚴格程度，例如可以是5×SSC 50℃，優(yōu)選條件是2×SSC 50℃，更優(yōu)選0.2×SSC 50℃。
相對于具有酶活性的天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列來說，具有高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)往往具有與天然蛋白質(zhì)同樣的酶活性，這一點已被人們所了解。因此本發(fā)明也包含相對于序列2所示氨基酸序列，具有55％以上，優(yōu)選60％以上，更優(yōu)選70％以上，再優(yōu)選80％以上，特別優(yōu)選具有90％以上同一性的氨基酸序列的，而且具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)，以及編碼該蛋白質(zhì)的基因。
具有同等酶活性的許多酶往往具有共同的抗原決定部位。因此本發(fā)明也包含與具有合成噢哢活性的蛋白質(zhì)、特別是與氨基酸序列如序列2所示蛋白質(zhì)的抗體特異結(jié)合的，而且具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)，以及編碼這些蛋白質(zhì)的基因。
本發(fā)明的編碼氨基酸序列如序列2所示的蛋白質(zhì)的基因可以以cDNA或基因組DNA從金魚草中獲得。cDNA的克隆方法在實施例8～10中有具體的記載。為了獲得基因組DNA，由金魚草按照常規(guī)方法建立基因組DNA文庫，通過利用上述的cDNA或其片段按照常規(guī)方法進行篩選獲得基因組DNA。
本發(fā)明的編碼的序列為具有序列2所示氨基酸序列被修飾的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因可以通過對編碼氨基酸序列如序列2所示的蛋白質(zhì)的DNA，例如cDNA的堿基序列通過常規(guī)方法進行定點突變、PCR法等基因操作進行修飾來制備。
與堿基序列如序列1記載的核酸雜交，而且具有以查耳酮為底物合成噢哢類的酶活性的基因中，來自天然的基因可以通過從能產(chǎn)生具有合成噢哢類的酶活性的植物中按照常規(guī)方法建立cDNA文庫或基因組DNA文庫，用例如堿基序列如序列1所示的cDNA或其片段作為探針篩選這些文庫得到。此時的雜交條件可以使用前面敘述的條件。
另外由于從金魚草中得到的噢哢合成酶是多酚氧化酶的一種，所以本發(fā)明人認為其它的多酚氧化酶也具有由查耳酮類合成噢哢類的活性，研究了作為多酚氧化酶來自紅色面包霉以酪氨酸酶出售的酶是否具有合成噢哢的活性。結(jié)果表明酪氨酸酶具有合成噢哢的活性。由此明確了具有多酚氧化酶活性的酶具有以查耳酮為底物合成噢哢的活性。
具有多酚氧化酶活性的酶的生理作用現(xiàn)在還不清楚，主要分為兒茶酚氧化酶(酶編號1.10.3.1)、漆酶(酶編號1.10.3.2)和酪氨酸酶(酶編號1.14.18.1)三類，酶的編號是按照對底物的特異性分類的。無論那一種都是酶反應(yīng)中心是銅的銅酶，人們認為蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生底物特異性上的差別。
如上所述，由于在多酚氧化酶中與銅結(jié)合的區(qū)域存在著保守區(qū)域，所以可以制備以該區(qū)域的氨基酸序列為基礎(chǔ)的引物，按照PCR法等常規(guī)方法得到多酚氧化酶基因(植物生理學(Plant Physiol)，107卷，1083-1089頁，1995；植物生理學Plant Physiol，109卷，525-531頁，1995；)，由此得到的基因可以獲得編碼具有合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的基因。
本發(fā)明還提供具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的上述蛋白質(zhì)的制造方法。該方法的特征是將構(gòu)建的含有編碼上述蛋白質(zhì)的DNA的載體導(dǎo)入宿主，然后培養(yǎng)或培育該宿主，獲得所期望的上述蛋白質(zhì)。宿主可以是宿主細胞，也可以是植物等生物體。宿主細胞可以是原核細胞、特別是細菌細胞，例如大腸桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌(Bacillus)屬細菌，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短芽孢桿菌Bacillusbrevis等，低等真核生物例如真菌類、如酵母、例如酵母Saccharomyces屬酵母、如釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，或霉菌，例如曲霉(Aspergillus)屬霉菌、如米曲霉Aspergillus oryzae、黑曲霉Aspergillus niger等。
作為高等真核生物細胞宿主，如昆蟲細胞、如蠶的細胞，動物細胞、如CHO細胞、人培育細胞、如Hela細胞等。
本發(fā)明的基因可以在生物體、例如動物、植物等中表達。有關(guān)在植物中的表達，下面有具體記載。
含有本發(fā)明的DNA的載體、特別是表達載體含有表達控制區(qū)，表達控制區(qū)依賴于宿主細胞。例如作為細菌表達載體的啟動子可以使用trc啟動子、tac啟動子、lac啟動子、T7啟動子等，作為酵母表達啟動子可以使用糖酵解系統(tǒng)酶基因的啟動子、例如甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子、半乳糖激酶啟動子等，而作為動物細胞用的表達載體的啟動子可以使用病毒啟動子。
為了從培養(yǎng)物中獲取具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)，可以使用液相層析、親和層析等蛋白質(zhì)分離純化中常用的手段。親和層析可以利用與本發(fā)明的具有合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的抗體，例如抗血清或單克隆抗體的特異結(jié)合進行。
本發(fā)明的具有合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的抗血清(多克隆抗體)是通過如下過程制備的將本發(fā)明的蛋白質(zhì)、例如實施例4中得到的蛋白質(zhì)與常用的佐劑一起免疫動物、例如兔子，然后從該動物獲取抗血清。單克隆抗體制備方法是按照常規(guī)方法將本發(fā)明的蛋白質(zhì)免疫動物、例如小鼠，然后將從該小鼠得到的B淋巴細胞，例如脾細胞與老鼠等的脊髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞，再通過培育該細胞來制備單克隆抗體。
如果具備現(xiàn)在的技術(shù)水準，可將該cDNA連接于構(gòu)成型的或誘導(dǎo)型的啟動子的調(diào)控區(qū)下，使用土壤桿菌的系統(tǒng)或使用基因槍、電穿孔系統(tǒng)導(dǎo)入植物、例如矮牽?；?、薔薇、石竹花、菊花、藍豬耳、馬鞭草、大丁草花、煙草、草莓、草原龍膽、龍膽、藍豬耳、唐菖蒲、郁金香等，在花瓣等使噢哢合成酶表達也是有可能的。
可以預(yù)料噢哢合成酶表達的花瓣等可以合成噢哢，花瓣的顏色會變成黃色。這樣得到的植物可以提供以前的品種不存在的新的顏色的花。而在有黃色品種的植物中雖然存在含有類胡蘿卜素的植物品種(菊花和薔薇等)，或是含有ベタレイン的植物品種(仙人掌)，但由于這些黃色與噢哢類的黃色在色調(diào)上不同，所以在已有黃色品種植物的色幅擴大方面也是很有用的。
金魚草中具有黃色花的品種有時缺少與噢哢合成酶共存的查耳酮異構(gòu)酶的酶活性。由于查耳酮異構(gòu)酶起到與噢哢合成酶競爭的作用，所以如果存在查耳酮異構(gòu)酶，由四羥基查耳酮可以生成4’，5，7-三羥基黃烷酮(柚皮素)，最終變成花青素甙和黃酮。因此為了使噢哢合成酶基因在植物中表達，生產(chǎn)噢哢類化合物，該植物最好是查耳酮異構(gòu)酶缺損的植物。
一般植物基因人為地抑制其活性是有可能的，特別是抑制參與類黃酮合成的基因的例子已了解了很多。人為抑制基因表達有反意義法和コサプレツシヨン法，已知類黃酮合成系統(tǒng)的基因無論用那種方法抑制都是可能的。(van der Krol等、自然(Nature)(1988)333，866-869、Napoli等，植物細胞(Plant Cell)(1990)2，279-289)。同樣抑制查耳酮異構(gòu)酶基因的表達也是可能的。
查耳酮異構(gòu)酶基因已經(jīng)從許多植物品種得到了。例如矮牽?；?、苜蓿、金魚草、蘋果、菜豆、葡萄(Holton等，植物細胞Plant Cell(1995)，7，1071-1083)。比較這些查耳酮異構(gòu)酶的氨基酸序列，無論那一品種的該序列都被很好地保守著。為了克隆參與類黃酮合成的某個基因只要將來自其它植物的基因作為探針就很容易得到，這樣的例子很多?；蛘呤潜容^已知的基因或氨基酸序列，利用保守的區(qū)域通過PCR也可以克隆。因此查耳酮異構(gòu)酶基因無論從那種植物都可以得到(Gutterson，Hort.，科學(Sci.)，30卷，964～966頁，1995)。
另外通過抑制黃烷酮3-羥化酶或二羥基黃酮醇4-還原酶的基因表達也可望達到同樣的效果。由于這些酶的基因從很多品種植物都可得到(Gong等，植物分子生物學(Plant.Mol.Biol.)，35，915-927，1997)，所以通過使用與查耳酮異構(gòu)酶同樣的方法從那種植物都可以得到。
因此為了對在某一植物品種中具有來自噢哢類的黃色的花的品種進行育種，只要使噢哢合成酶在花瓣中表達就可以了。優(yōu)選是抑制查耳酮異構(gòu)酶基因的表達，只使噢哢合成酶表達。此時作為這些基因表達調(diào)節(jié)使用的啟動子無論是構(gòu)建的還是花瓣特異的都可以。這些技術(shù)可以進一步完善，如果與可將糖加到噢哢類的糖轉(zhuǎn)移酶基因共同導(dǎo)入該植物的話，可以得到穩(wěn)定的黃色花。這些操作只要具備現(xiàn)在的技術(shù)水準都是可能的。
另外已知就大麗花和金魚草來說，花青素甙和噢哢共存時，花色變成褐色。通過向花中生產(chǎn)花青素甙的植物導(dǎo)入噢哢合成酶，培育褐色的花的品種也是有可能的。象這樣的花作為新的花在產(chǎn)業(yè)上是很重要的了。
實施例以下通過實施例，詳細地敘述發(fā)明。
實施例1.四羥基查耳酮的制備向4g 4’，5，7-三羥基黃烷酮(柚皮素)中加入20ml的50％(V/W)氫氧化鉀，使其完全溶解。將該溶液于100℃保持90秒鐘后，立刻用300ml冰水使溶液稀釋冷卻，停止反應(yīng)。然后在通風櫥內(nèi)向該溶液中加入6N鹽酸，將pH調(diào)至3以下，使沉淀生成。將生成的黃色沉淀過濾出，用最少量的乙醇溶解，然后一邊用冰冷卻，一邊緩慢加入400ml冷水。放置過夜后，將經(jīng)8000轉(zhuǎn)、30分鐘離心分離的沉淀再懸浮于水中，進行冷凍干燥。冷凍干燥后的四羥基查耳酮(THC)的重量有2.7g。
將粗THC溶解于最少量的甲醇中，通過分離用反相高效液相層析純化THC。使用島久社的YMC D-ODS-5 S-5 120A(2.0cm×25cm)，用40％(V/V)乙腈、0.03％(V/V)三氟乙酸水溶液洗脫，流速為4.5ml/分。THC大約在25分鐘時被洗脫出，而4’，5，7-三羥基黃烷酮大約在29分鐘時被洗脫出。收集THC級分，并冷凍干燥。在同一條件下再進行一次層析，制備成純化的THC。
實施例2.金魚草素的制備將金魚草品種蝶黃花瓣290g在液氮中粉碎，于2L含有0.1％TFA的50％乙腈中浸漬一個晚上。進行硅藻土過濾，將濾液減壓濃縮后，用HP-20純化。將黃色色素級分濃縮供分離HPLC用。使用島久社的YMC D-ODS-5 S-5 120A(2.0cm×25cm)，A液用水，B液用0.1％TFA，50％乙腈，進行從B20到B60％的直線濃度梯度層析，時間為120分鐘。結(jié)果蠟菊噢哢-6-葡萄糖苷于40分鐘時洗脫出，金魚草素-6-葡萄糖苷于53分鐘時洗出，四羥基查耳酮-6-葡萄糖苷于100分鐘時被洗出。得到的金魚草素-6-葡萄糖苷經(jīng)β-半乳糖苷酶水解就得到了金魚草素。
實施例3.噢哢合成酶活性的測定方法通過向加有50μl pH5.0的1M醋酸鈉緩沖液和用水稀釋的350μl的粗酶液中加入于乙醇中366nm的吸光度為462的THC 5μl使反應(yīng)開始。在30℃下反應(yīng)1小時后，加入含有1％(V/V)的TFA的90％(V/V)乙腈水溶液100μl停止反應(yīng)后，利用HPLC測定活性。粗酶液使用的是后面的實施例4講到的各純化步驟中的粗酶液。
柱子使用的是YMC J’Sphere ODS M80(4.6×150mm)，流速為0.7ml/分。溶劑A為0.1％TFA，溶劑B為含有0.1％TFA的90％乙腈溶液，樣品加到柱子上后，最初3分鐘，保持A∶B＝7∶3，接下來的10分鐘用直線濃度梯度使得A∶B＝6∶4，將該濃度保持5分鐘，隨后的1分鐘使得A∶B＝7∶3，使該濃度保持5分鐘。在該條件下底物THC大約在20.9分鐘被洗脫出來。作為反應(yīng)產(chǎn)物被檢測出的是大約在8.8分鐘被洗脫下來的化合物。該化合物就象后面敘述的那樣是金魚草素。
可知通過該反應(yīng)可以由THC生成金魚草素。
實施例4.噢哢合成酶的純化1)酶的純化將金魚草開始著黃色的花和萼之間的白的花瓣除去的花蕾32175g作為起始材料進行酶的純化。大約每600g花加冰冷卻的緩沖液A(0.01M醋酸鈉，pH5.0)2400ml、120g的聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrolidone)(PVPP)，然后用ワ-リング粉碎機進行1-1.5分鐘破碎。
粉碎液于4℃下進行8000轉(zhuǎn)、15分鐘的離心分離，所得上清中加入硫酸銨至60％飽和，攪拌溶解后放置。于4℃下進行8000轉(zhuǎn)，15分鐘的離心分離，將沉淀懸浮于最小容量的緩沖液A中，對緩沖液A透析。將透析內(nèi)液于4℃進行8000轉(zhuǎn)、15分鐘的離心分離，其上清作成硫銨分級濃縮液。將硫銨濃縮液于-20℃下冷凍保存用于SP-Sephadex C50層析。
2)SP-Sephadex C50得到的硫銨分級濃縮液分三次進行以下操作。測定透析后的硫銨分級濃縮液的電導(dǎo)度，用冰冷卻的去離子水稀釋濃縮液，根據(jù)需要使電導(dǎo)度于4℃達到0.8-1mS。將硫銨分級濃縮液加到經(jīng)緩沖液B(含有數(shù)μM的THC的緩沖液A)充分平衡的SP-Sephadex C50柱(6cm×25.5cm；約0.7L)。加樣后用緩沖液B將柱子充分洗凈。用緩沖液B(2.0L)和含有0.6MNaCl的緩沖液B(2.0L)間的直線濃度梯度洗柱子，同時按23ml分級。收集活性級分(約1200ml)，過濾滅菌，于4℃下保存用于Con ASepharose層柝。
3)Con A SepharoseCon A Sepharose層析分為級分A(1100ml含有374,000U)和級分B(2900ml含有831,000U)兩次進行。將MnCl2和CaCl2溶解于級分A，使它們的濃度分別達到1mM，然后加到經(jīng)緩沖液C(含有1mM MnCl2、1mMCaCl2、0.5MnaCl的緩沖液B)平衡的Con A Sepharose柱(2cm×12cm；約40mL)。加樣后用大約0.3L的緩沖液C洗凈柱子。流出液和洗凈級分(300mL)中分別含有負荷前的大約50000U(各為原來的13％)的活性。
洗凈后，通過緩沖液C(250mL)和含有0.2M甲基-α-D-葡萄糖苷、0.2M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷的緩沖液C(250mL)之間的直線濃度梯度洗脫柱子，同時按4mL分級，收集活性級分(計78mL)?；钚约壏謱彌_液D(5mM磷酸鈉緩沖液(pH5.0)，0.3mM CaCl2、3-6μM THC)充分透析。洗凈級分的活性與留待進行第二批層析的活性級分B合并再次進行層析。
將MnCl2和CaCl2溶解于剩下的級分B，使它們的濃度分別達到1mM，然后加到經(jīng)緩沖液C平衡的Con A Sepharose柱(3.6cm×12cm；約120mL)。加樣后用大約0.3L的緩沖液C洗凈柱子。流出液和洗凈級分(300mL)中幾乎不含有活性。洗凈后，通過緩沖液C(350mL)和含有0.2M甲基-α-D-葡萄糖苷、0.2M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷的緩沖液C(350mL)之間的直線濃度梯度洗脫柱子，同時按8mL分級，收集活性級分(計150mL)?；钚约壏謱彌_液D充分透析后，與先前的樣品合并得到活性級分(計250mL)。
4)Gigapite將上述透析內(nèi)液(250mL)加到經(jīng)緩沖液D平衡過的Gigapite柱(生化學工業(yè)；2cm×16cm，50mL的開口柱)。加樣后用緩沖液D(250mL)洗凈柱子。然后用緩沖液D(200mL)和含有0.5M磷酸鉀緩沖液(pH5.0)(200mL)間的直線濃度梯度洗脫柱子，同時按4ml分級，收集活性級分(約120ml)。
5)HiLoad 16/60 Superdex 75pg FPLC將{3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate}(CHAPS)溶解于活性級分中，終濃度為0.1％，使用アミコンPM10膜進行超濾，將活性級分濃縮至18mL。濃縮的級分分6次進行以下操作。
使用FPLC系統(tǒng)，用含有0.07％CHAPS，0.15M NaCl的緩沖液B平衡冰冷卻的HiLoad 16/60 Superdex 75pg柱，用0.5ml/min流速洗脫，按2ml分級，收集活性級分(計63mL)。
6)SP-Sepharose FF FPLC將得到的活性級分對緩沖液E(含有0.07％CHAPS的緩沖液B)于4℃下充分透析。用FPLC柱分兩次進行以下的層析。用緩沖液E平衡冰冷卻的SP-Sepharose FF柱(1×16cm)。將樣品加到柱子上，使用緩沖液E作為A液，含有0.7M NaCl的緩沖液E作為B液。最初30分鐘用95％A液、5％B液洗柱子，其后的120分鐘進行到55％A液、45％B液的直線濃度梯度洗脫，之后的10分鐘用同樣的條件洗脫。流速0.5ml/min，按1.0ml分級，收集活性級分(計27.8mL)、過濾滅菌于4℃下保存。
7)Gigapite柱層析活性級分中的22ml用Gigapite(1×14cm)FPLC進一步純化。樣品22ml對含有0.07％CHAPS的0.005M磷酸鉀緩沖液(pH5.0)于4℃下透析過夜，按下面的條件進行FPLC，也觀察到了活性和蛋白帶之間的關(guān)系。作為A液使用含有0.07％CHAPS，0.3mM CaCl2的0.005M磷酸鉀緩沖液(pH5.0)，作為B液使用含有0.07％CHAPS的0.5M磷酸鉀緩沖液(pH5.0)，將柱子和緩沖液冰冷卻后進行層析。
用100％A液洗柱子，時間30分鐘，流速5ml/min，然后用6秒時間達到95％A液、5％B液，接下來的149分54秒進行達到20％A液、80％B液直線濃度梯度洗脫，之后的155分鐘內(nèi)用同樣條件洗脫，按1.0ml分級。
從層析和活性測定結(jié)果收集確認與活性關(guān)系密切的40kDa的蛋白質(zhì)級分，供一級結(jié)構(gòu)解析用。
實施例5.三類柱層析中的活性測定和SDS-PAGE1)Superdex200 Smart system取50μl樣品用Superdex200 Smart system進行分級。用含有0.07％CHAPS、0.15M NaCl的0.01M醋酸鈉(pH5.0)作為溶劑，于4℃下進行以下操作。流速40.0μl/min，按40.0μl分級，進行凝膠過濾層析。得到的樣品進行活性測定和SDS-PAGE。酶活性是在分子量43kDa附近被洗脫出，樣品中含有的蛋白質(zhì)中40kDa蛋白質(zhì)與活性最有關(guān)。
2)Alkyl-Sepharose HR5/5 FPLC250μl樣品對0.01M醋酸鈉(pH5.0)于4℃下透析過夜，溶解硫酸銨使終濃度為2M。室溫下進行Alkyl-Sepharose HR5/5 FPLC。作為A液使用含有2M(NH4)2SO4的0.01M醋酸鈉(pH5.0)，作為B液使用0.01M醋酸鈉(pH5.0)。最初10分鐘用100％A液洗柱子，在接下來的50分鐘內(nèi)進行最終達到B液100％的直線濃度梯度洗脫，后面的5分鐘內(nèi)用同樣條件洗脫，按0.5ml分級。
每一級分各取400μl經(jīng)Ultra Free C3GC(分級分子量10,000、Millepore)濃縮至40μl，取出其中的10μl進行SDS-PAGE分析，10μl用于活性測定。樣品中含有的蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)40kD與活性密切相關(guān)。
3)Gigapite HR5/5 FPLC300μl樣品對含有0.07％CHAPS的0.005M磷酸鉀緩沖液(pH5.0)于4℃下透析過夜，按下面的條件于室溫下進行Gigapite HR5/5 FPLC。
作為A液使用含有0.07％CHAPS，0.3mMCaCl2的0.005M磷酸鉀緩沖液(pH5.0)，作為B液使用含有0.07％CHAPS的0.5M磷酸鉀緩沖液(pH5.0)，最初5分鐘用100％A液洗柱子，接下來的6秒進行80％A液、20％B液洗脫，之后的44分54秒進行20％A液、80％B液直線濃度梯度洗脫，按0.5ml分級。進行活性測定和SDS-PAGE電泳。樣品中含有的蛋白質(zhì)中40kDa蛋白質(zhì)與活性最有關(guān)。
以上Superdex200 Smart system、Alkyl-Sepharose FPLC以及Gigapite FPLC柱層析的結(jié)果表明大約40kDa的蛋白質(zhì)與活性最相關(guān)。
實施例6.噢哢合成酶的性質(zhì)用純化的噢哢合成酶進行反應(yīng)，可以證實無論是由THC還是由五羥基查耳酮都可以純化出金魚草素。生成的產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析可以確認是金魚草素。
該酶的分子量經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定為40kDa，用Superdex200凝膠過濾法測定是43kD。由此可知噢哢合成酶是個單體酶。1mM的一價銅離子、二價銅離子、二價鐵離子、三價鐵離子存在下90％以上酶活性被抑制。由于該酶可與Con A Sepharose結(jié)合，所以該酶可能是個含糖的酶。另外若添加過氧化氫，酶活性稍有上升。
以THC為底物反應(yīng)時，有認為是金魚草素的產(chǎn)物生成，大量收集該產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)確定。將20ml含有10mM過氧化氫的1M醋酸鈉緩沖液pH5.0、酶液20ml、水58ml、THC 10mg(0.5ml)混合，于30℃下保持3.5小時。反應(yīng)后，使反應(yīng)液吸附于Sep-pak C18，用甲醇洗脫。用蒸發(fā)器濃縮后，用分離用HPLC分離純化。使用的柱子是YMC D-ODS-5 S-5 120A(2.5×25cm)。用含有0.03％TFA的40％乙腈水溶液進行洗脫，流速為4.5ml/分。回收大約17分鐘時洗脫出的峰，干燥后得到大約4.9mg的生成物。用1HNMR、質(zhì)譜確定結(jié)構(gòu)，該化合物是金魚草素。
實施例7.噢哢合成酶的氨基酸序列的確定向得到的大約1nmol的噢哢合成酶樣品加入終濃度為2％的SDS樣品處理液，在非還原條件下使用制備型電泳裝置(バイオフオレ-シス、アト-社)進行電泳，回收分子量41000的多肽。該多肽經(jīng)使用了C4柱(Develosil 300C4-HG-5)的反相HPLC進行分離，檢測出一個峰，可以確認純化的噢哢合成酶是純的。
該多肽經(jīng)リジルエンド肽酶AP1消化。反應(yīng)用緩沖液是40mM Tris-HCl(pH9.5)，含有0.01％的Tween20和2M尿素。消化物經(jīng)使用了BakerbondODS(4.6mm×25cm)柱的反相HPLC分離純化。即用0.05％三氟乙酸水溶液作為A液，用含有0.05％三氟乙酸的80％乙腈作為B液時，最初5分鐘達到90％A液、10％B液。接下來的80分鐘進行達到100％B液的直線濃度梯度洗脫，分離肽。
使用氣相肽序列儀確定純化出的肽的結(jié)構(gòu)。確定的結(jié)構(gòu)如下所示。
P5(K)KLGYVYQDVEIP(序列編號3)P8(K)IVYRQMVSSAK(序列編號4)P11(K)TPQLFFGRPYRRGDQEF(序列編號5)
P4-5(K)IIDFELPXPSTTMRVRRAAHLVDDAYIXK(序列編號6)實施例8.金魚草花瓣cDNA文庫的建立花瓣的cDNA文庫的建立依據(jù)以下方法進行。從黃色的金魚草的就要開出新鮮花的花瓣5g用R.McGookin等《分子生物學方法》(Method inMolecular Biology)vol.2(Humana Press Inc.1984)詳細給出的硫氰酸胍/氯化銫方法獲得RNA、使用寡核苷酸數(shù)dT30(日本ロシュ)，純化PolyA+RNA。利用該PolyA+RNA，使用cDNA合成試劑盒，Uni-XR載體試劑盒(Stratagene)、λZAPII(Stratagene)作成載體，建立cDNA文庫。建立方法依據(jù)Stratagene公司推薦的方法。得到的文庫由16×105噬斑形成單位(pfu)構(gòu)成。
實施例9.利用遞減法獲得在黃色金魚草中表達的基因遞減法是獲得在某個組織或時期特異表達的基因的方法之一，這里利用PCR-SelectTMcDNA Subtraction kit(Clontech公司)按照推薦的方法進行。使用來自黃色金魚草花瓣的cDNA作為tester、來自粉紅色金魚草花瓣的mRNA作為driver。最終使用TA克隆試劑盒(Invitogen社)將PCR擴增的DNA片段亞克隆到PCRIITM載體中，確定了各自的堿基序列。
其中認為是命名為SYP8的基因編碼的氨基酸序列如序列7所示。
RQMVSSAKTPQLFFGRPYRRGDQEFPGVGSIELVPHGMIHLWTGSENTPYGENMGAFYSTARDPIFFAHHSNVDRMWSIWKTLGGPRRTDLTDPDFLDASFVFCDENAEMVRVKVRDCLDGKKLG(序列編號7)該氨基酸序列中，N-末端的25個氨基酸構(gòu)成的序列和C-末端4個氨基酸構(gòu)成的序列與實施例7中得到的序列P5、P8、P11一致。即確認該基因片段編碼噢哢合成酶。
實施例10.全長噢哢合成酶基因的獲得利用DNA片段SYP8篩選前述金魚草cDNA文庫。引物的篩選用使用了非放射性系統(tǒng)檢測試劑盒(ベ-リンガ-社)方法進行。篩選了大約20萬噬斑，結(jié)果得到很多的陽性噬斑。從中隨機選擇出20個噬斑，通過兩次篩選分離出純粹的噬斑，確定了其中最長的克隆SYP8-17的堿基序列。
堿基序列是通過合成寡核苷酸引物、用DNA Sequencer model 373A(ABI社)確定的。堿基序列和推測的氨基酸序列如序列1所示。利用該氨基酸序列進行數(shù)據(jù)檢索時，該基因表現(xiàn)出與多酚氧化酶基因(GenBankAccession NO.L29451，D45385，Z11702)等有弱的同源性，可知該基因是一個新的基因。而與多酚氧化酶有同源性的主要區(qū)域是與作為多酚氧化酶的活性中心的銅的結(jié)合區(qū)域。
實施例11.噢哢合成酶基因的表達形式利用SYP8-17進行黃色金魚草的各個器官、花瓣的各個發(fā)育階段的RNA印跡解析。另外也進行了黃色、粉紅色、白色的各個金魚草花瓣的RNA印跡解析。方法依據(jù)分子克隆(Molecular Cloning)(Sambrook等，冷泉港實驗室出版社Cold Spring Harbour Laboratory Press，1989)。結(jié)果如圖3、4和5所示。噢哢合成酶基因在花瓣中特異表達，而且在花瓣中的表達是與噢哢類合成同時進行的。而與黃色金魚草的花瓣相比，噢哢合成活性很弱或檢測不出來的粉紅色和白色的金魚草花瓣中也許是噢哢合成酶基因的mRNA的積蓄少所以幾乎看不到。這些結(jié)果表明得到的基因與噢哢類的合成有關(guān)。
實施例12.馬鞭草cDNA文庫的建立從馬鞭草品種花手鞠紫(三得利)的新鮮花蕾5g象先前那樣純化mRNA，建立cDNA文庫。cDNA文庫的建立如實施例8那樣進行。得到的文庫是由0.8×106噬斑形成單位(pfu)構(gòu)成。
實施例13.馬鞭草查耳酮異構(gòu)酶cDNA的克隆比較序列已知的來自高等植物的查耳酮異構(gòu)酶的氨基酸序列，以認為是高度保守的區(qū)域的氨基酸序列Phe-Val/Ile-Lys-Phe-Thr-Ala-Ile序列(序列編號8)、Lys-Trp-Lys-Gly-Lys-Thr/Pro序列(序列編號9)、His-Ala-Val-Cys-Asn-Glu(序列編號10)的逆序列為基礎(chǔ)合成以下的引物。
CHI-F15’-TT(T，C)(A，G)TN AA(A，G)TT(T，C)ACN GCN AT-3’(序列編號11)CHI-F25’-AA(A，G)TGG AA(A，G)GGN AA(A，G)(A，C)C-3’(序列編號12)
CHI-R25’-(A，G)TG NGC NAC(A，G)CA(A，G)TT(T，C)TC-3’(序列編號13)用預(yù)先合成的CHI-F1和CHI-R2、或CHI-F2和CHI-R2的引物組合于96℃反應(yīng)2分鐘后，反復(fù)進行如下循環(huán)30次96℃1分鐘、42℃1.5分鐘、72℃3分鐘，最后于72℃反應(yīng)7分鐘。得到的PCR產(chǎn)物作為模板，再次在同樣條件下進行PCR，就CHI-F1和CHI-R2引物組而言擴增了大約200bp的PCR產(chǎn)物，CHI-F2和CHI-R2的引物組擴增了大約800，600，400以及150bp的PCR產(chǎn)物。
得到的PCR產(chǎn)物使用TA克隆試劑盒(Invitogen社)亞克隆到PCRIITM載體中。亞克隆的DNA片段的堿基序列用DNA Sequencer model 373A(ABI公司)確定。通過CHI-F1和CHI-R2、或CHI-F2和CHI-R2引物組合得到的PCR產(chǎn)物的序列分別是222bp和159bp，是長度不同的同樣序列。由此推測出的氨基酸序列表現(xiàn)出與來自其它高度植物的查耳酮異構(gòu)酶有很高的同源性。
對含有花手鞠查耳酮異構(gòu)酶222bp的PCRIITM載體用EcoRI消化，以得到的大約230bp片段為模板、CHI-F1和CHI-R2為引物進行PCR。擴增的大約230bp的PCR產(chǎn)物為模板用PCR法于95℃反應(yīng)2分鐘后，反復(fù)進行如下循環(huán)25次95℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃4分鐘，最后于72℃反應(yīng)7分鐘，用毛地黃毒苷進行標記，用作篩選時的探針。從花手鞠cDNA文庫進行的篩選使用的是非放射性系統(tǒng)的DNA檢測試劑盒(ベ-リンガ-社)，按推薦的方法進行。
如果使用同樣的方法也可以得到其它植物的查耳酮異構(gòu)酶的基因。
實施例14.SYP8抗原的制備用The QIAexpressionist kit(QIAGEN社)使實施例9記載的SYP8基因在大腸桿菌中表達，純化。由于純化出的噢哢合成酶標準樣品的分子量是40～43kDa，所以可以想象到成熟型蛋白質(zhì)是N末端和C末端的肽被切除后形成的。
在此合成了應(yīng)當使序列2所示氨基酸序列中第61個殘基甘氨酸殘基到第416個殘基賴氨酸殘基的區(qū)域表達的QESYP8-5’，QESYP8-3’引物。
QESYP8-5’5’-AA GGA TCCGGCCCT ATC GCC-3’(序列14)QESYP8-3’5’-GGG TTC GAA GAATTCATC TCT G-3’(序列15)QESYP8-5’引物中導(dǎo)入了BamHI位點，QESYP8-3’引物導(dǎo)入了HindIII位點。進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)液總量為100μl，組成如下合成的QESYP8-5’，QESYP8-3’引物各30pmol、SYP-17基因1ng、1×克隆的pfu DNA聚合酶緩沖液(stratagene)、200μM dNTPs、克隆的pfu DNA聚合酶5單位(stratagene)。反應(yīng)于94℃下保持45秒鐘，然后反復(fù)進行如下循環(huán)25次94℃45秒鐘、50℃45秒鐘、72℃4分鐘，最后于72℃反應(yīng)保持10分鐘。使用TA克隆試劑盒(Invitogen社)將得到的PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR2.1·TOPOTM載體中，作成質(zhì)粒pCR·QESYP8。pCR·QESYP8用BamHI，HindIII處理，將得到的大約1kb的DNA片段連接到經(jīng)同樣的BamHI，HindIII處理的pQE30載體(QIAGEN社)，構(gòu)建成質(zhì)粒pQESYP8。用pQESYP8轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15[pRep4]。大腸桿菌內(nèi)的SYP8蛋白的表達和純化依據(jù)制造者推薦的方法進行。得到的純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，確認有少量的共存的雜蛋白，再象以下那樣進一步純化。將蛋白溶液用Centriprep10(Amicon公司)濃縮至大約1ml，用蒸餾水透析，制成冷凍干燥樣品。進行SDS處理后，用Biophoresis(アト-社、4.5％濃縮膠、10％分離膠、15mA、按0.8ml分級)分離共存的雜蛋白。得到的最終純化樣品用UltraFree 10(Millepore社)濃縮，同時置換成含有0.1％CHAPS的PBS緩沖液(1升中溶解了8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4、用鹽酸將pH調(diào)至7.4)。最終純化的樣品的蛋白濃度是1.0mg/ml。
實施例15.SYP8抗體柱的制備實施例14中制備的SYP8抗原(1.0mg/ml)分為4次，各0.2mg，免疫兩只兔子。初次免疫使用Freund完全佐劑。追加免疫時使用不完全佐劑。追加免疫是在初次免疫的第14天、第42天、第56天。方法按照《新生物化學實驗講座》12卷記載的方法。初次免疫后的第52天、66天、70天采血，得到的血液于37℃保持30分鐘后，于4℃下靜置過夜。去除凝集的血餅，得到抗血清?？寡逵?.85％NaCl稀釋2倍后，加入一半量的冰冷卻的フ-リゲン(ヘキスト日本社)，激烈攪拌后，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，脫脂、上清作為抗血清使用。
對脫脂的抗SYP8抗血清進行等量的0.15M NaCl溶液稀釋，加入硫酸銨，使其飽和度達到33％，于8000rpm下進行30分鐘離心分離。得到的沉淀對緩沖液A(0.05M Tris-HCl，pH8.6、0.15M NaCl)透析。透析內(nèi)液上Hi Trap ProteinA柱(1ml)，純化IgG級分。將透析后的樣品加到經(jīng)緩沖液A平衡過的Hi Trap ProteinA柱上，用緩沖液A洗凈柱子后，依次用緩沖液B(0.05M檸檬酸緩沖液、pH5.3、0.15NaCl)、緩沖液C(0.05M醋酸緩沖液、pH4.3、0.15M NaCl)、緩沖液D(0.05M甘氨酸緩沖液、pH2.3、0.15NaCl)洗脫。利用紫外吸收法和免疫點印跡法確認IgG處于緩沖液C、緩沖液D兩個級分中，將這兩個級分混合，作為IgG級分。這些蛋白質(zhì)的總量大約是70mg。得到的IgG級分對0.1M NaHCO3、0.5M NaCl透析后，用セントリコン10(Amicon公司)濃縮至大約2mg/ml。
4.5g CNBr活化的Sepharose 4B懸浮于45ml的1mM HCl中，使用布氏漏斗用500ml的1mM HCl洗凈。將洗凈的樹脂緩慢地加入到濃縮的IgG溶液中，于4℃下振蕩過夜，使IgG固定化。通過布氏漏斗抽濾回收樹脂，然后再懸浮于30ml、pH8.5的0.2M Tris-HCl緩沖液中，于4℃下振蕩兩夜，使樹脂上殘存的活性基團鈍化。然后依次用pH5.0的0.2M醋酸緩沖液、pH8.5的Tris-HCl、以及pH7.8的0.01M磷酸鉀緩沖液、0.2M NaCl洗樹脂。作為對照抗Band A IgG、抗β-半乳糖苷酶IgG也分別進行同樣處理，固定于Sepharose4B上。該固定化的Sepharose4B用作實施例16的IgG-Sepharose4B懸濁液(抗SYP8、抗Band A、抗β-半乳糖苷酶)。另外每單位重量樹脂的反應(yīng)IgG重量，3種抗體都大致設(shè)定成一樣。固定化收率是90～100％。
實施例16.免疫沉降實驗向一定量的酶液分別加入牛血清白蛋白水溶液(終濃度0.1％)和實施例15制備的IgG-Sepharose4B懸濁液(抗SYP8、抗Band A、抗β-半乳糖苷酶；樹脂相∶液相＝2∶1V/V)各0、200、500、815μl，然后用pH7.8的0.01M磷酸鉀緩沖液、0.2M NaCl將總量補足1ml。將混合液于4℃振蕩24小時，13000rpm離心20分鐘，然后用上清測定噢哢合成酶活性。
噢哢合成酶活性的測定是向上清加終濃度0.1％CHAPS、5mM H2O2、pH5.4的0.1M檸檬酸緩沖液，總量為395μl，于30℃保持15分鐘后，加THC(是用乙醇溶解使之A366＝600)5μl開始反應(yīng)。于30℃反應(yīng)60分鐘后，加入100μl 10％TFA、90％乙腈停止反應(yīng)。象實施例3所敘述的那樣用HPLC通過分析反應(yīng)液測定活性。
如圖6所示那樣，在使用抗SYP8-IgG-Sepharose4B時，上清中的酶活性隨抗SYP8-IgG-Sepharose4B的添加量的增加而降低。作為對照加抗BandA-IgG-Sepharose4B、抗β-半乳糖苷酶-IgG-Sepharose4B時，噢哢合成酶活性無變化。用0.01M磷酸鉀緩沖液、0.2M NaCl洗凈作為沉淀回收的樹脂測定噢哢合成酶活性時，只是對抗SYP8-IgG-Sepharose4B看到強的噢哢合成活性。
上清經(jīng)SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡法分析時就象圖7所示那樣，噢哢合成酶的信號隨抗SYP8-IgG-Sepharose4B的添加量的增加而降低。而作為對照在使用抗BandA-IgG-Sepharose4B的同樣實驗中，噢哢合成酶基因的信號與抗bandA-IgG-Sepharose4B的添加量無關(guān)，是一定的。
從這些結(jié)果確認SYP8基因是編碼噢哢合成酶的基因。如圖7所示隨著抗SYP8-IgG-Sepharose4B的添加量的增加，檢測出了大約80kDa的信號，由于該信號隨著在實驗中樹脂保留時間增長而增大，所以認為該信號是由從Sepharose4B脫離下來的IgG引起的。
實施例17.
就象實施例10所敘述的那樣，在氨基酸水平上，噢哢合成酶表現(xiàn)出與多酚氧化酶有弱的同源性，具有同源性的主要區(qū)域是對銅的結(jié)合區(qū)域。由此可以想象到噢哢合成酶也是銅酶，所以對金魚草素合成酶進行了原子吸光光譜分析。使用的測定裝置是島津AA-670F，測定的模式是燃燒室測定，在324.8nm的波長下進行。
使用1000ppm的銅標準液(和光純藥)被濃硝酸稀釋1000倍的稀釋液作成校正曲線(校正范圍0～9ppb)。在原子吸收光譜分析中，有時共存的有機物質(zhì)會妨礙測定，所以在本測定之前，用蘑菇酪氨酸酶(含銅離子的酶)也在含有0.1％CHAPS的醋酸緩沖液中事先確認銅原子吸收光譜測定是可能的。然后將金魚草素合成酶純品(200μl)對含有0.1％CHAPS的醋酸緩沖液(pH6.0)充分透析。通過SDS-PAGE分析幾個已知量的標準蛋白，得到的銀染色的帶的濃度用圖象掃描儀數(shù)值化，作成由帶的濃度求蛋白質(zhì)量的校正曲線。在同一條件下將一部分金魚草素合成酶用SDS-PAGE分析，其銀染色的帶的濃度用圖象掃描儀數(shù)值化，然后從已作成的校正曲線估計蛋白質(zhì)濃度。100μl樣品中加入0.5μl濃硝酸(1.38N)，測定結(jié)果表明可以檢測出銅，由此可知該酶是個銅酶。
實施例18.關(guān)于酪氨酸酶的噢哢合成活性將酪氨酸酶(Sigma公司目錄no.T7755；0.04mg/ml，10μl)、0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.5，335μl)、9％CHAPS(20μl)、ミリQ水(20μl)混合后，于30℃溫育30分鐘，然后加入四羥基查耳酮(THC，4.3mM在乙醇中，15μl)，立刻攪拌，使其于30℃下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后向反應(yīng)液加入停止液(含有90％乙腈的10％三氟乙酸水溶液)100μl停止反應(yīng)，象實施例3那樣進行HPLC分析。對照用水取代酪氨酸酶。
在加酪氨酸酶組，底物THC大約在15.9分鐘洗脫出，作為反應(yīng)產(chǎn)物的金魚草素大約在12.5分鐘洗脫出。而用水取代酪氨酸酶組，底物THC大約在16分鐘時被洗脫出，沒有洗脫出金魚草素。
用五羥基查耳酮(PHC)取代THC作為底物，用0.116M檸檬酸鈉緩沖液(pH5.4)作為緩沖液，在與上面相同的條件下使其反應(yīng)。對照也是用水取代酪氨酸酶。
在加酪氨酸酶組，底物PHC大約在14.7分鐘洗脫出，作為反應(yīng)產(chǎn)物的金魚草素大約在12.5分鐘洗脫出。而用水取代酪氨酸酶組，底物PHC大約在14.6分鐘時被洗脫出，沒有洗脫出金魚草素。
由此可以判明酪氨酸酶也有合成噢哢的活性。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性就象以上敘述的那樣，在本發(fā)明中，最初測定了由四羥基查耳酮合成一種噢哢-金魚草素的反應(yīng)，然后分離純化催化該反應(yīng)的金魚草素合成酶，確定其氨基酸序列，克隆其基因。這里作為酶源使用了金魚草，也可以從含有噢哢的其它植物用同樣的方法純化合成噢哢類的酶，獲得其基因。
由于催化同樣反應(yīng)的酶的基因相互間的堿基序列相同，可進行雜交，所以可以以從金魚草得到的cDNA為基礎(chǔ)獲得其它來源的合成噢哢類的酶的基因。
另外由多酚氧化酶也可以得到編碼具有以查耳酮為底物合成噢哢類活性蛋白質(zhì)的基因。
將目的基因?qū)胫参铿F(xiàn)在已廣泛地進行，利用本發(fā)明以前不帶有黃色花的植物品種有可能培育出黃色花的品種。而帶有黃色花的植物品種也可以改變其花的色調(diào)。
序列表<110>SUNTORY LIMITED三得利株式會社<120>編碼具有合成噢哢類活性的蛋白質(zhì)的基因<130>G837<150>JP 10-107296<151>1998-04-17<160>15<210>1<211>1951<212>DNA<213>Antirrhinum majus金魚草<220>
<221>CDS<222>(96)...(1781)<223>編碼具有噢哢合成活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列<400>1aaattacatt gcttcctttg tcccaccttc caccaccaat atatacaact tcctcagcta 60gttgtttatt atcaatcaaa taaaattatt tccca atg ttc aaa aat cct aat113Met Phe Lys Asn Pro Asn1 5atc cgc tat cac aaa cta tct tcc aaa tcc aat gac aac gat caa gaa 161Ile Arg Tyr His Lys Leu Ser Ser Lys Ser Asn Asp Asn Asp Gln Glu10 15 20
tcc tcc cat cgt tgt aag cac att cta tta ttt ata ata acc tta ttc209Ser Ser His Arg Cys Lys His Ile Leu Leu Phe Ile Ile Thr Leu Phe25 30 35cta ctt ata gtt ggc ctg tac atc gcc aac tct ctc gcc tat gcc cgg257Leu Leu Ile Val Gly Leu Tyr Ile Ala Asn Ser Leu Ala Tyr Ala Arg40 45 50ttt gcc tcg acc tca acc ggc cct atc gcc gcc cct gat gtc acc aaa305Phe Ala Ser Thr Ser Thr Gly Pro Ile Ala Ala Pro Asp Val Thr Lys55 60 65 70tgt ggt cag cca gac ttg cca cct ggc aca gcc cca ata aac tgt tgt353Cys Gly Gln Pro Asp Leu Pro Pro Gly Thr Ala Pro Ile Asn Cys Cys75 80 85ccc cca atc ccc gct aaa atc atc gat ttc gag cta cca cct ccc tcc401Pro Pro Ile Pro Ala Lys Ile Ile Asp Phe Glu Leu Pro Pro Pro Ser90 95 100act acc atg agg gtt cgc cgt gcg gct cat tta gtt gat gat gca tac449Thr Thr Met Arg Val Arg Arg Ala Ala His Leu Val Asp Asp Ala Tyr105 110 115att gcc aaa ttc aag aaa gcc gtt gag ctt atg cga gct cta cct gag497Ile Ala Lys Phe Lys Lys Ala Val Glu Leu Met Arg Ala Leu Pro Glu120 125 130gat gac cct cgt agc ttc aag caa caa gct aac gtc cat tgc gct tac545Asp Asp Pro Arg Ser Phe Lys Gln Gln Ala Asn Val His Cys Ala Tyr135 140 145 150tgc gcg ggg gcg tat aat caa gcc ggt ttc aca aac cta aag ctc caa593Cys Ala Gly Ala Tyr Asn Gln Ala Gly Phe Thr Asn Leu Lys Leu Gln155 160 165
atc cac cga tct tgg ctt ttt ttc ccg ttc cat aga tat tat atc tac641Ile His Arg Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe His Arg Tyr Tyr Ile Tyr170 175 180ttt ttt gaa aga ata ttg gga aaa cta atc aat gat aca act ttt gct689Phe Phe Glu Arg Ile Leu Gly Lys Leu Ile Asn Asp Thr Thr Phe Ala185 190 195ctc cca ttt tgg aac tat gat tca cct ggt gga atg aca atc cca tca737Leu Pro Phe Trp Asn Tyr Asp Ser Pro Gly Gly Met Thr Ile Pro Ser200 205 210atg ttt att gat act aat tct tcg ctg tac gat agt tta cgg gac agt785Met Phe Ile Asp Thr Asn Ser Ser Leu Tyr Asp Ser Leu Arg Asp Ser215 220 225 230aat cat cag cca cca acc atc gta gac ttg aac tac gcc ttt tct gat833Asn His Gln Pro Pro Thr Ile Val Asp Leu Asn Tyr Ala Phe Ser Asp235 240 245tcc gac aat acc act act cct gaa gag caa atg att ata aac ctt aaa881Ser Asp Asn Thr Thr Thr Pro Glu Glu Gln Met Ile Ile Asn Leu Lys250 255 260att gtg tac aga caa atg gtg tcg agc gct aag act cca cag ctt ttc929Ile Val Tyr Arg Gln Met Val Ser Ser Ala Lys Thr Pro Gln Leu Phe265 270 275ttc ggc cgc cca tac cga cgt ggg gac caa gag ttt ccc ggg gtg ggg977Phe Gly Arg Pro Tyr Arg Arg Gly Asp Gln Glu Phe Pro Gly Val Gly280 285 290tcg att gag tta gtc cct cat ggc atg ata cat tta tgg acc ggt tct 1025Ser Ile Glu Leu Val Pro His Gly Met Ile His Leu Trp Thr Gly Ser295 300 305 310
gag aac acg ccc tat ggc gag aac atg ggg gct ttc tac tca acg gct1073Glu Asn Thr Pro Tyr Gly Glu Asn Met Gly Ala Phe Tyr Ser Thr Ala315 320 325aga gac ccg ata ttt ttt gct cat cat tcg aac gtc gat aga atg tgg1121Arg Asp Pro Ile Phe Phe Ala His His Ser Asn Val Asp Arg Met Trp330 335 340tcc ata tgg aag acc cta gga ggg ccg cgg agg acg gac tta aca gat1169Ser Ile Trp Lys Thr Leu Gly Gly Pro Arg Arg Thr Asp Leu Thr Asp345 350 355cca gat ttt ctt gat gcg tct ttc gtt ttt tat gac gaa aac gca gag1217Pro Asp Phe Leu Asp Ala Ser Phe Val Phe Tyr Asp Glu Asn Ala Glu360 365 370atg gtt cgg gtc aag gtt cgg gat tgc tta gat gaa aag aaa cta ggg1265Met Val Arg Val Lys Val Arg Asp Cys Leu Asp Glu Lys Lys Leu Gly375 380 385 390tac gtt tat caa gat gtg gag att ccg tgg ctc aac act cgt cca aca1313Tyr Val Tyr Gln Asp Val Glu Ile Pro Trp Leu Asn Thr Arg Pro Thr395 400 405cca aaa gtt tct ccg tct cta ctt aag aaa ttt cat aga aca aac act1361Pro Lys Val Ser Pro Ser Leu Leu Lys Lys Phe His Arg Thr Asn Thr410 415 420gcc aat ccg aga caa gtt ttt cct gcg ata ctt gac aga gtc tta aaa1409Ala Asn Pro Arg Gln Val Phe Pro Ala Ile Leu Asp Arg Val Leu Lys425 430 435gtt atc gtg acg agg ccg aag aaa act aga agt agg aaa gaa aag gac1457Val Ile Val Thr Arg Pro Lys Lys Thr Arg Ser Arg Lys Glu Lys Asp440 445 450
gag tta gaa gag att tta gtg att gaa ggg att gaa ctg gaa aga gac1505Glu Leu Glu Glu Ile Leu Val Ile Glu Gly Ile Glu Leu Glu Arg Asp455 460 465 470cac ggg cac gta aaa ttc gac gtt tat att aat gct gac gaa gat gac1553His Gly His Val Lys Phe Asp Val Tyr Ile Asn Ala Asp Glu Asp Asp475 480 485ctt gcg gtg att tcg ccg gag aat gct gag ttc gcc ggg agt ttc gtg1601Leu Ala Val Ile Ser Pro Glu Asn Ala Glu Phe Ala Gly Ser Phe Val490 495 500agt ctg tgg cac aaa cct ata aag ggg aag agg aca aag acg cag tta1649Ser Leu Trp His Lys Pro Ile Lys Gly Lys Arg Thr Lys Thr Gln Leu505 510 515tta aca ttg tcg att tgt gat att ttg gag gat ttg gat gct gac gaa1697Leu Thr Leu Ser Ile Cys Asp Ile Leu Glu Asp Leu Asp Ala Asp Glu520 525 530gat gat tat gtg ttg gtc act ttg gtt ccg aga aac gcc gga gat gcg1745Asp Asp Tyr Val Leu Val Thr Leu Val Pro Arg Asn Ala Gly Asp Ala535 540 545 550atc aag att cat aat gtc aag att gag ctt gat ggc taataaattc 1791Ile Lys Ile His Asn Val LysIle Glu Leu Asp Gly555560 562tattgatttc ttctcaacct acagttgatc atttaccgat tgattattcc aataaaagta 1851tctcatgtac caatatcgat cgtattaatc gtaatacttt cagattttta tttatttaaa 1911agcagttgta taaatggtga aataaggatt actttttgag1951<210>2<211>562<212>PRT
<213>Antirrhinum majus金魚草<220>
<223>具有噢哢合成活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列<400>2Met Phe Lys Asn Pro Asn Ile Arg Tyr His Lys Leu Ser Ser Lys Ser1 5 10 15Asn Asp Asn Asp Gln Glu Ser Ser His Arg Cys Lys His Ile Leu Leu20 25 30Phe Ile Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ile Val Gly Leu Tyr Ile Ala Asn35 40 45Ser Leu Ala Tyr Ala Arg Phe Ala Ser Thr Ser Thr Gly Pro Ile Ala50 55 60Ala Pro Asp Val Thr Lys Cys Gly Gln Pro Asp Leu Pro Pro Gly Thr65 70 75 80Ala Pro Ile Asn Cys Cys Pro Pro Ile Pro Ala Lys Ile Ile Asp Phe85 90 95Glu Leu Pro Pro Pro Ser Thr Thr Met Arg Val Arg Arg Ala Ala His100 105 110Leu Val Asp Asp Ala Tyr Ile Ala Lys Phe Lys Lys Ala Val Glu Leu115 120 125Met Arg Ala Leu Pro Glu Asp Asp Pro Arg Ser Phe Lys Gln Gln Ala130 135 140Asn Val His Cys Ala Tyr Cys Ala Gly Ala Tyr Asn Gln Ala Gly Phe145 150 155 160Thr Asn Leu Lys Leu Gln Ile His Arg Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe165 170 175
His Arg Tyr Tyr Ile Tyr Phe Phe Glu Arg Ile Leu Gly Lys Leu Ile180 185 190Asn Asp Thr Thr Phe Ala Leu Pro Phe Trp Asn Tyr Asp Ser Pro Gly195 200 205Gly Met Thr Ile Pro Ser Met Phe Ile Asp Thr Asn Ser Ser Leu Tyr210 215 220Asp Ser Leu Arg Asp Ser Asn His Gln Pro Pro Thr Ile Val Asp Leu225 230 235 240Asn Tyr Ala Phe Ser Asp Ser Asp Asn Thr Thr Thr Pro Glu Glu Gln245 250 255Met Ile Ile Asn Leu Lys Ile Val Tyr Arg Gln Met Val Ser Ser Ala260 265 270Lys Thr Pro Gln Leu Phe Phe Gly Arg Pro Tyr Arg Arg Gly Asp Gln275 280 285Glu Phe Pro Gly Val Gly Ser Ile Glu Leu Val Pro His Gly Met Ile290 295 300His Leu Trp Thr Gly Ser Glu Asn Thr Pro Tyr Gly Glu Asn Met Gly305 310 315 320Ala Phe Tyr Ser Thr Ala Arg Asp Pro Ile Phe Phe Ala His His Ser325 330 335Asn Val Asp Arg Met Trp Ser Ile Trp Lys Thr Leu Gly Gly Pro Arg340 345 350Arg Thr Asp Leu Thr Asp Pro Asp Phe Leu Asp Ala Ser Phe Val Phe355 360 365Tyr Asp Glu Asn Ala Glu Met Val Arg Val Lys Val Arg Asp Cys Leu370 375 380
Asp Glu Lys Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Gln Asp Val Glu Ile Pro Trp385 390 395 400Leu Asn Thr Arg Pro Thr Pro Lys Val Ser Pro Ser Leu Leu Lys Lys405 410 415Phe His Arg Thr Asn Thr Ala Asn Pro Arg Gln Val Phe Pro Ala Ile420 425 430Leu Asp Arg Val Leu Lys Val Ile Val Thr Arg Pro Lys Lys Thr Arg435 440 445Ser Arg Lys Glu Lys Asp Glu Leu Glu Glu Ile Leu Val Ile Glu Gly450 455 460Ile Glu Leu Glu Arg Asp His Gly His Val Lys Phe Asp Val Tyr Ile465 470 475 480Asn Ala Asp Glu Asp Asp Leu Ala Val Ile Ser Pro Glu Asn Ala Glu485 490 495Phe Ala Gly Ser Phe Val Ser Leu Trp His Lys Pro Ile Lys Gly Lys500 505 510Arg Thr Lys Thr Gln Leu Leu Thr Leu Ser Ile Cys Asp Ile Leu Glu515 520 525Asp Leu Asp Ala Asp Glu Asp Asp Tyr Val Leu Val Thr Leu Val Pro530 535 540Arg Asn Ala Gly Asp Ala Ile Lys Ile His Asn Val Lys Ile Glu Leu545 550 555 560Asp Gly562<210>3<211>13<212>PRT
<213>Antirrhinum majus金魚草<220>
<223>具有噢哢合成活性的蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列<400>3Lys Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Gln Asp Val Glu Ile Pro5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>Antirrhinum majus<220>
<223>Partial amino acid sequence of a protein having aurone synthesizing activity<400>4Lys Ile Val Tyr Arg Gln Met Val Ser Ser Ala Lys5 10<210>5<211>18<212>PRT<213>Antirrhinum majus金魚草<220>
<223>具有噢哢合成活性的蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列<400>5Lys Thr Pro Gln Leu Phe Phe Gly Arg Pro Tyr Arg Arg Gly Asp Gln5 10 15
Glu Phe<210>6<211>30<212>PRT<213>Antirrhinum majus金魚草<220>
<221>不確定<222>(9)<220>
<221>不確定<222>(29)<223>具有噢哢合成活性的蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列<400>6Lys Ile Ile Asp Phe Glu Leu Pro Xaa Pro Ser Thr Thr Met Arg Val5 10 15Arg Arg Ala Ala His Leu Val Asp Asp Ala Tyr Ile Xaa Lys20 25 30<210>7<211>125<212>PRT<213>Antirrhinum majus金魚草<220>
<223>具有噢哢合成活性的蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列<400>7
Arg Gln Met Val Ser Ser Ala Lys Thr Pro Gln Leu Phe Phe Gly Arg5 10 15Pro Tyr Arg Arg Gly Asp Gln Glu Phe Pro Gly Val Gly Ser Ile Glu20 25 30Leu Val Pro His Gly Met Ile His Leu Trp Thr Gly Ser Glu Asn Thr35 40 45Pro Tyr Gly Glu Asn Met Gly Ala Phe Tyr Ser Thr Ala Arg Asp Pro50 55 60Ile Phe Phe Ala His His Ser Asn Val Asp Arg Met Trp Ser Ile Trp65 70 75 80Lys Thr Leu Gly Gly Pro Arg Arg Thr Asp Leu Thr Asp Pro Asp Phe85 90 95Leu Asp Ala Ser Phe Val Phe Cys Asp Glu Asn Ala Glu Met Val Arg100 105 110Val Lys Val Arg Asp Cys Leu Asp Gly Lys Lys Leu Gly115 120 125<210>8<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<221>
<222>(2)<223>Xaa是Val或Ile<400>8Phe Xaa Lys Phe Thr Ala Ile5
<210>9<211>6<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<221>
<222>(6)<223>Xaa是Thr或Pro<400>9Lys Trp Lys Gly Lys Xaa5<210>10<211>6<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<221>
<222>
<223>
<400>10His Ala Val Cys Asn Glu5<210>11<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<221>
<222>
<223>引物<400>11ttyrtnaart tyacngcnat20<210>12<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<221>
<222>
<223>引物<400>12aartggaarg gnaarmc 17<210>13<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<221>
<222>
<223>引物<400>13rtgngcnacr carttytc 18<210>14<211>20
<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<221>
<222>
<223>引物<400>14aaggatccgg ccctatcgcc 20<210>15<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<221>
<222>
<223>引物<400>15gggttcgaag aattcatctc tg 2權(quán)利要求
1.編碼具有以查耳酮為底物合成噢哢類活性蛋白質(zhì)的基因。
2.權(quán)利要求1記載的基因，其中上述蛋白質(zhì)是多酚氧化酶。
3.權(quán)利要求1或2記載的基因，是編碼具有序列2記載的氨基酸序列，或在序列2所示氨基酸序列中通過除去或缺失、置換和/或附加一個或數(shù)個氨基酸后被修飾的氨基酸序列，而且具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的基因。
4.權(quán)利要求1或2記載的基因，是和具有序列1記載的堿基序列的核酸在嚴格條件下可以進行雜交，而且編碼具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的基因。
5.權(quán)利要求1或2記載的基因，是編碼具有與序列2記載的氨基酸序列有55％以上序列同源性，而且具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的基因。
6.含有權(quán)利要求1～5中任一項記載的基因的載體。
7.利用權(quán)利要求6記載的載體轉(zhuǎn)化的宿主。
8.權(quán)利要求7記載的宿主，其中宿主是微生物或動物細胞。
9.權(quán)利要求7記載的宿主，其中宿主是微生物細胞或植物體。
10.權(quán)利要求1～5中任一項記載的基因編碼的蛋白質(zhì)。
11.能夠與權(quán)利要求10記載的蛋白質(zhì)的抗體特異結(jié)合，而且具有以查耳酮為底物合成噢哢類活性的蛋白質(zhì)。
12.蛋白質(zhì)的制造方法，其特征是培養(yǎng)權(quán)利要求7記載的宿主，或培育宿主，然后從該宿主提取或純化具有以查耳酮為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)。
13.具有以查耳酮類為底物合成噢哢活性的蛋白質(zhì)的提取或純化方法，其特征是利用與權(quán)利要求10或11記載的蛋白質(zhì)抗體特異結(jié)合。
14.噢哢的合成方法，其特征是利用權(quán)利要求10或11記載的蛋白質(zhì)作用于查耳酮類。
15.于植物體內(nèi)合成噢哢類的方法，其特征是以權(quán)利要求1～5中任一項記載的基因轉(zhuǎn)化植物或植物細胞，使該基因表達，然后通過生成的蛋白質(zhì)在植物體內(nèi)合成噢哢類。
16.權(quán)利要求1～5中任一項記載的基因被導(dǎo)入后，花色被調(diào)節(jié)的植物或具有與此同樣性質(zhì)的其后代或它們的組織。
17.花色被調(diào)節(jié)成黃色的權(quán)利要求16記載的植物或具有與此同樣性質(zhì)的其后代或它們的組織。
全文摘要
提供例如與金魚草等花色有關(guān)的具有噢哢合成酶活性的蛋白質(zhì)以及編碼該蛋白質(zhì)的基因、特別是cDNA、及其用途。通過將該基因?qū)氩槎悩?gòu)酶缺損的植物后使其表達，可以使該植物的花帶有黃色。
文檔編號C12N15/52GK1644690SQ20051000394
公開日2005年7月27日 申請日期1999年4月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月17日
發(fā)明者榊原圭子, 福井祐子, 田中良和, 久住高章, 水谷正子, 中山亨 申請人:三得利株式會社, 三得利花業(yè)株式會社