專(zhuān)利名稱：高耐汞惡臭假單孢菌株chy－7及其在治理汞污染中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物實(shí)施環(huán)保治理的項(xiàng)目，具體的說(shuō)是一種高耐汞惡臭假單孢菌CHY-7菌株及其在治理汞污染中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2003年聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署發(fā)表了一份報(bào)告顯示，自工業(yè)革命以來(lái)，汞在大氣、水、土壤中的含量已增加了3倍左右，在工業(yè)區(qū)附近汞的含量更高，汞污染的不斷加劇對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境造成了極大的危害。
汞作為自然環(huán)境里的一種天然成分，在自然界的本底水平并不高，例如地表水含量不到0.1μg/m3，大氣中含量為0.001~50μg/m3，土壤中含量平均為0.1μg/g。然而，有色金屬的開(kāi)采和加工、氯堿的生產(chǎn)、造紙、電氣等工業(yè)汞用量逐年增加，以及含汞農(nóng)藥一段時(shí)間廣泛使用，導(dǎo)致含汞物質(zhì)不斷排入外環(huán)境，造成嚴(yán)重的汞污染。另外，含汞物質(zhì)的自然轉(zhuǎn)化速度十分緩慢，即使在清除污染源之后，汞在局部環(huán)境中仍可長(zhǎng)期存留。
汞污染主要通過(guò)食物鏈作用，在水生生物體內(nèi)大量富集，人類(lèi)食用汞污染的魚(yú)類(lèi)等而帶入體內(nèi)。有報(bào)告顯示，在美國(guó)1/12或接近500萬(wàn)婦女體內(nèi)汞的含量高于安全標(biāo)準(zhǔn)。環(huán)境中任何形式的汞在一定條件下均可轉(zhuǎn)化為劇毒的甲基汞，甲基汞進(jìn)入人體后主要侵害神經(jīng)系統(tǒng)，引起腦神經(jīng)病變。1953年日本九洲百余例水洖病的發(fā)生就是一個(gè)典型的例子。甲基汞可通過(guò)胎盤(pán)屏障侵害胎兒，使新生兒發(fā)生先天性疾病。汞污染還可導(dǎo)致心血管系統(tǒng)等疾病。
在我國(guó)汞的污染同樣嚴(yán)重，一些地方的水質(zhì)、土壤、稻田、魚(yú)鴨等都受到不同程度的污染。山東南四湖水產(chǎn)品調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，有的池養(yǎng)魚(yú)鴨體內(nèi)汞超標(biāo)最高可達(dá)2.7倍。貴州省調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于長(zhǎng)期引用汞污染河水灌田，結(jié)果造成汞在稻田土壤中顯著積累。河北的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，一些土壤、蔬菜、魚(yú)、土地水中汞殘留超過(guò)正常范圍。1998年江蘇對(duì)一無(wú)公害蔬菜基地土壤有害金屬污染調(diào)查發(fā)現(xiàn)汞污染最突出，這可能與當(dāng)時(shí)種菜歷史長(zhǎng)及使用含汞農(nóng)藥有關(guān)。另外，研究調(diào)查結(jié)果顯示三峽庫(kù)區(qū)江段的沉積物也普遍受到汞污染，汞的富集因子EF值高達(dá)1.4-9.2。
目前環(huán)境汞污染的處理都是針對(duì)工業(yè)廢水中汞的去除，主要采用物理化學(xué)的方法，常用的有活性炭吸附法、混凝法、還原法、硫化物沉淀法和離子交換法。這些措施成本昂貴，還可能留下危險(xiǎn)的副產(chǎn)物。而對(duì)于自然界水體和土壤中汞污染除了切斷污染源外，這些方法都不適用。
1960年首次報(bào)道從自然界中分離到耐汞菌株，隨后的研究發(fā)現(xiàn)微生物具有不同的耐汞分子機(jī)制，其中最復(fù)雜、普遍的耐汞機(jī)制涉及Mer蛋白家族及其相關(guān)的mer基因A、B、C、D、P、R和T。這些基因位于耐汞操縱元(mer operon)，已經(jīng)鑒定至少有11個(gè)mer操縱元，其中merA基因編碼無(wú)機(jī)汞還原酶，在NADPH-依賴的反應(yīng)中，將2價(jià)離子汞(Hg2+)還原成相對(duì)無(wú)毒的易揮發(fā)的元素汞(Hg0)。MerB基因編碼有機(jī)汞水解酶，將強(qiáng)毒的有機(jī)汞水解成毒性相對(duì)弱的無(wú)機(jī)汞(Hg2+)，其他mer基因主要是調(diào)節(jié)基因。目前，認(rèn)為具有mer操縱元的耐汞微生物可作為修復(fù)水體和土壤汞污染最有效的工具。另外，通過(guò)接合作用，mer操縱元可在微生物間水平傳遞，使其在生物降解汞污染方面具有更廣泛的應(yīng)用前景。
1993年Brunke等人以自然界分離到的和merA基因工程菌為實(shí)驗(yàn)材料，證明這些細(xì)菌可以清除污水中的HgCl2。1999年以后德國(guó)科研工作者從Spittelwasser河流污泥中通過(guò)含50μg/L Hg2+的LB選擇性培養(yǎng)基分離得到Pseudomonas Putida Spi3菌株的，該菌株清除氯堿工廠電解廢液中Hg2+的清除效率達(dá)97％，具體實(shí)驗(yàn)條件是第一天，將細(xì)菌培養(yǎng)物以20ml/h的流速通過(guò)生物反應(yīng)器(柱床體積為20ml)；接著，將培養(yǎng)基流過(guò)生物反應(yīng)器2天、5天或10天，讓細(xì)菌在生物反應(yīng)器的生物膜上生長(zhǎng)繁殖；最后，以流速2ml/h的培養(yǎng)基和18ml/h的電解廢液(Hg2+濃度為1.5mg/L)通過(guò)生物反應(yīng)器的生物膜，檢測(cè)流出液體的Hg的含量。另外，該菌株的清除電解廢液中的Hg2+的最高濃度范圍為7-9mg/L。20002年他們將規(guī)模放大到1000L。由于采用微生物降解汞污染簡(jiǎn)易，對(duì)環(huán)境的不良影響輕，成本低，可望成為清除汞污染的重要手段之一。
從包括中國(guó)專(zhuān)利在內(nèi)的有關(guān)資料檢索表明，從汞污染的土壤中分離出耐汞菌株，以及利用耐汞微生物清除汞污染尚未見(jiàn)到其相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從自然界中土壤中直接分離、篩選高耐汞、生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求低、適應(yīng)自然生態(tài)環(huán)境且生存能力強(qiáng)、具有高效還原離子態(tài)汞(Hg2+)為易揮發(fā)的元素汞(Hg0)的細(xì)菌菌株及其在治理汞污染環(huán)境中的應(yīng)用。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株，其特征在于該菌株為pseudomonas putida CHY-7，于2004年12月7日保藏于“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，其保藏號(hào)CCTCC NO.M 204093.
該pseudomonas putida CHY-7菌株是從某一廢棄日光燈廠廠區(qū)汞污染的土壤中分離得到的；菌株適宜在中性及弱酸性或弱堿性培養(yǎng)介質(zhì)中常溫培養(yǎng)，也可在自來(lái)水和土壤中生長(zhǎng)；其細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征為革蘭氏陰性桿菌，其長(zhǎng)度為2.0-4.0×0.7-1.1um，不產(chǎn)生芽孢，以多根極毛運(yùn)動(dòng)，專(zhuān)性好氧；屬于惡臭假單孢菌，菌落淡黃色、邊緣光滑隆起，在色素生成培養(yǎng)基中可產(chǎn)生熒光。
其具體篩選步驟如下采集日光燈廠廠區(qū)汞污染的土壤，加入含HgCl2的LB液體培養(yǎng)基(Hg2+濃度為25mg/L)，搗勻，自然沉淀后，離心取上清，涂布于含25mg/L Hg2+的LB平板，28℃溫育24h。挑選7株耐汞細(xì)菌進(jìn)行耐汞藥性水平檢測(cè)。
用HgCl2配制Hg2+濃度為1.25-100mg/L倍比稀釋的LB液體培養(yǎng)基，接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)菌液，28℃靜置培養(yǎng)48h；根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，判定菌株的耐Hg2+水平，見(jiàn)下表-1.
表-1耐汞菌株耐汞水平檢測(cè)菌株編耐Hg2+水平號(hào) (mg/L)CHY-1 100CHY-2 25CHY-3 25CHY-4 25CHY-5 25CHY-6 25CHY-7 100按照參考文獻(xiàn)痢疾桿菌耐藥性變異的研究I478株痢菌傳遞性R質(zhì)粒的檢測(cè)(包幼迪，俞樹(shù)高，代庚孫等。中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1982，2(5)304-307)的方法，選擇其中4株耐汞菌株CHY-1、CHY-3、CHY-6和CHY-7進(jìn)行細(xì)菌耐抗生素藥性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)下表-2。
表-2菌株耐抗生素藥性檢測(cè) 注鏈霉素(SM)、氯霉素(CM)、四環(huán)素(TC)、安卞青霉素(AP)、卡那霉素(KM)、慶大霉素(GM)、紅霉素(Ery)和頭孢拉叮(Cep)由于CHY-7菌株耐Hg2+高達(dá)100mg/L，對(duì)抗生素耐藥性較少(表-2)，故對(duì)CHY-7菌株的生物學(xué)特性作進(jìn)一步研究。
API 20NE試劑盒(BioMerieux公司)及其它生化鑒定高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株的生理生化特征見(jiàn)下表-3。
參考《Bergy’s Manual of systemic Bacteriology》Vol.VIII的內(nèi)容和API 20NE試劑盒說(shuō)明，根據(jù)形態(tài)特征與細(xì)胞壁化學(xué)組分定屬的原則，證明CHY-7菌株為革蘭氏陰性桿菌，其長(zhǎng)度為2.0-4.0X0.7-1.1μm，不產(chǎn)生芽孢，以多根極毛運(yùn)動(dòng)，專(zhuān)性好氧；生化鑒定屬于惡臭假單孢菌(pseudomonas putida)，其菌落淡黃色、邊緣光滑隆起，在色素生成培養(yǎng)基中可產(chǎn)生熒光。
表-3高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株的生理生化特征

進(jìn)一步利用16S rRNA基因的保守DNA序列分類(lèi)鑒定CHY-7菌株與惡臭假單孢菌ATTC17484和ATTC17522的16SrRNA基因序列100％的同源，即CHY-7菌株屬于惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)。該序列已遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank Accession No.AY834215)。
本發(fā)明的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株既可以在含Hg2+(100mg/ml)的LB等營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也可以在滅菌自來(lái)水和滅菌土壤中生長(zhǎng)。該菌株適應(yīng)pH值范圍廣(pH5.0-10.0)，能在4℃-39℃之間生長(zhǎng)，但不能在42℃生長(zhǎng)。
該高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株耐離子汞水平高達(dá)100mg/L，具有催化離子汞(Hg2+)轉(zhuǎn)化為元素汞(Hg0)的能力，在Hg2+濃度為5-50mg/L的范圍內(nèi)，48小時(shí)的轉(zhuǎn)化率為94.3％-82.8％以上，Hg2+濃度越低轉(zhuǎn)化率越高。而德國(guó)工業(yè)化用的Pseudomonas Putida Spi3菌株在清除電解廢液中的Hg2+的最高濃度范圍為7-9mg/L。
本發(fā)明提供的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株的基因組DNA含有merA基因，編碼無(wú)機(jī)汞還原酶(merA)，催化離子汞(Hg2+)轉(zhuǎn)化為相對(duì)無(wú)毒的易揮發(fā)的元素汞(Hg0)。該菌株的部分merA基因片段(約700bp)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的merA相應(yīng)的DNA序列同源性分別為93.1％(GenBank gi21322678)、91.2％(gi24411176)、91.9％(gi150631)、92.1％(gi23821228)和92.9％(gi21322688)；該DNA序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank accessionNo.AY834216)。
本發(fā)明提供的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株具有高耐Hg2+水平以及很強(qiáng)的還原離子汞的能力，適用于汞污染的治理；由于該菌株?duì)I養(yǎng)要求不高，生長(zhǎng)的pH范圍寬(pH5.0-10.0)，在滅菌自然水中可維持生長(zhǎng)至少1個(gè)月以上，而滅菌的普通土壤中保持菌數(shù)達(dá)18天，30天時(shí)還有80％的活菌體數(shù)，6個(gè)月后仍能分離到該菌株，顯示CHY-7菌株有很強(qiáng)的自然界生存能力，尤其適用于工業(yè)汞污水的處理、無(wú)公害蔬菜基地汞污染土壤的修復(fù)和魚(yú)、蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)汞污染水質(zhì)的處理。
本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株在液體中耐離子汞水平高達(dá)100mg/L，比德國(guó)用于工業(yè)清除電解廢液的PseudomonasPutidaSpi3菌株耐離子汞水平(最高為10mg/L)高10倍；本發(fā)明的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株在離子汞濃度為5-50mg/L范圍內(nèi)48小時(shí)清除離子汞的效率為94.3％-82.8％，而德國(guó)用于工業(yè)清除電解廢液的Pseudomonas PutidaSpi3菌株清除電解廢液中的Hg2+的最高濃度范圍為7-9mg/L；所以本發(fā)明的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株具有處理更高濃度的離子汞污染和更高清除汞污染的效率，適用于工業(yè)汞污水的處理；另外，由于該菌株對(duì)人、畜無(wú)致病性作用，也特別適用于無(wú)公害蔬菜基地汞污染土壤的修復(fù)以及魚(yú)、蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)汞污染水質(zhì)的處理。


附圖1為本發(fā)明CHY-7菌在水體和土壤環(huán)境中的生長(zhǎng)曲線，圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間(天)，縱坐標(biāo)為細(xì)菌濃度(×107/ml or ×107/g)。
附圖2為本發(fā)明CHY-7菌株還原Hg2+的能力檢測(cè)，圖中橫坐標(biāo)為Hg2+起始濃度(mg/L)，縱坐標(biāo)為殘留汞濃度(mg/L)。
附圖3為本發(fā)明CHY-7菌株的merA基因的PCR法鑒定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株的篩選步驟如下從福建省某一廢棄的日光燈泡廠的汞污染土壤中采集土壤樣品，取樣品10g，搗勻，加入10ml含HgCl2的LB液體培養(yǎng)基(Hg2+濃度為25mg/L)懸浮，自然沉淀后，100g離心取上清，涂布于含25mg/L Hg2+的LB平板，28℃溫育24h。
從Hg2+選擇性培養(yǎng)基(Hg2+的LB平板)上生長(zhǎng)的單菌落中，挑選7株耐汞菌株(編號(hào)為CHY-1、CHY-2、CHY-3、CHY-4、CHY-5、CHY-6和CHY-7)進(jìn)行耐汞藥性水平檢測(cè)。將待測(cè)菌落接種于含25mg/L Hg2+的LB培養(yǎng)液中，細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，以1∶100比例接種于HgCl2配制的Hg2+濃度為1.25-100mg/L倍比稀釋的LB液體培養(yǎng)液中，28℃靜置培養(yǎng)48h。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，判定該菌株的耐Hg2+水平；然后，利用API20NE System(BioMerieux Inc.)細(xì)菌生化分類(lèi)鑒定試劑盒對(duì)菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定。7株耐汞細(xì)菌的生化鑒定及其耐Hg2+水平見(jiàn)下表-1。
表-1耐汞細(xì)菌的生化鑒定及其耐Hg2+水平測(cè)定菌株編號(hào) 生化分類(lèi)鑒定 耐Hg2+水平(mg/L)CHY-1 假單孢菌 100CHY-2 假單孢菌 25CHY-3 假單孢菌 25CHY-4 枯草桿菌 25CHY-5 枯草桿菌 25CHY-6 假單孢菌 25CHY-7 假單孢菌 100采用液體培養(yǎng)法對(duì)4株耐汞假單孢菌進(jìn)行抗生素耐藥性分析，選用的抗生素為鏈霉素(SM)、氯霉素(CM)、四環(huán)素(TC)、安卞青霉素(AP)、卡那霉素(KM)、慶大霉素(GM)、紅霉素(Ery)和頭孢拉叮(Cep)；具體方法參考文獻(xiàn)痢疾桿菌耐藥性變異的研究I 478株痢菌傳遞性R質(zhì)粒的檢測(cè)(包幼迪，俞樹(shù)高，代庚孫等。中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1982，2(5)304-307)。結(jié)果見(jiàn)表-2。
表-2菌株耐抗生素藥性檢測(cè) 注“+”敏感，“-”耐藥。
通過(guò)離子汞選擇性培養(yǎng)基的篩選、細(xì)菌生化分類(lèi)鑒定、耐汞水平和抗生素耐藥性檢測(cè)，得到一株高耐Hg2+、對(duì)抗生素耐藥性較少的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株；并將該菌株于2004年12月7日保藏于“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，其保藏號(hào)CCTCC No.M 204093。
該高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株適宜在pH5.0-10.0的培養(yǎng)介質(zhì)以及自來(lái)水和普通土壤中生長(zhǎng)，最適pH值為6.0-8.0；能在4℃-39℃之間生長(zhǎng)，但不能在42℃生長(zhǎng)，最適溫度為28-30℃；其細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征為革蘭氏陰性桿菌，長(zhǎng)度為2.0-4.0X0.7-1.1um，不產(chǎn)生芽孢，以多根極毛運(yùn)動(dòng)，專(zhuān)性好氧；屬于惡臭假單孢菌(pseudomonas putida)其菌落淡黃色、邊緣光滑隆起，在色素生成培養(yǎng)基中可產(chǎn)生熒光。
實(shí)施例2利用16S rRNA基因的分類(lèi)鑒定高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株采用Wizard Genomic DNA purification Kit提取CHY-7細(xì)菌基因組DNA，依據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因中保守的序列設(shè)計(jì)及合成引物。PCR引物上游引物16S-F5’-TgCCAgCAgCCgCggTAA-3’；下游引物16S-R5’-AggCCCgggAACgTATTCAC-3’。PCR反應(yīng)條件為94℃/3mim；94℃/45s，56℃/30s，72℃/1min，30個(gè)循環(huán)；72℃/7min。PCR產(chǎn)物由大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。DNA測(cè)序結(jié)果如下
ACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAACTGACAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATC將以上DNA序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)BLASTN分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與惡臭假單孢菌ATTC17484和ATTC17522的16SrRNA基因序列100％的同源，即CHY-7菌株屬于惡臭假單孢菌(Pseudomnonas putida)；該序列已遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank Accession No.AY834215)。
實(shí)施例3巢式PCR鑒定高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株的mer4基因根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的merA基因序列及同源性比較分析，利用Generunner等生物軟件在merA基因高度保守DNA序列區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物(merA-F455’-ggCgCACgTCAAggAAgC-3’；merA-F3525’-gTCgAgCAAggCgCgCAg-3’；merA-R5415’-gACACgggCCTgCTgCTg-3’；merA-R7565’-gTCCAgTAgggTgACTCTTTC-3’；共組成4對(duì)引物即merA-F45/merA-R541、merA-F45/merA-R756、merA-F352/merA-R541和merA-F352/merA-R756)，以CHY-7細(xì)菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片斷。PCR反應(yīng)條件為94℃/3min94℃/45s，54-58℃/30s，72℃/1min，共30循環(huán)；72℃/7min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色和紫外成像系統(tǒng)成像分析，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA片斷大小與預(yù)期一致(見(jiàn)附圖3)。
將MerA-F45/MerA-756引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(為4對(duì)引物中擴(kuò)增的DNA片斷最長(zhǎng)，約700bp)直接測(cè)序(大連寶生物公司)；DNA測(cè)序結(jié)果如下CAGTCTGCCGTTGTGTCCTACGCCAAGGGCGCGGCCCAGCTCGACCTTGACCCCGGTACCGCATCAGACGCACTGACTGCCGTCGTGGCCGGACTCGGCTACAGGGCGACGCTCGCTGATACCTCATCGACGGACAACCGCACCGGACTGCACGACAAGGTACGCGGCTGGATGGGAACCGCCGATAAGGGCAGCGACGGCGAGCGCCAGTTGCATATCGCCGTCATCGGCAGCGGCGGCGCTGCAATGGCGGCGGCGCTGAAGGCCGTCGAGCAAGGCGCAAAGGTCACGCTGATCGAGCGCGGCACCATCGGCGGCACCTGCGTCAACGTCGGTTGTGTGCCGTCCAAGATCATGATCCGCGCCGCCCACATCGCCCATCTGCGCCGGGAAAGCCCATTCGACGGCGGCATGCCACCCACACCGCCGACGATCTTGCGCGAGCGGCTGCTGGCCCAGCAGCAGGCCCGTGTCGAAGAACTCCGTCATGCCAAGTACGAAGGCATCCTGGACGGCAATTCAGCCATCACCGTTCTGCACGGTGAAGCGCGTTTCAAGGACGACCAGAGCCTTATCGTTAGTTTGAACGAGGGTGGTGAGCGCGTCGTGATGTTCGACCGCTGCCTGGTCGCCACGGGTGCCAGTCCGGCCATGCCGCCGATTCCGGGCCTGAAAGAGTCACCCTACTGGACA預(yù)測(cè)的蛋白序列如下QSAVVSYAKGAAQLDLDPGTASDALTAVVAGLGYRATLADTSSTDNRTGLHDKVRGWMGTADKGSDGERQLHIAVIGSGGAAMAAALKAVEQGAKVTLIERGTIGGTCVNVGCVPSKIMIRAAHIAHLRRESPFDGGMPPTPPTILRERLLAQQQARVEELRHAKYEGILDGNSAITVLHGEARFKDDQSLIVSLNEGGERVVMFDRCLVATGASPAMPPIPGLKESPYWT將以上DNA序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)BLASTN分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHY-7菌株基因組DNA擴(kuò)增的merA基因片段(693bp)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的merA相應(yīng)的DNA序列同源性分別為93.1％(GenBank gi21322678)、91.2％(gi24411176)、91.9％(gi150631)、92.1％(gi23821228)和92.9％(gi21322688)，從而證明CHY-7菌株具有耐汞性及其將Hg2+轉(zhuǎn)化為Hg0的能力是由于該菌株基因組含有merA基因；該DNA序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBankaccession No.AY834216)實(shí)施例4高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株在水體和土壤中的生長(zhǎng)特性對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌液離心，初始接種約10×106菌數(shù)/ml于3ml滅菌自來(lái)水中，室溫(25℃)靜置培養(yǎng)，定期采集水樣，稀釋涂布LB平板，菌落計(jì)數(shù)。同樣，將待測(cè)菌液均勻混于滅菌的土壤中，每份10g土壤，初始接種量約為10×106菌數(shù)/g，土壤為農(nóng)田土；定期采集土壤樣本，加滅菌水混勻懸浮，自然沉淀，取上清稀釋涂布LB平板，菌落計(jì)數(shù)。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，連續(xù)觀察30天。
結(jié)果表明該菌株在滅菌自然水中可維持生長(zhǎng)至少1個(gè)月以上，而滅菌的普通土壤中保持菌數(shù)達(dá)18天，30天時(shí)還有80％的活菌體數(shù)(見(jiàn)附圖1)。
實(shí)施例5高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株催化離子汞(Hg2+)轉(zhuǎn)化為元素汞(Hg0)的能力分析用HgCl2配制Hg2+濃度為5.0、10.0、35.0和50.0mg/L的LB液體培養(yǎng)基，分裝于15ml滅菌試管中，接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株，接種量約10×106菌數(shù)/ml，30℃靜置培養(yǎng)48h。離心取培養(yǎng)液上清，用雙道原子熒光光度計(jì)測(cè)定汞含量；同時(shí)設(shè)平行對(duì)照組，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌轉(zhuǎn)化Hg2+為Hg0的效率的計(jì)算公式如下轉(zhuǎn)化率(％)＝(對(duì)照組汞濃度-試驗(yàn)組汞濃度)/對(duì)照組汞濃度×100％。
由附圖2結(jié)果可以看出，本發(fā)明的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)化離子汞的能力，在離子汞濃度為5-50mg/L范圍內(nèi)48小時(shí)清除離子汞的效率達(dá)94.3％-82.8％。
權(quán)利要求
1.一株高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株，其特征在于該菌株為惡臭假單胞菌(pseudomonas putida)CHY-7，于2004年12月7日保藏于“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，其保藏號(hào)CCTCC NO.M 204093。
2.一株高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株，其特征在于從汞污染的土壤中分離得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株，其特征在于該菌株適宜在中性及弱酸性或弱堿性培養(yǎng)介質(zhì)中常溫培養(yǎng)，也可在自來(lái)水和土壤中生長(zhǎng)。
4.一株高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株，其特征在于其細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征為革蘭氏陰性桿菌，其長(zhǎng)度為2.0-4.0×0.7-1.1μm，不產(chǎn)生芽孢，以多根極毛運(yùn)動(dòng)，專(zhuān)性好氧；屬于惡臭假單孢菌，菌落淡黃色、邊緣光滑隆起，在色素生成培養(yǎng)基中可產(chǎn)生熒光。
5.一株高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株，其特征在于該菌株?duì)I養(yǎng)要求不高，生長(zhǎng)的pH范圍寬pH5.0-10.0，具有很強(qiáng)的自然界生存能力。
6.一株高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株，其特征在于該菌株耐Hg2+水平為100mg/L；其基因組DNA含有merA基因，編碼無(wú)機(jī)汞還原酶(merA)，可催化離子汞(Hg2+)轉(zhuǎn)化為相對(duì)無(wú)毒的易揮發(fā)的元素汞(Hg0)；該菌株的merA基因部分DNA序列遞交于NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為AY834216。
7.按權(quán)利要求6所述的高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株，其特征在于該菌株具有高耐汞特性及極強(qiáng)的催化離子汞(Hg2+)轉(zhuǎn)化為元素汞(Hg0)的能力。
8.一株高耐汞惡臭假單胞菌CHY-7菌株在治理汞污染的應(yīng)用，其特征在于該菌株適用于工業(yè)汞污水的處理，無(wú)公害蔬菜基地汞污染土壤的修復(fù)，水產(chǎn)養(yǎng)殖等場(chǎng)所汞污染水質(zhì)的處理。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高耐汞惡臭假單孢菌株CHY－7及其在治理汞污染中的應(yīng)用，屬利用微生物實(shí)施環(huán)保治理的項(xiàng)目。該菌株為惡臭假單孢菌(pseudomonasputida)CHY－7，已保藏“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”。該菌株是從汞污染的土壤中分離得到的；適宜在中性及弱酸性或弱堿性培養(yǎng)介質(zhì)中常溫培養(yǎng)，也可在自來(lái)水和土壤中生長(zhǎng)；其細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征為革蘭氏陰性桿菌，長(zhǎng)度為2.0－4.0×0.7－1.1μm，不產(chǎn)生芽孢，專(zhuān)性好氧；屬于惡臭假單孢菌，菌落淡黃色、邊緣光滑隆起，在色素生成培養(yǎng)基中可產(chǎn)生熒光。本發(fā)明從土壤中直接分離、篩選高耐汞、生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求低、適應(yīng)自然生態(tài)環(huán)境且生存能力強(qiáng)、具有高效還原離子態(tài)汞(Hg
文檔編號(hào)C12N1/20GK1683518SQ200510006009
公開(kāi)日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月6日
發(fā)明者陳貽鍇, 陽(yáng)菊華, 詹麗欽, 包幼迪 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)