專利名稱：假單胞菌Na的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因克隆，尤其是涉及一種假單胞菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)克隆。
背景技術(shù)：
目前從原核生物中克隆一個已知基因的常規(guī)做法是通過生物信息查尋，得知其它生物基因的序列后，再循兩條技術(shù)路線進(jìn)行克隆基因1.合成該基因的寡聚核苷酸DNA探針，以放射性同位素或非放射性化學(xué)物質(zhì)(例如發(fā)熒光物質(zhì))標(biāo)記該分子探針，將該探針與事先構(gòu)建的該生物基因組文庫進(jìn)行Southern雜交，釣出含有目的基因的DNA片段，對該片段測序；構(gòu)建含該片段的表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，檢測被該DNA片段轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)化子獲得的新蛋白及其新的生物學(xué)功能(參見文獻(xiàn)Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniantis TMolecular CloningA Laboratory Mannual(2nd).Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989.(金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南(第二版).北京科學(xué)出版社，1996))。
2.根據(jù)已知基因的兩端序列設(shè)計并人工合成3′端和5′端寡聚短核苷酸引物，以該生物的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并構(gòu)建重組質(zhì)粒，測序，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，檢測該DNA片段轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)化子獲得的新蛋白及其新的生物學(xué)功能(參見文獻(xiàn)吳乃虎編著.基因工程原理.北京科學(xué)出版社，1998)。
方法1需要事先構(gòu)建該生物的基因組文庫，然后化學(xué)合成放射性或非放射性DNA探針，再進(jìn)行大量的Southern雜交，費錢、費時，實驗周期又長；方法2比方法1簡單，但由于不同生物的基因序列并不完全相同，因此往往需合成多對的引物，然后在PCR反應(yīng)中設(shè)置多套循環(huán)參數(shù)，尤其是“退火”的溫度。這樣，方法2一般都要進(jìn)行多次的反復(fù)摸索才可能克隆出目的基因，本發(fā)明即借鑒這種方法，并進(jìn)行必需的修改和補充。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)基因(nha A)及一種既快捷又經(jīng)濟(jì)的克隆方法。
本發(fā)明所說的假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)基因(nha A)的序列如下
1ATGATTATGGCCAACAGCGGCGCAACCAGTGGATGGTATCACGACTTTCTGGAGACGCCG 6061 TTCACTCGGTTGGTTCACTCGAAATCAAGCAAAAACATGCTGTTATGGATAAATGACGCG 120121 CTGATGGCGGTATTTTTCCTGTTAGTCGGTCTGGAAGTTAAACGTGAACTGATGCAAGGA 180181 TCGCTAGCCAGCTTACGCCAGGCCGCATTTCCAGTTATCGCCGCTATTGGTGGGATGATT 240241 GTGCCGGCATTACTCTATCTGGCTATTAACTATGCCGATCCGATTACCCGCCAAGGGTGG 300301 GCGATCCCGGCGGCTACTGACATTGCTTTTGCACTTGGTGTACTGGCGCTGTTGGGAAGT 360361 CGTGTTCCGTTTGCGCTGAAGATCTTTATGATGGCTCTGGCTATTATCGACGATCTTGGG 420421 GCCATCATTATCATCGCATTGTTCTACACTAATGACTTATCGATGGCCTCTCTTGGCCTC 480481 GCGGCTGTAGCATTTGCGGTACTCGCGGTATTGAATCTGTGTGGTGCACGCCGCACGGGC 540541 GTCTATATTCTTGTTGGCGTGGTGTTGTGGACTGCGGTGTTGAAATCGGGGGTTCACGCA 600601 ACTCTGGCGGGGGTAATTGTCGGCTTCTTTATTCCTTTGAAAGAGAAGCATGGGCCTTCT 660661 CCAGCGAAGCGACTGGAGCATGTGTTGCACCCGTGGGTGGCGTATCTGATTTTGCCGCTG 720721 TTTGCATTTGCTAATGCTGGCGTTTCACTGCAAGGCGTCACGCTGGATGGCTTGACCTCC 780781 ATTCTGCCATTGGGGATCATCGCTGGCTTGCTGATTGGCAAACCGCTGGGGATTAGTCTG 840841 TTCTGCTGGTTGGCGCTGCGTTTGAAACTGGCGCATCTGCCTGAGGGAACGACTTATCAG 900901 CAAATTATGGTGGTGGGGATCGTGTGCGGTATCGGTTTTACTATGTCTATCTTTATTGCC 960961 AGCCTGGCCTTTGGTAGCGTAGATCCAGAACTGATTAACTGGGCGAAACTCGGTATCCTG 10201021 GTCGGTTCTATCTCTTCGGCGGTAATTGGATACAGCTGGTTACGCGTTCGTTTGCGTCCA 10801081 TCAGTTTGA 1089該基因長1089bp，編碼362個氨基酸。根據(jù)原核基因的特征分析，本序列的前3個核苷酸“ATG”(黑體字)為基因的起始密碼子；接著，根據(jù)三聯(lián)體密碼，可以推算出該基因的編碼氨基酸序列；最后的3個核苷酸“TGA”(黑體字)為基因的終止符。因此這是一個完整的結(jié)構(gòu)基因。通過BLAST軟件分析，該基因推測的編碼氨基酸序列如下MIMANSGATSGWYHDFLETPFTRLVHSKSSKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQGSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAINYADPITRQGWAIPAATDIAFALGVLALLGSRVPFALKIFMMALAIIDDLGAIIIIALFYTNDLSMASLGLAAVAFAVLAVLNLCGARRTGVYILVGWLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGPSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPSV將上述序列輸入美國GenBank數(shù)據(jù)庫分析DNA序列同源性、蛋白序列同源性和蛋白保守區(qū)域比較，結(jié)果如下P1atgattatggccaacagcggcgcaaccagtggatggtatcacgactttctggagacgccg 60||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2185 atgattatggccaacagcggcgcaaccagtggatggtatcacgactttctggagacgccg 2244P61 -ttca-ctc--ggttggttcactcgaaatcaagcaaaaacatgctgttatggataaatga 116|||| ||| ||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||E2245 gttcagctccgggttggttcactcgaaatcaa-caaaaacatgctgttatggataaatga 2303P117 cgcgctgatggcggtatttttcctgttagtcggtctggaagttaaacgtgaactgatgca 176||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2304 cgcgctgatggcggtatttttcctgttagtcggtctggaagttaaacgtgaactgatgca 2363P177 aggatcgctagccagcttacgccaggccgcatttccagttatcgccgctattggtgggat 236||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2364 aggatcgctagccagcttacgccaggccgcatttccagttatcgccgctattggtgggat 2423
P237 gattgtgccggcattactctatctggctattaactatgccgatccgattacccgccaagg 296|||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||E2424 gattgtgccggcattactctatctggcttttaactatgccgatccgattacccgcgaagg 2483P297 gtgggcgatcccggcggctactgacattgcttttgcacttggtgtactggcgctgttggg 356||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2484 gtgggcgatcccggcggctactgacattgcttttgcacttggtgtactggcgctgttggg 2543P357 aagtcgtgttccgtttgcgctgaagatctttatgatggctctggctattatcgacgatct 416||||||||||||||| ||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||E2544 aagtcgtgttccgttagcgctgaagatctttttgatggctctggctattatcgacgatct 2603P417 tggggccatcattatcatcgcattgttctacactaatgacttatcgatggcctctcttgg 476||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2604 tggggccatcattatcatcgcattgttctacactaatgacttatcgatggcctctcttgg 2663P477 cctcgcggctgtagcatttgcggtactcgcggtattgaatctgtgtggtgcacgccgcac 536| |||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2664 cgtcgcggctgtagcaattgcggtactcgcggtattgaatctgtgtggtgcacgccgcac 2723P537 gggcgtctatattcttgttggcgtggtgttgtggactgcggtgttgaaatcgggggttca 596||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2724 gggcgtctatattcttgttggcgtggtgttgtggactgcggtgttgaaatcgggggttca 2783P597 cgcaactctggcgggggtaattgtcggcttctttattcctttgaaagagaagcatgggcc 656||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2784 cgcaactctggcgggggtaattgtcggcttctttattcctttgaaagagaagcatgggcg 2843P657 ttctccagcgaagcgactggagcatgtgttgcacccgtgggtggcgtatctgattttgcc 716||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2844 ttctccagcgaagcgactggagcatgtgttgcacccgtgggtggcgtatctgattttgcc 2903P717 gctgtttgcatttgctaatgctggcgtttcactgcaaggcgtcacgctggatggcttgac 776||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2904 gctgtttgcatttgctaatgctggcgtttcactgcaaggcgtcacgctggatggcttgac 2963P777 ctccattctgccattggggatcatcgctggcttgctgattggcaaaccgctggggattag 836||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E2964 ctccattctgccattggggatcatcgctggcttgctgattggcaaaccgctggggattag 3023P837 tctgttctgctggttggcgctgcgtttgaaactggcgcatctgcctgagggaacgactta 896||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E3024 tctgttctgctggttggcgctgcgtttgaaactggcgcatctgcctgagggaacgactta 3083P897 tcagcaaattatggtggtggggatcgtgtgcggtatcggttttactatgtctatctttat 956||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||E3084 tcagcaaattatggtggtggggatcctgtgcggtatcggttttactatgtctatctttat 3143P957 tgccagcctggcctttggtagcgtagatccagaactgattaactgggcgaaactcggtat 1016||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E3144 tgccagcctggcctttggtagcgtagatccagaactgattaactgggcgaaactcggtat 3203P1017 cctggtcggttctatctcttcggcggtaattggatacagctggttacgcgttcgtttgcg 1076||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||E3204 cctggtcggttctatctcttcggcggtaattggatacagctggttacgcgttcgtttgcg 3263P1077 tccatcagtttga 1089|||||||||||||E3264 tccatcagtttga 3276注E為大腸桿菌K12的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因；P為假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因；比較發(fā)現(xiàn)，克隆的假單胞菌基因序列與大腸桿菌K12的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nhaA)高度同源，兩者之間不同的核苷酸已經(jīng)用黑色背景表示。因此初步判斷所克隆基因為假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)。
本基因已經(jīng)被美國GenBank數(shù)據(jù)庫收錄，收錄號為AF643494。
根據(jù)克隆的假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因，按照通用的三聯(lián)體遺傳密碼推測出它所編碼的酶蛋白序列，再與大腸桿菌K12的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白序列進(jìn)行同源性比較，它們完全相同的氨基酸數(shù)達(dá)95.3％。
P1MIMANSGATSGWYHDFLETPFTRLVHS-KSSKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQ 59E26 MIMANSGATSGWYHDFLETPVQLRVGSLEINKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQ 85P60 GSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAINYADPITRQGWAIPAATDIAFALGVLALLG 119E86 GSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAFNYADPITREGWAIPAATDIAFALGVLALLG 145 P180 GVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGPSPAKRLEHVLHPWVAYLILP 239E206 GVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGRSPAKRLEHVLHPWVAYLILP 265P240 LFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTY 299E266 LFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTY 325P300 QQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLR 359E326 QQIMVVGILCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLR 385P360 PSV 362E386 PSV 388注E大腸桿菌k12(E.coli k12)；P假單胞桿菌(Pseudomonas sp.cn4902)；不同氨基酸殘基之間用暗背景表示假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白與其他5種桿菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白保守區(qū)域比較如下
A 151 NDLSMASLGLAAVAFAVLAVLNLCGARRTGVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFF 210B 177 NDLSMASLGVAAVAIAVLAVLNLCGVRRTGVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFF 236C 189 HGLSVQALIFSAVAIIVLILLNRFRVSALCAYMVVGAILWASVLKSGVHATLAGVIIGFS 248D 177 HDLSPQAFIFAGIAVAILITMNRLKITALSAYGIVGIILWASVLKSGVHATLAGVIIGFC 236E 177 SDLSIVSLGVAAFAIAVLALLNLCGVRRTGVYILVGAVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFF 236F 169 SDLSTIALTIGFIMTGVLFMLNAKHVTKLSIYLVAGLILWIAVLKSGVHATLAGVVIGFA 228A 211 IPLK-EKHGPSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAG 269B 237 IPLK-EKHGRSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAG 295C 249 IPLK-GKKGERPLDDFEHILASWSSFVILPLFAFANAGVSFAGIDVNMISSPLLLAIASG 307D 237 IPLN-GKKGERPLDDFEHTLSPWSAFAILPLFAFCNAGVSLIGMGMDNLTSTLPMGIALG 295E 237 IPLK-EKHGRSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTIDGLTSMLPLGIIAG 295F 229 IPLKGNKGEHSPLKHLEHALHPYVAFAILPVFAFANAGISLQGVSLAGLTSMLPLGVALG 288A 270 LLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDP 329B 296 LLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMAVGILCGIGFTMSIFIASLAFGSVDP 355C 308 LIIGKPVGIFGFSYISVKLGLAKLPDGINFKQIFAVAVLCGIGFTMSMFLASLAFDANAG 367D 296 LLLGKPLGIFSFCFVAVKLGIAKLSEGINFKQIFAVSVLCGIGFTMSMFLAGLAFGGESD 355E 296 LLIGKPLGISLFCWLALRFKLAHLPQGTTYQQIMAVGILCGIGFTMSIFIASLAFGNVDP 355F 289 LFLGKPLGIFSFSWAAVKLGVAKLPEGINFKHIFAVSVLCGIGFTMSIFISSLAFGQANE 348A 330 --ELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPS-V 362B 356 --ELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPS-V 388C 368 -ESVNTLSRLGILLGSTVSAILGYLFLKQTTKLN-- 400D 356 SENVTALARLGILIGSGFSAVLGY------------ 379E 356 --ELINWAKLGILIGSLLSAWGYSWLRARLNAP-A 388F 349 --AYDTYARLGILMGSTTAALLGYSLLRLSLPLKKA 382注A假單胞桿菌(Pseudomonas sp.cn 4902)； B大腸桿菌(Escherichia coli)；C流感嗜血桿菌(Haemophilus influenae)； D多殺性巴斯德桿菌(Pasteurella multocida)；E鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhomurium)；F霍亂弧菌(Vibrio cholerae)；6種菌都相同的氨基酸已經(jīng)用黑色背景表示以上比較表明，假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因推測的多肽與其他5種桿菌的NhaA蛋白具有很高的同源性。在362個氨基酸殘基中完全相同的氨基酸高達(dá)149個，59處(黑背景表示)，占41.6％。其中最大的保守區(qū)域由連續(xù)13個氨基酸殘基組成(No.192～No.205)，連續(xù)5個以上氨基酸殘基完全一致的保守區(qū)域就有7處。
將上述克隆基因與表達(dá)載體連接成重組載體，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞(大腸桿菌)，提取轉(zhuǎn)化子的總蛋白進(jìn)行電泳(參見圖1)，發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白分子量大約為41kD，和理論推測值相符。
本發(fā)明所說的假單胞菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的具體步驟如下1、將假單胞菌在含NaCl0.1～0.9mol/L的培養(yǎng)基中，溫度為15～32℃，以100～150rpm的速度震蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長中后期；2、常規(guī)堿變性法提取假單胞菌的總DNA，經(jīng)紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應(yīng)≥1.8。若OD260/OD280比值≥1.8，說明所得DNA較純，可以進(jìn)入下一步驟；若OD260/OD280比值＜1.8，說明所得DNA純度不夠，應(yīng)進(jìn)一步純化，直至OD260/OD280比值≥1.8。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的分子量是否≥21kb。；若所提取DNA的分子量≥21kb則可以進(jìn)入下一步；3、根據(jù)幾種生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的序列設(shè)計引物，其中一對可較穩(wěn)定地獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物如下5’端引物5’ACCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’3’端引物5’TGGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’為了便于構(gòu)建原核基因表達(dá)載體，在5’端引物和3’端引物分別設(shè)計添加了Sma I和BamHI的酶切位點(下劃線)；4、PCR擴(kuò)增體系在0.5mL無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中依次加入重蒸水 9.2μL10×PCR緩沖液2.0μLMgCl2(25mmol/L) 1.2μLdNTPs(各2.5mmol/L) 0.4μL引物1(20mmol/L) 1.0μL引物2(20mmol/L) 1.0μL假單胞菌總DNA(5ng/μL) 5.0μLpfu DNA聚合酶(5u/μL)0.2μL—————————————————————————總體積 20.0μL5、PCR反應(yīng)參數(shù)95℃預(yù)變性，5min；94℃變性，1min；51℃退火，1min；72℃延伸，2min；35～40個循環(huán)，最后72℃延伸，10min，保存于4℃；6、PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在含有0.5～1.0μg/mL溴乙錠的0.8％～1.0％瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄，并在紫外燈下用鋒利的刀片切下擴(kuò)增的約1.1kb的條帶；7、參照華舜公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書，回收膠條中的約1.1kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；8、為了提高克隆效率，方便與T載體連接，需要在PCR產(chǎn)物末端加上一個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(A)，在0.5mL無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中依次加入重蒸水 1.2μL10×PCR緩沖液 2.0μLMgCl2(25mmol/L)1.2μLDNTPs(各2.5mmol/L) 0.4μL回收的PCR產(chǎn)物 15.0μLTaq DNA聚合酶(5u/μL) 0.2μL————————————————————————總體積 20.0μL
置恒溫72℃，10min后，加入2倍體積的冷無水乙醇(-20℃～0℃)，充分混勻，冰箱中靜置4～16h沉淀DNA；10000～15000g離心，棄上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?、參照大連寶生物工程公司的pMD18-T載體克隆方法進(jìn)行載體與DNA的連接，在無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中加入pMD18-T載體 1.0μL加“A”的PCR產(chǎn)物 4.0μL連接溶液I 5.0μL—————————————————————————總體積10.0μL恒溫16℃連接反應(yīng)過夜(15～24h)；10、全量連接液(優(yōu)選10μL)用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101(優(yōu)選100～200μL)后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)24～48h，形成單菌落；挑選白色菌落，在液體LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)(優(yōu)選100～150rpm)過夜(優(yōu)選12～16h)，堿裂解法提取其中的重組質(zhì)粒；11、以Sma I和Bam HI雙酶切法鑒定所擴(kuò)增的目的基因是否已經(jīng)插入重組質(zhì)粒中，在無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中加入下列酶切反應(yīng)液重蒸水 12.0μL10×緩沖液 2.0μL待鑒定質(zhì)粒 5.0μLBam HI 0.5μLSma I0.5μL—————————————————————————總體 20.0μL37℃水浴1.5～2.0h，65℃ 20～25min結(jié)束反應(yīng)，0.8％～1.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察，發(fā)現(xiàn)一條清晰的分子量大約為1.1kb的DNA條帶，即為所需的目的基因；也可利用上述一對引物對待鑒定質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測；12、檢測轉(zhuǎn)化子的耐鹽水平含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)48～60h，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子能夠在含NaCl 1.1mol/L的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長，而對照的最高耐鹽水平只達(dá)到1.0mol/L，可見轉(zhuǎn)入的外源基因與轉(zhuǎn)化子的耐鹽性提高密切相關(guān)；13、轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切或PCR鑒定后，對其中的克隆基因進(jìn)行測序；14、根據(jù)已測知的克隆基因序列，與美國GenBank等數(shù)據(jù)庫中的資料進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)的同源性比較，初步判斷克隆基因為假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)；
15、構(gòu)建原核基因表達(dá)重組質(zhì)粒以檢測克隆基因的表達(dá)效率及表達(dá)產(chǎn)物活性堿法大量提取上述重組質(zhì)粒及原核表達(dá)pBV220載體，利用Bam HI和Sma I內(nèi)切酶分別雙酶切上述兩種質(zhì)粒，電泳后從凝膠中回收各片段，在16℃用T4連接酶連接過夜(優(yōu)選12～18h)；以CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101，將轉(zhuǎn)化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取長出的重組子，提取其中的重組質(zhì)粒，用原內(nèi)切酶酶切并用0.8％～1.0％瓊脂糖電泳鑒定哪一株含正確的重組質(zhì)粒(即由Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因和pBV220載體構(gòu)成的重組質(zhì)粒)；16、提取轉(zhuǎn)化子的總蛋白將含重組pBV220質(zhì)粒(其中帶有上述Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因)的大腸桿菌JM101在含有60μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.8～0.9，立即轉(zhuǎn)入到42℃熱誘導(dǎo)基因表達(dá)4h，取1mL菌液離心收集菌體，加入2×SDS加樣緩沖液50μL及0.1體積的β-巰基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌體；10 000～12 000g離心10～15min后收集上清液，即為轉(zhuǎn)化子的總蛋白粗提取物；17、SDS-PAGE電泳檢測目的基因表達(dá)產(chǎn)物配制濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％的SDS-PAGE平板，分別加入轉(zhuǎn)化子和對照各20～30μL總蛋白粗提取物，SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在約41kD處出現(xiàn)的蛋白帶吸收峰值比對照高得多，即從原來的占總蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，說明轉(zhuǎn)化子能有效地轉(zhuǎn)錄并表達(dá)轉(zhuǎn)入的nha A基因；18、測定轉(zhuǎn)化子的生長曲線分別將篩選得到的轉(zhuǎn)化子和對照接種至5mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至指數(shù)生長期；分別吸取等量轉(zhuǎn)化子和對照至100mL含NaCl1.0mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃100～150rpm震蕩培養(yǎng)；每隔4～8h取樣測其OD600值，連續(xù)測48h，記錄各組數(shù)據(jù)；重復(fù)本實驗3次，求平均值作圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子和對照的生長都受到抑制，遲滯期延長，菌數(shù)到6h后才有較明顯的增長。但轉(zhuǎn)化子的生長速度和最終菌濃度遠(yuǎn)高于對照組。轉(zhuǎn)化子達(dá)到生長平衡期時的OD600值約為對照組的2.3倍(參見圖2)?？梢?，外源nha A基因使轉(zhuǎn)化子的耐鹽性明顯提高；19、測定轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度分別將轉(zhuǎn)化子和對照接種至200mL含NaCl 0.95mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩(100～150rpm)培養(yǎng)36～48h；以LB培養(yǎng)液稀釋轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液的濃度，使OD600≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3000～4000g，10～15min離心收集菌體；以50mmol/L葡萄糖溶液離心清洗菌體兩次除去菌體外可能吸附的Na+；用干凈濾紙吸干菌泥中可見的水分，加10mL濃HNO3溶解，電爐上加熱30min；冷卻后，加10mL HNO3-HClO4混合液(HNO3∶HClO4為3∶1)；加熱至有濃白煙產(chǎn)生，繼續(xù)加熱4～4.5h，蒸去大部分HNO3和HClO4；以無離子水將其稀釋至100mL；原子吸收光譜測定其中Na+濃度，并換算成轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度；經(jīng)兩次實驗后得知，轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度為14.3ng/106細(xì)胞，僅為對照的60.4％(參見圖3)，其原因就在于轉(zhuǎn)化子中由外源nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白不斷將Na+泵出胞外的緣故；20、轉(zhuǎn)化子中nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中的定位將轉(zhuǎn)化子接種至50～100mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩(100～150rpm)培養(yǎng)過夜(12～16h)；42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；用LB培養(yǎng)液調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化子和對照的菌液濃度，使其基本一致，冰浴中超聲破碎(功率為450W，處理5～7s，間隔9～15s，處理時間7～9min)；取樣番紅染色，在高倍鏡下(40×)檢查細(xì)菌破碎率，應(yīng)達(dá)到70％以上；低速離心(1 500～1 800g，10min)除去未破碎細(xì)胞，然后超速離心(100 000～150 000g，10min)收集細(xì)胞碎片；加重蒸水100μL，沸水浴10min，10 000～12 000g離心10min；取上清液20～25μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白主要位于細(xì)胞膜上(參見圖4)；21、轉(zhuǎn)化子丟失重組質(zhì)粒實驗將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于無抗性篩選(未添加氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基中，高溫(42℃)繼代培養(yǎng)18次(9天)，將上述多次繼代的轉(zhuǎn)化子分別涂布于①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨芐青霉素(Amp)60μg/mL的LB瓊脂培養(yǎng)基上(含瓊脂1.2～1.5％)，培養(yǎng)48～60h。實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)上述高溫處理的轉(zhuǎn)化子都不能在含Amp 60μg/mL的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長，其耐鹽性也回落到原初水平(即1.0mol/L)。隨機挑取10株經(jīng)上述高溫處理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培養(yǎng)基上長出的原轉(zhuǎn)化子，提取其中的質(zhì)粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們中的質(zhì)粒都已全部丟失。本實驗從反面證明了外源nha A基因與該菌的耐鹽性提高密切相關(guān)。
本方法也適用于克隆其它原核生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)。
在步驟4以及其它的PCR擴(kuò)增體系應(yīng)是無菌及無DNA污染的，所用的離心管應(yīng)為薄壁型的。
在步驟6和步驟11中將擴(kuò)增產(chǎn)物在含有0.5～1.0μg/mL溴乙錠的0.8％～1.0％瓊脂糖凝膠中電泳后，凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄，并在紫外燈下用鋒利的刀片切下擴(kuò)增的約1.1kb的條帶。這些操作都應(yīng)戴護(hù)目鏡和一次性塑料薄膜手套。
在步驟8、9、10中，各種操作都應(yīng)在超凈工作臺中進(jìn)行。
在步驟10中，應(yīng)在無菌條件下取100μL轉(zhuǎn)化子溶液分別用三角形無菌玻棒均勻涂抹在含Amp-Xgal-IPTG和Amp的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48h后，按常規(guī)挑選菌落呈白色的轉(zhuǎn)化子。
在步驟11中，以65℃處理20～25min使酶失活，結(jié)束反應(yīng)，應(yīng)在水浴中進(jìn)行。利用上述一對引物對待鑒定質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測的條件與步驟4和步驟5相同。
在步驟14中，所說的生物數(shù)據(jù)庫為GenBank或其他數(shù)據(jù)庫。
在步驟17和步驟20中，所說的SDS-PAGE電泳檢測目的基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，是一種垂直板凝膠電泳，所用電壓為50～100伏，電流強度為50～200毫安。
在步驟18中，所說的每隔4～8h取樣測培養(yǎng)液的OD600值，連續(xù)測48h，記錄各組數(shù)據(jù)；重復(fù)本實驗3次，求平均值作圖，測定轉(zhuǎn)化子的生長曲線，是建立在已經(jīng)完成了以下預(yù)實驗的基礎(chǔ)上取出少量菌液，測其OD600值；再定量取該液，并按1∶10的比例進(jìn)行系列稀釋，然后各取50μL各種稀釋度的菌液分別均勻地涂抹在瓊脂LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48h，計數(shù)各培養(yǎng)皿上長出的總菌數(shù)，再換算成該菌液的菌濃度，就得到某個菌液OD600值與總菌數(shù)的對應(yīng)關(guān)系。
在步驟19中所說的以原子吸收光譜法測定轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度時要經(jīng)過換算，是建立在事先已經(jīng)按同樣方法獲得了系列NaCl溶液經(jīng)原子吸收光譜法繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上。
在步驟21中所說的將轉(zhuǎn)化子在高溫(42℃)繼代培養(yǎng)18次(9天)，是指在震蕩(100～160rpm)條件下。
本發(fā)明根據(jù)幾種生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的序列設(shè)計引物，提取假單胞菌的總DNA，經(jīng)多次PCR試驗，克隆了假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)。實驗證明，該基因的表達(dá)蛋白位于細(xì)胞膜上，具有突出的將細(xì)胞內(nèi)的Na+泵出胞外的功能，同時使被該基因轉(zhuǎn)化的生物的耐鹽性大大提高。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)可用于培育轉(zhuǎn)基因耐鹽作物和動物，有利于充分利用廣袤的鹽堿地和海水(咸水)進(jìn)行種植和養(yǎng)殖，達(dá)到節(jié)約淡水和擴(kuò)大耕地面積的目的，因此該基因具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為含外源Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的大腸桿菌E.coli JM101的SDS-PAGE電泳圖譜。在圖1中，1為含外源Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的大腸桿菌E.coli JM101；2為對照；箭頭指處為41kD的蛋白帶。
圖2為轉(zhuǎn)化子在含NaCl 1.0mol/L的培養(yǎng)基中的生長曲線。在圖2中，橫坐標(biāo)為時間/小時(Time/h)。
圖3為轉(zhuǎn)化子和對照細(xì)胞中的Na+濃度比較。
圖4為轉(zhuǎn)化子細(xì)胞膜(壁)的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜。在圖4中，1為轉(zhuǎn)化子膜蛋白；2為對照的膜蛋白；3為轉(zhuǎn)化子總蛋白；4為對照的總蛋白；M為分子量標(biāo)記；箭頭指處為nha A基因表達(dá)的41kD蛋白。
具體實施例方式
以下實施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1從極端耐鹽的假單胞菌中克隆Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)，其步驟為1、將假單胞菌在含NaCl 0.5mol/L的培養(yǎng)基中，溫度為28℃，以100rpm的速度震蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長中后期；2、常規(guī)堿變性法提取假單胞菌的總DNA，經(jīng)紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應(yīng)≥1.8。
3、根據(jù)根據(jù)幾種生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的序列設(shè)計引物，其中一對可較穩(wěn)定地獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物如下5’端引物5’ACCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’3’端引物5’TGGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’為了便于構(gòu)建原核基因表達(dá)載體，在5’端引物和3’端引物分別設(shè)計添加了Sma I和BamHI的酶切位點(下劃線)。
4、PCR擴(kuò)增體系在0.5mL無菌無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中依次加入重蒸水 9.2μL10×PCR緩沖液 2.0μLMgCl2(25mmol/L)1.2μLDNTPs(各2.5mmol/L) 0.4μL引物1(20mmol/L) 1.0μL引物2(20mmol/L) 1.0μL假單胞菌總DNA(5ng/μL) 5.0μLpfu DNA聚合酶(5u/μL) 0.2μL—————————————————————————總體積 20.0μL5、PCR反應(yīng)參數(shù)95℃預(yù)變性，5min；94℃變性，1min；51℃退火，1min；72℃延伸，2min；40個循環(huán)。最后72℃延伸，10min，保存于4℃；6、PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在含有1.0μg/mL溴乙錠的1.0％瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄，并在紫外燈下用鋒利的刀片切下擴(kuò)增的約1.1kb的條帶。
7、參照華舜公司凝膠回收試劑盒說明書回收膠條中的約1.1kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；8、為了提高克隆效率，方便與T載體連接，需要在PCR產(chǎn)物末端加上一個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(A)。在0.5mL無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中依次加入重蒸水 1.2μL10×PCR緩沖液 2.0μLMgCl2(25mmol/L) 1.2μLdATP(2.5mmol/L)0.4μL回收的PCR產(chǎn)物 15.0μLTaq DNA聚合酶 (5u/μL)0.2μL——————————————————————————————總體積 20.0μL置恒溫72℃，10min后，加入2倍體積的冷無水乙醇(-18℃)，充分混勻，冰箱中靜置4h沉淀DNA；10000g離心，棄上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 9、參照大連寶生物工程公司的pMD18-T載體克隆方法進(jìn)行載體與DNA的連接。在無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中加入PMD18-T載體1.0μL加“A”的PCR產(chǎn)物 4.0μL連接溶液I 5.0μL——————————————————————————總體積 10.0μL恒溫16℃連接反應(yīng)過夜(16h)。
10、全量連接液(10μL)用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101(100μL)后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)24h，形成單菌落；挑選白色菌落，在液體LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)(150rpm)過夜(15h)，堿裂解法提取其中的重組質(zhì)粒；11、以Sma I和Bam HI雙酶切法鑒定所擴(kuò)增的目的基因是否已經(jīng)插入重組質(zhì)粒中 在無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中加入下列酶切反應(yīng)液重蒸水 12.0μL10×緩沖液 2.0μL待鑒定質(zhì)粒 5.0μLBam HI 0.5μLSma I 0.5μL————————————————————————總體積 20.0μL37℃水浴2.0h，65℃ 24min結(jié)束反應(yīng)，1.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察，發(fā)現(xiàn)一條清晰的分子量大約為1.1kb的DNA條帶，即為所需的目的基因。也可利用上述一對引物對待鑒定質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測。
12、檢測轉(zhuǎn)化子的耐鹽水平 含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)48h，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子能夠在含NaCl 1.1mol/L的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長，而對照的最高耐鹽水平只達(dá)到1.0mol/L。可見轉(zhuǎn)入的外源基因與轉(zhuǎn)化子的耐鹽性提高密切相關(guān)。
13、轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切或PCR鑒定后，對其中的插入基因進(jìn)行測序。測序結(jié)果見前述。
該基因長1089bp，編碼362個氨基酸。根據(jù)原核基因的特征分析，本序列的前3個核苷酸“ATG”為基因的起始密碼子；接著根據(jù)三聯(lián)體密碼，可以推算出該基因的編碼氨基酸序列；最后的3個核苷酸“TGA”為基因的終止符。因此這是一個完整的結(jié)構(gòu)基因。通過BLAST軟件分析，該基因推測的編碼氨基酸序列如下MIMANSGATSGWYHDFLETPFTRLVHSKSSKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQGSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAINYADPITRQGWAIPAATDIAFALGVLALLGSRVPFALKIFMMALAIIDDLGAIIIIALFYTNDLSMASLGLAAVAFAVLAVLNLCGARRTGVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGPSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPSV14、將上述測序結(jié)果輸入美國GenBank數(shù)據(jù)庫分析DNA序列同源性、蛋白序列同源性和蛋白保守區(qū)域比較，發(fā)現(xiàn)該基因序列與大腸桿菌K12的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因高度同源，其推測的蛋白序列與大腸桿菌K12的nha A基因推測的蛋白序列同源性達(dá)95％。因此初步判斷所克隆基因為假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)。
15、構(gòu)建原核基因表達(dá)重組質(zhì)粒以檢測克隆基因的表達(dá)效率及表達(dá)產(chǎn)物活性 堿法大量提取上述重組質(zhì)粒及pBV220載體，利用Bam HI和Sma I內(nèi)切酶分別雙酶切上述兩種質(zhì)粒，電泳后從凝膠中回收各片段，在16℃用T4連接酶連接過夜(約14h)；以CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101，將轉(zhuǎn)化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取長出的重組子，提取其中的重組質(zhì)粒，用原內(nèi)切酶酶切并用0.9％瓊脂糖電泳鑒定哪一株含正確的重組質(zhì)粒(即由Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因和pBV220載體構(gòu)成的重組質(zhì)粒)。
16、提取轉(zhuǎn)化子的總蛋白 將上述含Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的重組pBV220質(zhì)粒的大腸桿菌JM101在含有60μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.8，立即轉(zhuǎn)入到42℃誘導(dǎo)基因表達(dá)4h，取1mL菌液離心收集菌體，加入2×SDS加樣緩沖液50μL及0.1體積的β-巰基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌體；10 000g離心12min后收集上清液，即為轉(zhuǎn)化子的總蛋白粗提取物。
17、SDS-PAGE電泳檢測目的基因表達(dá)產(chǎn)物 配制濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％的SDS-PAGE平板，分別加入轉(zhuǎn)化子和對照的各20μL總蛋白粗提取物。SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在約41kD處出現(xiàn)的蛋白帶吸收峰值比對照高得多，即從原來的占總蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，說明轉(zhuǎn)化子能有效地轉(zhuǎn)錄并表達(dá)轉(zhuǎn)入的nha A基因。
18、測定轉(zhuǎn)化子的生長曲線 分別將篩選得到的轉(zhuǎn)化子和對照接種至5mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至指數(shù)生長期；分別吸取等量轉(zhuǎn)化子和對照至100mL含NaCl 1.0mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃120rpm震蕩培養(yǎng)；每隔4h取樣測其OD600值，連續(xù)測48h，記錄各組數(shù)據(jù)；重復(fù)本實驗3次，求平均值作圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子和對照的生長都受到的抑制，遲滯期延長，菌數(shù)到6h后才有較明顯的增長。但轉(zhuǎn)化子的生長速度和最終菌濃度遠(yuǎn)高于對照組。轉(zhuǎn)化子達(dá)到生長平衡期時的OD600值約為對照組的2.3倍?？梢姡庠磏ha A基因使轉(zhuǎn)化子的耐鹽性明顯提高。
19、測定轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度 分別將轉(zhuǎn)化子和對照接種至200mL含NaCl 0.95mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩(100rpm)培養(yǎng)48h；以LB培養(yǎng)液稀釋轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液的濃度，使OD600≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3000g，15min離心收集菌體；以50mmol/L葡萄糖溶液離心清洗菌體兩次除去菌體外可能吸附的Na+；用干凈濾紙吸干菌泥中可見的水分，加10mL濃HNO3溶解，電爐上加熱30min；冷卻后，加10mL HNO3-HClO4混合液(HNO3∶HClO4為3∶1)；加熱至有濃白煙產(chǎn)生，繼續(xù)加熱4h，蒸去大部分HNO3和HClO4；以無離子水將其稀釋至100mL；原子吸收光譜測定其中Na+濃度，并換算成轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度；經(jīng)兩次實驗后得知，轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度為14.3ng/106細(xì)胞，僅為對照的60.4％，其原因就在于轉(zhuǎn)化子中由nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白不斷將Na+泵出胞外的緣故。
20、檢測轉(zhuǎn)化子中nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中的定位 將轉(zhuǎn)化子接種至50～100mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩(110rpm)培養(yǎng)過夜(13h)；42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；用LB培養(yǎng)液調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化子和對照的菌液濃度，使其基本一致，冰浴中超聲破碎(功率為450W，處理7s，間隔9s，處理時間7min)；取樣番紅染色，在高倍鏡下(40×)檢查細(xì)菌破碎率，應(yīng)達(dá)到70％以上；低速離心(1500g，10min)除去未破碎細(xì)胞，然后超速離心(100 000g，10min)收集細(xì)胞碎片；加重蒸水100μL，沸水浴10min，10 000g離心10min；取上清液20μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白主要位于細(xì)胞膜上。
21、轉(zhuǎn)化子丟失重組質(zhì)粒實驗 將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于無抗性篩選的LB培養(yǎng)基中，42℃繼代培養(yǎng)18次，將上述多次繼代的轉(zhuǎn)化子分別涂布于①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨芐青霉素(Amp)60μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h。實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)上述高溫處理的轉(zhuǎn)化子都不能在含Amp 60μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上生長，其耐鹽性也回落到原初水平(即1.0mol/L)。隨機挑取10株經(jīng)上述高溫處理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培養(yǎng)基上長出的原轉(zhuǎn)化子，提取其中的質(zhì)粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們中的質(zhì)粒都已全部丟失。本實驗從反面證明了nha A基因與該菌的耐鹽性密切相關(guān)。
實施例2與實施例1類似，其區(qū)別在于將假單胞菌接種在含NaCl 0.7mol/L的培養(yǎng)基中，恒溫24℃，以150rpm的速度震蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長中后期，約為20h。常規(guī)堿變性法提取該菌的總DNA，經(jīng)紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應(yīng)≥1.8。
根據(jù)根據(jù)幾種生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的序列設(shè)計引物，其中一對可較穩(wěn)定地獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物如下5’端引物5’ACCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’3’端引物5’TGGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’為了便于構(gòu)建原核基因表達(dá)載體，在5’端引物和3’端引物分別設(shè)計添加了Sma I和BamHI的酶切位點(下劃線)。
在0.5mL無菌無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中依次加入下列試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)重蒸水 9.2μL10×PCR緩沖液2.0μLMgCl2(25mmol/L) 1.2μLdNTPs(各2.5mmol/L) 0.4μL引物1(20mmol/L) 1.0μL引物2(20mmol/L) 1.0μL假單胞菌總DNA(5ng/μL) 5.0μLpfu DNA聚合酶(5u/μL)0.2μL——————————————————————————總體積 20.0μLPCR反應(yīng)參數(shù)95℃預(yù)變性，5min；94℃變性，1min；51℃退火，1min；72℃延伸，2min；37個循環(huán)。最后72℃延伸，10min，保存于4℃；PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在含有0.6μg/mL溴乙錠的0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄，并在紫外燈下用鋒利的刀片切下擴(kuò)增的約1.1kb的條帶。參照華舜公司凝膠回收試劑盒說明書回收該條帶；為了提高克隆效率，方便與T載體連接，需要在PCR產(chǎn)物末端加上一個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(A)。在0.5mL無菌無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中依次加入
重蒸水 1.2μL10×PCR緩沖液2.0μLMgCl2(25mmol/L) 1.2μLdATP(2.5mmol/L)0.4μL回收PCR產(chǎn)物15.0μLTaq DNA聚合酶(5u/μL) 0.2μL——————————————————————————總體積 20.0μL置恒溫72℃，10min后，加入2倍體積的冷無水乙醇(-15℃)，充分混勻，冰箱中靜置5h沉淀DNA；15000g離心，棄上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。參照大連寶生物工程公司的pMD18-T載體克隆方法進(jìn)行載體與DNA的連接。在無菌無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中加入pMD18-T載體1.0μL加“A”的PCR產(chǎn)物 4.0μL連接溶液I 5.0μL——————————————————————————總體積 10.0μL恒溫16℃連接反應(yīng)過夜(18h)。
全量連接液(10μL)用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101(180μL)后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)28h，形成單菌落；挑選白色菌落，在液體LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)(110rpm)過夜(14h)，堿裂解法提取其中的重組質(zhì)粒；以Sma I和Bam HI雙酶切法鑒定所擴(kuò)增的目的基因是否已經(jīng)插入重組質(zhì)粒中 在無菌無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中加入下列酶切反應(yīng)液重蒸水 12.0μL10×緩沖液 2.0μL待鑒定質(zhì)粒 5.0μLBam HI 0.5μLSma I 0.5μL——————————————————————————總體積 20.0μL37℃水浴1.8h，65℃22min結(jié)束反應(yīng)，1.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察，發(fā)現(xiàn)一條清晰的分子量大約為1.1kb的DNA條帶，即為所需的目的基因。也可利用上述一對引物對待鑒定質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測。
檢測轉(zhuǎn)化子的耐鹽水平 含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)50h，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子能夠在含NaCl 1.1mol/L的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長，而對照的最高耐鹽水平只達(dá)到1.0mol/L。可見轉(zhuǎn)入的外源基因與轉(zhuǎn)化子的耐鹽性提高密切相關(guān)。
轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切或PCR鑒定后，對其中的插入基因進(jìn)行測序。發(fā)現(xiàn)它是一個完整的結(jié)構(gòu)基因。通過BLAST軟件分析，推測出該基因編碼的氨基酸序列。將上述序列輸入美國GenBank數(shù)據(jù)庫分析DNA序列同源性、蛋白序列同源性和蛋白保守區(qū)域比較，發(fā)現(xiàn)該基因序列與大腸桿菌K12的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)高度同源，其蛋白序列與大腸桿菌K12的nha A基因推測的蛋白序列同源性達(dá)95％。因此初步判斷所克隆基因為假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)。
構(gòu)建原核基因表達(dá)重組質(zhì)粒以檢測克隆基因的表達(dá)效率及表達(dá)產(chǎn)物活性 堿法大量提取上述重組質(zhì)粒及pBV220載體，利用Bam HI和Sma I內(nèi)切酶分別雙酶切上述兩種質(zhì)粒，電泳后從凝膠中回收各片段，在16℃用T4連接酶連接過夜(約16h)；以CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101，將轉(zhuǎn)化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取長出的重組子，提取其中的重組質(zhì)粒，用原內(nèi)切酶酶切并用1.0％瓊脂糖電泳鑒定哪一株含正確的重組質(zhì)粒(即由Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因和pBV220載體構(gòu)成的重組質(zhì)粒)。
提取轉(zhuǎn)化子的總蛋白 將上述含Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的重組pBV220質(zhì)粒的大腸桿菌JM101在含有60μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至0D600為0.9，立即轉(zhuǎn)入到42℃誘導(dǎo)基因表達(dá)4h，取1mL菌液離心收集菌體，加入2×SDS加樣緩沖液50μL及0.1體積的β-巰基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌體；11 000g離心后收集上清液，即為轉(zhuǎn)化子的總蛋白粗提取物。
SDS-PAGE電泳檢測目的基因表達(dá)產(chǎn)物 配制濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％的SDS-PAGE平板，分別加入轉(zhuǎn)化子和對照的各22μL總蛋白粗提取物。SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在約41kD處出現(xiàn)的蛋白帶吸收峰值比對照高得多，即從原來的占總蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，說明轉(zhuǎn)化子能有效地轉(zhuǎn)錄并表達(dá)轉(zhuǎn)入的nha A基因。
測定轉(zhuǎn)化子的生長曲線 分別將篩選得到的轉(zhuǎn)化子和對照接種至5mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至指數(shù)生長期；分別吸取等量轉(zhuǎn)化子和對照至100mL含NaCl 1.0mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃100rpm震蕩培養(yǎng)；每隔6h取樣測其OD600值，連續(xù)測48h，記錄各組數(shù)據(jù)；重復(fù)本實驗3次，求平均值作圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子和對照的生長都受到的抑制，遲滯期延長，菌數(shù)到6h后才有較明顯的增長。但轉(zhuǎn)化子的生長速度和最終菌濃度遠(yuǎn)高于對照組。轉(zhuǎn)化子達(dá)到生長平衡期時的OD600值約為對照組的2.3倍?？梢?，外源nha A基因使轉(zhuǎn)化子的耐鹽性明顯提高。
測定轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度 分別將轉(zhuǎn)化子和對照接種至200mL含NaCl 0.95mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩(110rpm)培養(yǎng)40h；以LB培養(yǎng)液稀釋轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液的濃度，使OD600≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3500g，11min離心收集菌體；以50mmol/L葡萄糖溶液離心清洗菌體兩次除去菌體外可能吸附的Na+；用干凈濾紙吸干菌泥中可見的水分，加10mL濃HNO3溶解，電爐上加熱30min；冷卻后，加10mL HNO3-HClO4混合液(HNO3∶HClO4為3∶1)；加熱至有濃白煙產(chǎn)生，繼續(xù)加熱4.2h，蒸去大部分HNO3和HClO4；以無離子水將其稀釋至100mL；原子吸收光譜測定其中Na+濃度，并換算成轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度；經(jīng)兩次實驗后得知，轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度為14.3ng/106細(xì)胞，僅為對照的60.4％，其原因就在于轉(zhuǎn)化子中由nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白不斷將Na+泵出胞外的緣故。
轉(zhuǎn)化子中nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中的定位 將轉(zhuǎn)化子接種至70mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩(130rpm)培養(yǎng)過夜(14h)；42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；用LB培養(yǎng)液調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化子和對照的菌液濃度，使其基本一致，冰浴中超聲破碎(功率為450W，處理6s，間隔10s，處理時間8min)；取樣番紅染色，在高倍鏡下(40×)檢查細(xì)菌破碎率，應(yīng)達(dá)到70％以上；低速離心(1700g，10min)除去未破碎細(xì)胞，然后超速離心(130 000g，10min)收集細(xì)胞碎片；加重蒸水100μL，沸水浴10min，11 000g離心10min；取上清液24μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白主要位于細(xì)胞膜上。
轉(zhuǎn)化子丟失重組質(zhì)粒實驗 將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于無抗性篩選的LB培養(yǎng)基中，42℃繼代培養(yǎng)18次，將上述多次繼代的轉(zhuǎn)化子分別涂布于①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨芐青霉素(Amp)60μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)50h。實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)上述高溫處理的轉(zhuǎn)化子都不能在含Amp 60μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上生長，其耐鹽性也回落到原初水平(即1.0mol/L)。隨機挑取10株經(jīng)上述高溫處理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培養(yǎng)基上長出的原轉(zhuǎn)化子，提取其中的質(zhì)粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們中的質(zhì)粒都已全部丟失。本實驗從反面證明了nha A基因與該菌的耐鹽性密切相關(guān)。
實施例3與實施例1類似，其區(qū)別在于將假單胞菌接種在含NaCl 0.4mol/L的培養(yǎng)基中，溫度為30℃，以110rpm的速度震蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長中后期；常規(guī)堿變性法提取假單胞菌的總DNA，經(jīng)紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應(yīng)≥1.8。
根據(jù)根據(jù)幾種生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的序列設(shè)計引物，其中一對可較穩(wěn)定地獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物如下5’端引物5’ACCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’3’端引物5’TGGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’
為了便于構(gòu)建原核基因表達(dá)載體，在5’端引物和3’端引物分別設(shè)計添加了Sma I和BamHI的酶切位點(下劃線)。
在0.5mL無菌無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中依次加入下列試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增重蒸水 9.2μL10×PCR緩沖液2.0μLMgCl2(25mmol/L) 1.2μLdNTPs(各2.5mmol/L) 0.4μL引物1(20mmol/L) 1.0μL引物2(20mmol/L) 1.0μL假單胞菌總DNA(5ng/μL) 5.0μLpfuDNA聚合酶(5u/μL) 0.2μL———————————————————————————總體積 20.0μLPCR反應(yīng)參數(shù)95℃預(yù)變性，5min；94℃變性，1min；51℃退火，1min；72℃延伸，2min；35個循環(huán)。最后72℃延伸，10min，保存于4℃；PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在含有0.5μg/mL溴乙錠的0.9％瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄，并在紫外燈下用鋒利的刀片切下擴(kuò)增的約1.1kb的條帶。按華舜公司凝膠回收試劑盒說明書回收該條帶；為了提高克隆效率，方便與T載體連接，需要在PCR產(chǎn)物末端加上一個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(A)。在0.5mL無菌無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中依次加入重蒸水1.2μL10×PCR緩沖液 2.0μLMgCl2(25mmol/L) 1.2μLdATP(2.5mmol/L) 0.4μL回收的PCR產(chǎn)物 15.0μLTaq DNA聚合酶(5u/μL) 0.2μL—————————————————————————總體積20.0μL置恒溫72℃，10min后，加入2倍體積的冷無水乙醇(-4℃)，充分混勻，冰箱中靜置12h沉淀DNA；13 000g離心，棄上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩⒄沾筮B寶生物工程公司的pMD18-T載體克隆方法進(jìn)行載體與DNA的連接。在無菌無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中加入pMD18-T載體 1.0μL加“A”的PCR產(chǎn)物4.0μL連接溶液I 5.0μL—————————————————————————總體積 10.0μL恒溫16℃連接反應(yīng)過夜(22h)。
全量連接液(10μL)用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101(150μL)后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)44h，形成單菌落；挑選白色菌落，在液體LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)(120rpm)過夜(16h)，堿裂解法提取其中的重組質(zhì)粒；以Sma I和Bam HI雙酶切法鑒定所擴(kuò)增的目的基因是否已經(jīng)插入重組質(zhì)粒中 在無菌無DNA污染的薄壁離心管(Eppendorf)中加入下列酶切反應(yīng)液重蒸水 12.0μL10×緩沖液 2.0μL待鑒定質(zhì)粒 5.0μLBam HI 0.5μLSma I 0.5μL—————————————————————————總體積 20.0μL37℃水浴1.6h，65℃ 20min結(jié)束反應(yīng)，0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察，發(fā)現(xiàn)一條清晰的分子量大約為1.1kb的DNA條帶，即為所需的目的基因。也可利用上述一對引物對待鑒定質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測。
檢測轉(zhuǎn)化子的耐鹽水平 含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)60h，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子能夠在含NaCl 1.1mol/L的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長，而對照的最高耐鹽水平只達(dá)到1.0mol/L。可見轉(zhuǎn)入的外源基因與轉(zhuǎn)化子的耐鹽性提高密切相關(guān)。
轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切或PCR鑒定后，對其中的插入基因進(jìn)行測序。發(fā)現(xiàn)這是一個完整的結(jié)構(gòu)基因。通過BLAST軟件推測該基因編碼的氨基酸序列。將上述序列輸入美國GenBank數(shù)據(jù)庫分析DNA序列同源性、蛋白序列同源性和蛋白保守區(qū)域比較，發(fā)現(xiàn)該基因序列與大腸桿菌K12的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)高度同源，其蛋白序列與大腸桿菌K12的nha A基因推測的蛋白序列同源性達(dá)95％。因此初步判斷所克隆基因為假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(nha A)。
構(gòu)建原核基因表達(dá)重組質(zhì)粒以檢測克隆基因的表達(dá)效率及表達(dá)產(chǎn)物活性 堿法大量提取上述重組質(zhì)粒及原核表達(dá)載體pBV220，利用Bam HI和Sma I內(nèi)切酶分別雙酶切上述兩種質(zhì)粒，電泳后從凝膠中回收各片段，在16℃用T4連接酶連接過夜(約14h)；以CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101，將轉(zhuǎn)化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取長出的重組子，提取其中的重組質(zhì)粒，用原內(nèi)切酶酶切并用1.0％瓊脂糖電泳鑒定哪一株含正確的重組質(zhì)粒(即由Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因和pBV220載體構(gòu)成的重組質(zhì)粒)。
提取轉(zhuǎn)化子的總蛋白 將上述含Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的重組pBV220質(zhì)粒的大腸桿菌JM101在含有60μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.9，立即轉(zhuǎn)入到42℃誘導(dǎo)基因表達(dá)4h，取1mL菌液離心收集菌體，加入2×SDS加樣緩沖液50μL及0.1體積的β-巰基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌體；12 000g離心13min后收集上清液，即為轉(zhuǎn)化子的總蛋白粗提取物。
SDS-PAGE電泳檢測目的基因表達(dá)產(chǎn)物 配制濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％的SDS-PAGE平板，分別加入轉(zhuǎn)化子和對照的各25μL總蛋白粗提取物。SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在約41kD處出現(xiàn)的蛋白帶吸收峰值比對照高得多，即從原來的占總蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，說明轉(zhuǎn)化子能有效地轉(zhuǎn)錄并表達(dá)轉(zhuǎn)入的nha A基因。
測定轉(zhuǎn)化子的生長曲線 分別將篩選得到的轉(zhuǎn)化子和對照接種至5mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至指數(shù)生長期；分別吸取等量轉(zhuǎn)化子和對照至100mL含NaCl 1.0mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃150rpm震蕩培養(yǎng)；每隔8h取樣測其OD600值，連續(xù)測48h，記錄各組數(shù)據(jù)；重復(fù)本實驗3次，求平均值作圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子和對照的生長都受到的抑制，遲滯期延長，菌數(shù)到6h后才有較明顯的增長。但轉(zhuǎn)化子的生長速度和最終菌濃度遠(yuǎn)高于對照組。轉(zhuǎn)化子達(dá)到生長平衡期時的OD600值約為對照組的2.3倍。可見，外源nha A基因使轉(zhuǎn)化子的耐鹽性明顯提高。
測定轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度 分別將轉(zhuǎn)化子和對照接種至200mL含NaCl 0.95mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩(140rpm)培養(yǎng)42h；以LB培養(yǎng)液稀釋轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液的濃度，使OD600≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3600g，12min離心收集菌體；以50mmol/L葡萄糖溶液離心清洗菌體兩次除去菌體外可能吸附的Na+；用干凈濾紙吸干菌泥中可見的水分，加10mL濃HNO3溶解，電爐上加熱30min；冷卻后，加10mL HNO3-HClO4混合液(HNO3∶HClO4為3∶1)；加熱至有濃白煙產(chǎn)生，繼續(xù)加熱4.5h，蒸去大部分HNO3和HClO4；以無離子水將其稀釋至100mL；原子吸收光譜測定其中Na+濃度，并換算成轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度；經(jīng)兩次實驗后得知，轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度為14.3ng/106細(xì)胞，僅為對照的60.4％，其原因就在于轉(zhuǎn)化子中由nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白不斷將Na+泵出胞外的緣故。
轉(zhuǎn)化子中nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中的定位 將轉(zhuǎn)化子接種至80mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩(150rpm)培養(yǎng)過夜(16h)；42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；用LB培養(yǎng)液調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化子和對照的菌液濃度，使其基本一致，冰浴中超聲破碎(功率為450W，處理5s，間隔15s，處理時間9min)；取樣番紅染色，在高倍鏡下(40×)檢查細(xì)菌破碎率，應(yīng)達(dá)到70％以上；低速離心(1800g，10min)除去未破碎細(xì)胞，然后超速離心(150 000g，10min)收集細(xì)胞碎片；加重蒸水100μL，沸水浴10min，12 000g離心10min；取上清液21μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白主要位于細(xì)胞膜上。
轉(zhuǎn)化子丟失重組質(zhì)粒實驗 將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于無抗性篩選的LB培養(yǎng)基中，42℃繼代培養(yǎng)18次，將上述多次繼代的轉(zhuǎn)化子分別涂布于①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨芐青霉素(Amp)60μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)50h。實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)上述高溫處理的轉(zhuǎn)化子都不能在含Amp 60μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上生長，其耐鹽性也回落到原初水平(即1.0mol/L)。隨機挑取10株經(jīng)上述高溫處理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培養(yǎng)基上長出的原轉(zhuǎn)化子，提取其中的質(zhì)粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們中的質(zhì)粒都已全部丟失。本實驗從反面證明了nha A基因與該菌的耐鹽性密切相關(guān)。
權(quán)利要求
1.假單胞菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因，其特征在于其序列如下1 ATGATTATGGCCAACAGCGGCGCAACCAGTGGATGGTATCACGACTTTCTGGAGACGCCG 6061TTCACTCGGTTGGTTCACTCGAAATCAAGCAAAAACATGCTGTTATGGATAAATGACGCG 120121 CTGATGGCGGTATTTTTCCTGTTAGTCGGTCTGGAAGTTAAACGTGAACTGATGCAAGGA 180181 TCGCTAGCCAGCTTACGCCAGGCCGCATTTCCAGTTATCGCCGCTATTGGTGGGATGATT 240241 GTGCCGGCATTACTCTATCTGGCTATTAACTATGCCGATCCGATTACCCGCCAAGGGTGG 300301 GCGATCCCGGCGGCTACTGACATTGCTTTTGCACTTGGTGTACTGGCGCTGTTGGGAAGT 360361 CGTGTTCCGTTTGCGCTGAAGATCTTTATGATGGCTCTGGCTATTATCGACGATCTTGGG 420421 GCCATCATTATCATCGCATTGTTCTACACTAATGACTTATCGATGGCCTCTCTTGGCCTC 480481 GCGGCTGTAGCATTTGCGGTACTCGCGGTATTGAATCTGTGTGGTGCACGCCGCACGGGC 540541 GTCTATATTCTTGTTGGCGTGGTGTTGTGGACTGCGGTGTTGAAATCGGGGGTTCACGCA 600601 ACTCTGGCGGGGGTAATTGTCGGCTTCTTTATTCCTTTGAAAGAGAAGCATGGGCCTTCT 660661 CCAGCGAAGCGACTGGAGCATGTGTTGCACCCGTGGGTGGCGTATCTGATTTTGCCGCTG 720721 TTTGCATTTGCTAATGCTGGCGTTTCACTGCAAGGCGTCACGCTGGATGGCTTGACCTCC 780781 ATTCTGCCATTGGGGATCATCGCTGGCTTGCTGATTGGCAAACCGCTGGGGATTAGTCTG 840841 TTCTGCTGGTTGGCGCTGCGTTTGAAACTGGCGCATCTGCCTGAGGGAACGACTTATCAG 900901 CAAATTATGGTGGTGGGGATCGTGTGCGGTATCGGTTTTACTATGTCTATCTTTATTGCC 960961 AGCCTGGCCTTTGGTAGCGTAGATCCAGAACTGATTAACTGGGCGAAACTCGGTATCCTG 10201021 GTCGGTTCTATCTCTTCGGCGGTAATTGGATACAGCTGGTTACGCGTTCGTTTGCGTCCA 10801081 TCAGTTTGA1089本基因基因長1089bp，編碼362個氨基酸。根據(jù)原核基因的特征分析，序列的前3個核苷酸“ATG”(黑體字)為基因的起始密碼子；接著，根據(jù)三聯(lián)體密碼，推算出該基因的編碼氨基酸序列；最后的3個核苷酸“TGA”(黑體字)為基因的終止符；通過BLAST軟件分析，該基因推測的編碼氨基酸序列如下MIMANSGATSGWYHDFLETPFTRLVHSKSSKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQGSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAINYADPITRQGWAIPAATDIAFALGVLALLGSRVPFALKIFMMALAIIDDLGAIIIIALFYTNDLSMASLGLAAVAFAVLAVLNLCGARRTGVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGPSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPSV
2.克隆假單胞菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因方法，其特征在于其步驟為1)將極端耐鹽假單胞菌接種在含NaCl 0.1～0.9mol/L的培養(yǎng)基中，溫度為15～32℃，以100～150rpm的速度震蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長中后期；2)常規(guī)堿變性法提取極端耐鹽假單胞菌或其它耐鹽原核生物的總DNA，經(jīng)紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應(yīng)≥1.8，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的分子量是否≥21kb；若OD260/OD280比值≥1.8，進(jìn)入下一步驟；若OD260/OD280比值＜1.8，進(jìn)一步純化，直至OD260/OD280比值≥1.8；3)根據(jù)幾種生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的序列設(shè)計引物，其中一對可較穩(wěn)定地獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物如下5’端引物5’ACCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’3’端引物5’TGGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’為了便于構(gòu)建原核基因表達(dá)載體，在5’端引物和3’端引物分別設(shè)計添加了Sma I和BamHI的酶切位點(下劃線)；4)PCR反應(yīng)的各項參數(shù)為95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性1min；51℃退火1min；72℃延伸2min；35～40個循環(huán)，最后72℃延伸10min，保存于4℃；5)PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在含有0.5～1.0μg/mL溴乙錠的0.8％～1.0％瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄，并在紫外燈下用鋒利的刀片切下擴(kuò)增的約1.1kb的條帶；6)在PCR產(chǎn)物末端加上一個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(A)，在0.5mL無菌無DNA污染的薄壁離心管中依次加入各所需試劑，置恒溫72℃反應(yīng)10min后，加入2倍體積的冷無水乙醇，溫度為-20～0℃，混勻，靜置4～16h沉淀DNA；10000～15000g離心，棄上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?)進(jìn)行載體與DNA的連接，在無菌無DNA污染的薄壁離心管中加入各所需試劑，恒溫16℃連接反應(yīng)過夜，全量連接液用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)形成單菌落；8)挑選白色菌落，在液體LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)過夜，堿裂解法提取其中的重組質(zhì)粒；以Sma I和Bam HI雙酶切法鑒定所擴(kuò)增的目的基因是否已經(jīng)插入重組質(zhì)粒中，在無菌無DNA污染的薄壁離心管中依次加入酶切反應(yīng)液，37℃水浴1.5～2.0h，65℃20～25min結(jié)束反應(yīng)，0.8％～1.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察，發(fā)現(xiàn)一條清晰的分子量大約為1.1kb的DNA條帶，即為所需的目的基因；本步驟也可以利用上述一對引物對待鑒定質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測；9)檢測轉(zhuǎn)化子的耐鹽水平含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)48～60h；10)轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切或PCR鑒定后，對其中的克隆基因進(jìn)行測序；11)根據(jù)已測知的克隆基因序列，與生物數(shù)據(jù)庫中的資料進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)的同源性比較，初步判斷克隆基因為假單胞菌的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因；12)構(gòu)建原核基因表達(dá)重組質(zhì)粒以檢測克隆基因的表達(dá)效率及表達(dá)產(chǎn)物活性堿法大量提取上述重組質(zhì)粒及原核表達(dá)pBV220載體，利用Bam HI和Sma I內(nèi)切酶分別雙酶切上述兩種質(zhì)粒，電泳后從凝膠中回收各片段，在16℃用T4連接酶連接過夜；以CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101，將轉(zhuǎn)化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取長出的重組子，提取其中的重組質(zhì)粒，用原內(nèi)切酶酶切并用0.8％～1.0％瓊脂糖電泳鑒定哪一株含正確的重組質(zhì)粒，即由Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因和pBV220載體構(gòu)成的重組質(zhì)粒；13)提取轉(zhuǎn)化子的總蛋白將含Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的重組pBV220質(zhì)粒的大腸桿菌JM101在含有60μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.8～0.9，立即轉(zhuǎn)入到42℃熱誘導(dǎo)基因表達(dá)4h，取1mL菌液離心收集菌體，加入2×SDS加樣緩沖液50μL及0.1體積的β-巰基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌體；10000～12000g離心10～15min后收集上清液，即為轉(zhuǎn)化子的總蛋白粗提取物；14)SDS-PAGE電泳檢測目的基因表達(dá)產(chǎn)物配制濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％的SDS-PAGE平板，分別加入轉(zhuǎn)化子和對照各20～30μL總蛋白粗提取物，SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在約41kD處出現(xiàn)的蛋白帶吸收峰值比對照高得多，即從原來的占總蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，說明轉(zhuǎn)化子能有效地轉(zhuǎn)錄并表達(dá)轉(zhuǎn)入的nha A基因；15)測定轉(zhuǎn)化子的生長曲線分別將篩選得到的轉(zhuǎn)化子和對照培養(yǎng)在含NaCl 1.0mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃100～150rpm震蕩培養(yǎng)；每隔4～8h取樣測其OD600值，連續(xù)測48h，記錄各組數(shù)據(jù)；重復(fù)本實驗3次，求平均值作圖；16)測定轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度分別將轉(zhuǎn)化子和對照在含NaCl 0.95mol/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)36～48h；以LB培養(yǎng)液稀釋轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液的濃度，使OD600≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3000～4000g，10～15min離心收集菌體；以50mmol/L葡萄糖溶液離心清洗菌體兩次除去菌體外可能吸附的Na+；用干凈濾紙吸干菌泥中可見的水分，加10mL濃HNO3溶解，電爐上加熱30min；冷卻后，加10mL HNO3-HClO4混合液；加熱至有濃白煙產(chǎn)生，繼續(xù)加熱4～4.5h，蒸去大部分HNO3和HClO4；以無離子水將其稀釋至100mL；原子吸收光譜測定其中Na+濃度，并換算成轉(zhuǎn)化子中的Na+濃度；17)轉(zhuǎn)化子中nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中的定位將轉(zhuǎn)化子接種至液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜；42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；用LB培養(yǎng)液調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化子和對照的菌液濃度，冰浴中超聲破碎；取樣番紅染色，檢查細(xì)菌破碎率，應(yīng)達(dá)到70％以上；離心除去未破碎細(xì)胞，再收集細(xì)胞碎片；加重蒸水，沸水浴，離心，取上清液20～25μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nha A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的蛋白主要位于細(xì)胞膜上；18)轉(zhuǎn)化子丟失重組質(zhì)粒實驗將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于無抗性篩選的LB培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)，分別涂布于①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨芐青霉素60μg/mL的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48～60h；隨機挑取10株經(jīng)上述高溫處理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培養(yǎng)基上長出的原轉(zhuǎn)化子，提取其中的質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求2所述的克隆假單胞菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因方法，其特征在于在步驟5)中采用凝膠回收試劑盒回收經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增的凝膠中的DNA片段；回收后的DNA片段經(jīng)含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠的含量為1‰。
4.如權(quán)利要求2所述的克隆假單胞菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因方法，其特征在于在步驟7)中，將回收的DNA片段與線性載體共育過夜，載體的量至少1倍于DNA片段；轉(zhuǎn)化用CaCl2處理獲得的感受態(tài)受體菌通常都用大腸桿菌。
5.如權(quán)利要求2所述的克隆假單胞菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因方法，其特征在于在步驟7)中，在無菌條件下各取100μL轉(zhuǎn)化子溶液分別用三角形無菌玻棒均勻涂抹在高鹽和含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48～60h后，按常規(guī)挑選既能在高鹽瓊脂培養(yǎng)基上生長又在含Amp-Xgal-IPTG培養(yǎng)基上菌落呈白色的轉(zhuǎn)化子。
6.如權(quán)利要求2所述的克隆假單胞菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因方法，其特征在于在步驟11)中，所說的生物數(shù)據(jù)庫為GenBank或其他數(shù)據(jù)庫。
7.如權(quán)利要求2所述的克隆假單胞菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因方法，其特征在于在步驟15)中，所說的對照為未經(jīng)遺傳學(xué)處理的大腸桿菌，分別接種在含NaCl為0.9～1.0mol/L的高鹽液態(tài)LB培養(yǎng)基中，在恒溫37℃、100～150rpm的搖床中連續(xù)培養(yǎng)48～60h，每隔4～8h取樣檢測其中的含菌數(shù)。
全文摘要
假單胞菌Na
文檔編號C12N15/31GK1667122SQ20051000657
公開日2005年9月14日 申請日期2005年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者劉廣發(fā), 陳啟偉 申請人:廈門大學(xué)