專利名稱：肽類天然微生物防腐劑產(chǎn)生菌及應(yīng)用和防腐劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肽類防腐劑產(chǎn)生菌的分離鑒定及該防腐劑產(chǎn)生菌代謝產(chǎn)物的應(yīng)用和以該防腐劑產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物為原料制備天然微生物防腐劑的方法。
背景技術(shù)：
防腐劑分為化學(xué)防腐劑和天然微生物防腐劑兩種。目前國內(nèi)外在食品工業(yè)中大量使用的防腐劑仍是人工化學(xué)方法合成的，在生產(chǎn)過程中使用的原料、輔料和添加劑本身或其中含有的雜質(zhì)都可能對人類健康造成傷害；化學(xué)防腐劑很多不是自然界自然存在的物質(zhì)，其對人體健康是否存在潛在的慢性毒性或三致作用還不完全清楚。目前我國批準使用的天然微生物防腐劑只有納他霉素和Nisin等少數(shù)幾種，品種很單一，而且微生物天然防腐劑具有異味和雜色等方面的缺陷。
無論是化學(xué)防腐劑還是天然防腐劑都存在抑菌譜窄的問題，如目前在市場上占有重要地位的Nisin只對革蘭氏陽性菌有抑制作用而對革蘭氏陰性菌物無抑制作用。多數(shù)防腐劑的抑菌都要求有適用的環(huán)境，或是酸性或是中性，如Nisin只在酸性條件下有抑菌作用。許多乳酸菌可代謝產(chǎn)生肽類物質(zhì)，目前研究清楚的Nisin是乳酸鏈球菌代謝產(chǎn)生，許多學(xué)者分離到了多種產(chǎn)生防腐劑的乳酸菌，但關(guān)于產(chǎn)物的性質(zhì)、分子量大小、產(chǎn)生菌的種類等目前多處于研究之中。
國外研究中，Richter報導(dǎo)該菌用于生產(chǎn)乳酸，乳酸產(chǎn)率達94％；Mercenier，Shaw等報導(dǎo)Lactobacillus paracasei具有很強的免疫刺激能力；Philippe報導(dǎo)Lactobacillus paracasei可用于治療過敏性鼻炎等疾病，此外還有許多關(guān)于該菌具有很好的治療腸道功能障礙的報導(dǎo)；Mexico的H.MINOR-PEREZ報導(dǎo)了Lactobacillus paracasei可產(chǎn)生細菌素。CN1556851A中公開了一種“新的類干酪乳桿菌菌株”，該菌株用于發(fā)酵干酪。CN1406274A中公開了一種“新穎的抗幽門螺桿菌和大腸桿菌157H7的類干酪乳桿菌類干酪亞種菌株的抗細菌記”，它是從豬的糞便中獲得的類干酪乳桿菌菌株，具有抗幽門螺桿菌和大腸桿菌0517的特性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肽類天然微生物防腐劑產(chǎn)生菌及應(yīng)用和防腐劑的制備方法，該產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物可以用做防腐劑，肽類防腐劑是采用微生物純種發(fā)酵代謝產(chǎn)生的，產(chǎn)物為肽類，安全性很高。
本發(fā)明的肽類防腐劑產(chǎn)生菌已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址中國，武漢，珞珈山，郵政編碼430072)保藏，命名為副干酪乳桿菌HD1.7(Lactobacillus paracasei HD1.7)，保藏編號為CCTCC NOM205015，保藏日期為2005年2月5日。
本發(fā)明的產(chǎn)生菌是采用常規(guī)平板劃線分離法，使用乳酸菌球和乳酸菌桿兩類分離培養(yǎng)基從齊齊哈爾豐源食品有限公司L-乳酸菌腌制酸菜發(fā)酵液中分離獲得。根據(jù)菌體形態(tài)和大小確定Lactobacillus paracasei HD1.7為細菌，根據(jù)乳酸細菌的定義確定該菌為乳酸菌，根據(jù)《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》乳桿菌屬的生理生化特征確定該菌為乳桿菌屬。根據(jù)與該菌生理生化性質(zhì)相近的乳桿菌的16SrDNA序列設(shè)計引物，通過PCR擴增、連接T載體、轉(zhuǎn)化、PCR鑒定、提取質(zhì)粒、測序、比對，依據(jù)其與副干酪乳桿菌中多株DNA序列的高度同源性，鑒定為Lactobacillus paracasei(副干酪乳桿菌)；再依據(jù)該菌株的分離來源與新產(chǎn)物特征特性等命名為Lactobacillus paracasei HD1.7株，其生物學(xué)特性如下A、Lactobacillus paracasei HD1.7為革蘭氏陽性菌，桿狀，菌落小，呈圓形；在15～45℃條件下培養(yǎng)均生長；異型發(fā)酵，可利用多種糖和醇，如甘露糖、乳糖、葡萄糖、果糖、松三糖、纖維二糖、麥芽糖、木糖、水楊苷、七葉苷、半乳糖、蜜二糖等；接觸酶試驗為陰性，不產(chǎn)生H2S，培養(yǎng)基為pH4.5的條件下生長，不液化明膠，不產(chǎn)吲哚，聯(lián)苯胺反應(yīng)陰性，硝酸鹽還原試驗陰性；B、Lactobacillus paracasei HD1.7培養(yǎng)進入對數(shù)生長期后，開始產(chǎn)生相對分子量為3000～30000的肽類；穩(wěn)定期產(chǎn)量達到高峰，隨后產(chǎn)量有小幅度增加；Lactobacillus paracasei HD1.7產(chǎn)生的肽類物質(zhì)在菌體內(nèi)外均可檢測到；C、從培養(yǎng)開始到穩(wěn)定期之間產(chǎn)生大量乳酸，以后乳酸產(chǎn)量有少量增加；該菌可作為乳酸產(chǎn)生菌，用于乳酸的生產(chǎn)和應(yīng)用工業(yè)；D、該菌具有調(diào)整胃腸道功能、治療過敏性鼻炎等多種治療功效。
該菌產(chǎn)生的肽類防腐劑是一種新型的天然微生物防腐劑，此防腐劑天然、安全、抑菌范圍更廣、適用范圍更寬；該菌產(chǎn)生的防腐劑為分子量3000～30000的肽類物質(zhì)；經(jīng)發(fā)酵條件研究，確定了Lactobacillus paracasei HD1.7的培養(yǎng)條件；經(jīng)培養(yǎng)基成分優(yōu)化研究，確定種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基成分。該菌的代謝產(chǎn)物可以生產(chǎn)肽類天然微生物防腐劑。
Lactobacillus paracasei HD1.7產(chǎn)生的肽類防腐劑的制備方法包括下述步驟a、肽類防腐劑的發(fā)酵將Lactobacillus paracasei HD1.7的保藏斜面劃線接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，35～40℃倒置培養(yǎng)36～48h后接種到種子發(fā)酵液中，在35～40℃下靜止培養(yǎng)24～36h，再按1～3％的接種量接于擴大培養(yǎng)發(fā)酵液中，在35～40℃下靜止培養(yǎng)24～36h，再以1～3％的接種量接于二級擴大培養(yǎng)發(fā)酵液中，在35～40℃下靜止培養(yǎng)24～36h，繼續(xù)按1～3％的接種量接種到發(fā)酵液中，在35～40℃靜止培養(yǎng)30～50h；b、肽類防腐劑的分離將Lactobacillus paracasei HD1.7菌株發(fā)酵液在4500r/min的條件下離心10min，在上清液中加入正丙醇和NaCl至過飽和，進行反復(fù)萃取、鹽析；然后加入-20℃的丙酮沉淀肽類防腐劑，將沉淀物再溶于HCl中，過夜后加KH2PO4沉淀肽類防腐劑，將沉淀物再溶于HCl中；加入丁醇和醋酸，并用氨水調(diào)體系的pH值至3.5，上層中加入冷丙酮，將沉淀物離心獲得肽類防腐劑干粉。由于制得的樣品中含有鹽，采用相對分子量截留范圍為3500～7000的透析袋透析；再用CM Sephadex C-25凝膠層析，接收并合并活性成分，使用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，制得肽類防腐劑干粉。經(jīng)Lactobacillus paracasei HD1.7發(fā)酵制得的肽類防腐劑經(jīng)進一步分離純化后，能夠很好地解決微生物天然防腐劑具有異味和雜色等方面的問題。
本發(fā)明分離到了一株新的產(chǎn)天然防腐劑的菌株，經(jīng)生理生化及16SrDNA測序、比對，鑒定為副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei HD1.7)。副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei HD1.7)的代謝產(chǎn)物是一種安全、抑菌范圍更廣、適用范圍更寬的肽類天然防腐劑。Lactobacillus paracasei HD1.7產(chǎn)生的肽類防腐劑抑菌譜較寬，既對革蘭氏陽性菌有抑菌作用又對革蘭氏陰性菌有抑制作用，對多種致病菌也有抑菌作用。Lactobacillus paracaseiHD1.7發(fā)酵獲得的肽類防腐劑在酸性及中性偏酸性環(huán)境中均有抑菌作用。
其具有如下特點(1)該代謝產(chǎn)物為肽類物質(zhì)代謝產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶處理后，抑菌活性消失，說明產(chǎn)物為蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)；代謝產(chǎn)物經(jīng)有機溶劑萃取粗提后進行電泳，經(jīng)與Marker比對確定產(chǎn)物中至少有三種肽類物質(zhì)，分子量在3000～30000之間；(2)肽類物質(zhì)的抑菌譜及抑菌能力小分子肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃色微球菌、枯草芽孢桿菌等均有抑制作用，即對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑制作用；對沙門氏菌、巨大芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、志賀氏菌、李斯特菌、變形桿菌等致病菌均有抑制作用；(3)肽類防腐劑的性質(zhì)A、對溫度的敏感性Lactobacillus paracasei HD1.7產(chǎn)生的肽類防腐劑在120℃條件下處理60min，其抑菌活性基本不受影響，說明具有很強的熱穩(wěn)定性；B、對酶的敏感性對胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、K-蛋白酶不敏感；C、在不同pH條件下抑菌效果在pH為2、3、4、5、6、7條件下均有抑菌活性，pH＝2時抑菌活性最強。
本發(fā)明具有如下特點1、分離到了一株新的產(chǎn)生天然防腐劑的菌株---Lactobacillus paracaseiHD1.7(副干酪乳桿菌HD1.7)，該菌株不僅能產(chǎn)生廣譜、高效肽類防腐劑，還能產(chǎn)生大量乳酸，因此既可用于生產(chǎn)防腐劑又可用于生產(chǎn)乳酸；該菌本身具有保健、治療功效，可用于調(diào)節(jié)胃腸道功能、應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉，還可用于治療過敏性鼻炎等免疫系統(tǒng)疾??；2、Lactobacillus paracasei HD1.7代謝產(chǎn)生了一種新型、天然的肽類微生物防腐劑，該防腐劑抑菌范圍更廣，既對革蘭氏陽性菌有抑制作用、又對革蘭氏陰性菌有抑制作用，對多種致病菌也有抑制作用；適用范圍更寬，在酸性及中性偏酸性條件下均有抑菌作用，適用于果蔬、乳、肉、蛋等各種食品的環(huán)境；抑菌效果更強，明顯強于在國內(nèi)外市場占有重要地位的同類產(chǎn)品Nisin；豐富了天然微生物防腐劑市場，能夠大大促進只允許添加天然防腐劑的綠色食品、保健食品的發(fā)展，也進一步保護了人類的健康；3、本發(fā)明研究清楚了Lactobacillus paracasei HD1.7的發(fā)酵條件，確定了接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)方式；經(jīng)培養(yǎng)基成分研究，確定了不同N源、不同C源、不同金屬離子、不同濃度磷源對肽類防腐劑產(chǎn)量及菌體生物量的影響，并優(yōu)化得到了可以獲得高菌體生物量的種子培養(yǎng)基和可以獲得肽類防腐劑高產(chǎn)量及低成本發(fā)酵培養(yǎng)基，為該項目的投產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明的Lactobacillus paracasei HD1.7的菌落形態(tài)圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式是這樣分離鑒定副干酪乳桿菌HD1.7的①采用常規(guī)平板劃線分離的方法從L-乳酸菌腌制酸菜發(fā)酵液中分離菌株。
②能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)菌株的篩選各單菌落經(jīng)平板擴大培養(yǎng)后，接入發(fā)酵液37℃培養(yǎng)48h，發(fā)酵液3500r/min離心12min，吸取100μl上清液，分別點入枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等12種指示菌的雙層檢測平板中，培養(yǎng)12～24h，觀察抑菌效果，保留抑菌譜廣、抑菌能力強的菌株。
③獲得的一株能代謝產(chǎn)生肽類防腐劑的菌株，經(jīng)生理生化及16SrDNA測序、比對，鑒定為副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei HD1.7)。
具體實施方式
如下(1)采用常規(guī)的培養(yǎng)特性、生理生化特性鑒定肽類防腐劑產(chǎn)生菌為乳桿菌屬；(2)采用16SrDNA寡核苷酸的堿基序列分析的方法分析程序為根據(jù)乳桿菌屬中許多種的16SrDNA基因兩端的保守序列設(shè)計PCR引物，采用溶菌酶-SDS-醋酸鉀法提取DNA，通過PCR擴增，電泳，回收PCR產(chǎn)物，將PCR的產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上，經(jīng)在菌體內(nèi)擴增后以帶有16SrDNA基因的載體作為模板，以M13F或M13R為引物測序，進行16SrDNA序列分析，鑒定肽類防腐劑產(chǎn)生菌為Lactobacillus paracaseiHD1.7(副干酪乳桿菌HD1.7)。
具體實施方式
二本實施方式的肽類天然微生物防腐劑制備方法包括下述步驟a、肽類防腐劑的發(fā)酵將Lactobacillus paracasei HD1.7的保藏斜面，劃線接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，35～40℃倒置培養(yǎng)36～48h后接種到種子發(fā)酵液中，在35～40℃下靜止培養(yǎng)24～36h，再按1～3％的接種量接于擴大培養(yǎng)發(fā)酵液中，在35～40℃下靜止培養(yǎng)24～36h，再以1～3％的接種量接于二級擴大培養(yǎng)發(fā)酵液中，在35～40℃下靜止培養(yǎng)24～36h，繼續(xù)按1～3％的接種量接種到發(fā)酵液中，在35～40℃靜止培養(yǎng)30～50h；b、肽類防腐劑的分離提純將Lactobacillus paracasei HD1.7菌株發(fā)酵液在4500r/min的條件下離心10min，在上清液中加入正丙醇和NaCl至過飽和，進行反復(fù)萃取、鹽析；然后加入-20℃的丙酮沉淀肽類防腐劑，將沉淀物再溶于HCl中，過夜后加KH2PO4沉淀肽類防腐劑，將沉淀物再溶于HCl中；加入丁醇和醋酸，并用氨水調(diào)體系的pH值至3.5，上層中加入冷丙酮，將沉淀物離心獲得肽類防腐劑干粉。
發(fā)酵工藝參數(shù)為(一)培養(yǎng)基1、種子發(fā)酵液、擴大培養(yǎng)發(fā)酵液和二級擴大培養(yǎng)發(fā)酵液均由下述成分組成碳源1～3g/L、氮源1～5g/L、金屬離子0.0001～0.001mol/L、吐溫0.1～1.0ml、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀0.01～0.02g/L。
a、碳源可為葡萄糖、蔗糖、乳糖中的一種或幾種，最佳碳源是葡萄糖，濃度為1～3g/L；b、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰胨、聚胨等有機氮源中的一種或幾種，尿素、豆?jié){、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2CO3、NaNO3等無機氮源菌中的一種或幾種均可作為氮源，最佳氮源是酵母膏和/或牛肉膏，濃度為酵母膏1～5g/L、牛肉膏1～5g/L；c、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等中的一種或幾種金屬離子均有促進該菌生長和促進肽類物質(zhì)產(chǎn)生的作用，最佳金屬離子是Ca2+和/或Mn2+，濃度為Ca2+0.001～0.01mol/L、Mn2+0.0001～0.001mol/L；
2、發(fā)酵培養(yǎng)基由下述成分組成豆芽50g～500g/L、番茄100～300g/L、白菜100～700g/L、蔗糖10～30g/L、或葡萄糖5～20g/L、復(fù)合維生素10～50ug/L、蛋白胨1～5g/L、或牛肉膏1～5g/L、或酵母膏1～5g/L、NaCl5～30g/L。
(二)培養(yǎng)條件a、在有氧、無氧、兼性厭氧、充氮、充CO2條件下Lactobacillus paracaseiHD1.7均可生長、產(chǎn)生肽類物質(zhì)；b、在培養(yǎng)溫度15～45℃條件下Lactobacillus paracasei HD1.7均可生長、產(chǎn)生肽類物質(zhì)；c、在發(fā)酵液pH值4.0～7.5條件下Lactobacillus paracasei HD1.7均可生長、產(chǎn)生肽類物質(zhì)；d、在接種量1～10％條件下Lactobacillus paracasei HD1.7均可產(chǎn)生肽類物質(zhì)；e、Lactobacillus paracasei HD1.7產(chǎn)肽類防腐劑高峰期為培養(yǎng)20～30小時，生產(chǎn)時為使不完全同步生長的菌都充分產(chǎn)生肽類防腐劑，將發(fā)酵時間定為30～50小時；f、靜止培養(yǎng)和震蕩培養(yǎng)Lactobacillus paracasei HD1.7均可生長、產(chǎn)生肽類物質(zhì)。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二不同的是，它還包括c步驟，c步驟為肽類防腐劑的純化由于制得的樣品中含有鹽，采用相對分子量截留范圍為3500～7000的透析袋透析；再用CM Sephadex C-25凝膠層析，接收并合并活性成分，使用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，制得肽類防腐劑干粉。經(jīng)Lactobacillus paracasei HD1.7發(fā)酵制得的肽類防腐劑經(jīng)進一步分離純化后，能夠很好地解決微生物天然防腐劑具有異味和雜色等方面的問題。
序列表<110>黑龍江大學(xué)<120>肽類天然微生物防腐劑產(chǎn)生菌及其代謝產(chǎn)物的發(fā)酵方法與應(yīng)用<160>1<170>Patent-In 3.1<210>1<211>1109<212>DNA<213>副干酪乳桿菌HD1.7(Lactobacillus paracasei HD1.7)的16SrDNA序列<400>1ccggggatcc tctagagatt acggctacct tgttacgact tcaccctaat catttgtccc 60accttagacg gctcgctccc taaaagggtt acgccaccgg cttcgggtgt tacaaactct 120catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg cgtgctgatc 180cgcgattact agcgattccg acttcgtgta ggcgagttgc agcctacagt ccgaactgag 240aatggcttta agagattagc ttgacctcgc ggtctcgcaa ctcgttgtac catccattgt 300agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct 360ccggtttgtc accggcagtc ttactagagt gcccaactaa atgctggcaa ctagtcataa 420gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat 480gcaccacctg tcattttgcc cccgaagggg aaacctgatc tctcaggtga tcaaaagatg 540tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 600gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggaatg 660cttaatgcgt tagctgcggc actgaagggc ggaaaccctc caacacctag cattcatcgt 720ttacggcatg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgcta cccatgcttt cgagcctcag 780cgtcagttac agaccagaca gccgccttcg ccactgtgtt tcttccatat atctacgcat 840tcaccgctac acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caggttccag ttccgatgcg 900cttctcggtt aggcggaggg cttcacatcc gactaaaaac cgctgccctc gcttacgcca 960taaatccgaa aaccttgcac ctacgtaata cgcggctgct gcacgtatta gcctggcttc 1020cggttggaat ccgttcagcc ggaacgttac tttgccgaac aatcttttct caccaccgag 1080ttatccaccc cgaaggcctt ctttactca1109
權(quán)利要求
1.肽類天然微生物防腐劑產(chǎn)生菌，命名為副干酪乳桿菌HD1.7(Lactobacillus paracasei HD1.7)，保藏編號為CCTCC NOM205015。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽類天然微生物防腐劑產(chǎn)生菌，其特征在于所述副干酪乳桿菌HD1.7的16SrDNA序列為CCGGGGATCCTCTAGAGATTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCTAATCATTTGTCCCACCTTAGACGGCTCGCTCCCTAAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGTGTTTCTTCCATATATCTACGCATTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAGGTTCCAGTTCCGATGCGCTTCTCGGTTAGGCGGAGGGCTTCACATCCGACTAAAAACCGCTGCCCTCGCTTACGCCATAAATCCGAAAACCTTGCACCTACGTAATACGCGGCTGCTGCACGTATTAGCCTGGCTTCCGGTTGGAATCCGTTCAGCCGGAACGTTACTTTGCCGAACAATCTTTTCTCACCACCGAGTTATCCACCCCGAAGGCCTTCTTTACTCA。
3.肽類天然微生物防腐劑產(chǎn)生菌的應(yīng)用，其特征在于肽類防腐劑產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物用于生產(chǎn)肽類天然微生物防腐劑。
4.肽類天然微生物防腐劑的制備方法，其特征在于它包括下述步驟a、肽類防腐劑的發(fā)酵將Lactobacillus paracasei HD1.7斜面保藏，劃線接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，35～40℃倒置培養(yǎng)36～48h后接種到種子發(fā)酵液，在35～40℃下靜止培養(yǎng)24～36h，再按1～3％的接種量接于擴大培養(yǎng)發(fā)酵液中，在35～40℃下靜止培養(yǎng)24～36h，再以1～3％的接種量接于二級擴大培養(yǎng)發(fā)酵液中，在35～40℃下靜止培養(yǎng)24～36h，繼續(xù)按1～3％的接種量接種到發(fā)酵液中，在35～40℃靜止培養(yǎng)30～50h；c、肽類防腐劑的分離將Lactobacillus paracasei HD1.7菌株發(fā)酵液在4500r/min的條件下離心10min，在上清液中加入正丙醇和NaCl至過飽和，進行反復(fù)萃取、鹽析；然后加入-20℃的丙酮沉淀肽類防腐劑，將沉淀物再溶于HCl中，過夜后加KH2PO4沉淀肽類防腐劑，將沉淀物再溶于HCl中；加入丁醇和醋酸，并用氨水調(diào)體系的pH值至3.5，上層中加入冷丙酮，將沉淀物離心獲得肽類防腐劑干粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽類天然微生物防腐劑的制備方法，其特征在于它還包括d步驟，d步驟為肽類防腐劑的純化采用相對分子量截留范圍為3500～7000的透析袋對c步驟得到的防腐劑進行透析；再用CMSephadex C-25凝膠層析接收并合并活性成分，使用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，制得純化后的肽類防腐劑干粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽類天然微生物防腐劑的制備方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基由下述成分組成豆芽50g～500g/L、番茄100～300g/L、白菜100～700g/L、蔗糖10～30g/L、蔗糖或葡萄糖5～20g/L、復(fù)合維生素10～50ug/L、蛋白胨1～5g/L、牛肉膏1～5g/L、酵母膏1～5g/L、NaCl5～30g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽類天然微生物防腐劑的制備方法，其特征在于種子發(fā)酵液、擴大培養(yǎng)發(fā)酵液和二級擴大培養(yǎng)發(fā)酵液均由下述成分組成碳源1～3g/L、氮源1～5g/L、金屬離子0.0001～0.001mol/L、吐溫0.1～1.0ml、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀0.01～0.02g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肽類天然微生物防腐劑的制備方法，其特征在于所述碳源為葡萄糖、蔗糖、乳糖中的一種或幾種的混合物；所述氮源為酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰胨、聚胨、尿素、豆?jié){、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2CO3、NaNO3中的一種或幾種的混合物；所述金屬離子為Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Fe2+中的一種或幾種的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肽類天然微生物防腐劑的制備方法，其特征在于所述碳源為葡萄糖；所述氮源為酵母膏和/或牛肉膏；所述金屬離子為Ca2+和/或Mn2+。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肽類天然微生物防腐劑的制備方法，其特征在于種子發(fā)酵液、擴大培養(yǎng)發(fā)酵液和二級擴大培養(yǎng)發(fā)酵液的pH值為4.0～7.5。
全文摘要
肽類天然微生物防腐劑產(chǎn)生菌及應(yīng)用和防腐劑的制備方法，它涉及一種防腐劑產(chǎn)生菌及該防腐劑產(chǎn)生菌代謝產(chǎn)物的應(yīng)用和以該防腐劑產(chǎn)生菌代謝產(chǎn)物為原料制備天然微生物防腐劑的方法。本發(fā)明的肽類產(chǎn)生菌命名為副干酪乳桿菌HD1.7(Lactobacillus paracaseiHD1.7)，保藏編號為CCTCCM 205015。副干酪乳桿菌HD1.7代謝產(chǎn)物是一種肽類防腐劑，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃色微球菌、枯草芽孢桿菌等均有抑制作用，對沙門氏菌、巨大芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、志賀氏菌、李斯特菌、變形桿菌等致病菌均有抑制作用；經(jīng)120℃、60min處理其抑菌活性基本不受影響，說明它具有很強的熱穩(wěn)定性；對多種蛋白酶不敏感，在中性、酸性條件下均有抑菌作用。
文檔編號C12N15/31GK1670184SQ200510009788
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者平文祥, 周東坡, 雷虹, 李秀涼, 張欽革, 王建臣, 賈樹彪 申請人:黑龍江大學(xué), 齊齊哈爾市豐源食品有限公司