專(zhuān)利名稱(chēng)：用igfbp2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法
(一)、所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用分子標(biāo)記檢測(cè)雞體脂性狀的方法。
(二)、背景技術(shù)經(jīng)過(guò)多年對(duì)肉雞的科學(xué)選育，現(xiàn)代肉雞的生產(chǎn)性能有了顯著提高。但是，在肉雞早期生長(zhǎng)速度得以明顯提高的同時(shí)，伴隨著出現(xiàn)的突出問(wèn)題是腹脂沉積過(guò)多，肉仔雞體內(nèi)沉積過(guò)多的脂肪有諸多不利(1)明顯降低飼料轉(zhuǎn)化效率，因?yàn)槌练e單位重量的脂肪組織比沉積單位重量的瘦肉多消耗三倍的能量；(2)降低了胴體瘦肉對(duì)脂肪組織的比例，因而降低了分割肉產(chǎn)量；(3)加工者和消費(fèi)者將肉仔雞體內(nèi)沉積的這些脂肪的很大一部分(腹脂墊、肌胃周?chē)尽⑧监熘炯澳c系膜脂肪等)丟棄，這不僅增加了加工者和消費(fèi)者的負(fù)擔(dān)，而且增加了廢物及處理水中的脂肪含量，從而污染環(huán)境。由此看來(lái)，肉仔雞體內(nèi)沉積過(guò)多的脂肪將會(huì)給生產(chǎn)者、加工者和消費(fèi)者造成顯而易見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)損失。肉種雞過(guò)肥將會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)蛋率、受精率和孵化率，并且會(huì)誘導(dǎo)脂肪肝綜合癥的發(fā)生，從而加大了產(chǎn)蛋期的死淘率。因此，控制脂肪在雞體內(nèi)的過(guò)多蓄積，進(jìn)一步提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化效率和胴體質(zhì)量是我國(guó)急需研究解決的重大問(wèn)題。
類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白II(Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2，IGFBP2)是循環(huán)系統(tǒng)中含量第二大的IGFBPs(Rajaram等，1997)，分子量大約在31-32KDa(Vivian等，1999)，具有廣泛的生物學(xué)功能，它能調(diào)節(jié)IGFs、TGFβ等生長(zhǎng)因子的生物活性，還可能擁有自己的特異性受體直接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用(Slootweg等，1995)。試驗(yàn)表明，在生物體內(nèi)IGFBP2具有影響脂類(lèi)代謝、調(diào)節(jié)體重等重要生理功能(Hoeflich等，1998；Brockmann等，2001)。
IGFBP2被多種細(xì)胞所分泌，存在于細(xì)胞外、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。完整的IGFBP2能與IGFs結(jié)合，但被蛋白酶水解之后，與IGFs的親和力會(huì)隨之降低(Hoeflich個(gè)人主頁(yè))。IGFBP2對(duì)IGFs活性有抑制作用，由于與IGF2的親和力遠(yuǎn)大于IGF1(Rajaram等，1997)，所以對(duì)IGF2的抑制作用更強(qiáng)一些。IGFs和TGFβ是刺激脂肪前體細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子(Butterwith等，1991)，IGFBP2可以調(diào)節(jié)IGFs(Rajaram等，1997)和TGF β(Richardson等，1998)在脂肪組織的活性，間接影響脂肪細(xì)胞的增殖。據(jù)報(bào)道，人的IGFBP2血漿含量與體重、腹脂重呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)(Brockmann等，2001)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IGFBP2血漿含量與瘦素(Leptin)血漿含量呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，Leptin是脂肪代謝的重要調(diào)節(jié)因子，影響脂肪沉積，可見(jiàn)IGFBP2對(duì)脂肪代謝有影響，但I(xiàn)GFBP2與Leptin之間的具體作用機(jī)制還不清楚。在生長(zhǎng)激素超量表達(dá)的小鼠中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法使IGFBP2超量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的腹脂降低(P＝0.08)(Hoeflich等，2001)；對(duì)小鼠IGFBP2的血漿含量研究發(fā)現(xiàn)，低脂小鼠血漿IGFBP2的相對(duì)含量明顯高于肥胖小鼠，IGFBP2相對(duì)含量與脂肪重呈負(fù)相關(guān)(Brockmann等，2001)，這一結(jié)果與在人上的研究結(jié)果相似。
雞IGFBP2的cDNA是從胚胎的視網(wǎng)膜中克隆得到的(Schoen等，1995)，其前體蛋白包含311個(gè)氨基酸殘基組成，除去36個(gè)殘基的信號(hào)肽，成熟蛋白為275個(gè)氨基酸殘基，與鼠、牛、綿羊和人的cDNA同源性分別為71％、68％、68％、66％。雞IGFBP2有4個(gè)外顯子，也具有哺乳動(dòng)物的IGFBP2擁有的RGD和ATTTA結(jié)構(gòu)域，其mRNA比人、鼠、綿羊的mRNA都長(zhǎng)，約2.3kb，因?yàn)殡u的IGFBP2有一個(gè)較長(zhǎng)的3’調(diào)控區(qū)(Schoen等，1995)。與哺乳動(dòng)物相似，雞胚胎期IGFBP2基因就有豐富表達(dá)，表達(dá)部位有眼睛、腦、骨骼肌、心臟、小腸和肝臟(Schoen等，1995)。
李志輝等(2003)對(duì)雞IGFBP2基因研究發(fā)現(xiàn)，在該基因的中發(fā)現(xiàn)一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，該位點(diǎn)是由序列中1196處一個(gè)C→A的點(diǎn)突變?cè)斐傻?GenBank Accession NoU15086)。
(三)、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種分子生物學(xué)技術(shù)，即采用PCR和SSCP方法，用聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)雞腹脂含量，從而預(yù)示和鑒定雞體脂性狀的分子標(biāo)記方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1、根據(jù)雞IGFBP2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物IGFBP2F5’-GGG ACT GCT TTC CAA TAG-3’IGFBP2R5’-TTA CAG TCT TTG GTC TCG G-3’2、利用該引物對(duì)雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
3、使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出IGFBP2基因3’調(diào)控區(qū)的C1196A的單堿基變異。
4、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析發(fā)現(xiàn)3種譜帶分別命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。取兩個(gè)純合基因型的片斷進(jìn)行回收，并克隆到載體，測(cè)序結(jié)果表明，AA型的基因序列和GenBank(Accession NoU15086)中的一致，定義為野生型；BB型發(fā)生了1196處發(fā)生堿基突變，為C1196A，定義為突變型。
本發(fā)明還可以包括1、其中分析基因多態(tài)性的方法是通過(guò)檢測(cè)單堿基變異而分類(lèi)的基因型。
2、其中用于分析基因多態(tài)性的區(qū)域是3’調(diào)控區(qū)。
3、其中用于分析基因多態(tài)性的區(qū)域是由IGFBP2F和IGFBP2R表示的引物擴(kuò)增的3’調(diào)控區(qū)。
4、其中用于分析多態(tài)性的位點(diǎn)選自在GenBank(Accession NoU15086)登錄的雞IGFBP2基因序列中第1196位的1個(gè)C→A堿基的變異。
5、其中雞體脂性狀是雞的腹脂重，腹脂率。
6、其中SSCP分析中的聚丙烯酰胺凝膠濃度為16％。
實(shí)驗(yàn)證明AA基因型雞只的腹脂重、腹脂率均顯著(P＜0.05或極顯著P＜0.01)低于BB基因型雞只的腹脂重、腹脂率。
本發(fā)明巧妙地采用PCR擴(kuò)增和SSCP的方法檢測(cè)了雞IGFBP2基因3’調(diào)控區(qū)的C1196A的單堿基變異，操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。使用本發(fā)明的標(biāo)記基因型對(duì)雞的體脂進(jìn)行選擇時(shí)，7周齡的腹脂重和腹脂率最高可以分別取得17.62％和15.14％的遺傳進(jìn)展，可以加速低脂雞的育種進(jìn)程。


附圖1是IGFBP2基因C1196A單堿基變異多態(tài)位點(diǎn)分析。
(五)、具體實(shí)施方案下面舉例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)地描述一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和性狀測(cè)定①AA肉雞、海蘭蛋雞和地方品種北京油雞、白耳雞、石歧雜共5個(gè)隨機(jī)群體。
②東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高低脂系第六世代、第七世代資源群體，分別選取了227和435只雞。7周齡時(shí)翅靜脈采血，草酸鹽抗凝；稱(chēng)量活重之后屠宰，稱(chēng)量屠體重、腹脂重等性狀。
③東北農(nóng)業(yè)大學(xué)建立的以高脂肉雞和白耳雞為親本雜交產(chǎn)生的F2資源群體(NEAUF2)，本研究共計(jì)選取540只雞。12周齡時(shí)翅靜脈采血，草酸鹽抗凝；稱(chēng)量活重之后屠宰，稱(chēng)量屠體重、腹脂重等性狀。
2.藥品和酶三羥甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co；Tris飽和酚，北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；蛋白酶K(Proteinase K)，MMERCK Co；DL 2000、dNTP(dATP；dTTP；dCTP；dGTP)、Taq酶，大連寶生物公司；瓊脂糖(Agarose)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，原平皓公司。
3.主要儀器PTC-200PCR儀(PERKIN ELMER)、Biometra梯度PCR儀、UVP多功能成像系統(tǒng)、Ultrospec 1000紫外分光光度計(jì)、BECKMAN冷凍離心機(jī)、Milli-Q超純水儀、DYY-III2穩(wěn)壓電泳儀及配套電泳槽。
二、實(shí)驗(yàn)方法1.緩沖液與常用試劑的配制
1M Tris Cl121.14g Tris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
TE緩沖液10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高壓滅菌。
20×SET緩沖液3MNaCl，1M Tris Cl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，高壓滅菌。
5×TBE緩沖液54g Tris堿，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。
50×TAE緩沖液242g Tris堿，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5MEDTA(pH8.0)，加水至1L。
1M Tris Cl121.14g Tris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
0.5M EDTA186.1g EDTA溶于800ml雙蒸水中，用NaOH調(diào)pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
3M NaAc(pH5.2)408.1g NaAc 3H2O溶于800ml雙蒸水中，用冰乙酸調(diào)pH至7.0，定容至1000ml。
200ml銀染液NH3H2O 2ml；3.6％NaOH 4.2ml；20％AgNO33.6ml，加去離子水至200ml。
200ml顯色液1％檸檬酸鈉1ml；甲醛100ul；加去離子水至200ml。
禽血裂解液10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，0.5％SDS。
2.引物的設(shè)計(jì)與合成以下引物由上海博亞生物公司合成IGFBP2F5’-GGG ACT GCT TTC CAA TAG-3’IGFBP2R5’-TTA CAG TCT TTG GTC TCG G-3’3.雞基因組DNA的小量提取方法一(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為100-200μg/ml，混勻55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的團(tuán)塊。
(2)將溶液冷卻至室溫，加入5M NaCl至終濃度1.5M，混勻10min。加入等體積酚/氯仿，反復(fù)顛倒離心管混勻10min?！?3)12,000rpm，室溫離心10min。取上清，加等體積氯仿混勻10min。□(4)12,000rpm，室溫離心10min。取上清2倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA?！?5)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗1次?！?6)7,500rpm，室溫離心5min，棄上清。
(7)將DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μl TE中。
方法二
(1)將20μl全血加入裝有700μl 1×SET的1.5ml離心管中，輕輕混勻。
(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度100-200μg/μl和10％的SDS至終濃度0.5％，55℃消化12h。
(3)待消化完全后，加入等體積的Tris飽和酚，來(lái)回顛倒，使其混勻(4)12,000rpm離心10min，用剪去尖端的吸頭將上層水相小心移入另一個(gè)離心管中，棄去有機(jī)相。重復(fù)第三和第四步驟一次。
(5)向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為24∶23∶1)，混合10min。12,000rpm.，離心10min，移出水相到另一個(gè)離心管。
(6)向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(23∶1)，來(lái)回顛倒混合10min，12,000rpm，離心10min，移出水相到另一個(gè)離心管。
(7)向水相中加入1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積的無(wú)水乙醇，來(lái)回顛倒，沉淀DNA。
(8)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗1次。
(9)7,500rpm離心5min。小心倒掉管中乙醇，將倒置在濾紙上，讓乙醇流盡，置于空氣中干燥。
(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中過(guò)夜溶解DNA。溶解后貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 4.PCR反應(yīng)(1)以雞DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25ul反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑10×PCR reaction buffer 2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 2.0μl引物1(10μM)0.5μl引物2(10μM)0.5μlEX-Taq(5U/μl) 0.25μl去離子水18.25l基因組DNA(50ng/μl) 1.0μl(2)將上述溶液混合并按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
94℃變性5min；94℃30sec，48.5℃30sec，72℃40sec，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。
(3)反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(5～10μl)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
5.SSCP分析以濃度為16％、體積為25ml，厚度為0.1cm的膠為例。
(1)清洗制膠用的玻璃板并用蒸餾水沖洗干凈，烘干后，用0.8％瓊脂糖封閉玻璃板和膠條間的縫隙。
(2)在100ml燒杯內(nèi)加入30％丙烯酰胺11.7ml，50％甘油2.5ml，5×TBE 5ml，10％過(guò)硫酸銨0.175ml，TEMED8μl，去離子水5.617ml，混勻后迅速灌膠。
(3)當(dāng)澆灌至離玻璃板上沿0.1cm時(shí)停止灌膠，插入梳子，室溫聚和半小時(shí)，多余的丙烯酰胺4℃保存。隨時(shí)觀察凝膠聚合情況，并補(bǔ)加丙烯酰胺。
(4)凝膠聚合好后，向電泳槽加入1×TBE，用注射器沖洗加樣孔。
(5)預(yù)電泳10min，同時(shí)準(zhǔn)備點(diǎn)樣。
(6)取1μl PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加5-6μl變性上樣Buffer混勻，置于100度沸水中變性10分鐘，然后迅速放置冰水中冷卻10分鐘，用微量注射器點(diǎn)樣。
(7)100伏，電泳14-16h。
6.硝酸銀染色方法(1)電泳結(jié)束后關(guān)上電泳儀，放出電泳液，小心取下凝膠，置于70％乙醇中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定10-15min。(乙醇用完可以回收)。
(2)雙蒸水洗膠2遍，每次2min，去除殘留乙醇。
(3)用200ml染色液染色30min。
(4)雙蒸水洗膠3遍，每次2min。
(5)用200ml顯色液顯色，約10-30min，當(dāng)DNA帶的強(qiáng)度合適時(shí)，倒掉顯色液。
(6)去離子水洗掉多余的顯色液，保鮮膜封好，掃描照相或保存。
7.統(tǒng)計(jì)模型建立根據(jù)資源群體的特點(diǎn)構(gòu)建合適統(tǒng)計(jì)模型□Y＝μ+G+L+G*L+BW7+e□Y＝μ+G+L+H+G*L+BW7+e③Y＝μ+G+S+H+F+D(F)+G*S+BW12+e其中Y為性狀觀察值，μ為群體均值，G為基因型固定效應(yīng)，S為性別固定效應(yīng)，H為孵化批次固定效應(yīng)，F(xiàn)為家系隨機(jī)效應(yīng)，D(F)為母雞(家系內(nèi))的隨機(jī)效應(yīng)，G*S為基因型與性別的互作效應(yīng)，G*L為基因型與品系的互作效應(yīng)，BW12為12周齡體重，BW7為7周齡體重，e為剩余值。
模型□應(yīng)用于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高低脂系第六世代資源群體，模型□應(yīng)用于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高低脂系第七世代資源群體，模型③應(yīng)用于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群體。使用SAS 6.12版本進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。使用統(tǒng)計(jì)軟件JMP 4.0(SAS Institute Inc.，Cary，NC)檢驗(yàn)基因型與性狀間的相關(guān)程度，并估計(jì)性狀的最小二乘均值。使用統(tǒng)計(jì)軟件MTDFREML估計(jì)基因型對(duì)性狀的遺傳和表型貢獻(xiàn)率。
實(shí)施例1、在不同品種基因型和基因頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果利用本發(fā)明的引物(IGFBP2F和IGFB2R)對(duì)AA肉雞、海蘭蛋雞和地方品種北京油雞、白耳雞、石歧雜，共5個(gè)隨機(jī)群體個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行SSCP分析。共檢測(cè)到3種基因型，分別將其命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。
計(jì)算了不同雞種該基因的基因型頻率和基因頻率并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)?；蛐秃突蝾l率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。獨(dú)立性檢驗(yàn)(X2)總體結(jié)果表明，品種間基因型頻率差異極顯著(P＜0.01)。進(jìn)行一步分析發(fā)現(xiàn)，在其它任意兩個(gè)雞種間差異都達(dá)到顯著的水平(P＜0.05)。北京油雞和白耳雞A基因頻率和AA基因型頻率明顯高于其它品種，而AA肉雞中A基因頻率和AA基因型頻率是5個(gè)品種中最低的。白耳雞是一種體形較小的蛋用地方品種，成年體重1.0-1.2千克(中國(guó)家禽品種志)，脂肪沉積較少，北京油雞是一種體形較小的蛋肉兼用型地方品種，成年體重1.6-1.7千克(中國(guó)家禽品種志)，肌間脂肪分布良好，肉質(zhì)細(xì)致，肉味鮮美，腹脂沉積較少；而肉雞由于多年的人工選擇，伴隨著早期生長(zhǎng)速度的提高，有著極強(qiáng)脂肪沉積能力，因此，等位基因A可能與降低脂肪沉積有關(guān)。
表1 基因型和基因頻率在不同品種間比較
*括號(hào)內(nèi)是檢測(cè)個(gè)體數(shù)實(shí)施例2、雞IGFBP2基因的多態(tài)性與肉雞高低脂雙向選擇品系第六世代腹脂性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(IGFBP2F和IGFB2R)對(duì)肉雞高低脂雙向選擇品系第六世代的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行SSCP分析。共檢測(cè)到3種基因型，分別將其命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。
對(duì)IGFBP2基因C1196A位點(diǎn)的3種基因型與第六世代227個(gè)個(gè)體的腹脂重和腹脂率進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果表明基因型對(duì)第六世代個(gè)體的腹脂重、腹脂率有顯著影響(P＜0.05)(表2)。
表2 第六世代腹脂性狀的最小二乘分析結(jié)果(P值)
對(duì)3種基因型間第六世代雞只腹脂性狀的最小二乘均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率顯著低于AB型個(gè)體的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率比AB基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率分別低6.6克和0.28％(表3)。
表3 IGFBP2基因不同基因型對(duì)第六世代雞只腹脂性狀的影響
均值比較時(shí)同一列無(wú)相同字母者差異顯著(a-bp＜0.05)表4列出基因型對(duì)第六世代肉雞腹脂性狀的遺傳貢獻(xiàn)率和表型貢獻(xiàn)率。IGFBP2基因的變異位點(diǎn)對(duì)第六世代肉雞的腹脂重和腹脂率的遺傳貢獻(xiàn)率都較大，分別為12.43％和10.09％。因此推測(cè)用該基因?qū)Ω怪誀钸M(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，會(huì)獲得較大的遺傳進(jìn)展。
表4 IGFBP2基因?qū)Φ诹来怆u腹脂性狀的遺傳和表型貢獻(xiàn)率
1A為剩余多基因效應(yīng)方差；E為殘差的方差；G為檢測(cè)的基因效應(yīng)方差實(shí)施例3、雞IGFBP2基因的多態(tài)性與肉雞高低脂雙向選擇品系第七世代腹脂性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(IGFBP2F和IGFB2R)對(duì)肉雞高低脂雙向選擇品系第七世代的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行SSCP分析。共檢測(cè)到3種基因型，分別將其命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。
對(duì)IGFBP2基因C1196A位點(diǎn)的3種基因型與第七世代435個(gè)個(gè)體的腹脂重和腹脂率進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果表明基因型對(duì)第七世代個(gè)體的腹脂重、腹脂率有顯著影響(P＜0.05)(表5)。
表5 第七世代腹脂性狀的最小二乘分析結(jié)果(P值)
對(duì)3種基因型間第七世代雞只腹脂性狀的最小二乘均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率顯著低于BB型個(gè)體的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；具有AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率比BB基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率分別低4.73克和0.19％(表6)。
表6 IGFBP2基因不同基因型對(duì)第七世代雞只腹脂性狀的影響
均值比較時(shí)同一列無(wú)相同字母者差異顯著(a-bp＜0.05)表7列出基因型對(duì)第七世代雞只腹脂性狀的遺傳貢獻(xiàn)率和表型貢獻(xiàn)率。IGFBP2基因的變異位點(diǎn)對(duì)第七世代肉雞的腹脂重和腹脂率的遺傳貢獻(xiàn)率都較大，分別為17.62％和15.14％。因此推測(cè)用該基因?qū)Ω怪誀钸M(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，會(huì)獲得較大的遺傳進(jìn)展。
表7 IGFBP2基因?qū)Φ谄呤来怆u腹脂性狀的遺傳和表型貢獻(xiàn)率
1A為剩余多基因效應(yīng)方差；E為殘差的方差；G為檢測(cè)的基因效應(yīng)方差實(shí)施例4、雞IGFBP2基因的多態(tài)性與東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群體體脂性狀的相關(guān)分析利用本發(fā)明的引物(IGFBP2F和IGFB2R)對(duì)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行SSCP分析。共檢測(cè)到3種基因型，分別將其命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。
對(duì)IGFBP2基因C1196A位點(diǎn)的3種基因型與東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群540個(gè)個(gè)體的腹脂重和腹脂率進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果表明基因型對(duì)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群個(gè)體的腹脂重、腹脂率有極顯著影響(P＜0.01)(表8)。
表8 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群腹脂性狀的最小二乘分析結(jié)果(P值)
對(duì)3種基因型間東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群雞只腹脂性狀的最小二乘均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率顯著低于BB型個(gè)體的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；具有AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率比BB基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率分別低10.29克和0.5％(表9)。
表9 IGFBP2基因不同基因型對(duì)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群雞只腹脂性狀的影響
均值比較時(shí)同一列無(wú)相同字母者差異顯著(a-bP＜0.05)表10列出基因型對(duì)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群雞只腹脂性狀的遺傳貢獻(xiàn)率和表型貢獻(xiàn)率。IGFBP2基因的變異位點(diǎn)對(duì)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群肉雞的腹脂重和腹脂率的遺傳貢獻(xiàn)率分別為2.95％和3.02％。
表10 IGFBP2基因?qū)|北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群肉雞腹脂性狀的遺傳和表型貢獻(xiàn)率
1A為剩余多基因效應(yīng)方差；E為殘差的方差；G為檢測(cè)的基因效應(yīng)方差
權(quán)利要求
1.一種用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是(1)、根據(jù)雞IGFBP2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物IGFBP2F5’-GGG ACT GCT TTC CAA TAG-3’IGFBP2R5’-TTA CAG TCT TTG GTC TCG G-3’(2)、利用該引物對(duì)雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)、使用16％聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，檢測(cè)出IGFBP2基因3’調(diào)控區(qū)中的1個(gè)單堿基突異位點(diǎn)；(4)、多態(tài)性分析經(jīng)SSCP分析分別發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別命名為AA、AB和BB型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中分析基因多態(tài)性的方法是通過(guò)檢測(cè)單堿基變異而確定基因型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于分析基因多態(tài)性的區(qū)域是3’調(diào)控區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于分析基因多態(tài)性的區(qū)域是由IGFBP2F和IGFBP2R表示的引物擴(kuò)增的3’調(diào)控區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于分析多態(tài)性的位點(diǎn)位于雞IGFBP2基因(GenBank AccessionNoU15086)序列中第1196位的1個(gè)C→A堿基突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中雞體脂性狀是雞的腹脂重和腹脂率。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于SSCP分析的聚丙烯酰胺凝膠濃度為16％。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于SSCP分析的聚丙烯酰胺凝膠濃度為16％。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法。根據(jù)雞IGFBP2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物IGFBP2F和IGFBP2R；利用該引物對(duì)雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后應(yīng)用SSCP的方法，使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出IGFBP2基因3’調(diào)控區(qū)中的1個(gè)單堿基變異位點(diǎn)；分別對(duì)雞IGFBP2基因該位點(diǎn)兩種純合型及雜合型進(jìn)行命名。利用本發(fā)明的分子標(biāo)記方法對(duì)雞體脂性狀進(jìn)行選擇，不僅為雞育種工作中標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)更為有效、簡(jiǎn)便易行的分子標(biāo)記方法，同時(shí)也為雞的體脂性狀改良提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段，從而可以加速低脂肉雞的育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1769487SQ200510010450
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者李輝, 李志輝 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)