專利名稱：轉(zhuǎn)基因大豆深加工產(chǎn)品三重巢式pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種轉(zhuǎn)基因成分的準確檢測方法，具體地說是轉(zhuǎn)基因大豆深加工產(chǎn)品進行定性檢測和對產(chǎn)品中的GMO含量進行定量檢測以便標識的方法。
背景技術(shù)：
隨著各國有關(guān)轉(zhuǎn)基因生物(genetically modified organism，GMO)標簽法的建立和不斷完善，轉(zhuǎn)基因成分的準確檢測也顯得日趨重要，很多國家不但要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行定性檢測，還需要對產(chǎn)品中的GMO含量進行定量檢測，以便標識。歐盟等國家和地區(qū)先后出臺轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標簽制度，出入境產(chǎn)品必須出具是否含有轉(zhuǎn)基因成分的檢測報告。近年來，我國大量進口轉(zhuǎn)基因大豆用于加工，由于市場標識不夠，使我國加工產(chǎn)品出口貿(mào)易遭受損失。為了加強對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，保障人體健康，規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的銷售行為，引導和保護消費者的知情權(quán)，農(nóng)業(yè)部頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，該辦法規(guī)定了在中國境內(nèi)需要標識的第一批轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，即大豆、玉米、油菜、棉花和番茄等5類17種產(chǎn)品。目前國內(nèi)的相關(guān)標準較為混亂，出現(xiàn)了一些技術(shù)標準不一致、法規(guī)滯后、與國際慣例不接軌等現(xiàn)象，致使某些產(chǎn)品實行國際、國內(nèi)市場“雙重標準”，沒有依照中國有關(guān)轉(zhuǎn)基因食品的規(guī)定貼上相關(guān)標識，侵害了中國消費者的利益。
大豆深加工制品已越來越多，如卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆油等食品，其加工呈現(xiàn)復雜化和多元化的特點，在國內(nèi)外仍然沒有適合的標準依據(jù)進行檢測?！皹分录币约啊叭赋彩称泛D(zhuǎn)基因”事件都表明，我國在轉(zhuǎn)基因市場的管理上確實存在漏洞，對轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)督力度不足，造成了企業(yè)有法律空子可鉆。要完善、健全我國的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理制度，首要問題是要解決我國尚未統(tǒng)一的檢測標準問題，同時要提高轉(zhuǎn)基因檢測的精確度，以保證我國消費者的利益。
目前，歐盟率先倡導并實行轉(zhuǎn)基因標識并要求產(chǎn)品成分中轉(zhuǎn)基因含量大于1％時必須進行標識，因此其檢測技術(shù)早已經(jīng)成熟，檢測下限達0.1％。國內(nèi)一些機構(gòu)，尤其進出口檢疫局也相繼建立檢測實驗室，技術(shù)趨于成熟，但還只限于對轉(zhuǎn)基因原料的檢測，在深加工產(chǎn)品的檢測技術(shù)的研究上還很不成熟，沒有統(tǒng)一的檢測標準，檢測結(jié)果不穩(wěn)定。深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因檢測所需的DNA提取技術(shù)在國外尚處于研究階段，并沒有形成系列化技術(shù)，商品化的提取試劑盒種類單一。由于深加工產(chǎn)品種類繁多，生產(chǎn)工藝復雜，而深加工品DNA提取技術(shù)應該是一系列技術(shù)，提取試劑盒也應該是多樣化，不同產(chǎn)品采用不同試劑盒，因此，缺乏針對不同深加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的DNA提取技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是公開一種轉(zhuǎn)基因大豆深加工產(chǎn)品三重巢式PCR檢測方法。其檢測方法為1.DNA提取將大豆標準品粉末及其它待檢樣品根據(jù)WizardMagnetic DNAPurification System for Food試劑盒操作說明分別進行DNA提取，并稍做改動。
2.DNA樣品濃度檢測DNA濃度通過核酸蛋白分析儀和電泳-EB染色的熒光強度雙重測定。
3.引物設計利用Primer Premier V5.0軟件進行三重巢式PCR的引物設計，用Oligo V6.22軟件篩選出引物之間互相干擾最小的引物。引物所擴增目的片段及擴增產(chǎn)物大小為。
(1)第一輪三重PCR所用引物引物名稱Lec EF 序列(5′→3′)cgccgcttccttcaacttLec ER 序列(5′→3′)gctggtggaggcatcatag位置Lectin內(nèi)源基因外引物擴增片段大小310
引物名稱SC EF 序列(5′→3′) gacgcacaatcccactatccSC ER 序列(5′→3′)ctgtagccactgatgctgaaa位置35S啟動子與CTP接合區(qū)域外引物擴增片段大小357引物名稱EN EF 序列(5′→3′)cgtgatgaacggtctggaaEN ER 序列(5′→3′) caggcagccttcgtatcg位置CP4-EPSPS外源基因與NOS接合區(qū)域外引物擴增片段大小421(2)第二輪三重PCR所用引物引物名稱Lec EF 序列(5′→3′)caagtcgtcgctgttgagtLec IR 序列(5′→3′)gtcgttttgatggatctgatag位置Lectin內(nèi)源基因內(nèi)引物擴增片段大小101引物名稱SC IF 序列(5′→3′)cgcacaatcccactatcctSC IR 序列(5′→3′)agcttgtcagcgtgtcctc位置35S啟動子與CTP接合區(qū)域內(nèi)引物擴增片段大小82引物名稱EN IF 序列(5′→3′)aaaaccctgtcacggtggaEN IR 序列(5′→3′)caggcagccttcgtatcg位置CP4-EPSPS外源基因與NOS接合區(qū)域內(nèi)引物擴增片段大小1154.三重巢式PCR反應體系4-1.第一輪三重PCR反應體系及反應條件在第一輪三重PCR反應體系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR緩沖液，引物混合液I 10μL，DNA聚合酶4U，補水至50μL。擴增條件為95℃預變性10min；95℃變性40s，54℃退火45s，65℃延伸60s，共30個循環(huán)；最后65℃延伸10min。
4-2.第二輪三重PCR反應體系及反應條件取第一輪多重PCR產(chǎn)物1μL作為模板，進行三重巢式PCR第二輪擴增。反應體系加引物混合液II 10μL，DNA聚合酶3U，其余同前。擴增條件為95℃預變性10min；95℃變性30s，54℃退火45s，65℃延伸45s，共38個循環(huán)；最后65℃延伸5min。
5.擴增產(chǎn)物檢測兩輪擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測。瓊脂糖膠濃度為3％，膠中溴化乙錠濃度為0.5μg/mL，電泳緩沖液為1×TAE，以50bp ladder DNA和DL 2000DNA做分子質(zhì)量標準，電泳條件為以10V/cm電壓，電泳1h。
6.結(jié)果6-1DNA提取所選材料均是大豆深加工產(chǎn)品，使用WizardMagnetic DNAPurification System for Food試劑盒可以滿足三重巢式PCR擴增的需要，但實際測量所提取DNA樣品的OD260值低于0.1以及OD260/OD280也小于1.5，進行電泳檢測時也觀察不到DNA條帶，說明所提取DNA樣品濃度很低。
6-2第一輪擴增結(jié)果第一輪擴增結(jié)果見圖1，僅陰性對照和陽性對照能夠觀察到擴增條帶，其它泳道未看到擴增結(jié)果。陽性對照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因擴增片段大小分別為310bp、357bp和421bp。陰性對照結(jié)果表明實驗過程中無假陽性結(jié)果，排除RR大豆轉(zhuǎn)基因成分污染的可能；陽性對照結(jié)果說明擴增體系正常，可以擴增出目的基因；空白對照無擴增條帶說明PCR反應體系無污染。
6-3第二輪擴增結(jié)果第二輪擴增結(jié)果，陽性對照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因擴增片段大小分別為101bp、82bp和115bp。卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉擴增出三條特異性條帶；大豆粗油僅擴增出Lectin基因；大豆精煉油和大豆色拉油未檢出任何條帶。
6-4外引物擴增靈敏度分析第一輪三重PCR靈敏度分析實驗中，0.5％RR大豆標準品利用三對外引物能夠同時擴增出三個目的基因，0.05％標準品只能擴增出Lectin和EPSPS-NOS基因，說明第一輪三重PCR的靈敏度為0.5％。
6-5內(nèi)引物擴增靈敏度分析第二輪三重PCR靈敏度分析實驗中，0.005％RR大豆標準品利用三對內(nèi)引物能夠同時擴增出較為清晰的三個目的基因，0.0005％標準品只能擴增出Lectin和35S-CTP基因，說明第二輪三重PCR的靈敏度為0.005％。
本發(fā)明提高了檢測效率、減少了檢測時間和檢測成本，并可以有效減少假陽性的結(jié)果，因此，可以應用于對豆油等轉(zhuǎn)基因深加工食品進行DNA檢測，具有實際意義。


圖1為本發(fā)明三重巢式PCR各引物間位置關(guān)系示意圖；圖2為本發(fā)明外引物擴增結(jié)果的電泳圖；圖3為本發(fā)明內(nèi)引物擴增結(jié)果的電泳圖；圖4為本發(fā)明第一輪擴增檢測靈敏度分析；圖5為本發(fā)明第二輪擴增檢測靈敏度分析。
具體實施例方式圖1為三重巢式PCR各引物間位置關(guān)系；第一輪擴增結(jié)果；第一輪擴增結(jié)果見圖1，僅陰性對照和陽性對照能夠觀察到擴增條帶，其它泳道未看到擴增結(jié)果。陽性對照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因擴增片段大小分別為310bp、357bp和421bp。陰性對照結(jié)果表明實驗過程中無假陽性結(jié)果，排除RR大豆轉(zhuǎn)基因成分污染的可能；陽性對照結(jié)果說明擴增體系正常，可以擴增出目的基因；空白對照無擴增條帶說明PCR反應體系無污染。
圖2為外引物擴增結(jié)果的電泳圖，其中M1，DL 2000分子質(zhì)量標準；1，卵磷脂；2，大豆蛋白質(zhì)粉；3，巧克力飲品；4，嬰兒米粉；5，大豆粗油；6，大豆精煉油；7，大豆色拉油；8，陰性對照；9，陽性對照；10，空白對照；M2，50bp DNA ladderDNA分子質(zhì)量標準。
第二輪擴增結(jié)果第二輪擴增結(jié)果見圖2，陽性對照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因擴增片段大小分別為101bp、82bp和115bp。卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉擴增出三條特異性條帶；大豆粗油僅擴增出Lectin基因；大豆精煉油和大豆色拉油未檢出任何條帶。
圖3為內(nèi)引物擴增結(jié)果的電泳圖，其中M1，DL 2000分子質(zhì)量標準；1，卵磷脂；2，大豆蛋白質(zhì)粉；3，巧克力飲品；4，嬰兒米粉；5，大豆粗油；6，大豆精煉油；7，大豆色拉油；8，陰性對照；9，陽性對照；10，空白對照；M2，50bp DNA ladderDNA分子質(zhì)量標準外引物擴增靈敏度分析第一輪三重PCR靈敏度分析實驗中，0.5％RR大豆標準品利用三對外引物能夠同時擴增出三個目的基因，0.05％標準品只能擴增出Lectin和EPSPS-NOS基因，說明第一輪三重PCR的靈敏度為0.5％。
圖4為第一輪擴增檢測靈敏度分析為M1，DL 2000分子質(zhì)量標準；1-7RR大豆含量分別為5％、5×10-1％、5×10-2％、5×10-3％、5×10-4％、5×10-5％、5×10-6％；8，陰性對照；9，陽性對照；10，空白對照；M2，50bp DNA ladder分子質(zhì)量標準M1，DL 2000Marker 1-7The content of RR soy is 5％，5×10-1％，5×10-2％，5×10-3％，5×10-4％，5×10-5％，5×10-6％，respectively；8，negative control；9，positive control；10，blank control；M2，50bp DNA ladder Marker
內(nèi)引物擴增靈敏度分析第二輪三重PCR靈敏度分析實驗中，0.005％RR大豆標準品利用三對內(nèi)引物能夠同時擴增出較為清晰的三個目的基因，0.0005％標準品只能擴增出Lectin和35S-CTP基因，說明第二輪三重PCR的靈敏度為0.005％。
圖5為第二輪擴增檢測靈敏度分析，其中M1，DL2000分子質(zhì)量標準；1-7RR大豆含量分別為5％、5×10-1％、5×10-2％、5×10-3％、5×10-4％、5×10-5％、5×10-6％；8，陰性對照；9，陽性對照；10，空白對照；M2，50bp DNAladder分子質(zhì)量標準M1，DL 2000Marker 1-7The content of RR soy is 5％，5×10-1％，5×10-2％，5×10-3％，5×10-4％，5×10-5％，5×10-6％，respectively；8，negative control；9，positive control；10，blank control；M2，50bp DNA ladder Marker本發(fā)明檢測方法的用途多重巢式PCR技術(shù)是十分有效的基因檢測技術(shù)，在國內(nèi)外剛剛興起，因此建立有效的多重巢式PCR技術(shù)對于深加工制品的檢測技術(shù)研究具有重要的意義。本研究將在國內(nèi)外率先建立大豆深加工制品的有效檢測技術(shù)，技術(shù)具有快捷、準確、靈敏、經(jīng)濟的諸多優(yōu)點，將切實解決大豆深加工制品的檢測技術(shù)難題，本研究成果將成為大豆深加工制品轉(zhuǎn)基因檢測的行業(yè)標準，在大豆深加工制品轉(zhuǎn)基因檢測中發(fā)揮重要的作用。
本檢測方法的適用范圍標準品RR大豆，非轉(zhuǎn)基因大豆，待檢深加工產(chǎn)品卵磷脂、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆蛋白質(zhì)粉、大豆粗油、大豆精煉油和大豆色拉油。
實驗試劑WizardMagnetic DNA Purification System for Food試劑盒；TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCR緩沖液(含MgCl2)、50bp ladder DNA和DLDNA2000分子質(zhì)量標準；特異引物。
儀器設備離心機(上海安亭，TDL-40B)、PCR儀(德國Biometra，BiometraTgradient)、核酸電泳儀(杭州大合，GE-100)、紫外分光光度儀(美國BECKMAN，DU640)、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP，G8000)。
本發(fā)明檢測方法的優(yōu)點多重巢式PCR是近幾年興起的檢測技術(shù)，它結(jié)合了巢式PCR的靈敏度高和多重PCR的操作簡單、特異性高的特點，這兩種方法的結(jié)合不但可以減少假陽性的出現(xiàn)，可以同時檢測多個目的片段，而且可以使檢測的下限下降幾個數(shù)量級。多重PCR技術(shù)多應用在疾病診斷和病毒鑒定具有快速、靈敏、專一、可靠等特點，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的診斷方式。目前為止該技術(shù)還未應用在轉(zhuǎn)基因加工產(chǎn)品的檢測中。
多重巢式PCR的檢測，提高了檢測效率、減少了檢測時間和檢測成本，并可以有效減少假陽性的結(jié)果，因此，可以應用于對豆油等轉(zhuǎn)基因深加工食品進行DNA檢測，具有實際意義。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因大豆深加工產(chǎn)品三重巢式PCR檢測方法，其檢測方法為(1).DNA提取將大豆標準品粉末及其它待檢樣品根據(jù)WizardMagneticDNA Purification System for Food試劑盒操作說明分別進行DNA提取，并稍做改動；(2).DNA樣品濃度檢測DNA濃度通過核酸蛋白分析儀和電泳-EB染色的熒光強度雙重測定；(3).引物設計利用Primer Premier V5.0軟件進行三重巢式PCR的引物設計，用Oligo V6.22軟件篩選出引物之間互相干擾最小的引物；引物所擴增目的片段及擴增產(chǎn)物大小為；(3-1)第一輪三重PCR所用引物引物名稱Lec EF 序列(5′→3′)cgccgcttccttcaacttLec ER 序列(5′→3′)gctggtggaggcatcatag位置Lectin內(nèi)源基因外引物擴增片段大小310引物名稱SC EF 序列(5′→3′)gacgcacaatcccactatccSC ER 序列(5′→3′)ctgtagccactgatgctgaaa位置35S啟動子與CTP接合區(qū)域外引物擴增片段大小357引物名稱EN EF 序列(5′→3′)cgtgatgaacggtctggaaEN ER 序列(5′→3′)caggcagccttcgtatcg位置CP4-EPSPS外源基因與NOS接合區(qū)域外引物擴增片段大小421(3-2)第二輪三重PCR所用引物引物名稱Lec EF 序列(5′→3′)caagtcgtcgctgttgagtLec IR 序列(5′→3′)gtcgttttgatggatctgatag位置Lectin內(nèi)源基因內(nèi)引物擴增片段大小101引物名稱SC IF 序列(5′→3′)cgcacaatcccactatcctSC IR 序列(5′→3′)agcttgtcagcgtgtcctc位置35S啟動子與CTP接合區(qū)域內(nèi)引物擴增片段大小82引物名稱EN IF 序列(5′→3′)aaaaccctgtcacggtggaEN IR 序列(5′→3′)caggcagccttcgtatcg位置CP4-EPSPS外源基因與NOS接合區(qū)域內(nèi)引物擴增片段大小115(4).三重巢式PCR反應體系(4-1).第一輪三重PCR反應體系及反應條件在第一輪三重PCR反應體系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR緩沖液，引物混合液I 10μL，DNA聚合酶4U，補水至50μL；擴增條件為95℃預變性10min；95℃變性40s，54℃退火45s，65℃延伸60s，共30個循環(huán)；最后65℃延伸10min；(4-2).第二輪三重PCR反應體系及反應條件取第一輪多重PCR產(chǎn)物1μL作為模板，進行三重巢式PCR第二輪擴增；反應體系加引物混合液II 10μL，DNA聚合酶3U，其余同前；擴增條件為95℃預變性10min；95℃變性30s，54℃退火45s，65℃延伸45s，共38個循環(huán)；最后65℃延伸5min；(5).擴增產(chǎn)物檢測兩輪擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測；瓊脂糖膠濃度為3％，膠中溴化乙錠濃度為0.5μg/mL，電泳緩沖液為1×TAE，以50bp ladder DNA和DL 2000 DNA做分子質(zhì)量標準，電泳條件為以10V/cm電壓，電泳1h；(6).結(jié)果(6-1)DNA提取所選材料均是大豆深加工產(chǎn)品，使用WizardMagnetic DNAPurification System for Food試劑盒可以滿足三重巢式PCR擴增的需要，但實際測量所提取DNA樣品的OD260值低于0.1以及OD260/OD280也小于1.5，進行電泳檢測時也觀察不到DNA條帶，說明所提取DNA樣品濃度很低；(6-2)第一輪擴增結(jié)果第一輪擴增結(jié)果，僅陰性對照和陽性對照能夠觀察到擴增條帶，其它泳道未看到擴增結(jié)果；陽性對照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因擴增片段大小分別為310bp、357bp和421bp；陰性對照結(jié)果表明實驗過程中無假陽性結(jié)果，排除RR大豆轉(zhuǎn)基因成分污染的可能；陽性對照結(jié)果說明擴增體系正常，可以擴增出目的基因；空白對照無擴增條帶說明PCR反應體系無污染；(6-3)第二輪擴增結(jié)果第二輪擴增結(jié)果，陽性對照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因擴增片段大小分別為101bp、82bp和115bp；卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉擴增出三條特異性條帶；大豆粗油僅擴增出Lectin基因；大豆精煉油和大豆色拉油未檢出任何條帶；(6-4)外引物擴增靈敏度分析第一輪三重PCR靈敏度分析實驗中，0.5％RR大豆標準品利用三對外引物能夠同時擴增出三個目的基因，0.05％標準品只能擴增出Lectin和EPSPS-NOS基因，說明第一輪三重PCR的靈敏度為0.5％；(6-5)內(nèi)引物擴增靈敏度分析第二輪三重PCR靈敏度分析實驗中，0.005％RR大豆標準品利用三對內(nèi)引物能夠同時擴增出較為清晰的三個目的基因，0.0005％標準品只能擴增出Lectin和35S-CTP基因，說明第二輪三重PCR的靈敏度為0.005％。
全文摘要
本發(fā)明公開一種轉(zhuǎn)基因大豆深加工產(chǎn)品三重巢式PCR檢測方法。其檢測方法為1.DNA提取；2.DNA樣品濃度檢測；3.引物設計；4.第一、二輪三重巢式PCR反應體系及反應條件；5.擴增產(chǎn)物檢測；6.結(jié)果計算和靈敏度分析。本發(fā)明提高了檢測效率、減少了檢測時間和檢測成本，并可以有效減少假陽性的結(jié)果，因此，可以應用于對豆油等轉(zhuǎn)基因深加工食品進行DNA檢測，具有實際意義。
文檔編號C12Q1/68GK1772919SQ20051001051
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日
發(fā)明者高學軍, 張明輝, 于艷波, 敖金霞, 曲波, 劉營 申請人:高學軍, 張明輝, 于艷波, 敖金霞, 曲波, 劉營