專利名稱：冬蟲夏草細胞液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冬蟲夏草細胞液的制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草是一種珍稀的名貴中藥，對許多疾病具有醫(yī)治作用，可提高人體的免疫功能和延緩衰老，得到國內(nèi)外醫(yī)療、食品界的格外重視。目前，國內(nèi)外對蟲草藥用及保健制品的研究開發(fā)工作正方興未艾，特別是國內(nèi)，在這方面的研究開發(fā)更是如火如荼，以蟲草子實體及其菌絲體為原料生產(chǎn)的藥用制劑和保健制劑已有幾十種，并且還在不斷推出。這些藥用制劑，在治療心血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、血液病以及作為抗腫瘤治療的輔助用藥等方面均取得了令人滿意的療效。這些產(chǎn)品的開發(fā)，進一步拓寬了蟲草制劑的臨床應(yīng)用范圍，擴展了蟲草的應(yīng)用領(lǐng)域。上述制劑中最具代表性的是冬蟲夏草口服液。但是，現(xiàn)有技術(shù)中公開的冬蟲夏草口服液存在以下不足首先是其培養(yǎng)基配方不合理。由于冬蟲夏草是以蝙蝠蛾二齡蟲為蟲草菌的寄主，而二齡蟲又是復(fù)雜的有機物集合體，其所含的營養(yǎng)成分十分復(fù)雜、全面，至今無確切的成份報道，因此，用目前常規(guī)的培養(yǎng)基對冬蟲夏草進行培養(yǎng)，無法達到冬蟲夏草所需營養(yǎng)成份；其次，現(xiàn)有技術(shù)中公開使用的對發(fā)酵液的處理方法中要用化學(xué)試劑將菌細胞與培養(yǎng)物殘基結(jié)合物一并沉淀，破壞了冬蟲夏草應(yīng)有的成分并使其改變性質(zhì)，自然會給服用者帶來不適應(yīng)和不安全性，而且還失去了冬蟲夏草質(zhì)的天然性；再者，現(xiàn)有技術(shù)制備的冬蟲夏草口服液不利于人體吸收，尤其對年老體弱或病人來說，療效和保健功能不明顯。上述缺陷的存在，影響了冬蟲夏草藥用和保健價值的正常發(fā)揮，制約了以冬蟲夏草為主要原料的技術(shù)開發(fā)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種冬蟲夏草細胞液的制備方法，其產(chǎn)品近似冬蟲夏草天然性，解決了有效成分的安全性以及含量的穩(wěn)定性問題，并提高了蟲草真菌的藥效、保健作用和服用的安全性。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的。為了保證冬蟲夏草細胞液的營養(yǎng)成份，首先要滿足蟲草菌的培養(yǎng)條件，特別是培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份應(yīng)該與其寄主蝙蝠蛾二齡蟲所含營養(yǎng)成份相近，這樣才能使培養(yǎng)的菌種接近天然的冬蟲夏草成份。經(jīng)多次檢測和試驗，本發(fā)明確定選擇蠶蛹粉或蠶蛹粉水提液做為添加劑，用以豐富培養(yǎng)基質(zhì)的營養(yǎng)成分，并分別添加在固體菌種和液體菌種培養(yǎng)基中。
此外，為了提高產(chǎn)品的吸收效果，本發(fā)明摒棄了以往的超微粉碎觀念使冬蟲夏草細胞液成為破壁細胞液，因為超微技術(shù)適用于固體介質(zhì)，而不適合于對活體菌液細胞壁的破解，特別是超微粉碎產(chǎn)生一定溫度將在某種程度上破壞加工物的有效成分。鑒于此，本發(fā)明利用活體菌液自身產(chǎn)生的生物酶使其細胞破壁，具體描述即活體菌液在一定溫度條件下，活體菌液中的培養(yǎng)基產(chǎn)生葡萄聚糖酶和殼多糖酶這兩種生物酶則將細胞連鍵—氫鍵阻斷，使細胞壁得以破解，由此得到破壁細胞液。
本發(fā)明的特征還在于對發(fā)酵液的處理不使用如醋酸鋅等化學(xué)試劑，以保證蟲草菌中的特殊化學(xué)成份如蟲草素、D-甘露醇、蟲草多糖、腺苷、尿苷、SOD等不受破壞和改性，保證了其藥效和安全性。
具體地，本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)冬蟲夏草斜面菌種的培養(yǎng)取天然冬蟲夏草進行組織分離，在斜面培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，制得斜面菌種；所用培養(yǎng)基中含有按質(zhì)量百分數(shù)表示的0.1-1％的蠶蛹粉；培養(yǎng)條件為溫度20-26℃，培養(yǎng)時間15-7天；(2)液體菌種的制備取固體菌種在盛有經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)液的容器中進行培養(yǎng)7天后，制得液體菌種；所用的培養(yǎng)液中含有蠶蛹粉水提液；(3)深層發(fā)酵擴大培養(yǎng)將液體菌種在無菌條件下依次接入盛有經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)液的一級、二級、三級深層發(fā)酵培養(yǎng)器中，經(jīng)培養(yǎng)得到活體菌液；三級深層發(fā)酵液體菌種接入量分別為培養(yǎng)液量的10％，三級深層發(fā)酵培養(yǎng)液中均含有蠶蛹粉水提液；
(4)活體菌液細胞破壁將活體菌液pH值調(diào)至6.1-6.7后，升溫至40-50℃，保持15-5小時，得到細胞液原液；(5)過濾、脫氣、裝瓶、滅菌上述細胞液原液經(jīng)過濾機初濾、精濾、真空減壓脫氣、裝瓶封蓋、滅菌后得破壁細胞液成品。
在步驟(2)和步驟(3)中所用的液體菌種培養(yǎng)液是這樣的每公斤培養(yǎng)液中含有用1-10克蠶蛹粉制得的水提液。
本發(fā)明取得的效果是利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)出的菌絲體，超過國家藥典標定含量的8.3倍；產(chǎn)品冬蟲夏草細胞液原液超過國家藥典標定成分含量的2.7～3.9倍；冬蟲夏草細胞液既可根據(jù)需要稀釋，還可根據(jù)需要濃縮，并可以根據(jù)需要添加其它液劑；本方法還可以方便提取其中某一專用成分或綜合用其全草所含成分，加工十分方便。
需要指出的是，本發(fā)明的細胞破壁工藝技術(shù)同樣適用于如猴頭、靈芝等所有珍稀真菌的活體菌液的細胞破壁而制得其細胞液。
具體實施例方式
以下實施例用以說明本發(fā)明。
實施例1(1)冬蟲夏草斜面菌種的培養(yǎng)培養(yǎng)基組成成分為葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、蠶蛹粉0.1％、磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、瓊脂2％，其余為無菌水(可用滅菌的自來水)；培養(yǎng)條件為溫度20℃，培養(yǎng)時間15天；取天然冬蟲夏草進行組織分離，在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，制得斜面菌種；(2)液體菌種的制備按培養(yǎng)液總質(zhì)量1公斤計，其組成為葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、1克蠶蛹粉的水提液，其余為無菌水(可用滅菌的自來水)；取上述培養(yǎng)基裝三角瓶約1/4，121℃滅菌30分鐘后冷卻至25℃，將固體菌種1cm2若干塊在無菌條件下接入，經(jīng)7天左右則成菌懸液并顯示菌絲片段和大量菌絲球充滿發(fā)酵變清液，即為液體菌種
(3)深層發(fā)酵擴大培養(yǎng)將液體菌種在無菌條件下接入一級深層發(fā)酵培養(yǎng)器中，接入量為培養(yǎng)液的10％，培養(yǎng)液經(jīng)滅菌后在無菌條件下接入。而后的二級、三級深層發(fā)酵培養(yǎng)依此類推，當(dāng)培養(yǎng)液變清并有大量菌絲片段和菌絲球出現(xiàn)時中止再進行下一個程序；(4)活體菌液細胞破壁將活體菌液pH值調(diào)至6.1后，升溫至40℃，保持15小時，得到破壁細胞液原液；(5)過濾、脫氣、裝瓶、滅菌將上述細胞液原液經(jīng)過過濾機初濾、精濾、真空減壓脫氣、脫炭處理，即可裝瓶滅菌得到可直接服用的冬蟲夏草口服液原液。
該原液可添加紅棗汁或酸棗汁等調(diào)節(jié)口感。
實施例2(1)冬蟲夏草斜面菌種的培養(yǎng)培養(yǎng)基成分葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、蠶蛹粉0.1％、磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、瓊脂2％，其余為無菌水(可用經(jīng)滅菌的自來水)；培養(yǎng)條件為溫度24℃，培養(yǎng)時間10天；取天然冬蟲夏草進行組織分離，在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，制得斜面菌種；(2)液體菌種的制備按培養(yǎng)液總質(zhì)量1公斤計，組成為葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、5克蠶蛹粉水提液，其余為無菌水(可用滅菌的自來水)；取上述培養(yǎng)基裝三角瓶約1/4，121℃滅菌30分鐘后冷卻至25℃，將固體菌種1cm2若干塊在無菌條件下接入，經(jīng)7天左右則成菌懸液并顯示菌絲片段和大量菌絲球充滿發(fā)酵變清液，即為液體菌種(3)深層發(fā)酵擴大培養(yǎng)將液體菌種在無菌條件下接入一級深層發(fā)酵培養(yǎng)器中，接入量為培養(yǎng)液的10％，培養(yǎng)液經(jīng)滅菌后在無菌條件下接入。而后的二級、三級深層發(fā)酵培養(yǎng)依此類推，當(dāng)培養(yǎng)液變清并有大量菌絲片段和菌絲球出現(xiàn)時中止再進行下一個程序；
(4)活體菌液細胞破壁將活體菌液pH值調(diào)至6.4后，升溫至45℃，保持10小時，得到破壁細胞液原液；(5)過濾、脫氣、裝瓶、滅菌將上述細胞液原液經(jīng)過過濾機初濾、精濾、真空減壓脫氣、脫炭處理，即可裝瓶滅菌得到可直接服用的冬蟲夏草口服液原液。
該原液可添加紅棗汁或酸棗汁等調(diào)節(jié)口感。
實施例3(1)冬蟲夏草斜面菌種的培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、蠶蛹粉0.1％、磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、瓊脂2％，其余為無菌水(可用滅菌的自來水)；培養(yǎng)條件為溫度26℃，培養(yǎng)時間7天；取天然冬蟲夏草進行組織分離，在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，制得斜面菌種；(2)液體菌種的制備按培養(yǎng)液總質(zhì)量1公斤計，組成分葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、10克蠶蛹粉水提液，其余為無菌水(可用滅菌的自來水)；取上述培養(yǎng)基裝三角瓶約1/4，121℃滅菌30分鐘后冷卻制25℃，將固體菌種1cm2若干塊在無菌條件下接入，經(jīng)7天左右則成菌懸液并顯示菌絲片段和大量菌絲球充滿發(fā)酵變清液，即為液體菌種(3)深層發(fā)酵擴大培養(yǎng)將液體菌種在無菌條件下接入一級深層發(fā)酵培養(yǎng)器中，接入量為培養(yǎng)液的10％，培養(yǎng)液經(jīng)滅菌后在無菌條件下接入。而后的二級、三級深層發(fā)酵培養(yǎng)依此類推，當(dāng)培養(yǎng)液變清并有大量菌絲片段和菌絲球出現(xiàn)時中止再進行下一個程序；(4)活體菌液細胞破壁將活體菌液pH值調(diào)至6.7后，升溫至50℃，保持5小時，得到破壁細胞液原液；(5)過濾、脫氣、裝瓶、滅菌將上述細胞液原液經(jīng)過過濾機初濾、精濾、真空減壓脫氣、脫炭處理，即可裝瓶滅菌得到可直接服用的冬蟲夏草口服液原液。
該原液可添加紅棗汁或酸棗汁等調(diào)節(jié)口感。
權(quán)利要求
1.冬蟲夏草細胞液的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)冬蟲夏草斜面菌種的培養(yǎng)取天然冬蟲夏草進行組織分離，在斜面培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，制得斜面菌種；所用培養(yǎng)基中含有按質(zhì)量百分數(shù)表示的0.1-1％的蠶蛹粉；培養(yǎng)條件為控制溫度20-26℃，培養(yǎng)時間15-7天；(2)液體菌種的制備取固體菌種在盛有經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)液的容器中進行培養(yǎng)7天，制得液體菌種；所用的培養(yǎng)液中含有蠶蛹粉水提液；(3)深層發(fā)酵擴大培養(yǎng)將液體菌種在無菌條件下依次接入盛有經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)液的一級、二級、三級深層發(fā)酵培養(yǎng)器中，經(jīng)培養(yǎng)得到活體菌液；三級深層發(fā)酵液體菌種接入量分別為培養(yǎng)液量的10％，三級深層發(fā)酵培養(yǎng)液中均含有蠶蛹粉水提液；(4)活體菌液細胞破壁將活體菌液pH值調(diào)至6.1-6.7后，升溫至40-50℃，保持15-5小時，使活體菌液中自身產(chǎn)生葡聚糖酶和殼多糖酶使其細胞壁破解，得到破壁細胞液原液；(5)過濾、脫氣、裝瓶、滅菌上述細胞液原液經(jīng)過濾機初濾、精濾、真空減壓脫氣、裝瓶封蓋、滅菌后得冬蟲夏草細胞液成品。
2.按權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草細胞液的制備方法，其特征是在步驟(2)和步驟(3)中所用液體菌種培養(yǎng)液是這樣的每公斤培養(yǎng)液中含有用1-10克蠶蛹粉的水提液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冬蟲夏草細胞液的制備方法，該方法包括以下步驟(1)冬蟲夏草斜面菌種的培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中含有按質(zhì)量百分數(shù)表示的0.1－1％的蠶蛹粉；(2)液體菌種的制備；(3)深層發(fā)酵擴大培養(yǎng)三級深層發(fā)酵培養(yǎng)液中均含有蠶蛹粉水提液；(4)活體菌液細胞破壁將活體菌液pH值調(diào)至6.1－6.7后，升溫至40－50℃，保持15－5小時，得到細胞液原液；(5)過濾、脫氣、裝瓶、滅菌得冬蟲夏草細胞液成品。本發(fā)明的制備方法工藝簡單，制備的冬蟲夏草破壁細胞液有效成分接近天然冬蟲夏草，其營養(yǎng)豐富，易于被人體吸收，服用安全。本發(fā)明易于工業(yè)化生產(chǎn)實施。
文檔編號C12N1/14GK1739582SQ20051001283
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日
發(fā)明者王永年, 王敬敏 申請人:王永年