專利名稱：多級式細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因治療、DNA疫苗、DNA鑒別、DNA防偽及DNA芯片技術(shù)中質(zhì)粒的大規(guī)模提取設(shè)備，尤其是提供了公開一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)的多級式細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提反應(yīng)器，屬于生物醫(yī)藥制備用裝置領(lǐng)域，
背景技術(shù)：
20世紀(jì)90年代開始，質(zhì)粒DNA作為基因治療的載體和基因免疫主體得到越來越廣泛的關(guān)注。質(zhì)粒DNA的大規(guī)模提取工藝的建立是基因治療和基因免疫研究工作的保證。
目前，細(xì)胞破碎和質(zhì)粒的粗提通常是將菌體按一定比例溶入緩沖溶液中，緩慢加入堿裂解溶液，搖勻、靜置，再加入中和溶液，混勻、放置，高速離心，取上清得到復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
作為細(xì)胞破碎和質(zhì)粒粗提的常規(guī)方法，雖然在實驗室被廣泛使用，但由于該方法是手動操作，偶然誤差較大，重復(fù)性不好，而且不能線性放大。如大于1公斤的菌體破碎時，加入堿裂解溶液，會出現(xiàn)粘團(tuán)現(xiàn)象，阻礙溶液進(jìn)一步反應(yīng)，造成反應(yīng)不均一，破碎率、回收率較低，重復(fù)性差的問題，無法適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種多級式細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提反應(yīng)器，可用于工業(yè)化生產(chǎn)，能夠替代目前質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備過程中，細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提步驟的設(shè)備。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下反應(yīng)器由供液機(jī)構(gòu)、輸液機(jī)構(gòu)、分液機(jī)構(gòu)、蛇形管反應(yīng)器、中和分液器組成，供液機(jī)構(gòu)為若干組平行并聯(lián)的貯液瓶構(gòu)成，每個貯液瓶的導(dǎo)管上設(shè)置有蠕動泵，通過控制電路控制工作，其中，第一級供液機(jī)構(gòu)由兩個儲液瓶通過三通分液器并聯(lián)構(gòu)成，實現(xiàn)兩種物質(zhì)的混合反應(yīng)；第一級供液機(jī)構(gòu)的輸出端再與儲液瓶通過三通分液器并聯(lián)后構(gòu)成次級供液機(jī)構(gòu)，依此類推，下一級的貯液瓶與上一級的供液機(jī)構(gòu)并聯(lián)后再與下一級的貯液瓶并聯(lián)，可根據(jù)反應(yīng)需要設(shè)置多級供液反應(yīng)機(jī)構(gòu)，最終級供液機(jī)構(gòu)的輸出端與儲液瓶并聯(lián)與中和分液器連接，中和分液器的出料口與收集管連接；在供液機(jī)構(gòu)的三通分液器與下級供液機(jī)構(gòu)之間還可加裝蛇形管反應(yīng)器，延長反應(yīng)時間，以滿足兩種物料的反應(yīng)時間要求。
蛇形管反應(yīng)器內(nèi)含2米-20米(依據(jù)處理量)的蛇形內(nèi)管，保證兩個貯液瓶A、B中的液體在溫和的條件下混合，同時延長反應(yīng)時間至符合要求。
為證明本發(fā)明的使用效果，以處理100L菌液為例對本發(fā)明細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提反應(yīng)器與目前常規(guī)方法進(jìn)行比較實驗例1樣品100L菌液，OD值為45，菌濃度為70％，菌體實重7000g。
常規(guī)方法
100L菌液10000rpm/min離心1小時→收獲7000g菌體→按18比例加入56L TE溶液充分混勻→將56L混勻液平均分到25個10L瓶中，每瓶2.24L菌體混勻液→每瓶中加入2.24L裂解液(1％SDS0.2％NaOH)輕輕搖勻，靜止5分鐘→每瓶中再加入2.24L中和液(3M醋酸鉀、PH5.5)，充分混勻，靜止10分鐘→每瓶加入2.24L 2MCaCl，靜止10分鐘→10000rpm/min離心20分鐘取上清共得224L，質(zhì)粒DNA含量為45ug/ml。
本發(fā)明的細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提反應(yīng)器100L菌液10000rpm/min離心1小時→收獲7000g菌體→按1∶8比例加入56L TE溶液充分混勻→將56L菌體混勻液放入貯液瓶A中，56L裂解液(1％SDS 0.2％NaOH)放入貯液瓶B中，56L中和液(3M醋酸鉀、PH5.5)放入貯液瓶C中，56L 2MCaCl放入貯液瓶D中→同時啟動輸液泵1、2，調(diào)節(jié)泵流速，使貯液瓶A、B中的液體等速通過三通分液器5，同時使其在蛇形反應(yīng)器7中進(jìn)出液相隔時間為5分鐘→蛇形反應(yīng)器7流出液體時，啟動輸液泵3，使裂解后的菌體在三通分液器6中混合，流入中和分液器中(同時低速攪拌)→當(dāng)貯液瓶A、B、C中的液體全部流空后，停止攪拌，靜止20分鐘→啟動輸液泵4，快速將貯液瓶D中的液體泵入中和分液器8中(同時低速攪拌)→停止攪拌，靜止10分鐘→打開中和分液器8下部的出料口，由收液罐9收集，共得224L，質(zhì)粒DNA含量為80ug/ml。
結(jié)論上述實驗表明，以處理100L菌液為例，常規(guī)方法需分25瓶，重復(fù)25個操作循環(huán)，或25人同時操作才能完成，重復(fù)操作和不同人員的操作會造成中間產(chǎn)品的不均一。采用細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提反應(yīng)器使工作者在連續(xù)、封閉、穩(wěn)定的條件下制造出均一的中間產(chǎn)品，同時大大減輕操作者的工作量。以1ml菌液使用質(zhì)粒提取試劑盒提取的質(zhì)粒DNA量為100％回收率，比較兩種方法的質(zhì)粒DNA回收效果，常規(guī)方法回收率在30％-50％，細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提反應(yīng)器回收率＞70％。
本發(fā)明的積極效果在于利用該套設(shè)備將重組質(zhì)粒的大規(guī)模提取工藝由手工、間斷的操作變成自動、連續(xù)化的過程，克服了目前實驗室常規(guī)方法不能線性放大的問題。將重組質(zhì)粒的宿主-菌體常規(guī)堿裂解、質(zhì)粒粗提和粗提物高速離心等過程由手動操作改變?yōu)榭煽氐淖詣舆^程；由開放、階段性工作改變?yōu)榉忾]、連續(xù)性工作；由實驗室規(guī)模改變?yōu)橐子诰€性放大的符合GMP要求的工業(yè)化規(guī)模的反應(yīng)系統(tǒng)。


圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
通過以下實施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實施例1根據(jù)圖1，由貯液瓶A和貯液瓶B經(jīng)導(dǎo)管并聯(lián)與三通分液器5構(gòu)成第一級供液機(jī)構(gòu)，第一級供液機(jī)構(gòu)的輸出端接蛇形管反應(yīng)器7后與貯液瓶C并聯(lián)后與三通分液器6連接，再與貯液瓶D并聯(lián)接密封的攪拌反應(yīng)罐8，攪拌反應(yīng)罐8出料口與收集罐9連接；上述的貯液瓶A～D的導(dǎo)管上分別設(shè)有蠕動泵1～4和進(jìn)料管10～14，由控制器控制其工作狀態(tài)；在攪拌反應(yīng)罐8的底部還可設(shè)有濾膜15中。
實施例2將100L菌液10000rpm/min離心1小時后收獲7000g菌體，按1∶8比例加入56L TE溶液充分混勻，取56L菌體混勻液放入貯液瓶A中，56L裂解液(1％SDS 0.2％NaOH)放入貯液瓶B中，56L中和液(3M醋酸鉀、PH5.5)放入貯液瓶C中，56L 2MCaCl放入貯液瓶D中，同時啟動輸液泵1、2，調(diào)節(jié)泵流速，使貯液瓶A、B中的液體等速通過三通分液器5，同時使其在蛇形反應(yīng)器7中進(jìn)出液相隔時間為5分鐘，蛇形反應(yīng)器7流出液體時，啟動輸液泵3，使裂解后的菌體在三通分液器6中混合，流入中和分液器中(同時低速攪拌)；當(dāng)貯液瓶A、B、C中的液體全部流空后，停止攪拌，靜止20分鐘，啟動輸液泵4，快速將貯液瓶D中的液體泵入攪拌反應(yīng)罐8中(同時低速攪拌)，停止攪拌，靜止10分鐘，打開攪拌反應(yīng)罐8下部的出料口，由收液罐9收集，共得224L，質(zhì)粒DNA含量為80ug/ml。
權(quán)利要求
1.一種多級式細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提反應(yīng)器，其特征在于反應(yīng)器由供液機(jī)構(gòu)、輸液機(jī)構(gòu)、分液機(jī)構(gòu)、蛇形管反應(yīng)器、中和分液器組成，供液機(jī)構(gòu)為若干組平行并聯(lián)的貯液瓶構(gòu)成，每個貯液瓶的導(dǎo)管上設(shè)置有蠕動泵，通過控制電路控制工作，其中，第一級供液機(jī)構(gòu)由兩個儲液瓶通過三通分液器并聯(lián)構(gòu)成，實現(xiàn)兩種物質(zhì)的混合反應(yīng)；第一級供液機(jī)構(gòu)的輸出端再與儲液瓶通過三通分液器并聯(lián)后構(gòu)成次級供液機(jī)構(gòu)，依此類推，下一級的貯液瓶與上一級的供液機(jī)構(gòu)并聯(lián)后再與下一級的貯液瓶并聯(lián)，可根據(jù)反應(yīng)需要設(shè)置多級供液反應(yīng)機(jī)構(gòu)，最終級供液機(jī)構(gòu)的輸出端與儲液瓶并聯(lián)與密封攪拌反應(yīng)罐連接，攪拌反應(yīng)罐出料口與收集管連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)器，其特征在于在供液機(jī)構(gòu)的三通分液器與下級供液機(jī)構(gòu)之間還可加裝蛇形管反應(yīng)器，延長反應(yīng)時間，以滿足兩種物料的反應(yīng)時間要求。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多級式細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提反應(yīng)器，其供液機(jī)構(gòu)為若干組平行并聯(lián)的貯液瓶構(gòu)成，每個貯液瓶的導(dǎo)管上設(shè)置有蠕動泵，通過控制電路控制工作，其中，第一級供液機(jī)構(gòu)由兩個儲液瓶通過三通分液器并聯(lián)構(gòu)成，第一級供液機(jī)構(gòu)的輸出端與另一儲液瓶通過三通分液器并聯(lián)后構(gòu)成次級供液機(jī)構(gòu)，依此類推，下一級的貯液瓶與上一級的供液機(jī)構(gòu)并聯(lián)后再與下一級的貯液瓶并聯(lián)，最終級供液機(jī)構(gòu)的輸出端與儲液瓶并聯(lián)與密封攪拌反應(yīng)罐連接，攪拌反應(yīng)罐出料口與收集管連接；供液機(jī)構(gòu)與下級供液機(jī)構(gòu)之間還可加裝蛇形管反應(yīng)器，延長反應(yīng)時間，以滿足兩種物料的反應(yīng)時間要求。本發(fā)明可替代了細(xì)胞破碎、質(zhì)粒粗提的手工制備操作，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12M1/00GK1710057SQ20051001690
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月22日
發(fā)明者殷玉和, 石晶, 孫博 申請人:殷玉和