專利名稱：豬肌肉烯醇化酶基因eno3及其作為豬生產(chǎn)性狀的遺傳標記的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及豬的分子生物學技術(shù)及育種領域，具體涉及豬的與生產(chǎn)性狀相關基因ENO3基因完全編碼列的克隆以及利用該基因作為豬生產(chǎn)性狀的遺傳標記。
背景技術(shù)：
通過生產(chǎn)性狀的表型值估算出的育種值進行動物選擇性育種，已大大促進了家畜生產(chǎn)性狀的遺傳改良。九十年代以來，隨著分子生物學技術(shù)的進步以及在豬領域中的應用，逐步出現(xiàn)了以分子標記為核心的分子標記輔助選擇和滲入等分子育種技術(shù)，這些技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合，大大加速了豬育種進程。能夠應用于分子標記輔助選擇的基因或標記必須對目標性狀具有較大的遺傳貢獻率，即主效基因或標記，因此尋找這些主效基因和與之緊密連鎖的分子標記成為分子標記輔助選擇的前提和基礎，也是當前和今后一段時間豬分子生物學領域的研究重點和急需解決的問題。
目前已有多個位于功能基因內(nèi)部的與生產(chǎn)性狀緊密連鎖的分子標記被發(fā)現(xiàn)并申請專利。例如，在傳統(tǒng)的豬育種計劃中，由于消費者對瘦肉的興趣，因此選擇主要強調(diào)降低脂肪。脂肪降低主要以背膘厚降低來衡量。然而，背膘厚下降同樣導致了肌內(nèi)脂肪的下降，脂肪最后的沉積部位是肌肉，因此肌內(nèi)脂肪與味道以及肌肉的接受程度呈正相關。為防止肌內(nèi)脂肪進一步的下降，必須找到影響此性狀的分子標記，因為肌內(nèi)脂肪是很難在活體中度量的。Gerbens等證實了位于豬6號染色體上肌肉組織特異候選基因心臟脂肪酸結(jié)合蛋白與豬中肌內(nèi)脂肪含量和其它生產(chǎn)性狀的關系，該基因已被申請專利，其專利號為WO 97/35878；另外，Rothschild等發(fā)現(xiàn)了leptin受體基因內(nèi)與瘦肉率有關的分子標記，其專利號為U.S.Pat.Nos.5972621。
肌肉特異性烯醇化酶enolase 3，(beta，muscle)——ENO3基因編碼三個烯醇酶(ENO1，ENO2，ENO3)同功酶之一，是在成人骨骼肌細胞中發(fā)現(xiàn)的一種同型二聚體，定位于人的17號染色體上，全長大約6kb，包括12個外顯子和11個內(nèi)含子。Peshavaria等(1991.Molecular structure of the human muscle-specificenolase gene(ENO3).Biochem J.275(Pt 2)427-33)首先分離出了人肌肉特異性烯醇化酶ENO3基因，并探索了它的分子結(jié)構(gòu)。Comi，G.P.等(2001.Beta-enolase deficiency，a new metabolic myopathy of distal glycolysis.Ann.Neurol.50202-207)發(fā)現(xiàn)ENO3基因的突變能導致這個酶的穩(wěn)定性降低，從而引起代謝性肌病。
生物學上，生產(chǎn)性狀體現(xiàn)在動物的特定組織中，比如，肌肉組織對應于瘦肉生產(chǎn)。因此，在動物育種計劃中，各種水平的選擇壓力都會施加于不同組織中。而關于不同組織中特異表達基因與個體生產(chǎn)性能之間的關系還沒有完全揭示出來。本發(fā)明提供了肌肉特異表達基因-烯醇化酶(ENO3)編碼基因完全編碼序列，第8、9、10、11內(nèi)含子序列以及第9內(nèi)含子內(nèi)的遺傳變異與豬胴體和肉質(zhì)生產(chǎn)性狀間的關系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆豬ENO3基因的完全編碼序列以及部分基因組DNA序列，尋找ENO3基因的突變位點以及基因多態(tài)性的檢測方法，為豬的分子育種提供輔助選擇方法。
本發(fā)明提供大白豬ENO3基因的完全的編碼序列，其序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2。以及大白豬、長白豬和梅山豬ENO3基因包含第8、9、10、11內(nèi)含子總共1705bp的基因組核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5所示；通過3個豬種的上述序列進行Cluster W比對提供了位于該1705bp擴增片段內(nèi)部1128處的突變位點。
制備該基因片段的步驟如下從大白豬肌肉樣中提取RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)人、鼠ENO3基因同源cDNA序列設計兩對引物，其引物序列分別如序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化、克隆測序，比較分析，獲得該基因的編碼序列。然后再選擇大白豬、長白豬和梅山豬為試驗材料，從豬血液中提取DNA，根據(jù)上述獲得的豬ENO3基因cDNA序列設計引物，其引物序列分別如序列表SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化、克隆測序，序列比較分析。
本發(fā)明提供了鑒定上述1705bp序列1128bp處(第9內(nèi)含子內(nèi))T缺失變異的StuI-RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法。其步驟包括根據(jù)所獲得的上述SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5序列，設計引物，其引物序列分別如序列表SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，在豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR擴增片段StuI酶切分型及檢測。
本發(fā)明進一步提供了利用StuI-RFLP方法確定的不同基因型個體與生產(chǎn)性狀間的相關關系。


1.序列表SEQ ID NO1是外來豬種“大白豬”的cDNA序列；2.序列表SEQ ID NO2是外來豬種“大白豬”的氨基酸序列；3.序列表SEQ ID NO3是中國豬種“梅山豬”的核苷酸序列；4.序列表SEQ ID NO4是外來豬種“長白豬”的核苷酸序列；5.序列表SEQ ID NO5是外來豬種“大白豬”的核苷酸序列。
6.序列表SEQ ID NO6是制備SEQ ID NO.1前218bp特異基因片段所用的正向引物。
7.序列表SEQ ID NO7是制備SEQ ID NO.1前218bp特異基因片段所用的反向引物。
8.序列表SEQ ID NO8是制備SEQ ID NO.1后1269bp特異基因片段所用的正向引物。
9.序列表SEQ ID NO9是制備SEQ ID NO.1后1269bp特異基因片段所用的反向引物。
10.序列表SEQ ID NO10是制備SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5特異基因片段所用的正向引物。
11.序列表SEQ ID NO11是制備SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5特異基因片段所用的反向引物。
12.序列表SEQ ID NO12是實施豬ENO3基因第9內(nèi)含子T缺失突變StuI-RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法的正向引物。
13.序列表SEQ ID NO13是實施豬ENO3基因第9內(nèi)含子T缺失突變StuI-RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法的反向引物。
圖1豬ENO3基因編碼序列擴增電泳圖譜。圖中，瓊脂糖凝膠濃度為1.5％，M泳道DNA MarkerDL2,000；圖1(A)泳道1-3代表序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示引物在不同豬種中的擴增片段，片段大小為218bp；圖1(B)泳道1-3代表序列表SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示引物在不同豬種中的擴增片段，片段大小為1269bp。
圖2包括豬ENO3基因第8、9、10、11內(nèi)含子的基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖中瓊脂糖凝膠濃度為1.0％；M泳道DNA Marker DL2,000；泳道1-3代表序列表SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示引物在不同豬種中的擴增片段，片段大小分別為1705bp、1704bp、1702bp。
圖3ENO3基因StuI-RFLP檢測結(jié)果。圖中瓊脂糖膠濃度為1.5％；泳道M為DL 2000Markers；3泳道為AA基因型，687bp；2、5泳道為AB基因型，687bp，518bp，169bp；1、4、6泳道為BB基因型，169bp，518bp。
圖4是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
具體實施例方式
實施例1基因編碼區(qū)全長序列的獲得從大白豬、梅山豬肌肉樣中提取RNA，再RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)人ENO3基因(BC017249)和鼠ENO3基因(BC013460)同源cDNA序列設計CATS(比較錨定標簽序列法)引物，引物序列如下引物1正向引物F1AGCTGCCACCTCTACTCC反向引物R1CCAGGTAGCGAGATTTGT引物2正向引物F2CTTCCACGGGTATCTATGA反向引物R2GTTGGCACCAGTGTTTATT用此兩對引物在大白、梅山肌肉cDNA中進行PCR擴增，PCR反應體系為25μl，其中模板cDNA為2μl，dNTPs濃度為200μmol/L，每條引物濃度為0.4μmol/L，3U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去離子水至總體積25μl；94□預變性4min；然后94□變性50s、(引物151□，引物255□)退火50s、72□延伸40s(引物1)或1min20s(引物2)，共35個循環(huán)；最后72□延伸10min。不同引物的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化(UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物技術(shù)公司)、克隆后，進行序列測定，序列測定由上海生工生物技術(shù)公司完成。由引物1獲得片段大小218bp，引物2獲得1269bp的片段，將這兩個序列片段用sequencher 4.1.4軟件的ASSEMBLY程序進行拼接，得到一條1426bp的cDNA整合序列，把此整合的序列與人、鼠ENO3基因的mRNA序列及其基因組結(jié)構(gòu)經(jīng)ClusterW軟件進行序列比對發(fā)現(xiàn)此序列包括豬ENO3基因5’端非翻譯區(qū)序列43bp，完全的編碼序列1305bp，3’端非翻譯區(qū)序列78bp；與人、鼠ENO3基因mRNA序列同源性分別達到90％和85％，其1305bp的開放閱讀框，編碼434個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
實施例2基因片段的獲得及多態(tài)性檢測方法的建立選擇大白豬、長白豬、梅山豬為試驗材料，根據(jù)上述豬ENO3基因cDNA序列設計以下引物，引物序列如下正向引物F3GGCATCTGAGTTCTACCGC反向引物R3GGCACCAGTGTTTATTTCG用此引物在3個豬種(大白豬、長白豬、梅山豬)基因組DNA中進行PCR擴增，PCR反應體系為25μl，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200μmol/L，每條引物濃度為0.4μmol/L，3U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去離子水至總體積25μl；PCR反應程序94℃預變性4min；然后94℃變性50s、55℃退火50s、72℃延伸1min30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。
不同豬種的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆后，進行序列測定。上述擴增片段大小為1705bp，與人、鼠ENO3基因組結(jié)構(gòu)比較可知，此序列包括豬ENO3基因的第8、9、10、11內(nèi)含子。不同豬種的PCR產(chǎn)物序列經(jīng)ClusterW軟件進行序列比對，其中位于該片段的1128bp處(第9內(nèi)含子內(nèi))的T發(fā)生缺失突變表現(xiàn)了中、外豬種間差異，并引起了StuI酶切位點(AGG↓CCT)多態(tài)性。據(jù)此，設計以下引物，并采用StuI-RFLP方法進行SNP分型，引物序列如下正向引物F4AGATTCTGCTTCGTCCCA反向引物R4GGCTTCCACCTTCTCACTTPCR反應體系為20μl，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200μmol/L，每條引物濃度為0.5μmol/L，1U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去離子水至總體積20μl；PCR反應程序為；94℃預變性4min；然后94℃變性45s、55.5℃退火45s、72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。
取8.5μl PCR產(chǎn)物加入0.5μl(10U/μl)限制性內(nèi)切酶和1μl 10×buffer(含10×BSA)，37℃ StuI酶切4h，取5μl酶切產(chǎn)物用瓊脂糖膠電泳檢測，在紫外燈下或銀染后觀察并記錄酶切結(jié)果。此擴增片段大小為687bp，StuI酶切多態(tài)性位點位于該片段的172bp處，若172bp處的堿基缺失時，則不存在StuI酶切位點，用StuI酶切檢測結(jié)果只有一條687bp片段(A等位基因)，當該位點為T時，結(jié)果導致一個StuI酶切位點的產(chǎn)生，酶切得到兩個片段，長度分別為169bp和518bp(B等位基因)。
實施例3分子標記在不同豬群中的多態(tài)性分布在3個國外豬群(大白豬、長白豬、杜洛克豬)和5個中國豬群(清平豬、八眉豬、淮南豬、梅山豬、二花臉豬)中檢測豬StuI第9內(nèi)含子的StuI-RFLP多態(tài)性，檢測結(jié)果如表1所示。在所檢測的幾個豬種中，大白、清平、淮南、梅山和二花臉豬群占優(yōu)勢的A等位基因的基因頻率分別為0.724、0.789、0.733、0.774和0.952，而長白、杜洛克中優(yōu)勢的B等位基因的基因頻率分別為0.641和0.932，在八眉豬中A等位基因和B等位基因的頻率相等，均為0.5。
表1 ENO3基因StuI酶切多態(tài)性在不同豬種中的分布結(jié)果

實施例4分子標記與生產(chǎn)性狀的關聯(lián)分析為了確定ENO3基因多態(tài)性與豬表型差異是否相關，選擇華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點實驗室組建的132頭豬(34頭大白豬、37頭長白豬、35頭長白×大白雜交豬、26頭大白×長白雜交豬)和140頭大白×梅山F2代資源群體為試驗材料，采用實施例2所建立的StuI-RFLP方法進行多態(tài)性檢測，并分析豬ENO3基因StuI-PFLP不同基因型與豬生產(chǎn)性狀的相關關系。采用SAS統(tǒng)計軟件(SAS Institute Inc，Version8.0)glm程序進行單標記方差分析，同時采用reg程序計算基因加性效應和顯性效應，并進行顯著性檢驗，所采用模型為Yijkl＝μ+Gi+Fj+Sk+Yl+bijklXijkl+eijkl
Yij為性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應(包括基因加性效應和顯性效應；加性效應用-1，0和1分別代表AA、AB和BB基因型，顯性效應用1，-1和1分別代表AA、AB和BB基因型)；Sk、Yl、Fj為固定效應，分別為性別、品種、家系效應，bijkl為屠宰體重或屠宰日齡的回歸系數(shù)，胴體性狀以屠宰體重為協(xié)變量，肉質(zhì)性狀以屠宰日齡為協(xié)變量，生長不考慮協(xié)變量；eijkl為殘差效應。
在所檢測的132頭大白、長白、長大豬、大長豬中，AA基因型有29個，AB基因型有59個，BB基因型有44個。不同基因型與生產(chǎn)性狀間的統(tǒng)計分析結(jié)果總結(jié)于表2和3。
由表2可以看出，StuI-RFLP基因型不同時，皮率、內(nèi)脂率、肥肉率、胴體長和背膘厚性狀存在顯著或極顯著差異。該位點在皮率和內(nèi)脂率主要以加性作用方式為主，A等位基因提高了皮率和內(nèi)脂率，雜合子個體具有較高的胴體長以及較低的肥肉率、肩部背膘厚和胸腰椎間背膘厚。該位點在胴體長、肩部背膘厚和胸腰椎間背膘厚性狀上顯性效應顯著，分別為-0.579±0.268、0.076±0.036和0.072±0.031。
表2ENO3基因StuI-RFLP基因型與胴體性狀的統(tǒng)計分析表

注以上數(shù)值為最小二乘均值±標準誤含有相同字母表示差異不顯著，小寫字母表示差異顯著，大寫字母表示差異極顯著加性效應負值表示B等位基因降低性狀表型值；*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(下表同)。
由表3可以看出，ENO3基因StuI-RFLP不同基因型時，背最長肌色值、背最長肌大理石紋和股二頭肌大理石紋差異顯著，股二頭肌色值、肌內(nèi)脂肪和肌內(nèi)水分差異極顯著，除背最長肌色值外，其它加性效應均顯著或極顯著。其中肌內(nèi)脂肪和肌內(nèi)水分加性效應極顯著，其值分別為-0.144±0.036和0.288±0.076；A等位基因在提高背最長肌大理石紋、股二頭肌大理石紋和肌內(nèi)脂肪的同時，降低了肌內(nèi)水分；雜合子個體具有較高的背最長肌色值和股二頭肌色值。
表3ENO3基因StuI-RFLP基因型與肉質(zhì)性狀的統(tǒng)計分析表

在所檢測的140頭大白×梅山F2代個體中，AA基因型有65個，AB基因型有58個，BB基因型有17個。不同基因型與生產(chǎn)性狀間的統(tǒng)計分析結(jié)果總結(jié)于表4和5。
由表4可以看出，在大梅F2代個體中，StuI-RFLP基因型不同時，初生重、骨率、肥肉率、瘦肥比率、肩部背膘厚和平均背膘厚性狀存在顯著或極顯著差異。該位點在這些性狀上均以加性作用方式為主，A等位基因在降低初生重、肥肉率、肩部背膘厚和平均背膘厚的同時，提高了骨率和瘦肥比率。
表4 在“大梅”F2代中ENO3基因StuI-RFLP基因型與胴體性狀的統(tǒng)計分析表

由表5可以看出，ENO3基因StuI-RFLP不同基因型時，股二頭肌色值和背最長肌大理石紋差異顯著，股二頭肌大理石紋和肌內(nèi)脂肪差異極顯著性，均以加性效應為主，其中股二頭肌大理石紋和肌內(nèi)脂肪加性效應極顯著，分別為-0.075±0.026和-0.363±0.088。AA基因型個體股二頭肌色值、背最長肌大理石紋、股二頭肌大理石紋和肌內(nèi)脂肪分別比BB基因型高0.841％、0.145、0.15和0.726％。
表5 在“大梅”F2代中ENO3基因StuI-RFLP基因型與肉質(zhì)性狀的統(tǒng)計分析表

SEQUENCE LISTING(序列表)<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>豬肌肉烯醇化酶編碼基因ENO3及其作為豬生產(chǎn)性狀的遺傳標記<130>
<141>2004-11-08<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1426<212>RNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>CDS<222>(44)..(1348)<223>
<220>
<221>primer bind<222>(1407)..(1426)<223>
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<220>
<221>primer bind<222>(1)..(18)<223>
<220>
<221>gene<222>(1)..(1426)<223>
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<400>13ggcttccacc ttctcactt 19
權(quán)利要求
1.一種豬生產(chǎn)性狀相關基因ENO3，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO3、SEQID NO4、SEQ ID NO5所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所獲得的ENO3基因cDNA序列長度為1426bp，序列中包含1305bp的開放閱讀框，43bp 5’非翻譯區(qū)和78bp3’非翻譯區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述DNA序列，其特征在于PCR擴增的序列全長為1705bp，其中包含豬ENO3基因的第8、9、10、11內(nèi)含子序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述基因，其特征在于序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5序列1128位堿基處有一個堿基T的缺失突變，導致Stu I-RFLP多態(tài)性。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述基因，其特征在于用于檢測如序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中1128bp處缺失突變的兩條引物序列如序列表SEQID NO.12和SEQ ID NO.13所述。
7.一種篩選豬生產(chǎn)性狀的分子標記的方法，按照以下步驟根據(jù)人、鼠ENO3基因cDNA同源序列設計引物在豬cDNA中擴增獲得豬ENO3基因的cDNA序列；再從豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)該基因cDNA序列設計引物，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQID NO.3-SEQ ID NO.5所述DNA序列；用該DNA序列設計引物在豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR擴增片段Stu I酶切分型及檢測。
8.權(quán)利要求1-7任一項所述的豬生產(chǎn)性狀相關基因ENO3在豬標記輔助選擇中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬的分子生物學技術(shù)及育種領域，具體涉及豬生產(chǎn)性狀相關基因ENO3基因完全編碼序列以及第9內(nèi)含子的突變位點的檢測方法。利用人、鼠ENO3基因的同源序列設計引物，獲得豬ENO3 cDNA序列長度為1426bp，序列中包含1305bp的開放閱讀框，43bp 5’非翻譯區(qū)和78bp 3’非翻譯區(qū)。從豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)該基因cDNA序列設計引物獲得其DNA序列為1705bp，其中包含豬ENO3基因的第8、9、10、11內(nèi)含子序列。在該片段1128位堿基處有一個堿基T的缺失突變，導致Stu I－RFLP多態(tài)性。在不同的試驗群體中應用該標記基因檢測了與豬重要生產(chǎn)性狀間的相關性，表明它與某些重要生產(chǎn)性狀存在顯著或極顯著相關，本發(fā)明的基因可作為豬育種輔助選擇的遺傳標記。
文檔編號C12P19/34GK1803824SQ20051001813
公開日2006年7月19日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月12日
發(fā)明者吳健, 鄧昌彥, 熊遠著, 雷明剛, 左波 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學