專利名稱：細(xì)菌性木聚糖酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木聚糖酶的生產(chǎn)工藝，具體地是一種細(xì)菌性木聚糖酶的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
阿拉伯木聚糖(Arabinoxylan，AX)是廣泛存在于我國常用植物性飼料原料(玉米、小麥、菜籽和棉粕)中的非淀粉多糖(Non-starch polysaccharides，NSP)，是限制營養(yǎng)物質(zhì)有效利用的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子。因此，消除阿拉伯木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用對進一步提高飼料資源的利用率、拓寬飼料資源和提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益有重要意義。國內(nèi)外大量研究表明通過在飼料中添加外源木聚糖酶及其復(fù)合酶制劑可以提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)利用率，改善動物生產(chǎn)性能。
通過對木聚糖酶的酶解作用模式進行的研究表明，內(nèi)切木聚糖酶可以隨機攻擊木聚糖的1-4-β糖苷鍵，并優(yōu)先攻擊非取代基團。木聚糖酶主要來源于細(xì)菌和真菌，大多數(shù)細(xì)菌性木聚糖酶為內(nèi)木聚糖酶，其作為飼料具有下述獨特的優(yōu)點1、熱穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性穩(wěn)定性是影響酶制劑使用效果的關(guān)鍵因素，使用結(jié)果表明在80℃的造粒溫度下，細(xì)菌性木聚糖酶的活性保留值為80％，而真菌性木聚糖酶僅保留5％左右。
2、較高的內(nèi)切木聚糖酶糖比例，酶解效率高細(xì)菌性木聚糖酶主要由內(nèi)切性木聚糖酶組成，分解木聚糖酶的效率高；細(xì)菌性木聚糖酶大多屬于10族內(nèi)切酶，水解異型聚糖(取代木聚糖)和同型木聚糖的能力更強。
3、徹底降解木聚糖。細(xì)菌性木聚糖酶不但可以作用于可溶性木聚糖，而且可作用于不溶性木聚糖，進一步釋放細(xì)胞壁中包裹的營養(yǎng)物質(zhì)。在各種植物原料中都存在不溶性木聚糖(占木聚糖總量的80％)，它們和纖維素相互作用包裹營養(yǎng)物質(zhì)形成營養(yǎng)屏障，影響營養(yǎng)吸收。使用細(xì)菌性木聚糖酶可顯著提高日糧的代謝能、消化能及其營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，可廣泛應(yīng)用于豆粕、玉米、小麥、餅粕等植物原料為主的飼料中。
4、對酶的抑制劑不敏感植物飼料原料中存在著對真菌性木聚糖酶的抑制劑，但對細(xì)菌性木聚糖酶不敏感，細(xì)菌性木聚糖酶在使用中不受酶抑制劑的影響，保持較高酶活。
5、PH適應(yīng)范圍廣細(xì)菌性木聚糖酶相對具有更廣泛的活性PH值范圍，可更加有效地在不同動物的胃腸道中發(fā)揮作用。在胃部其穩(wěn)定性很好，進入腸道后呈現(xiàn)更高的酶活(腸道是消化道中最長的部位)，使食糜在動物腸道內(nèi)更好地被降解消化吸收。
上世紀(jì)50-70年代，開始研究外源酶在動物中的應(yīng)用，但因價格昂貴而限制了其應(yīng)用。80年代后，生物技術(shù)的發(fā)展促進了飼用酶制劑的研究和商品化生產(chǎn)和應(yīng)用。我國飼用酶制劑的應(yīng)用起于80年代后期。目前，酶制劑特別是以木聚糖酶為主的復(fù)合酶制劑以其可有效降解玉米、小麥和雜粕等飼料原料中的阿拉伯木聚糖，消除阿拉伯木聚糖對動物的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率和動物的生長性能而成為一種在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用的酶制劑。特別是細(xì)菌性木聚糖酶以其穩(wěn)定性好，降解效率高等特點引起了人們的廣泛關(guān)注。
我國大部分肉雞飼料和部分豬飼料均采用制粒工藝，很多飼料廠溫度超過75℃，甚至到90℃以上。因此，酶制劑產(chǎn)品的耐溫性是影響其使用效果的關(guān)鍵，也是衡量酶制劑性能的主要指標(biāo)。
目前國際上僅有比利時NUTREX公司開發(fā)出耐熱性的細(xì)菌性的內(nèi)切木聚糖酶，其生產(chǎn)工藝不詳，且其售價高。
目前我國市場上銷售的絕大部分木聚糖酶均為真菌性木聚糖酶。是用真菌和固體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)木聚糖酶，終產(chǎn)物為多酶復(fù)合體，發(fā)酵參數(shù)變異加大，難于控制，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，添加量大，生產(chǎn)成本高。特別是對熱處理抵抗能力低，飼料制粒過程中酶活損失大，儲存期短，實際應(yīng)用安全問題較多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種能實現(xiàn)生產(chǎn)的大型化、機械化、自動化和連續(xù)化，提高產(chǎn)品的耐高溫性及水解性能，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量的飼用細(xì)菌性木聚糖酶的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是一種細(xì)菌性木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征在于采用耐高溫枯草桿菌為生產(chǎn)菌種，通過液體深層發(fā)酵方法生產(chǎn)細(xì)菌性木聚糖酶。
本發(fā)明生產(chǎn)方法的具體步驟是第一，菌種活化將保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基(復(fù)壯培養(yǎng)基)上，于33-39℃，培養(yǎng)40-52小時；第二，瓶培養(yǎng)將經(jīng)活化并擴大培養(yǎng)的種子接搖瓶進行培養(yǎng)，500ml搖瓶中裝50ml培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速160-200rpm，培養(yǎng)溫33-39℃，時間24-48小時；第三，種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)將搖瓶中培養(yǎng)的菌體液移至種子罐，接種量為0.4-0.8％，轉(zhuǎn)速220-280rpm，恒溫33-39℃，培養(yǎng)24-48小時；121℃保溫20min；第四，發(fā)酵培養(yǎng)將種子罐培養(yǎng)的菌體液移至發(fā)罐酵，接種量0.5-1％，發(fā)酵溫度33-39℃，PH7.2，轉(zhuǎn)速130rpm，通氣比1∶0.7，發(fā)酵周期48-72小時，發(fā)酵液的酶活單位達10000U/ml。轉(zhuǎn)速為130rpm，培養(yǎng)時間約70h，第五，后處理發(fā)酵液經(jīng)過濾、沉淀、濃縮、吸附干燥工序制備成所需細(xì)菌性木聚糖酶；其中，斜面培養(yǎng)基為牛肉膏2-4g，蛋白胨8-12g，氯化鈉(NaCl)4-6g，瓊脂18-22g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2；搖瓶中培養(yǎng)液為牛肉膏2-4g，蛋白胨8-12g，氯化鈉(NaCl)4-6g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2；種子罐中的培養(yǎng)液為葡萄糖1-2％，CaCl2.2H2O(二水氯化鈣)0.01-0.05％，NH4H2PO4(磷酸二氫銨)0.3-0.7％，F(xiàn)eSO4.7H2O(七水硫酸亞鐵)0.01-0.05％，檸檬酸鈉0.05-0.1％，PH7.2；發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液為酵母膏0.1-0.3％，葡萄糖1-2％，F(xiàn)eSO4.7H2O(七水硫酸亞鐵)0.01-0.05％，MnSO4.H2O(二水硫酸錳)0.03-0.08％，CaCl2.2H2O(二水氯化鈣)0.01-0.05％，檸檬酸鈉0.03-0.08％，PH7.2，本發(fā)明的桔草桿菌生產(chǎn)出的細(xì)菌性木聚糖酶水解效率高，能高效降解底物，且即可生產(chǎn)出低分子量的堿性木聚糖酶，又可生產(chǎn)出高分子量的酸性木聚糖酶，具有更廣泛的活性PH值范圍，可更加有效地在不同動物的胃腸中發(fā)揮作用。
本發(fā)明采用深層液體發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌性木聚糖酶，其酶性好，其生產(chǎn)工藝易于控制，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，且適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，自動化程度高。
具體實施例方式
實施例11、菌種冷凍保藏制備枯草芽孢桿菌體懸浮液，經(jīng)冷凍干燥處理，將冷凍后菌體裝于充氮的密封安培瓶中，保藏于-80℃低溫冰箱，保存期限為8-10年。
2、冷凍后的菌種的復(fù)壯及篩選將菌體粉溶解于無菌生理鹽水中，接種于復(fù)壯培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)48h，篩選菌落較大，表面光滑、濕潤的單菌體。其中，斜面培養(yǎng)基為牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉(NaCl)5g，瓊脂20g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，在121℃下滅菌20min，將滅菌斜面培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24-48h，以檢查滅菌是否徹底。
3、母瓶培養(yǎng)將經(jīng)活化并擴大培養(yǎng)的種子接搖瓶進行培養(yǎng)，500ml搖瓶(三角瓶)中裝50ml培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)溫33℃，時間48h；搖瓶培養(yǎng)液為牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，121℃滅菌20min。
4、種子罐培養(yǎng)將搖瓶中培養(yǎng)24h后的菌體液移至種子罐，接種量為0.4％，轉(zhuǎn)速220rpm，恒溫37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)基葡萄糖1％，CaCl2.2H2O 0.01％，NH4H2PO40.5％，F(xiàn)eSO4.7H2O0.01％，檸檬酸鈉0.05％，PH7.2，121℃保溫20min。
5、發(fā)酵培養(yǎng)接種量0.5％，發(fā)酵溫度37℃，PH7.2，轉(zhuǎn)速130rpm，通氣比1∶0.7，發(fā)酵周期70h，發(fā)酵液的酶活單位達10000U/ml。培養(yǎng)基酵母膏0.1％，葡萄糖1％，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01％，MnSO4.H2O0.05％，CaCl2.2H2O 0.01％，檸檬酸鈉0.05％，PH7.2，121℃保溫20min。
6、發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液添加絮凝劑后，靜置30min，經(jīng)離心過濾，除去菌體，收集上清液，調(diào)節(jié)清液酸度，PH為5.0，靜置1h，過濾除去大部分沉淀，收集清液。
7、濃縮采用多效減壓薄膜蒸發(fā)法，真空度約為0.07Mpa，蒸發(fā)溫度70℃，料液瞬間受熱時間約20S。
8、干燥用淀粉和玉米芯(1∶2)載體吸附經(jīng)濃縮的酶液，于鼓風(fēng)干燥箱中干燥，溫度50℃，時間約2H，待物料含水量為10％時，經(jīng)粉碎和調(diào)配即可。
實施例21、菌種活化擴大將冷凍保藏的枯草芽孢桿菌菌體粉溶解于無菌生理鹽水中，接種于復(fù)壯培養(yǎng)基上，于33℃培養(yǎng)52h，篩選菌落較大，表面光滑、濕潤的單菌體。其中，斜面培養(yǎng)基為牛肉膏2g，蛋白胨8g，氯化鈉(NaCl)4g，瓊脂18g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，在121℃下滅菌20min，將滅菌斜面培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24-48h，以檢查滅菌是否徹底。
2、瓶培養(yǎng)將經(jīng)活化并擴大培養(yǎng)的種子接搖瓶進行培養(yǎng)，500ml搖瓶(三角瓶)中裝50ml培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)溫37℃，時間24h；搖瓶培養(yǎng)液為牛肉膏2g，蛋白胨8g，NaCl4g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，121℃滅菌20min。
3、種子罐培養(yǎng)將搖瓶中培養(yǎng)24h后的菌體液移至種子罐，接種量為0.5％，轉(zhuǎn)速250rpm，恒溫33℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)基葡萄糖1％，CaCl2.2H2O 0.01％，NH4H2PO40.5％，F(xiàn)eSO4.7H2O0.01％，檸檬酸鈉0.05％，PH7.2，121℃保溫20min。
4、發(fā)酵培養(yǎng)接種量0.5％，發(fā)酵溫度37℃，PH7.2，轉(zhuǎn)速130rpm，通氣比1∶0.7，發(fā)酵周期70h，發(fā)酵液的酶活單位達10000U/ml。培養(yǎng)基酵母膏0.1％，葡萄糖1％，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01％，MnSO4.H2O0.05％，CaCl2.2H2O 0.01％，檸檬酸鈉0.05％，PH7.2，121℃保溫20min。
5、發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液添加絮凝劑后，靜置30min，經(jīng)離心過濾，除去菌體，收集上清液，調(diào)節(jié)清液酸度，PH為5.0，靜置1h，過濾除去大部分沉淀，收集清液。
6、濃縮采用多效減壓薄膜蒸發(fā)法，真空度約為0.07Mpa，蒸發(fā)溫度70℃，料液瞬間受熱時間約20S。
7、干燥用淀粉和玉米芯(1∶2)載體吸附經(jīng)濃縮的酶液，于鼓風(fēng)干燥箱中干燥，溫度50℃，時間約2H，待物料含水量為10％時，經(jīng)粉碎和調(diào)配即可。
實施例31、菌種活化擴大將冷凍保藏的枯草芽孢桿菌菌體粉溶解于無菌生理鹽水中，接種于復(fù)壯培養(yǎng)基上，于39℃培養(yǎng)40h，篩選菌落較大，表面光滑、濕潤的單菌體。其中，斜面培養(yǎng)基為牛肉膏5g，蛋白胨12g，氯化鈉(NaCl)6g，瓊脂22g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，在121℃下滅菌20min，將滅菌斜面培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24-48h，以檢查滅菌是否徹底。
2、瓶培養(yǎng)將經(jīng)活化并擴大培養(yǎng)的種子接搖瓶進行培養(yǎng)，500ml搖瓶(三角瓶)中裝50ml培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)溫39℃，時間24h；搖瓶培養(yǎng)液為牛肉膏5g，蛋白胨12g，NaCl6g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，121℃滅菌20min。
3、種子罐培養(yǎng)將搖瓶中培養(yǎng)24h后的菌體液移至種子罐，接種量為0.5％，轉(zhuǎn)速250rpm，恒溫33℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)基葡萄糖1％，CaCl2.2H2O 0.01％，NH4H2PO40.5％，F(xiàn)eSO4.7H2O0.01％，檸檬酸鈉0.05％，PH7.2，121℃保溫20min。
4、發(fā)酵培養(yǎng)接種量0.5％，發(fā)酵溫度37℃，PH7.2，轉(zhuǎn)速130rpm，通氣比1∶0.7，發(fā)酵周期70h，發(fā)酵液的酶活單位達10000U/ml。培養(yǎng)基酵母膏0.1％，葡萄糖1％，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01％，MnSO4.H2O0.05％，CaCl2.2H2O 0.01％，檸檬酸鈉0.05％，PH7.2，121℃保溫20min。
5、發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液添加絮凝劑后，靜置30min，經(jīng)離心過濾，除去菌體，收集上清液，調(diào)節(jié)清液酸度，PH為5.0，靜置1h，過濾除去大部分沉淀，收集清液。
6、濃縮采用多效減壓薄膜蒸發(fā)法，真空度約為0.07Mpa，蒸發(fā)溫度70℃，料液瞬間受熱時間約20S。
7、干燥用淀粉和玉米芯(1∶2)載體吸附經(jīng)濃縮的酶液，于鼓風(fēng)干燥箱中干燥，溫度50℃，時間約2H，待物料含水量為10％時，經(jīng)粉碎和調(diào)配即可。
試驗與結(jié)果細(xì)菌木聚糖酶耐熱穩(wěn)定性稱取15份木聚糖酶(單位為15000U/g)，每份約10g，均勻平攤于100cm2的玻璃板上，放置于恒濕恒溫的試驗箱中進行耐熱試驗，相對濕度穩(wěn)定于90％，處理溫度分別為85℃、80℃、75℃，恒溫時間分別為2min、4min、6min、8min、10min，然后檢測各樣品的酶活，結(jié)果如下
結(jié)果說明，細(xì)菌木聚糖酶在飼料生產(chǎn)加工中具有較高穩(wěn)定性，能保持高的酶力，有效降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，是一種理想的綠色飼料添加劑。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌性木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征在于采用耐高溫枯草桿菌為生產(chǎn)菌種，通過液體深層發(fā)酵方法生產(chǎn)細(xì)菌性木聚糖酶。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于其具體生產(chǎn)步驟如下第一，菌種活化將保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，于33-39℃，培養(yǎng)40-52小時；第二，瓶培養(yǎng)將經(jīng)活化并擴大培養(yǎng)的種子接搖瓶進行培養(yǎng)，500ml搖瓶中裝50ml培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速160-200rpm，培養(yǎng)溫33-39℃，時間24-48小時；第三，種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)將搖瓶中培養(yǎng)的菌體液移至種子罐，接種量為0.4-0.8％，轉(zhuǎn)速220-280rpm，恒溫33-39℃，培養(yǎng)24-48小時；121℃保溫20min；第四，發(fā)酵培養(yǎng)將種子罐培養(yǎng)的菌體液移至發(fā)罐酵，接種量0.5-1％，發(fā)酵溫度33-39℃，PH7.2，轉(zhuǎn)速130rpm，通氣比1∶0.7，發(fā)酵周期48-72小時，發(fā)酵液的酶活單位達10000U/ml，轉(zhuǎn)速為130rpm，培養(yǎng)時間約70h；第五，后處理發(fā)酵液經(jīng)過濾、沉淀、濃縮、吸附干燥工序制備成所需細(xì)菌性木聚糖酶；其中斜面培養(yǎng)基為牛肉膏2-4g，蛋白胨8-12g，氯化鈉4-6g，瓊脂18-22g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2；搖瓶中培養(yǎng)液為牛肉膏2-4g，蛋白胨8-12g，氯化鈉4-6g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2；種子罐中的培養(yǎng)液為葡萄糖1-2％，二水氯化鈣0.01-0.05％，磷酸二氫銨0.3-0.7％，七水硫酸亞鐵0.01-0.05％，檸檬酸鈉0.05-0.1％，PH7.2；發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液為酵母膏0.1-0.3％，葡萄糖1-2％，七水硫酸亞鐵0.01-0.05％，二水硫酸錳0.03-0.08％，二水氯化鈣0.01-0.05％，檸檬酸鈉0.03-0.08％，PH7.2。
全文摘要
一種細(xì)菌性木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征在于采用耐高溫枯草桿菌為生產(chǎn)菌種，通過液體深層發(fā)酵方法生產(chǎn)細(xì)菌性木聚糖酶。本發(fā)明的桔草桿菌生產(chǎn)出的細(xì)菌性木聚糖酶水解效率高，能高效降解底物，且即可生產(chǎn)出低分子量的堿性木聚糖酶，又可生產(chǎn)出高分子量的酸性木聚糖酶，具有更廣泛的活性pH值范圍，可更加有效地在不同動物的胃腸中發(fā)揮作用。本發(fā)明采用深層液體發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌性木聚糖酶，其酶性好，其生產(chǎn)工藝易于控制，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，且適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，自動化程度高。
文檔編號C12N1/20GK1676605SQ20051001845
公開日2005年10月5日 申請日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者詹志春 申請人:武漢新華揚生物有限責(zé)任公司