專利名稱：水稻抗白葉枯病隱性基因xal3和它的等位顯性基因Xal3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個水稻抗白葉枯病隱性基因xa13的分離克隆、功能驗證和應(yīng)用。抗病隱性基因xa13是它的等位(顯性)基因Xa13的功能缺陷突變體。顯性基因Xa13的突變使水稻產(chǎn)生對某些白葉枯病菌的抗性。
背景技術(shù)：
植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細(xì)菌、霉菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩大類(1)抗病基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因?？共』蚪閷?dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強，是很好的基因資源。但絕大多數(shù)抗病基因都具有病原生理小種特異性，即一個抗病基因只能介導(dǎo)對一種或幾種病原生理小種的抗病反應(yīng)?？共∠嚓P(guān)基因是指除抗病基因外所有參與抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參與合成植物體內(nèi)抗病信號分子、參與信號傳導(dǎo)或參與防衛(wèi)反應(yīng)等。
植物中已有多個抗病基因被克隆。在已被克隆的植物抗病基因中，大多數(shù)基因都編碼信號分子識別蛋白(Baker等，1997，Signaling in plant-microbe interactions，Science 276726-733。這類抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)可以用基因?qū)驅(qū)W說解釋(Flor，1956，The complementarygene systems in flax and flax rust，Adv.Genet.829-54)。根據(jù)基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，現(xiàn)可將已經(jīng)分離克隆并經(jīng)過功能驗證的植物抗病基因分為8類(Hammond-Kosack和Parker，2003，Deciphering plant-pathogen communicationfresh perspectives for molecular resistance breeding，Curr.Opin.Biotech.14177-193)。本專利申請涉及的水稻抗白葉枯病隱性基因xa13屬于目前尚未在植物中報道過的一種新類型抗病基因。
水稻白葉枯病是一種非常嚴(yán)重的病害，由稻黃單孢桿菌中的致病變種Xanthomonasoryzae pv.oryzae(Xoo)侵染引起。這種病害在亞洲、歐洲、非洲、南美、美國和澳大利亞都有發(fā)生；而以日本、印度和中國發(fā)生比較嚴(yán)重。我國主要發(fā)生在華東、華中、華南稻區(qū)，在西北、西南、華北和東北部分稻區(qū)也有分布。白葉枯病在潮濕和低洼地區(qū)發(fā)病比較頻繁，一般秈稻重于粳稻，雙季晚稻重于雙季早稻，單季中稻重于單季晚稻(過崇儉，1995，中國農(nóng)作物病蟲害，中國農(nóng)業(yè)出版社，14-24)。受侵染的水稻一般減產(chǎn)20-30％，嚴(yán)重時能夠達(dá)到50％(Ou，1985，Rice disease，2nd edition，Commonwealth Mycology Institute，NewEngland)。白葉枯病造成米質(zhì)松脆，發(fā)芽率降低。如果在分蘗期出現(xiàn)凋萎型白葉枯，則造成稻株的大量枯死，損失會更大。
控制白葉枯病害流行的最好的方法是改良水稻品種的抗性。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為品種改良提供了高效途徑。但利用這一途徑的前提是必須具有優(yōu)良抗病基因克隆。目前已被鑒定的抗白葉枯病基因有30個，但國際國內(nèi)已報道被克隆的抗白葉枯病基因只有四個Xa21(Song等1995，A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene，Xa21，Science2701804-1806，美國專利5,859,339)、Xa1(Yoshimura等，1998，Expression of Xa1，a bacterialblight resistance gene in rice，is induced by bacterial inoculation，Proc.Natl.Acad.Sci.USA951663-1668)，Xa26(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzaepv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein，Plant J.37517-527，本申請人的在先授權(quán)的中國發(fā)明專利ZL02139212.9)和xa5(Iyer和McCouch，2004，The rice bacterialblight resistance gene xa5 encodes a novel form of disease resistance，Mol.Plant-Microbe Interact171348-1354)。在國際上已經(jīng)鑒定并命名的30個抗白葉枯病基因中，大多數(shù)基因?qū)Π兹~枯病菌生理小種PXO99沒有抗性。而本申請所涉及的xa13基因?qū)Π兹~枯病菌PXO99有很強抗性。xa13基因是它的等位(顯性)基因Xa13的功能缺陷突變體。顯性基因Xa13存在于所有對白葉枯病菌PXO99不具有抗性的水稻品種中。利用基于RNA干擾(RNA interference，RNAi)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可使水稻中顯性基因Xa13的功能喪失，拓寬水稻的抗譜；也可以利用RNAi技術(shù)抑制隱性基因xa13的功能，進(jìn)一步提高水稻對白葉枯病的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的涉及從水稻中分離和應(yīng)用一種新的DNA序列，這些序列包含隱性基因xa13和xa13基因的等位顯性基因Xa13的DNA片段。所述的隱性基因xa13是顯性基因Xa13的等位突變基因。攜帶隱性基因xa13的DNA片段賦予水稻對由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)。其中，顯性基因Xa13和隱性基因xa13的DNA片段分別如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示的DNA序列。
所述的顯性基因Xa13的編碼產(chǎn)物XA13蛋白和隱性基因xa13的編碼產(chǎn)物xa13蛋白均由307個氨基酸組成(分別如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示氨基酸序列)。與XA13蛋白相比，xa13蛋白第238位氨基酸發(fā)生突變，由XA13蛋白的丙氨酸變?yōu)閤a13蛋白的蘇氨酸。
本發(fā)明為增強水稻對白葉枯病菌的抗性的應(yīng)用提供了一種新的方法。這種方法包括將隱性基因xa13或顯性基因Xa13的部分片段與能夠表達(dá)雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)的載體連接、轉(zhuǎn)入水稻，通過抑制顯性基因Xa13的功能改良水稻對白葉枯病的抗性，或者通過抑制隱性基因xa13的功能進(jìn)一步提高水稻的抗性。
在本發(fā)明的實施例部分，申請人詳細(xì)闡述了本發(fā)明所涉及的隱性基因xa13和顯性基因Xa13的分離、功能驗證和應(yīng)用過程以及這兩個基因的特點。


序列表SEQ ID NO1.本發(fā)明分離的水稻抗白葉枯病隱性基因xa13的等位顯性基因Xa13的序列，該顯性基因來源于水稻品種IR24和IR64(菲律賓國際水稻研究所公開提供的水稻品種)。
序列表SEQ ID NO2.本發(fā)明分離的水稻品種明恢63、IR24和IR64中顯性基因Xa13的cDNA序列。
序列表SEQ ID NO3.本發(fā)明分離的水稻抗白葉枯病隱性基因xa13的序列，該隱性基因來源于水稻品系IRBB13(菲律賓國際水稻研究所公開提供的水稻品系)。
圖1.是本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗白葉枯病隱性基因xa13和它的等位顯性基因Xa13、以及xa13和Xa13基因功能驗證的流程圖。
圖2.是覆蓋抗白葉枯病隱性基因xa13區(qū)段的物理圖譜。圖中短橫線示細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)克隆。分子標(biāo)記之間的數(shù)字表示在F2群體中檢測到的xa13位點與分子標(biāo)記之間發(fā)生重組交換的單株數(shù)。其中沒有下劃線的數(shù)字表示在第二個F2群體中檢測到的重組交換事件的次數(shù)，有下劃線標(biāo)記的數(shù)字表示在第三個F2群體中檢測到的重組交換事件的次數(shù)。連接分子標(biāo)記和BAC克隆的豎虛線表示通過DNA雜交或者序列比較分析證實了相對應(yīng)的分子標(biāo)記和BAC克隆具有同源性。
圖3.是本發(fā)明涉及的顯性基因Xa13的結(jié)構(gòu)以及遺傳轉(zhuǎn)化片段結(jié)構(gòu)。長方塊代表Xa13基因的外顯子，橫線條代表內(nèi)含子；黑色長方塊示編碼區(qū)，斜線長方塊示5’-和3’-末端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)；ATG和TGA分別是翻譯起始密碼和終止密碼；數(shù)字示各結(jié)構(gòu)的堿基(bp)數(shù)。與水稻品種IR24和IR64中的Xa13基因序列進(jìn)行比較分析，水稻品種明恢63中的Xa13基因發(fā)生兩個堿基替換(箭頭)。這兩個堿基替換存在于內(nèi)含子中，堿基替換內(nèi)容見表1。
圖4.是具有IRBB13遺傳背景的T0代遺傳轉(zhuǎn)化植株接種白葉枯病菌PXO99兩周后表型和對應(yīng)植株的基因型分析。感病遺傳轉(zhuǎn)化T0代植株和水稻感病對照品種IR24都攜帶顯性基因Xa13的候選基因，而抗病轉(zhuǎn)化植株和水稻抗病對照品系IRBB13都不攜帶Xa13候選基因。
圖5.是具有IRBB13遺傳背景的T1代遺傳轉(zhuǎn)化植株接種白葉枯病菌PXO99兩周后表型和對應(yīng)植株的基因型分析。來源于一個T0植株的T1代植株的感病表型與顯性基因Xa13候選基因的分子標(biāo)記共分離。IRBB13攜帶隱性基因xa13，IR24攜帶顯性基因Xa13。
圖6.是攜帶嵌合基因eGFP-Xa13的水稻愈傷組織切片，用發(fā)紅色熒光的PI(propidium iodide)染料染色。采用萊卡共聚焦顯微鏡觀察。圖中A.在觀察綠色熒光的波長(505-530nm)下，觀察到綠色熒光在組織中的分布。B.在觀察紅色熒光波長(488nm)下，觀察與A同一視野中組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)；長箭頭(白色)示細(xì)胞核，短箭頭(天蘭色)示細(xì)胞膜。C.將A和B的圖像重疊，顯示綠色熒光位于細(xì)胞膜，證實XA13是細(xì)胞膜蛋白質(zhì)。
圖7.是攜帶顯性基因Xa13DNA片段的pMCG161載體的部分結(jié)構(gòu)。圖中RB和LBT-DNA的右側(cè)和左側(cè)邊界；Hpt潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；35S花椰菜花葉病毒35S啟動子；AdhI玉米乙醇脫氫酶基因的內(nèi)含子I；OCS章魚堿合成酶多聚腺苷酸信號。
圖8.是本發(fā)明所涉及的隱性基因xa13的結(jié)構(gòu)以及PCR擴增片段結(jié)構(gòu)。圖中長方塊代表xa13基因的外顯子，橫線條代表內(nèi)含子；黑色長方塊示編碼區(qū)，斜線長方塊示5’-和3’-UTR；ATG和TGA分別是翻譯起始密碼和終止密碼；數(shù)字示各結(jié)構(gòu)的堿基(bp)數(shù)。與顯性基因Xa13比較分析，長箭頭示xa13基因發(fā)生一個堿基替換、并造成一個氨基酸密碼改變的位置，實心短箭頭示xa13基因發(fā)生一個堿基替換、但沒有造成氨基酸密碼改變的位置，空心短箭頭示xa13基因發(fā)生3個堿基插入的位置。堿基替換和插入的內(nèi)容見表3。
圖9.是本發(fā)明的其中一個實施例中所應(yīng)用的一個水稻品系“IR24”的顯性基因Xa13和另一個水稻品系“IRBB13”的隱性基因xa13的相對表達(dá)量。Xa13或xa13基因的表達(dá)量是與看家基因actin的表達(dá)量相比后的相對表達(dá)量，使各材料在樣品量一致的條件下進(jìn)行比較。ck未接種也未接水材料；8、24和72接種PXO99或接水8、24、72小時。
具體實施例方式
以下實施例中進(jìn)一步解釋和定義本發(fā)明，圖1描述了遺傳定位和分離克隆抗白葉枯病隱性基因xa13和它的等位顯性基因Xa13、以及驗證xa13和Xa13基因功能的流程。根據(jù)以下實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例1構(gòu)建抗白葉枯病隱性基因xa13區(qū)段的物理圖譜1.實驗材料和接種方法分兩年用攜帶隱性基因xa13的秈稻家系“IRBB13”和“IRBB13”的近等基因系(輪回感病親本)、攜帶顯性基因Xa13的“IR24”(Chu等，2004，Genome-wide analysis ofdefense-responsive genes in bacterial blight resistance of rice mediated by the recessive R genexa13.Mol.Genet.Genomics 271111-120)構(gòu)建了三個F2群體。第一個群體由250株極端抗病(接種白葉枯病菌PXO99兩周后病斑長度小于3厘米)單株組成，第二個群體由6000個隨機單株組成，第三個群體由1972個隨機單株組成。利用這三個F2群體定位隱性基因xa13。
本發(fā)明采用剪葉法(Kauffman等，1973，An improved technique for evaluating resistance ofrice varieties to Xanthomonas oryzae.Plant Dis.Rep.57537-541)接種白葉枯病菌。白葉枯病菌菌株是PXO99，由菲律賓國際水稻研究所提供(Chu等，2004，Genome-wide analysis ofdefense-responsive genes in bacterial blight resistance of rice mediated by the recessive R genexa13.Mol.Genet.Genomics 271111-120)。白葉枯病菌的培養(yǎng)遵循已經(jīng)公開發(fā)表的方法(Lin等，1996，Identifying and mapping a new gene for bacterial blight resistance in rice based on RFLPmarkers.Phytopathology 861156-1159)。
2.構(gòu)建xa13基因區(qū)段的物理圖譜根據(jù)前人對隱性基因xa13的遺傳分析，該基因位于水稻8號染色體的兩個RFLP(restriction fragment length polymorphism)標(biāo)記RG136和R2027之間(Zhang等，1996，RAPDand RFLP mapping of the bacterial blight resistance gene xa13 in rice，Theor Appl Genet 9365-70；Sanchez等，1999，Genetic and physical mapping of xa13，a recessive gene bacterial blightresistance gene in rice.Theor Appl Genet 981022-1028)。本發(fā)明利用第一個F2群體進(jìn)行分析，將xa13基因定位于RG136和另一個RFLP標(biāo)記S14003之間(圖2)。進(jìn)一步用第二個F2群體分析，發(fā)現(xiàn)一個CAPS(cleaved amplification polymorphism sequence)標(biāo)記E6a位于RG136和xa13位點之間，即xa13位點位于E6a和S14003之間(圖2)。利用水稻品種明恢63的細(xì)菌人工染色體(bacterial artifical chromosome，BAC)文庫(Peng等，1998，A BAC libraryconstructed to the rice cultivar‘Minghui63’for cloning genes of agronomic importance，ActaBotanica Sinica 401108-1114)，本發(fā)明構(gòu)建了xa13基因區(qū)段、覆蓋分子標(biāo)記E6a至S14003區(qū)間的物理圖譜(圖2)。該物理圖譜由5個重疊的BAC克隆(22E06、23P23、30A21、39N05、44F01)組成，其中BAC克隆44F01的序列與兩個來自水稻品種IR64、位于xa13區(qū)段的BAC克隆21H14和14L03(Sanchez等，1999，Genetic and physical mapping of xa13，a recessive genebacterial blight resistance gene in rice.Theor Appl Genet 981022-1028)同源。
3.物理圖譜中部分BAC克隆的測序和原始序列的拼接采用超聲波法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press)構(gòu)建目標(biāo)BAC克隆的Shotgun文庫。用超聲波處理BAC克隆的環(huán)形質(zhì)粒，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離出1.5-2.5kb的DNA片段，純化后用T4-DNA聚合酶補平末端，與Sma I酶切的去磷酸化的pUC18載體(購自美國Amersham Bioscience公司)平端連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(參見Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonasoryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant J.37517-527)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。提取陽性克隆質(zhì)粒，并與空pUC18質(zhì)粒進(jìn)行電泳比較，剔除假陽性克隆及小片段克隆，或用BamHI和EcoRI雙酶切，檢測插入片段大小。
采用M13-R(5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’)和M13-F(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)引物和購美國Perkin Elmer公司的測序試劑盒(Big Dye Kit)，根據(jù)試劑盒的使用說明以雙脫氧核苷酸末端終止法分別從每個亞克隆的兩端測序。測序儀為Perkin Elmer公司的ABI377 Sequencer。
使用Sequencher 4.1軟件(美國Gene Codes Corporation)拼接序列。用Sequencher 4.1軟件自動去除末端測序較差的序列和pUC18載體序列；用Sequencher 4.1軟件沒有去除干凈的序列則用手工刪除。BAC載體的碎片序列和污染的細(xì)菌DNA序列則通過和BAC序列進(jìn)行比較或BLAST分析的方法(Altschul等，1997，Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generationof protein database search programs，Nucleic Acids Res.253389-3402)加以去除。用Sequencher4.1軟件對兩條序列進(jìn)行拼接的參數(shù)是重疊序列長度(Mini Overlap)大于20bp(base pair)，重疊序列的一致性(Mini Match)大于85％。每一個堿基的確定都要參照重疊在該位點的多個Shotgun片段序列。對于由一個Shotgun片段序列所覆蓋的區(qū)域要再次測序驗證，以確保堿基的準(zhǔn)確性。而由一個亞克隆覆蓋的斷口處，則對該克隆進(jìn)行長序列膠測序或用primerwalking的方法，填補缺口。
明恢63和IR64都攜帶xa13基因的等位顯性基因Xa13。對明恢63的BAC克隆44F01進(jìn)行了部分測序和對IR64的兩個BAC克隆21H14和14L03進(jìn)行了完全測序。44F01大約140Kb，21H14大約90kb，14L03大約67kb。
實施例2精細(xì)定位隱性基因xa13分子標(biāo)記E6a在第二個F2群體的26個單株中檢測到與xa13位點發(fā)生了重組(圖2)。用一系列來自測序的BAC克隆的分子標(biāo)記進(jìn)一步分析用E6a標(biāo)記檢測到的26個重組交換單株。這些標(biāo)記包括6個來源于BAC克隆21H14和14L03的shotgun克隆(RP3、RP4、RP5、RP7、RP8和RP10)，根據(jù)21H14序列設(shè)計的SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記SR6和根據(jù)14L03序列設(shè)計CAPS標(biāo)記ST9。分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)記RP3、RP4、RP5、SR6和RP7分別在與E6a標(biāo)記相關(guān)的26個單株的1至15株中檢測到與xa13位點發(fā)生了重組，而標(biāo)記RP8、ST9和RP10在這26個單株中全部與xa13位點共分離(圖2)。
根據(jù)明恢63BAC克隆44F01的序列設(shè)計的SSR標(biāo)記SR11在第三個F2群體的8個單株中檢測到與xa13位點發(fā)生了重組，E6a在這個群體的另外10個單株中檢測到與xa13位點發(fā)生了重組，說明E6a和SR11分別位于xa13位點的兩側(cè)(圖2)。用4個分子標(biāo)記進(jìn)一步分析第三個群體中用E6a標(biāo)記檢測到的10個重組交換單株和用SR11檢測到的8個重組單株。發(fā)現(xiàn)標(biāo)記RP7在與E6a標(biāo)記相關(guān)的10個單株的2株中檢測到與xa13位點發(fā)生了重組，而標(biāo)記RP8、ST9和RP10在這10個單株中全部與xa13位點共分離(圖2)；標(biāo)記ST9和RP10在與SR11標(biāo)記相關(guān)的8個單株的2株中檢測到與xa13位點發(fā)生了重組，而RP7和RP8在這8個單株中全部與xa13位點共分離。分析結(jié)構(gòu)提示xa13位點位于標(biāo)記RP7和ST9之間，該區(qū)段長14.8kb(圖2)。
實施例3顯性基因Xa13的分離和功能驗證1.Xa13候選基因的確定采用GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com/)基因預(yù)測軟件對分子標(biāo)記RP7和ST9之間、包含xa13的等位顯性基因Xa13、來源于水稻品種IR64的14.8kb(圖2)序列進(jìn)行分析，顯示該區(qū)段可能存在三個基因。其中第一和第三個基因不完整，第二個基因完整。因此推測第二個基因是顯性基因Xa13。
2.Xa13候選基因的分離和驗證本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切處理水稻品種IR64的BAC克隆14L03的質(zhì)粒DNA，從中分離了包含顯性基因Xa13的候選基因、長大約14kb的DNA片段(圖3)。將該片段與BamHI酶切處理的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300(Sun等，2004，Xa26，agene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptorkinase-like protein.Plant J.37517-527)連接。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Lin和Zhang，2005，Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep 23540-547)將該片段轉(zhuǎn)入攜帶隱性基因xa13的水稻品系IRBB13中，獲得45株遺傳轉(zhuǎn)化植株。
用與攜帶隱性基因xa13的水稻呈非親和性反應(yīng)的白葉枯病菌PXO99接種(實施例1中接種方法，下同)所有T0代轉(zhuǎn)化植株。與對照IRBB13相比，26株轉(zhuǎn)化植株的抗病表型發(fā)生了變化。接種兩周后這26株轉(zhuǎn)化植株的病斑長度為12.3-25.6厘米，與感病水稻IR24的病斑長度(20.6±2.7厘米)相似，而與抗病水稻IRBB13的病斑長度(1.4±0.2厘米)差別明顯。為了確認(rèn)這些轉(zhuǎn)化植株表型改變與轉(zhuǎn)入的Xa13候選基因相關(guān)，本發(fā)明用一個Xa13候選基因調(diào)控區(qū)的特異CAPS標(biāo)記Xa13/SphI檢測所有45株轉(zhuǎn)化植株。檢測結(jié)果顯示所有感病轉(zhuǎn)化植株(26株)都含有轉(zhuǎn)入的Xa13候選基因，而所有抗病轉(zhuǎn)化植株(19株)都不攜帶Xa13候選基因(圖4)。這些結(jié)果證明轉(zhuǎn)化植株的表型改變是因為轉(zhuǎn)入基因的作用。
為了進(jìn)一步驗證遺傳轉(zhuǎn)化植株表型改變是因為轉(zhuǎn)入的Xa13候選基因的作用。本發(fā)明檢測了T1代植株。結(jié)果顯示所有T1代植株的感病表型都與顯性基因Xa13候選基因的分子標(biāo)記共分離(圖5)。證明用于遺傳轉(zhuǎn)化的候選基因就是顯性基因Xa13。
本發(fā)明進(jìn)一步采用PCR方法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press)、根據(jù)水稻品種IR64中Xa13基因兩側(cè)的DNA序列設(shè)計PCR引物X13Ful F(5’-TACGGTCCATGTTGAGCTTTAGGATTAGCGGGTT-3’)、X13Ful R(5’-GATGGATCCTCTGTCACCCACGATTTTTCCT-3’)和end R(5’-GGGGATCCACTACAGTGGCATCCATCG-3’)。利用PCR引物X13Ful F和end R從水稻品種IR24中擴增了包含顯性基因Xa13的大約5.1kb片段，利用PCR引物X13Ful F和X13FulR從水稻品種明恢63中擴增了包含顯性基因Xa13的大約4.4kb片段(圖3)。另外，本發(fā)明利用Xa13基因的序列、通過BLAST分析方法(Altschul等，1997，Gapped BLAST andPSI-BLASTa new generation of protein database search programs，Nucleic Acids Res.253389-3402)檢索明恢63 cDNA文庫(儲昭暉等，2002，水稻全生育期均一化cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定，科學(xué)通報471656-1662)，獲得Xa13基因的全長cDNA克隆EI74B06。對這些DNA片段和cDNA克隆EI74B06進(jìn)行完全測序和序列比較分析。結(jié)果顯示包含顯性基因Xa13和它的調(diào)控區(qū)的5.1kb片段序列在水稻品種IR24和IR64中完全相同。明恢63中的Xa13基因序列與IR24和IR64中的Xa13基因序列相比，有2個堿基差異；但這2個堿基的差異位于內(nèi)含子處(表1和圖3)，因此明恢63、IR24和IR64中Xa13基因的cDNA序列(包括編碼區(qū)以及5’-和3’-UTR)完全相同(序列表SEQ ID NO2所示序列)。序列分析還顯示顯性基因Xa13長2834bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1至2834bp處)，由5個外顯子(分別位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1-223、1263-1306、1405-1776、1870-1989、2082-2834bp處)和4個內(nèi)含子(分別位于序列表SEQ ID NO1所示序列的224-1262、1307-1404、1777-1869、1990-2081bp處)組成。外顯子1中包含171個堿基的5’-UTR(序列表SEQ ID NO1所示序列的1-171bp處)，外顯子5中包含420個堿基的3’-UTR(序列表SEQ ID NO1所示序列的2415-2834bp處)(圖3)。
表1本發(fā)明克隆的顯性基因Xa13的序列在水稻品種IR24、IR64和明恢63中的差異

1序列表SEQ ID NO1(水稻品種IR24和IR64中顯性基因Xa13)所示序列位點。
3.Xa13基因的編碼產(chǎn)物Xa13基因的編碼區(qū)位于序列表SEQ ID NO1所示序列的172-223、1263-1306、1405-1776、1870-1989、2082-2414bp處或者序列表SEQ ID NO2所示序列的172-1095bp處)，編碼307個氨基酸。采用PSORT軟件(Nakai和Kanehisa，1991，Expert system forpredicting protein localization sites in gram-negative bacteria.Proteins 11(2)95-110，http//psort.ims.u-tokyo.ac.jp)分析顯示，XA13蛋白是一個細(xì)胞膜蛋白質(zhì)。
為了進(jìn)一步驗證XA13蛋白在細(xì)胞中的分布，我們將綠色熒光蛋白基因(eGFP)(Zhang等，2004，A rice WRKY gene encodes a transcriptional repressor of the gibberellin signalingpathway in Aleurone cells.Plant Physiol.1341500-1513)與Xa13基因的5’末端融合并由玉米泛素啟動子(Ubi)驅(qū)動，通過觀察綠色熒光分布確定XA13蛋白的分布。將這個嵌合基因UbiGFP-Xa13與HindIII和BamHI雙酶切處理的上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300連接。通過上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將嵌合基因轉(zhuǎn)入水稻品種中花11。取轉(zhuǎn)基因愈傷組織進(jìn)行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)綠色熒光確實位于細(xì)胞膜上(圖6)，證明XA13是細(xì)胞膜蛋白質(zhì)。
4.Xa13基因的功能分析本發(fā)明采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)(Smith等，2000，Total silencing byintron-spliced hairpin RNAs，Nature 407319-320)、通過抑制水稻品種明恢63中顯性基因Xa13的表達(dá)，驗證該基因的功能。這個技術(shù)途徑的主要機理將目標(biāo)基因的部分片段以反向重復(fù)的形式與能夠表達(dá)雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)的載體連接，通過遺傳轉(zhuǎn)化將該載體導(dǎo)入植物中。獲得的轉(zhuǎn)化植株大量表達(dá)與目標(biāo)基因部分片段同源的dsRNA。這些dsRNA迅速形成短干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)。這些siRNA與目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄子(mRNA)互補配對，在細(xì)胞內(nèi)RISC酶復(fù)合體的作用下使目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄子降解，從而在mRNA水平上抑制目標(biāo)基因的功能。研究者可以通過轉(zhuǎn)基因植株表型的改變，驗證目標(biāo)基因的功能。RNA干擾技術(shù)已被廣泛用于基因功能的驗證(Smith等，2000，Total silencing byintron-spliced hairpin RNAs，Nature 407319-320)。
本發(fā)明利用能夠表達(dá)dsRNA的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體pMCG161(McGinnis等，2005，Transgene-induced RNA interference as a tool for plant functional genomics.Methods Enzymol3921-24，http//www.chromdb.org/info/plasmids/pMCG161.html)，通過上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將顯性基因Xa13的DNA片段轉(zhuǎn)入水稻品種明恢63，使明恢63中表達(dá)顯性基因Xa13的dsRNA，從而抑制明恢63中顯性基因Xa13的表達(dá)。具體操作步驟如下用下列ds1-2F和ds1-2R序列作為PCR引物，以水稻品種明恢63的顯性基因Xa13的cDNA克隆為模板，通過PCR擴增獲得顯性基因Xa13中長650bp的DNA片段(位于序列表SEQ IDNO2所示序列的163-812bp處，相當(dāng)于序列表SEQ ID NO1所示序列的163-223、1263-1306、1405-1776、1870-1989、2082-2134bp處)。為了便于PCR產(chǎn)物的克隆，ds1-2F和ds1-2R引物的5’末端標(biāo)有下劃線的部分為限制性酶SpeI和KpnI或者SacI和BamHI的酶切位點，隨后的3’-端的序列則分別與顯性基因Xa13的cDNA序列相互匹配。
SpeI KpnIds1-2F5’-GGGACTAGTGGTACCCAGTAGCAATGGCAGGAGGTSacI BamHIds1-2R5’-GGGGAGCTCGGATCCAAGTAGAGCCCCATCTGCAC構(gòu)建Xa13基因片段的第一重復(fù)鏈(正向鏈)用KpnI和BamHI酶切部分PCR產(chǎn)物及載體pMCG161(依據(jù)載體pMCG161的使用說明，http//www.chromdb.org/info/plasmids/pMCG161.html)，酶切完全后在65℃水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶，置于冰上，用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。電轉(zhuǎn)后獲得的克隆質(zhì)粒用ds1-2F和ds1-2R引物擴增篩選陽性克隆并經(jīng)KpnI和BamHI酶切驗證(圖7)。
構(gòu)建Xa13基因片段的第二重復(fù)鏈(反向鏈)用SacI和SpeI酶切剩余的PCR產(chǎn)物和連接了第一重復(fù)鏈的pMCG161載體質(zhì)粒，酶切完全后在65℃水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶，用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。電轉(zhuǎn)后獲得的克隆質(zhì)粒用SacI和SpeI雙酶切反應(yīng)篩選陽性克隆，陽性克隆命名為D75R(圖7)。
采用上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將攜帶Xa13基因片段的pMCG161載體(圖7)導(dǎo)入水稻品種明恢63。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為D75RMH。本發(fā)明共獲得獨立轉(zhuǎn)化植株11株。對全部11株植株在成株期階段接種白葉枯病菌株P(guān)XO99。與對照明恢63相比，4株轉(zhuǎn)化植株的表型發(fā)生了顯著(P＜0.05)變化。與對照明恢63相比，接種兩周后這4株轉(zhuǎn)化植株的病斑長度減短了36-73％(表2)。
表2 明恢63RNAi遺傳轉(zhuǎn)化植株(D75RMH)對白葉枯病菌PXO99的反應(yīng)

為進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)化植株的抗病能力增強是否與顯性基因Xa13的表達(dá)量相關(guān)，本發(fā)明對表2中所列4株轉(zhuǎn)化植株抽提總RNA，利用7500 Real Time PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、定量PCR分析試劑盒SYBRGreen PCR Master Mix(美國Applied Biosystems公司)、以及Applied Biosystems公司的定量PCR分析方法做定量反轉(zhuǎn)錄(reverse transcript，RT)-PCR分析，比較轉(zhuǎn)化植株和對照材料中Xa13基因表達(dá)量。PCR反應(yīng)引物是X13Rt3F(5’-TGACGACGACTGATCTCGAC-3’)和dse1-R(5’-TGCTAATGACACACTCTTACCACA-3’)(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的2415-2434和2579-2556bp處)。以水稻肌動蛋白的RT-PCR產(chǎn)物作為樣品量一致性對照。肌動蛋白PCR引物序列是actinF(5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’)和actinR(5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’)。分析結(jié)果顯示表型改變的4株轉(zhuǎn)化植株中Xa13基因的表達(dá)量與對照明恢63相比降低至15-74％(表2)。這些結(jié)果說明Xa13基因在抗白葉枯病反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控因子的作用，而這一作用與它的表達(dá)量相關(guān)。
實施例4隱性基因xa13的分離和功能驗證1.xa13基因的分離用實施例3中的PCR引物X13Ful F和end R從水稻品種IRBB13中擴增包含xa13基因的大約4.7kb片段(圖8)，然后對該片段進(jìn)行測序。序列分析顯示隱性基因xa13與水稻品種IR24和IR64的顯性基因Xa13相比存在6個堿基替換和3個堿基插入(表3)。其中3個堿基替換和3個堿基插入位于內(nèi)含子中；另外3個堿基替換位于編碼序列內(nèi)，但只有一個堿基的替換造成一個氨基酸密碼的改變(表3和圖8)。序列分析顯示隱性基因xa13基因長2837bp(位于序列表SEQ ID NO3所示序列的1至2837bp處)，由5個外顯子(分別位于序列表SEQ ID NO3所示序列的1-223、1266-1309、1408-1779、1873-1992、2085-2837bp處)和4個內(nèi)含子(分別位于序列表SEQ ID NO3所示序列的224-1265、1310-1407、1780-1872、1993-2084bp處)組成。外顯子1中包含171個堿基的5’-UTR(序列表SEQ ID NO3所示序列的1-171bp處)，外顯子5中包含420個堿基的3’-UTR(序列表SEQ ID NO3所示序列的2418-2837bp處)(圖8)。
xa13基因的編碼區(qū)位于序列表SEQ ID NO3所示序列的172-223、1266-1309、1408-1779、1873-1992、2085-2417bp處)，編碼307個氨基酸。隱性基因xa13編碼的蛋白質(zhì)xa13和顯性基因Xa13編碼的蛋白質(zhì)XA13只存在一個氨基酸的差異(表3)，它位于序列表SEQ ID NO1和序列表SEQ ID NO3所示氨基酸序列的第238位。
表3 本發(fā)明的顯性基因Xa13和隱性基因xa13序列差異位點

1序列表SEQ ID NO1(顯性基因Xa13)所示序列位點。
2.xa13基因的功能分析因為顯性基因Xa13和隱性基因xa13的序列高度相似，本發(fā)明采用實施例3中所述RNAi技術(shù)和攜帶顯性基因Xa13片段的pMCG161載體，通過上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法抑制IRBB13中隱性基因xa13基因的表達(dá)。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為D75RIB13。本實施例共獲得獨立轉(zhuǎn)化植株16株。對全部16株植株在成株期階段接種白葉枯病菌株P(guān)XO99。與對照IRBB13相比，7株轉(zhuǎn)化植株的病斑長度明顯(P＜0.05)變短(表4)。為了確認(rèn)這些轉(zhuǎn)化植株表型改變與隱性基因xa13的表達(dá)量相關(guān)，本發(fā)明采用上述定量RT-PCR方法檢測了其中14株轉(zhuǎn)化植株中xa13基因的相對表達(dá)量。與對照IRBB13相比，病斑長度明顯變短的7株轉(zhuǎn)化植株中xa13基因的表達(dá)量降低了3.3-10.1倍以上(表4)。這些結(jié)果說明隱性基因xa13在抗白葉枯病反應(yīng)中也有一定負(fù)向調(diào)控因子的作用，而這一作用依賴于表達(dá)量。降低xa13基因的表達(dá)，可進(jìn)一步增強水稻的抗性。
表4 本發(fā)明的水稻品種IRBB13 RNAi遺傳轉(zhuǎn)化植株(編號為D75RIB13)對水稻白葉枯病菌PXO99的反應(yīng)


實施例5隱性基因xa13和顯性基因Xa13表達(dá)量的分析上述實施例3和實施例4已證明抑制顯性基因Xa13的表達(dá)使水稻對白葉枯病菌PXO99感病變?yōu)榭共?，抑制隱性基因xa13的表達(dá)可進(jìn)一步增強水稻對PXO99的抗性。這些結(jié)果說明水稻對PXO99的抗性與Xa13或xa13的低量表達(dá)密切相關(guān)。為了進(jìn)一步驗證這些實驗結(jié)果，本發(fā)明分別用白葉枯病菌PXO99接種攜帶隱性基因xa13的水稻品系IRBB13和攜帶顯性基因Xa13的水稻品系IR24，并同時設(shè)置了接水的對照實驗。在接種或接水處理8、24、72小時后取水稻葉片組織抽提RNA，按上述定量RT-PCR方法檢測不同處理材料中顯性基因Xa13或隱性基因xa13的表達(dá)量。分析結(jié)果顯示IR24的顯性基因Xa13和IRBB13的隱性基因xa13的基礎(chǔ)表達(dá)量差別不大(ck對照)，顯性基因Xa13的表達(dá)量大約是隱性基因xa13的2倍(表4和圖9)；接水后顯性基因Xa13的表達(dá)量上升(接水對照)，接種PXO99后Xa13基因的表達(dá)量進(jìn)一步上升，接種后72小時后顯性基因Xa13的表達(dá)量是基礎(chǔ)表達(dá)量(ck對照)的大約43倍(圖9)。而隱性基因xa13的表達(dá)量在接種或接水后都無明顯變化(圖9)。這一結(jié)果進(jìn)一步證明病原誘導(dǎo)后表達(dá)量的差異是隱性基因xa13和顯性基因Xa13功能差異的一個重要因素。結(jié)合上述實施例的結(jié)果，本發(fā)明的結(jié)論是(1)顯性基因Xa13的編碼產(chǎn)物是抗病反應(yīng)中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，它的大量存在是白葉枯病菌在寄主水稻中生存所必需的；(2)抑制顯性基因Xa13的功能可改良水稻對白葉枯病的抗性，抑制隱性基因xa13的功能可進(jìn)一步增強水稻的白葉枯病的抗性。
序列表序列表SEQ ID NO1<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻抗白葉枯病隱性基因xa13和它的等位顯性基因Xa13<130>
<141>2005-05-09<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2834<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
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<400>1acacatgcag ttgtagtagc acttaagcct tcctctctag ctagcatctc ttgtgtcagg60aagttggaag ggatttctgg ctagtttcta gctggtgtct cctctcctct tcctaacctt120ctcactgatt aacaccttag agttagttaa taaccttcat caccagtagc a atg gca 177Met Ala1gga ggt ttc ttg tcc atg gct aac ccg gcg gtc acc ctc tcc ggt g223Gly Gly Phe Leu Ser Met Ala Asn Pro Ala Val Thr Leu Ser Gly5 10 15ttgcaggtaa agcatgcaac caatgcataa tgctcaaact taatttcatc atcatcatca283tcatcatctt cacagccatg atcatccatg gacaaatgca actgaagatc attttagttt343tcatatgcta atgatcaaat tcaggttaat tgctgtttaa tttctccata cactagttgt403ctgcaccatt gcattgtgca cagcacacac acgcttttga tgcttctagg aatgcatatc463tgttcagcag ttcacacagt gcagcagggc aatgttgtta aaaaatcttc tccttttttt523ttatgtcctt gtattcttga gctttctgtc tccattgatc tgcttttttc ttgtttacaa583gtgatgggca caagtcactt cccttagctt cagctcatgc atggagcagg aatctcactt643caaaagacct agcacttttt ctctcttcac ctttttgcct caacacatgc ccagtttctg703gccacacaaa cataaacaca tatactatct agctgcataa ttgcatcaaa ttaagcaggg763tttgtttcag ctaggaattc cacacatagg tcattaatta gtattgccaa ctttctcaac823atgcatgcac tctagtactc tacctaagct agctcccaga ttagcttctg ctaatttaat883tccgatttct tgaaatggag atcggttgag cagtgaggga ggcgtgcatc tgcacctctt943cgtcgctgtc actaaacaaa agcagagcta gctaggtggt aacaaactga tttgattttt1003gtcagtaaac aaaaatgacc aattaatgac ccatcaacca gtttcaattc tcgatcctaa1063cctagctaac atctctgaaa ctctgaaaga acattactat cttactgaca gtgtatatat1123atgcaaacta aaattttatt ttattttatc ctaacctagc taacatatct gcatccgtgt1183gaaccagctg aaactctgaa agaatgttac tccactgatc atatattaat taacgatgtc1243gttttctgtc ttgtttctt tt gca gga aac atc atc tcc ttc ctg gtg ttc 1294
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Phe Phe Ser Cys Val Gln Met Gly Leu Tyr Phe Trp Tyr Arg Lys Pro205 210 215agg aac acg gcc gtg ctg ccg acg acg tcc gac tcc atg tcc ccg atc 2198Arg Asn Thr Ala Val Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ser Met Ser Pro Ile220 225 230 235tcc gcc gcc gcc gcc gcc acg cag agg gtg atc gag ctc ccc gcc ggc 2246Ser Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gln Arg Val Ile Glu Leu Pro Ala Gly240 245 250acg cac gcc ttc acc atc ctg tcc gtg agc ccc atc ccg atc ctc ggc 2294Thr His Ala Phe Thr Ile Leu Ser Val Ser Pro Ile Pro Ile Leu Gly255 260 265gtg cac aag gtc gag gtg gtg gcc gcc gag cag gcg gcc gac ggc gtc 2342Val His Lys Val Glu Val Val Ala Ala Glu Gln Ala Ala Asp Gly Val270 275 280gcc gcc gcc gcc gcc gcc gac aag gag ctg ctg cag aac aag ccg gag 2390Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Lys Pro Glu285 290 295gtg atc gag atc acc gcc gcc gtg tgacgacgac tgatctcgac gacgacagat 2444Val Ile Glu Ile Thr Ala Ala Val300 305tctcgctact gatgaagacg acgacgacga tggccggatc gatgacggcc agaatttagc2504agtgtggatt actaccgaac tttaattagt tggttaatta ttggattaca atgtggtaag2564agtgtgtcat tagcagctag ttaacttact taaattaatt atcttgttca gtcagtcagt2624cagtcagtca gtcagctttg agtgagtgag tgagtgatct cgacgtagtt tgctggttgg2684tgtaataaga aaaaggcgat ctactagtag tctactagct agtacgcatg catgtgtgtg2744tgctctactt accgtgttgc aatctcatct ctttgtactt acaactcaga aatcaatgga2804agattgtgac aggtattatt agtagttact 2834<210>2<211>307<212>PRT<213>Oryza sativa<400>2Met Ala Gly Gly Phe Leu Ser Met Ala Asn Pro Ala Val Thr Leu Ser1 5 10 15Gly Val Ala Gly Asn Ile Ile Ser Phe Leu Val Phe Leu Ala Pro Val20 25 30Ala Thr Phe Leu Gln Val Tyr Lys Lys Lys Ser Thr Gly Gly Tyr Ser35 40 45Ser Val Pro Tyr Val Val Ala Leu Phe Ser Ser Val Leu Trp Ile Phe50 55 60Tyr Ala Leu Val Lys Thr Asn Ser Arg Pro Leu Leu Thr Ile Asn Ala65 70 75 80Phe Gly Cys Gly Val Glu Ala Ala Tyr Ile Val Leu Tyr Leu Val Tyr85 90 95
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序列表SEQ ID NO3<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻抗白葉枯病隱性基因xa13和它的等位顯性基因Xa13<130>
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ttc ctt gca cca gtg tgagtactcc attcctactg tcaccatcaa aatctcgaga 1349Phe Leu Ala Pro Val30gaaacatctg aatatctctg acgacgaact ggaatttata tctctgaaaa attgcagg 1407gcg acg ttc ttg cag gtg tac aag aag aag tcg acg gga ggg tac agc 1455Ala Thr Phe Leu Gln Val Tyr Lys Lys Lys Ser Thr Gly Gly Tyr Ser35 40 45tcg gtg ccg tac gtg gtg gcg ctc ttc agc tcg gtg ctg tgg atc ttc 1503Ser Val Pro Tyr Val Val Ala Leu Phe Ser Ser Val Leu Trp Ile Phe50 55 60tac gcg ctg gtg aag acc aac tcg agg ccg ctg ctg acc atc aac gcc 1551Tyr Ala Leu Val Lys Thr Asn Ser Arg Pro Leu Leu Thr Ile Asn Ala65 70 75 80ttc ggc tgc ggc gtc gag gcg gcc tac atc gtc ctc tac ctc gtc tac 1599Phe Gly Cys Gly Val Glu Ala Ala Tyr Ile Val Leu Tyr Leu Val Tyr85 90 95gcg ccg cgc cgc gcc agg ctc cgc acc ctc gcc ttc ttc ctc ctc ctc 1647Ala Pro Arg Arg Ala Arg Leu Arg Thr Leu Ala Phe Phe Leu Leu Leu100 105 110gac gtc gcc gcc ttc gcc ctc atc gtc gtc acc acc ctc tac ctc gtc 1695Asp Val Ala Ala Phe Ala Leu Ile Val Val Thr Thr Leu Tyr Leu Val115 120 125ccc aag ccc cac cag gtc aag ttc ctc ggc agc gtc tgc ctc gcc ttc 1743Pro Lys Pro His Gln Val Lys Phe Leu Gly Ser Val Cys Leu Ala Phe130 135 140tcc atg gcc gtc ttc gtc gcc cct ctc tcc atc atc gtaagcttaa 1789Ser Met Ala Val Phe Val Ala Pro Leu Ser Ile Ile145 150 155gctctctacc cccctctaca tttcactgac atcaattgca ttatgtagct gagcatttct1849gttgatgatg atgatgcttg cag ttc aag gtg atc aag acc aag agc gtc gag1902Phe Lys Val Ile Lys Thr Lys Ser Val Glu160 165ttc atg ccg atc ggg ctc tcc gtc tgc ctc acg ctc agc gcc gtc gcg 1950Phe Met Pro Ile Gly Leu Ser Val Cys Leu Thr Leu Ser Ala Val Ala170 175 180tgg ttc tgc tac ggc ctc ttc acc aag gac ccc tac gtc atg 1992Trp Phe Cys Tyr Gly Leu Phe Thr Lys Asp Pro Tyr Val Met185 190 195gtgagctcag ctgccgccat tgatagagct gctcgacgac gccattgttg tgaattgttt2052tgagctgact tgcatttctt ggtgcgatgc ag tac ccg aac gtg ggc ggc ttc 2105Tyr Pro Asn Val Gly Gly Phe200ttc ttc agc tgc gtg cag atg ggg ctc tac ttc tgg tac cgg aag ccg 2153Phe Phe Ser Cys Val Gln Met Gly Leu Tyr Phe Trp Tyr Arg Lys Pro205 210 215
agg aac acg gcc gtg ctg ccg acg acg tcc gac tcc atg tcc ccg atc 2201Arg Asn Thr Ala Val Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ser Met Ser Pro Ile220 225 230 235tcc gcc acc gcc gcc gcc acg cag agg gtg atc gag ctc ccc gcc ggc 2249Ser Ala Thr Ala Ala Ala Thr Gln Arg Val Ile Glu Leu Pro Ala Gly240 245 250acg cac gcc ttc acc atc ctg tcc gtg agc ccc atc ccg atc ctc ggc 2297Thr His Ala Phe Thr Ile Leu Ser Val Ser Pro Ile Pro Ile Leu Gly255 260 265gtg cac aag gtc gag gtg gtg gcc gcc gag cag gcg gcc gac ggc gtc 2345Val His Lys Val Glu Val Val Ala Ala Glu Gln Ala Ala Asp Gly Val270 275 280gcc gcc gcc gcc gcc gcc gac aag gag ctg ctg cag aac aag ccg gag 2393Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Lys Pro Glu285 290 295gtg atc gag atc acc gcc gcc gtg tgacgacgac tgatctcgac gacgacagat 2447Val Ile Glu Ile Thr Ala Ala Val300 305tctcgctact gatgaagacg acgacgacga tggccggatc gatgacggcc agaatttagc2507agtgtggatt actaccgaac tttaattagt tggttaatta ttggattaca atgtggtaag2567agtgtgtcat tagcagctag ttaacttact taaattaatt atcttgttca gtcagtcagt2627cagtcagtca gtcagctttg agtgagtgag tgagtgatct cgacgtagtt tgctggttgg2687tgtaataaga aaaaggcgat ctactagtag tctactagct agtacgcatg catgtgtgtg2747tgctctactt accgtgttgc aatctcatct ctttgtactt acaactcaga aatcaatgga2807agattgtgac aggtattatt agtagttact 2837<210>2<211>307<212>PRT<213>Oryza sativa<400>2Met Ala Gly Gly Phe Leu Ser Met Ala Asn Pro Ala Val Thr Leu Ser1 5 10 15Gly Val Ala Gly Asn Ile Ile Ser Phe Leu Val Phe Leu Ala Pro Val20 25 30Ala Thr Phe Leu Gln Val Tyr Lys Lys Lys Ser Thr Gly Gly Tyr Ser35 40 45Ser Val Pro Tyr Val Val Ala Leu Phe Ser Ser Val Leu Trp Ile Phe50 55 60Tyr Ala Leu Val Lys Thr Asn Ser Arg Pro Leu Leu Thr Ile Asn Ala65 70 75 80Phe Gly Cys Gly Val Glu Ala Ala Tyr Ile Val Leu Tyr Leu Val Tyr85 90 95Ala Pro Arg Arg Ala Arg Leu Arg Thr Leu Ala Phe Phe Leu Leu Leu100 105 110
Asp Val Ala Ala Phe Ala Leu Ile Val Val Thr Thr Leu Tyr Leu Val115 120 125Pro Lys Pro His Gln Val Lys Phe Leu Gly Ser Val Cys Leu Ala Phe130 135 140Ser Met Ala Val Phe Val Ala Pro Leu Ser Ile Ile Phe Lys Val Ile145 150 155 160Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Met Pro Ile Gly Leu Ser Val Cys Leu165 170 175Thr Leu Ser Ala Val Ala Trp Phe Cys Tyr Gly Leu Phe Thr Lys Asp180 185 190Pro Tyr Val Met Tyr Pro Asn Val Gly Gly Phe Phe Phe Ser Cys Val195 200 205Gln Met Gly Leu Tyr Phe Trp Tyr Arg Lys Pro Arg Asn Thr Ala Val210 215 220Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ser Met Ser Pro Ile Ser Ala Thr Ala Ala225 230 235 240Ala Thr Gln Arg Val Ile Glu Leu Pro Ala Gly Thr His Ala Phe Thr245 250 255Ile Leu Ser Val Ser Pro Ile Pro Ile Leu Gly Val His Lys Val Glu260 265 270Val Val Ala Ala Glu Gln Ala Ala Asp Gly Val Ala Ala Ala Ala Ala275 280 285Ala Asp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Lys Pro Glu Val Ile Glu Ile Thr290 295 300Ala Ala Val30權(quán)利要求
1.來源于水稻的顯性基因Xa13的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中所示的DNA序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.來源于水稻的隱性基因xa13介導(dǎo)的賦予植物對白葉枯病菌抗性的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO3中所示的DNA序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列，所述的隱性基因xa13是權(quán)利要求1中所述的顯性基因Xa13的等位基因。
3.顯性基因Xa13的cDNA序列，它是SEQ ID NO2中所示的DNA序列。
4.與合適啟動子連接的、能夠使水稻產(chǎn)生雙鏈RNA的權(quán)利要求1至3所述的DNA序列的部分片段。
5.權(quán)利要求1至4任一項所述的DNA序列在增加水稻對白葉枯病抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及包含水稻抗白葉枯病隱性基因xa13以及xa13的等位顯性基因Xa13的兩條DNA片斷的分離克隆、功能驗證和應(yīng)用?？共‰[性基因xa13是顯性基因Xa13的功能缺陷突變體。顯性基因Xa13的突變使水稻產(chǎn)生對白葉枯病菌的抗性。利用基于RNA干擾(RNA interference，RNAi)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將隱性基因xa13或者顯性基因Xa13的部分DNA片段與外源調(diào)節(jié)序列連接并轉(zhuǎn)入水稻，抑制水稻中顯性基因Xa13的功能，可顯著增強水稻對白葉枯病菌的抵抗能力；另外，通過RNAi技術(shù)抑制抑制水稻中隱性基因xa13的功能，可進(jìn)一步增強水稻對白葉枯病的抗性。
文檔編號C12N15/82GK1861791SQ20051001867
公開日2006年11月15日 申請日期2005年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月10日
發(fā)明者王石平, 儲昭暉, 袁猛, 葛小佳, 楊紅 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)