專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)豬偽狂犬病毒熒光定量pcr試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)豬偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒，適用于豬偽狂犬病毒定性定量檢測(cè)，同時(shí)還涉及具有定性定量檢測(cè)豬偽狂犬病毒的用途。
背景技術(shù)：
偽狂犬病是豬的一種高度接觸性傳染病，常給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，疫病的早期特異性診斷、染疫動(dòng)物的撲殺和疫苗接種是有效預(yù)防控制豬瘟的重要手段。
傳統(tǒng)的偽狂犬病檢測(cè)方法主要包括酶連免疫吸附(ELISA)試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒血凝(HA)與血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)、膠體金等方法，這些方法在病毒病診斷和進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫中起了重要作用，但普遍存在著明顯的不足，諸如周期長(zhǎng)，操作繁瑣，特異性和敏感性差，不規(guī)范，不適用于大批量檢測(cè)，給偽狂犬病的檢測(cè)帶來(lái)巨大困難。
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determinedby LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，16329-38)、病原體的定性(McGoldrick A，Lowings JP，Ibata G，et al.A Novel Approach to the Detection ofClassical Swine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods，1998，72125-135.；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCRassay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，831-10.)和定量檢測(cè)(Desire N，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1Proviral Load by a TaqManReal-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，391303-1310.；Martell M，Gomez J，Esteban JI，et al.High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCRQuantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37327-332.；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detection and Quantificationof CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCVRNAusing real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95111-119.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量主要方法，國(guó)內(nèi)目前也已有關(guān)于丙肝、乙肝、支原體、愛(ài)滋病、結(jié)核定量檢測(cè)的試劑盒上市。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種定量檢測(cè)豬偽狂犬病毒的熒光定量PCR試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒不僅可使用目前存在市場(chǎng)上的所有類(lèi)型熒光定量?jī)x器，而且能快速地對(duì)偽狂犬病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的豬偽狂犬病毒的熒光定量PGR試劑盒在偽狂犬病毒快速定量檢測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種快速定量檢測(cè)偽狂犬病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括該試劑盒包括a)DNA裂解液，b)Taq DNA聚合酶，c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，d)熒光定量反應(yīng)液，其特征是熒光定量反應(yīng)液含有引物和熒光探針，引物為正向引物(SEQ ID NO1)和反向引物(SEQ ID NO2)，正向引物為5′-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT-3′，反向引物為5′-TGGTAGATGCAGGGCTCGTA-3′，熒光探針序列為5′-CGGGGACACGTTCGACCTGATGCC-3′(SEQ ID NO3)，熒光探針5′端標(biāo)記FAM(熒光報(bào)告基團(tuán))，3′端標(biāo)記ROX(熒光淬滅基團(tuán))，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pG-HB(SEQID NO4)是含有偽狂犬病毒HB毒株(請(qǐng)見(jiàn)偽狂犬病毒胸苷激酶基因變異引起的病毒致弱作用，潘茲書(shū)等，科學(xué)通報(bào)，2001年16期)gE基因167個(gè)核苷酸片段構(gòu)成的pGEM-T載體，且該載體(購(gòu)于Takara公司)可在大腸桿菌DH5α(購(gòu)于Takara公司)中增殖。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，熒光定量反應(yīng)液是由正向引物和反向引物，熒光探針，PCR 10×buffer溶液，MgCl2溶液，dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶和無(wú)菌雙蒸水組成；在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，熒光定量反應(yīng)液由PCR 10×buffer 2μl，10μmol/L正向引物和反向的引物各1.5μl，1μmol/L熒光探針2μl，25mmol/LMgCl23μl，10mmol/L dNTPs 0.5μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，無(wú)菌雙蒸水9μl組成。其中熒光探針為SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，熒光探針5′端標(biāo)記FAM，3′端標(biāo)記ROX。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板是含有偽狂犬病毒(請(qǐng)見(jiàn)偽狂犬病毒胸苷激酶基因變異引起的病毒致弱作用，潘茲書(shū)等，科學(xué)通報(bào)，2001年16期)gE基因167個(gè)核苷酸片段連接入pGEM-T載體(請(qǐng)見(jiàn)編號(hào)為PromegaCorporation，Technical Manual，NO0421-30，1999年修訂版)構(gòu)成的。且該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。貯存濃度為5×1010拷貝/μl，使用前系列稀釋。實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品為含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒pGS，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測(cè)A260(所測(cè)樣品在吸收波長(zhǎng)為260nm紫外線照射下的光密度)的定量并稀釋至5×1010拷貝/μl，-20℃保存。
在本發(fā)明提供偽狂犬病毒快速定量檢測(cè)偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒中，有一條兩端標(biāo)記有熒光基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5′端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3′端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒(méi)有熒光信號(hào)的變化。在PCR退火和延伸過(guò)程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′-3′外切活性對(duì)探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了兩基團(tuán)之間的FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對(duì)偽狂犬病毒的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過(guò)程中，熒光量的積累超過(guò)基底熒光量的循環(huán)圈數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。
在本發(fā)明提供檢測(cè)豬偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì)偽狂犬病毒檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系，如引物和探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)(熒光定量PCR技術(shù))和定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于偽狂犬病毒定量檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了檢測(cè)豬偽狂犬病毒熒光定量PCR方法，并研制出檢測(cè)豬偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10Copies，完全可以滿足快速鑒別診斷偽狂犬病毒的要求。
該方法包括下列步驟A)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，并用紫外分光光度計(jì)定量；B)用DNA裂解液從待測(cè)標(biāo)本中提取DNA；C)分別取B)步中的DNA和同樣量的系列稀釋的A)步中的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品加入到含Taq DNA聚合酶和熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中用熒光定量檢測(cè)儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；D)通過(guò)比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
在本發(fā)明中提供的偽狂犬病毒快速定量檢測(cè)偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒可對(duì)偽狂犬病毒進(jìn)行定量檢測(cè)，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的膠體金檢測(cè)方法和偽狂犬病毒ELISA鑒別診斷方法。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、定量準(zhǔn)確；2、檢測(cè)速度快，僅1小時(shí)，加上DNA提取的制備，共僅需2-3小時(shí)；3、步驟簡(jiǎn)單；4、可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣品檢測(cè)。


圖1為熒光定量PCR檢測(cè)湖北仙桃樣品的動(dòng)力曲線圖，結(jié)果全為陽(yáng)性；圖2為熒光定量PCR檢測(cè)湖北天門(mén)、河南信陽(yáng)樣品的動(dòng)力曲線圖，結(jié)果全為陽(yáng)性；圖3為熒光定量PCR檢測(cè)湖北京山、湖北仙桃、湖北武漢樣品的動(dòng)力曲線圖，結(jié)果除了武漢的3份樣品，甘肅樣品為陰性外，其余都是陽(yáng)性；圖4為熒光定量PCR檢測(cè)湖北武漢樣品的動(dòng)力曲線圖，結(jié)果全為陰性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 用偽狂犬病毒快速定量檢測(cè)的熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)偽狂犬病毒1豬偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒組成與配制，試劑組成a).DNA提取試劑為自己配制，裂解液4mol/L異硫氰酸胍、0.5％十二烷基肌氨酸鈉、0.1mmol/Lβ巰基乙醇、25mmol/L檸檬酸鈉，異丙醇，雙蒸水，用滅菌雙蒸水配制的75％乙醇。
b).標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
c).熒光定量反應(yīng)液PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各1.5μl(10μmol/L)，熒光探針2μl(1μmol/L)，MgCl22.5μl(25mmol/L)，dNTPs 0.5μl(10mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.5μl(3U/μl)，無(wú)菌雙蒸水9μl。熒光探針FP序列為SEQ ID NO3，其5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光受體基團(tuán)為ROX。使用濃度為1μmol/L。
2用偽狂犬病毒快速定量檢測(cè)的熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)偽狂犬病毒A)取偽狂犬病毒野毒HB株接種PK-15單層細(xì)胞(由本實(shí)驗(yàn)室保藏)出現(xiàn)CPE以后反復(fù)凍溶三次，6000r/min離心10min，取100μl上清加入200μl裂解液(試劑a)置室溫10分鐘，再加300μl-20℃預(yù)冷的異丙醇沉淀RNA和DNA。5分鐘后12000r/min室溫離心10min，-20℃預(yù)冷的75％乙醇漂洗1次，干燥后溶于10μl水中備用。
B)將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板(試劑b)系列稀釋為5×107拷貝數(shù)/μl、5×106拷貝數(shù)/μl5×105拷貝數(shù)/μl、5×104拷貝數(shù)/μl、5×103拷貝數(shù)/μl。
C)分別取熒光定量PCR反應(yīng)液(試劑c)各18μl，取第B)步所得DNA和第C)步稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板各2μl，并設(shè)陰性對(duì)照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測(cè)儀上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為95℃預(yù)變52min；94℃15s，59℃40s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)為530nm。
循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板2×105拷貝數(shù)/μl、5×104拷貝數(shù)/μl、5×103拷貝數(shù)/μl的Ct值分別為30.15、33.78和36.04，陰性對(duì)照為0；換算后每ml疫苗樣品拷貝數(shù)為6×106拷貝數(shù)/ml。
反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，得到Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P＞0.05，數(shù)據(jù)差異無(wú)顯著意義，說(shuō)明其不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。
實(shí)施例2 用偽狂犬病毒快速定量檢測(cè)的熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)偽狂犬病毒臨床標(biāo)本對(duì)2005年2月份至2005年5月份湖北京山、仙桃，河南明港等地的豬采集鼻拭子和組織樣品，標(biāo)本采集時(shí)間為6-10日齡仔豬、斷奶前仔豬(35日齡)。
1豬偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒組成與配制，試劑組成a).DNA提取試劑為自己配制，裂解液4mol/L異硫氰酸胍、0.5％十二烷基肌氨酸鈉、0.1mmol/L β巰基乙醇、25mmol/L檸檬酸鈉，異丙醇，雙蒸水，用滅菌雙蒸水配制的75％乙醇。
b).標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
c).熒光定量反應(yīng)液PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各1.5μl(10μmol/L)，熒光探針2μl(1μmol/L)，MgCl22.5μl(25mmol/L)，dNTPs 0.5μl(10mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.5μl(3U/μl)，無(wú)菌雙蒸水9μl。熒光探針FP序列為SEQ ID NO3，其5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光受體基團(tuán)為ROX。使用濃度為1μmol/L。
2用偽狂犬病毒快速定量檢測(cè)的熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)偽狂犬病毒樣品A)取鼻咽洗液作為分離病毒的樣品用高壓滅菌的棉拭子，伸入鼻咽部上1-2厘米，旋轉(zhuǎn)一周，停留約10秒鐘后取出，將棉拭子頭放入盛有1毫升無(wú)菌生理鹽水的冷凍保存管中，從頸部剪斷拭子，將拭子頭在生理浸入鹽水中反復(fù)漂洗(漂洗液可在-20℃保存一個(gè)月，或在-70℃長(zhǎng)期保存)。取咽拭子抽提液，接種PK-15單層細(xì)胞(由本實(shí)驗(yàn)室保藏)出現(xiàn)CPE以后反復(fù)凍溶三次，6000r/min離心10min，取100μl上清加入200μl裂解液(試劑a)置室溫20-25℃10分鐘，再加300μl-20℃預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA。5分鐘后12000r/min室溫離心10min，-20℃預(yù)冷的75％乙醇漂洗1次，干燥后溶于10μl水中備用。
B)將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板(試劑b)系列稀釋為5×107拷貝數(shù)/μl、5×106拷貝數(shù)/μl5×105拷貝數(shù)/μl、5×104拷貝數(shù)/μl、5×103拷貝數(shù)/μl。
C)分別取熒光定量PCR反應(yīng)液(試劑c)各18μl，取第B)步所得DNA和第C)步稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板各2μl，并設(shè)陰性對(duì)照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測(cè)儀上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為95℃預(yù)變52min；94℃15s，59℃40s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)為530nm。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，對(duì)以上60份樣本進(jìn)行DNA的提取、熒光定量PCR檢測(cè)，以水做陰性對(duì)照，結(jié)果如下一共66份樣品，其中陽(yáng)性42份，陰性24份，陽(yáng)性率為63.6％。

從上述實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)明，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且，熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品的檢測(cè)僅需4個(gè)小時(shí)就能完成，而傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法約需1周左右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間。
該試劑盒的操作只需1人即可完成整個(gè)定量操作過(guò)程，一次可檢測(cè)32-384個(gè)(由定量檢測(cè)儀的型號(hào)決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費(fèi)。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>一種檢測(cè)豬偽狂犬病病毒熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用<130>一種檢測(cè)豬偽狂犬病病毒熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1cttccactcg cagctcttct20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2tggtagatgc agggctcgta20<210>3<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>3cggggacacg ttcgacctga tgcc 24<210>4<211>168<212>DNA<213>人工合成
<400>4cttccactcg cagctcttctcgcccggggacacgttcgac ctgatgccgcgcgtggtctc60gaacatgggtgactcgcgtgagaactttaccgccacgctgactggtactacgcgcgcgc 120gcccccgcgg tgcctgctgt actacgtgtacgagccctgcatctacca 16權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)豬偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括a)DNA裂解液，b)Taq DNA聚合酶，c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，d)熒光定量反應(yīng)液，其特征是熒光定量反應(yīng)液含有引物和熒光探針，引物為正向引物和反向引物，正向引物為SEQ ID NO1，反向引物為SEQ ID NO2，熒光探針序列為SEQ ID NO3，熒光探針5′端標(biāo)記FAM，3′端標(biāo)記ROX基團(tuán)，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pG-HB是含有豬偽狂犬病毒毒株gE基因167個(gè)核苷酸片段構(gòu)成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)豬偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒，其特征是熒光定量反應(yīng)液是由PCR10×buffer，10μmol/L的正向引物和反向引物，1μmol/L熒光探針，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs和無(wú)菌雙蒸水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)豬偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒，其特征是標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pG-HB的核苷酸序列為SEQ ID NO4。
4.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)豬偽狂犬病毒的熒光定量PCR試劑盒在豬偽狂犬病毒定量檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)豬偽狂犬病毒熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒包括a)DNA裂解液，b)Taq DNA聚合酶，c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板含有pG－HB的核苷酸序列，d)熒光定量反應(yīng)液含有正相、反相引物和熒光探針序列，該試劑盒方法簡(jiǎn)便，定量準(zhǔn)確，檢測(cè)速度快，可同時(shí)進(jìn)行多通量的樣品檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1710101SQ20051001897
公開(kāi)日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2005年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月23日
發(fā)明者潘茲書(shū), 張楚瑜, 萬(wàn)超 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)