專利名稱：哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于口腔預防醫(yī)學技術領域，更具體涉及一種哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制備方法，同時還涉及一種哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在生物防齲中的用途。
背景技術：
齲病是一種與牙菌斑相關的感染性疾病。變形鏈球菌(Streptococcusmutans)和茸毛鏈球菌(Streptococcus sobrinus)是主要致齲菌，其葡糖基轉移酶能利用飲食中的蔗糖合成非水溶性葡聚糖。這種葡聚糖因非水溶性和粘附力強等特性，不僅在致齲菌粘附中至關重要，同時使菌斑結構更為致密，妨礙菌斑中所產酸的擴散，促進釉質脫礦，是鏈球菌致齲的重要毒力因素(Tanzer JM.The microbiology of primary dental caries in humans.J Dent Educ.2001；651028)。
牙菌斑的控制是齲病預防的重要措施，常用的方法有機械法和藥物法。機械法主要是刷牙，使用牙簽、牙線、專業(yè)潔治等。藥物法則是利用一些化學藥物來去除或抑制菌斑的形成。目前臨床上主要使用的化學藥物為洗必泰，這種藥物具有很好的抗菌特性，可不同程度的降低牙菌斑的致病作用，但長期使用洗必泰可出現牙齒著色，破壞口腔正常菌群等副作用(楊是石四箴主編口腔預防醫(yī)學及兒童口腔醫(yī)學人民衛(wèi)生出版社，1995)。
采用酶制劑控制菌斑的原理是將菌斑細菌之間和細菌與牙表面之間的粘附離解，進而達到瓦解菌斑的目的，可望成為一種科學、安全的生物防齲新方法。早期曾使用蛋白酶，但效果較差。鑒于非水溶性葡聚糖在形成菌斑過程中的重要作用，能特異性水解該糖的非水溶性葡聚糖酶被給予更多的關注，關于它能減少或清除牙菌斑的作用在國外已見報道(Kelstrup J，Holm-Pedersen P，Poulsen S.Reduction of the formation of dental plaque and gingivitis in humans by crudemutanase.J Dent Res 1978；8693)。目前已發(fā)現某些鏈霉菌屬，黃桿菌屬，假單胞桿菌屬，分枝孢子菌屬，木霉菌屬等能產生非水溶性葡聚糖酶，而在中國，關于非水溶性葡聚糖酶的研究十分有限，非水溶性葡聚糖酶的開發(fā)應用尚為空白。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供了一種哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制備方法，該制備方法簡單，成本低廉。
本發(fā)明還涉及哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在抑制口腔鏈球菌粘附中的應用。
本發(fā)明還涉及哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在防止牙菌斑形成中的應用。
為了實現上述任務，本發(fā)明采用了以下技術手段非水溶性葡聚糖酶的制備步驟如下A培養(yǎng)茸毛鏈球菌Streptococcus sobrinus OMZ176(武漢大學口腔醫(yī)學院實驗中心保存)，在腦心液體培養(yǎng)基(Brain heart infusion broth，BHI，Difco，美國主要成分為每1升中含牛腦浸出液200克，牛心浸出液250克，蛋白胨10克，葡萄糖2克，氯化鈉5克，磷酸二鈉2.5克)中加入蔗糖至終濃度3％(質量體積百分數W/V)，利用茸毛鏈球菌Streptococcus sobrinus OMZ176產生的葡糖基轉移酶催化蔗糖生成非水溶性葡聚糖。
B以非水溶性葡聚糖為培養(yǎng)基中唯一的碳源，誘導木霉菌產生非水溶性葡聚糖酶，培養(yǎng)基成分為磷酸二氫鉀0.25％(W/V)、硫酸銨0.16％(W/V)、尿素0.03％(W/V)、硫酸鎂0.03％(W/V)、氯化鈣0.03％(W/V)、非水溶性葡聚糖0.25％(W/V)。選擇產酶能力最強木霉菌哈茨木霉菌Th。本實驗所提供的產酶菌為哈茨木霉菌Th(山東農業(yè)大學惠贈，紫外光誘導哈茨木霉產生腐霉利抗性菌株的研究，中國生物防治，2002，18(2)75-78)。C在誘導產酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈茨木霉菌Th70-74小時，離心除去菌絲，上清液中加入硫酸銨至55％-70％飽和度范圍，沉淀，獲得非水溶性葡聚糖酶粗提物，培養(yǎng)基成分與上述B相同。
D對已制備的哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的性質研究表明，該酶的最適反應pH值范圍在pH5.0～6.5，最佳反應溫度為38-42℃。
非水溶性葡聚糖酶生物防齲應用研究步驟如下A通過致齲鏈球菌蔗糖依賴性黏附實驗證明哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶能有效抑制鏈球菌的黏附。
B使用與齦上菌斑相關的五種國際參考標準菌株形成人工菌斑，應用激光共聚焦顯微鏡觀察非水溶性葡聚糖酶對人工菌斑結構的影響，顯示哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶可有效降低菌斑高度，抑制菌斑發(fā)育成致密結構。
本發(fā)明與現有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果與應用藥物或蛋白酶制劑控制菌斑的方法比較，使用非水溶性葡聚糖酶控制菌斑效果良好，且不會破壞口腔中的正常菌群的生存，不會引起牙齒著色等副作用。
與其他已報道的產非水溶性葡聚糖酶的微生物相比，本發(fā)明提供的哈茨木霉菌Th培養(yǎng)方法簡單，且能在短的時間內產生較高的酶活性。
硫酸銨是一種中性鹽，對蛋白質有相當好的穩(wěn)定作用，又因為其離子容積較大，吸走水分子的能力也大，是有效的鹽析工具。應用硫酸氨飽和沉淀法來初步提純非水溶性葡聚糖酶方法成本低廉，簡便易行。


圖1非水溶性葡聚糖酶的硫酸銨鹽析曲線在不同程度的硫酸銨飽和沉淀中，非水溶性葡聚糖酶活性在50％飽和度以前一直較低，從55％-70％之間迅速升高。
圖2pH對非水溶性葡聚糖酶活性的影響示意圖在不同pH值條件下檢測酶活性，確定哈茨木霉菌Th非水溶性葡聚糖酶的最適pH值是5.5。
圖3溫度對非水溶性葡聚糖酶的影響示意圖在不同溫度下檢測酶活性，確定哈茨木霉菌Th非水溶性葡聚糖酶的最佳反應溫度是40℃。
圖4激光共聚焦顯微鏡觀察非水溶性葡聚糖酶對照組72小時人工生物膜的三維結構示意5激光共聚焦顯微鏡觀察非水溶性葡聚糖酶的實驗組72小時人工生物膜的三維結構示意圖具體實施方式
下面根據附圖對本發(fā)明做進一步詳細描述1.非水溶性葡聚糖制備將保存于-70℃的Streptococcus sobrinus OMZ176(武漢大學口腔醫(yī)學院實驗中心保存)活化后接種于腦心液體培養(yǎng)基中，37℃，85％N2，10％H2，5％CO2厭氧培養(yǎng)18小時。取菌液20ml轉接于1000ml腦心液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24小時。12000rpm離心15min，棄沉淀，將上清液倒至已滅菌的燒杯，加入蔗糖至終濃度3％，疊氮鈉至終濃度0.05％，37℃靜置培養(yǎng)48小時。12000rpm離心30min，棄上清，將沉淀用無菌蒸餾水洗滌5次，所得物質即為非水溶性葡聚糖。
2.產非水溶性葡聚糖酶菌株的篩選將受試菌木霉菌Trichoderma SP.AF93270(武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存)，綠色木霉菌Trichoderma viride AF93333(武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存)，綠色木霉菌Trichoderma virideAF93255(武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存)，木霉菌Trichodermasp.AF93253(武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存)，康寧木霉菌Trichodermakonigus.AF93251(武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存)，哈茨木霉菌Trichoderma harzianum Th(山東農業(yè)大學惠贈，)接種到誘導產非水溶性葡聚糖酶的培養(yǎng)基中28℃，300rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為磷酸二氫鉀KH2PO40.2％(W/V)，硫酸銨(NH4)2SO40.14％(W/V)，尿素Urea 0.03％(W/V)，硫酸鎂MgSO4.7H2O 0.03％(W/V)，氯化鈣CaCl20.03％(W/V)，非水溶性葡聚糖0.25％(W/V)。使用Nelson-Somogyi法測定還原糖含量，非水溶性葡聚糖酶酶活性單位定義為每分鐘催化底物釋放相當于1umol葡萄糖的還原糖所需的酶量(Nelson NJ.A photometric adaptation of the Somogyi method for the determinationof glucose.J Biol Chem 1944；53375-380；Somogyi M.Notes on sugar determination.J Biol Chem1952，19519-23)。每24小時測定培養(yǎng)液中的酶活性，結果表明哈茨木霉菌Th在較短的時間內產生最高的酶活性(72小時，0.071U/ml)(附表1)。
附表1六種受試菌在相同條件下產生最大非水溶性葡聚糖酶的情況

3.非水溶性葡聚糖酶的初步制備選定哈茨木霉菌Th為高產酶菌，在確定的酶活性產生最高的時間(第72小時)提取非水溶性葡聚糖酶。向12個三角瓶內的20ml哈茨木霉菌Th培養(yǎng)液上清液中于4℃在磁力攪拌器上緩慢加入硫酸銨，使其飽和度分別達到20％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，80％，90％。在4℃下靜置16小時，12000×g離心30分鐘(4℃)，棄去上清，將沉淀用蒸餾水溶解后，測定酶活性，做出酶的硫酸銨鹽析曲線(圖1)。硫酸銨沉淀中的酶活性在50％以前一直較低，從55％-70％的飽和度間迅速升高，其后保持穩(wěn)定，所以選擇55％-70％作為非水溶性葡聚糖酶鹽析的飽和度范圍。
哈茨木霉菌在誘導產酶培養(yǎng)基中生長72小時后，離心去除菌絲，上清液用55％-70％的硫酸銨沉淀后，所得沉淀物溶于蒸餾水，于4℃透析24小時，將透析液冷凍干燥成粉末，-70℃保存待用。
4.pH對酶活力的影響底物非水溶性葡聚糖用pH3.0～8.0的緩沖液配制(0.10MNa2PO4～0.05M檸檬酸)。反應體系為0.5ml適當稀釋的酶溶液，0.4％非水溶性葡聚糖0.5ml。37℃孵育1小時后，通過Somogyi-Nelson方法測定酶活性。結果表明，非水溶性葡聚糖酶在pH5.0～6.5活力較高，其最適pH為5.5(圖2)。
5.溫度對酶活力的影響底物非水溶性葡聚糖用0.2M醋酸鈉緩沖液(pH5.5)配制。反應體系為0.5ml適當稀釋的酶溶液，0.4％非水溶性葡聚糖0.5ml。37℃孵育1小時后，通過Somogyi-Nelson方法測定酶活性。結果表明，非水溶性葡聚糖酶最適反應溫度為40℃(圖2)。
6.非水溶性葡聚糖酶對鏈球菌蔗糖依賴性粘附的影響在含1％蔗糖的腦心液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入非水溶性葡聚糖酶，至終濃度為0.5U/ml，0.22um濾孔濾膜過濾除菌，分裝至試管中，每支3ml。不含酶的為對照組。每組一式三份。
所有試管中加入50ul來源于同一試管培養(yǎng)18小時的變形鏈球菌Streptococcus sobrinus OMZ176，變形鏈球菌Streptococcus sobrinus 6715，變形鏈球菌Streptococcu smutans MT8148菌液，30°角傾斜培養(yǎng)18小時。(此為第一批試管A試管)取出第一批試管(A試管)，輕微翻轉試管3次，將菌液倒入第二批潔凈試管(B試管)，所含細菌為粘附細菌。B試管中的菌液4000rpm離心25分鐘，棄上清，用磷酸鹽緩沖液洗滌菌細胞兩次，洗凈培養(yǎng)基，再加3ml磷酸鹽緩沖液，渦旋震蕩，充分混懸細菌。
從第一批試管(A試管)的無粘附試管側壁加入3ml磷酸鹽緩沖液，渦旋震蕩5分鐘，將含有細菌的液體轉移至第三批潔凈試管(C試管)。這些細菌為非緊密粘附的細菌。C試管中的菌液4000rpm離心25分鐘，棄上清，再加3ml磷酸鹽緩沖液，渦旋震蕩，充分混懸細菌。
向第一批試管(A試管)中加入3ml磷酸鹽緩沖液超聲震蕩，使試管壁上緊密粘附的細菌全部震蕩下。試管4000rpm離心25分鐘，棄上清，再加3ml磷酸鹽緩沖液，震蕩混勻。
在分光光度計下測定所有試管中細菌的光密度值(OD550)，計算細菌的粘附率，緊密粘附細菌的粘附率＝A/(A+B+C)×100％。
通過實驗比較0.5U/ml的非水溶性葡聚糖酶對口腔鏈球菌粘附的影響，結果發(fā)現與不加酶的對照組相比，非水溶性葡聚糖酶明顯降低了變形鏈球菌Streptococcus sobrinus OMZ176，變形鏈球菌Streptococcus sobrinus 6715，變形鏈球菌Streptococcu smutans MT8148對玻璃的粘附率(P＜0.01)。(附表2)
附表2非水溶性葡聚糖酶對細菌黏附的影響

*與對照組相比有顯著性差異，P＜0.017.非水溶性葡聚糖酶對生物膜形成的影響生物膜實驗菌株為武漢大學口腔醫(yī)學院保存的與齦上菌斑相關的五種國際參考標準菌株，即變形鏈球菌Streptococcus mutans MT8148，茸毛鏈球菌Streptococcus sobrinus 6715，血鏈球菌Streptococcus sanguis 903，福氏桿菌Fusobacterium nucleatumsubsp.polymorphum AT10753，放線菌Actinomyces viscosus ATCC 19246。將保存菌種活化后接種于腦心液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)16小時，分別調光密度值(OD550)至1.0，取等量細菌混勻備用。將洗凈滅菌的蓋玻片置于無菌的6孔細胞培養(yǎng)板，加入無菌唾液后室溫下緩慢震蕩4小時以便在玻片上形成唾液獲得性膜。吸干唾液，向每孔加入1mlL唾液，1.5ml含1％蔗糖的腦心液體培養(yǎng)基溶液和200ul細菌混合液。實驗組含有非水溶性葡聚糖酶(0.4U/ml)，37℃厭氧培養(yǎng)。每24小時更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)72小時后取樣本(各3片)，用二乙酸熒光素(FDA，Sigma，美國30ug/ml)，碘化吡啶(PI，Sigma，美國50ug/ml)進行熒光染色后將本置于激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2，德國)下觀察。觀察條件氬激光(488/514nm)，物鏡×40。測量生物膜表面與膜與蓋玻片交界面之間的距離，即為生物膜的厚度。將標本逐層掃描并三維立體重建。實驗結果顯示72小時對照組生物膜高度達到33.12±3.28μm，細胞密集，結構致密。與此相比，加入非水溶性葡聚糖酶的生物膜高度明顯降低(24.49±4.56μm)，有許多散在的細胞團塊，結構疏松(圖3)，顯示非水溶性葡聚糖酶能降低菌斑的高度，使菌斑結構疏松，進而達到瓦解菌斑的目的。這預示該非水溶性葡聚糖酶在齲病的預防中應該具有一定的應用前景。
權利要求
1.一種哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制備方法，它包括下列步驟A、培養(yǎng)茸毛鏈球菌，在腦心液體培養(yǎng)基中加入蔗糖，利用茸毛鏈球菌產生的葡糖基轉移酶催化蔗糖生成非水溶性葡聚糖；B、以非水溶性葡聚糖為培養(yǎng)基中的碳源，誘導木霉菌產生非水溶性葡聚糖酶，誘導產酶培養(yǎng)基成分包括磷酸二氫鉀0.25％、硫酸銨0.16％、尿素0.03％、硫酸鎂0.03％、氯化鈣0.03％、非水溶性葡聚糖0.25％，選擇菌株哈茨木霉菌Th；C、在誘導產酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈茨木霉菌Th70-74小時，離心除去菌絲，上清液中加入硫酸銨至55％-70％飽和度范圍，沉淀，獲得非水溶性葡聚糖酶粗提物；D、確定哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶pH值范圍在pH5.0～6.5，反應溫度為38-42℃。
2.權利要求1所述的一種哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在抑制口腔鏈球菌粘附中的應用。
3.權利要求1所述的一種哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在防止牙菌斑形成中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制備方法及應用，它包括下列步驟首先是培養(yǎng)茸毛鏈球菌；其次是在誘導產酶培養(yǎng)中培養(yǎng)木霉菌，誘導木霉菌產生非水溶性葡聚糖酶，選擇產酶量最高的菌株哈茨木霉菌Th；第三是在誘導產酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈茨木霉菌，離心除去菌絲，上清液中加入硫酸銨，沉淀，獲得非水溶性葡聚糖酶粗提物；第四是確定哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶pH值范圍及反應溫度。本發(fā)明制備方法簡單，成本低廉，哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶控制菌斑效果良好，且不會破壞口腔中的正常菌群的生存，不會引起牙齒著色等副作用。
文檔編號C12N9/46GK1757720SQ20051001913
公開日2006年4月12日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權日2005年7月21日
發(fā)明者邊專, 甘瑜, 樊明文, 孟柳燕, 李成章 申請人:武漢大學