專利名稱：茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物及其制備方法和用途。它屬于高分子化學(xué)領(lǐng)域，也屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來研究表明，真菌多糖具有廣泛的藥用價值，如抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗感染、抗消化性潰瘍、抗氧化、抗輻射、防衰老、降血糖血脂等；作為免疫調(diào)節(jié)劑，激活巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、LAK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子生成，活化補(bǔ)體，而且毒副作用低、安全性高，故對多糖的研究已成為當(dāng)代生物學(xué)、化學(xué)的熱門領(lǐng)域。然而，從茯苓菌絲體中提取的主要成分是(1→3)-α-D-葡聚糖，它不溶于水且?guī)缀鯚o生物活性，因而沒有應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種具有抗腫瘤活性的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物及其制備方法和用途，即將從茯苓菌絲體中提取的水不溶性α-葡聚糖通過硫酸酯衍生化得到水溶性多糖，該茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物具有抗腫瘤活性，而且制備方法簡單易行，成本低廉，可用于制備抗腫瘤藥物或提高機(jī)體免疫功能的保健品。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物，由下法制得將茯苓(Poria cocos)菌絲體依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取除脂肪；然后依次經(jīng)過生理鹽水、熱水提取，離心；離心后剩余物用0.5-1.0M NaOH/0.05-0.1wt％NaBH4溶液在5-10℃下提取得到重均分子量Mw為7.75×104-57.3×104的水不溶性的α-葡聚糖；將所述α-葡聚糖懸浮于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在20-50℃下攪拌12-24小時，再加入吡啶，升溫至50-90℃繼續(xù)攪拌0.5-1小時；然后在50-90℃和持續(xù)攪拌條件下，以0.4-0.6mL/min的速度逐滴加入氯磺酸，其中葡聚糖羥基與氯磺酸、吡啶的摩爾比為1∶5-7∶10-17.5；反應(yīng)液在50-90℃下反應(yīng)40-120分鐘后冷卻到室溫，加入蒸餾水以形成清亮的溶液，調(diào)節(jié)pH至9-10，然后加入沉淀劑乙醇得到硫酸酯化衍生物的粗產(chǎn)品；將該粗產(chǎn)品再溶解于蒸餾水中，注入纖維素透析袋，在pH為9-11的NaOH溶液中透析除去吡啶，然后用蒸餾水透析4-10天，冷凍干燥得到茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物。
上述茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物的硫酸酯基團(tuán)取代度為0.86-1.38，重均分子量為2.36×104-14.5×104。
上述茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物在制備抗腫瘤藥物或提高機(jī)體免疫功能的保健品中的應(yīng)用。
用紅外光譜、核磁共振譜、元素分析、粘度計及激光光散射儀確定了其化學(xué)組成和二級結(jié)構(gòu)。核磁結(jié)果示出該α-葡聚糖的硫酸酯化反應(yīng)屬于非選擇性取代，主要發(fā)生在C-6位羥基，取代度為0.86-1.38，重均分子量(Mw)為2.36×104-14.5×104。
不同分子量的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物對人體肝癌細(xì)胞HepG2和Sarcoma180肉瘤的體外增殖抑制率的結(jié)果見附表1。顯然，所有的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物都具有顯著的體外抑制作用，且抑制率具有明顯的時間、劑量依賴關(guān)系，說明它有穩(wěn)定的療效。值得注意的是，中等分子量的硫酸酯化衍生物顯示更高的體外抗腫瘤活性。體內(nèi)試驗結(jié)果也示出，所有α-葡聚糖的硫酸酯化衍生物對植入BALB/c小鼠體內(nèi)的Sarcoma 180肉瘤都有顯著的抑制效果，結(jié)果見附表2。中等分子量的硫酸酯化衍生物(6×104-10×104)顯示最高的體內(nèi)抗腫瘤活性，且與五氟尿嘧啶相比對機(jī)體無毒副作用。因此，該茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物作為抗癌藥物和增強(qiáng)機(jī)體免疫的保健品具有廣泛的應(yīng)用前景。
與已有的技術(shù)相比較，本發(fā)明的創(chuàng)新如下本發(fā)明提供的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物是一種全新的物質(zhì)，具有顯著體內(nèi)、體外抗腫瘤活性，且對機(jī)體無毒副作用，尤其是重均分子量范圍在6×104-10×104的硫酸酯衍生物體內(nèi)、體外抑制率接近五氟尿嘧啶，卻沒有它那樣的毒副作用。因此，這種茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物可制成抗腫瘤藥物或增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的保健品。采用從茯苓菌絲體中提取的主要成分α-葡聚糖為原料，通過硫酸酯化的方法將水不溶、無生物活性的葡聚糖轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄缘?、有顯著生物活性、窄分散的葡聚糖。該方法簡單易行，成本低，因此有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體的實例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明實施例1將茯苓菌絲體(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，菌種編號P0)依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取除脂肪；然后依次經(jīng)過生理鹽水、熱水提取，離心；離心后剩余物用0.5 NaOH/0.05wt％NaBH4溶液在5℃下提取得到水不溶性的α-葡聚糖。采用重沉淀分級方法對該α-葡聚糖進(jìn)行分級將該α-葡聚糖溶解于0.25M LiCl/Me2SO中，在25℃條件下以體積比4∶1的丙酮和0.25M LiCl/Me2SO混合溶液為沉淀劑緩慢滴加到α-葡聚糖溶液中直到溶液出現(xiàn)渾濁；在攪拌下將該渾濁溶液升溫至50℃，自然降溫至25℃，并保持12小時，然后將該渾濁溶液離心分離出第一個級分，上清液按上述重沉淀分級方法進(jìn)行下一次分級，經(jīng)9次分級，依次得到α-葡聚糖的9個級分F1-F9。
將200mgα-葡聚糖級分F2(Mw＝45.2×104)懸浮于10mL無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在50℃下攪拌過夜，再一次性加入吡啶3mL，升溫至60℃繼續(xù)攪拌30分鐘；然后在60℃和持續(xù)攪拌條件下，以0.6mL/min的速度逐滴緩慢加入氯磺酸1.25mL，其中葡聚糖羥基與氯磺酸，吡啶的摩爾比為1∶5∶10；反應(yīng)液在60℃下反應(yīng)70分鐘后冷卻到室溫，加入蒸餾水以形成清亮的溶液，調(diào)節(jié)pH至10，然后加入沉淀劑乙醇得到硫酸酯化衍生物的粗產(chǎn)品；將粗產(chǎn)品再溶解于蒸餾水中，注入纖維素透析袋，在pH為9-10的NaOH溶液中透析除去吡啶，然后用蒸餾水透析7天，冷凍干燥得到白色絮狀的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物，編號為S2。試樣S2具有很好的水溶性，取代度為0.89，重均分子量為9.10×104。試樣S2在濃度為0.5mg/mL對人體肝癌細(xì)胞HepG2和Sarcoma 180肉瘤的體外增殖抑制率分別為36.6％和44.9％。試樣S2在劑量為20mg/kg時，它對植入BALB/c小鼠體內(nèi)的Sarcoma 180肉瘤的抑制率為52.0％，且對機(jī)體無毒副作用。因此，該茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物S2不但可抑制癌細(xì)胞，而且可增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。
實施例2將200mg按上述實施例1分級的試樣F3(Mw＝37.5×104)懸浮于10mL無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在40℃下攪拌過夜，再一次性加入吡啶3mL，升溫至70℃繼續(xù)攪拌30分鐘；然后在70℃和持續(xù)攪拌條件下，以0.4mL/min的速度逐滴緩慢加入氯磺酸1.25mL，其中葡聚糖羥基與氯磺酸，吡啶的摩爾比為1∶7∶10；反應(yīng)液在70℃下反應(yīng)60分鐘后冷卻到室溫，加入蒸餾水以形成清亮的溶液，調(diào)節(jié)pH至10，然后加入沉淀劑乙醇得到硫酸酯化衍生物的粗產(chǎn)品；將粗產(chǎn)品再溶解于蒸餾水中，注入纖維素透析袋，在pH為9-10的NaOH溶液中透析除去吡啶，然后用蒸餾水透析6天，冷凍干燥得到白色絮狀的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物，編號為S3。試樣S3具有很好的水溶性，取代度為0.98，重均分子量為6.88×104。試樣S3在濃度為0.5mg/mL對人體肝癌細(xì)胞HepG2和Sarcoma 180肉瘤的體外增殖抑制率分別為50.7％和46.6％。試樣S3在劑量為20mg/kg時，它對植入BALB/c小鼠體內(nèi)的Sarcoma 180肉瘤的抑制率為50.0％，且對機(jī)體無毒副作用。因此，該茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物S3不但可抑制癌細(xì)胞，而且可增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。
參照實施例2、3可以得到對應(yīng)α-葡聚糖的9個級分F1-F9的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物S1-S9。紅外光譜結(jié)果示出，硫酸酯化衍生物S1-S9在1260和820cm-1處分別出現(xiàn)S＝O和C-O-S伸縮振動峰。核磁結(jié)果示出，取代碳的化學(xué)位移相對未取代碳的向低場移動6-10ppm；該α-葡聚糖的硫酸酯化反應(yīng)屬于非選擇性取代，主要發(fā)生在C-6位羥基。元素分析和激光光散射儀結(jié)果示出，取代度為0.86-1.38，重均分子量為2.36×104-14.5×104。
附表1.不同分子量的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物在濃度為0.5mg/mL對人體肝癌細(xì)胞HepG2和Sarcoma 180肉瘤的體外增殖抑制率

附表2.不同分子量的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物對植入BALB/c小鼠體內(nèi)的Sarcoma 180肉瘤的抑制率

權(quán)利要求
1.一種茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物，由下法制得將茯苓菌絲體依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取除脂肪；然后依次經(jīng)過生理鹽水、熱水提取，離心；離心后剩余物用0.5-1.0M NaOH/0.05-0.1wt％NaBH4溶液在5-10℃下提取得到重均分子量為7.75×104-57.3×104的水不溶性的α-葡聚糖；將所述α-葡聚糖懸浮于無水N，N-二甲基甲酰胺中，在20-50℃下攪拌12-24小時，再加入吡啶，升溫至50-90℃繼續(xù)攪拌0.5-1小時；然后在50-90℃和持續(xù)攪拌條件下，以0.4-0.6mL/min的速度逐滴加入氯磺酸，其中葡聚糖羥基與氯磺酸、吡啶的摩爾比為1∶5-7∶10-17.5；反應(yīng)液在50-90℃下反應(yīng)40-120分鐘后冷卻到室溫，加入蒸餾水以形成清亮的溶液，調(diào)節(jié)pH至9-10，然后加入沉淀劑乙醇得到硫酸酯化衍生物的粗產(chǎn)品；將該粗產(chǎn)品再溶解于蒸餾水中，注入纖維素透析袋，在pH為9-11的NaOH溶液中透析除去吡啶，然后用蒸餾水透析4-10天，冷凍干燥得到茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物。
2.按權(quán)利要求1所述的α-葡聚糖的硫酸酯化衍生物，其特征在于茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物的硫酸酯基團(tuán)取代度為0.86-1.38，重均分子量為2.36×104-14.5×104。
3.權(quán)利要求1或2所述的茯苓菌核葡聚糖硫酸酯的制備方法，其特征在于將茯苓菌絲體依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取除脂肪；然后依次經(jīng)過生理鹽水、熱水提取，離心；離心后剩余物用0.5-1.0M NaOH/0.05-0.1wt％NaBH4溶液在5-10℃下提取得到重均分子量為7.75×104-57.3×104的水不溶性的α-葡聚糖；將所述α-葡聚糖懸浮于無水N，N-二甲基甲酰胺中，在20-50℃下攪拌12-24小時，再加入吡啶，升溫至50-90℃繼續(xù)攪拌0.5-1小時；然后在50-90℃和持續(xù)攪拌條件下，以0.4-0.6mL/min的速度逐滴加入氯磺酸，其中葡聚糖羥基與氯磺酸、吡啶的摩爾比為1∶5-7∶10-17.5；反應(yīng)液在50-90℃下反應(yīng)40-120分鐘后冷卻到室溫，加入蒸餾水以形成清亮的溶液，調(diào)節(jié)pH至9-10，然后加入沉淀劑乙醇得到硫酸酯化衍生物的粗產(chǎn)品；將該粗產(chǎn)品再溶解于蒸餾水中，注入纖維素透析袋，在pH為9-11的NaOH溶液中透析除去吡啶，然后用蒸餾水透析4-10天，冷凍干燥得到茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物。
4.權(quán)利要求1或2所述的茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物在制備抗腫瘤藥物或提高機(jī)體免疫功能的保健品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及茯苓菌絲體葡聚糖硫酸酯化衍生物，由下法制得將茯苓菌絲體提取得到水不溶性的α－葡聚糖；將α－葡聚糖懸浮于無水N，N－二甲基甲酰胺中，依次加入吡啶和氯磺酸，反應(yīng)液在50－90℃下反應(yīng)40－120分鐘后冷卻到室溫，加入蒸餾水以形成清亮的溶液，調(diào)節(jié)pH至9－10，然后加入沉淀劑乙醇得到α－葡聚糖的硫酸酯化衍生物。該α－葡聚糖的硫酸酯化反應(yīng)主要發(fā)生在C－6位羥基，取代度為0.86－1.38，重均分子量為2.36×10
文檔編號C12P19/04GK1718590SQ20051001918
公開日2006年1月11日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者張俐娜, 黃琪琳 申請人:武漢大學(xué)