專利名稱：一種低分子量殼聚糖或殼寡糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低分子量殼聚糖或殼寡糖的制備方法，屬再生資源化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低分子量殼聚糖和殼寡糖是甲殼素脫乙酰化后的降解產(chǎn)物，具有比大分子量殼聚糖更好的溶解性、生物相容性。不同分子量的殼聚糖具有不同的生物生理活性，所以制備不同分子量的殼聚糖對(duì)于殼聚糖應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等方面具有重要意義。目前制備低分子量殼聚糖和殼寡糖的方法主要有化學(xué)法和生物法，化學(xué)法反應(yīng)過(guò)程劇烈，不容易獲得低分子量殼聚糖而且產(chǎn)物結(jié)構(gòu)被修飾。酶法降解只是打斷殼聚糖的β(1-4)糖甙鍵，一般不改變殼聚糖分子的殘基結(jié)構(gòu)，而專一性酶價(jià)格昂貴、不易大量獲得，不適合低分子量殼聚糖和殼寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)；使用自由酶水解制備低分子量殼聚糖和殼寡糖，酶在反應(yīng)后不能重復(fù)使用，不經(jīng)濟(jì)，反應(yīng)條件苛刻，產(chǎn)物含有0.1％(w/w)糖與酶蛋白的復(fù)合物，這種產(chǎn)物由于可以導(dǎo)致熱原反應(yīng)而不能將其應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種可連續(xù)制備幾乎不含酶蛋白復(fù)合物的低分子量殼聚糖或殼寡糖的方法。該方法利用中性蛋白酶為非專一性酶，可以有效降解殼聚糖，可以工業(yè)化生產(chǎn)，價(jià)廉，品質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，將中性蛋白酶用交聯(lián)法固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上，提高了酶活力，擴(kuò)大了酶對(duì)溫度和pH的穩(wěn)定性，避免了降解產(chǎn)物與酶蛋白復(fù)合物的產(chǎn)生，提高了產(chǎn)物產(chǎn)率，減小了產(chǎn)物的分子量分布。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是制備低分子量殼聚糖或殼寡糖時(shí)首先用N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球作為中性蛋白酶固定化的載體，以戊二醛作交聯(lián)劑，制得固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶，然后用制得的固定化酶水解殼聚糖，按需控制酶解反應(yīng)時(shí)間，即可得到所需低分子量殼聚糖或殼寡糖。
無(wú)酶蛋白復(fù)合物的低分子量殼聚糖或殼寡糖制備方法的具體步驟如下
(1)將N-琥珀酰殼聚糖溶于水中，制得濃度為0.25-0.40g/ml的N-琥珀酰殼聚糖水溶液，在磁力攪拌下將此溶液逐滴擠入由0.1-0.3g/ml的氯化鈣溶液和無(wú)水乙醇以體積比3∶7～7∶3混合形成的凝固液中獲得N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球，將N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球在凝固液體系中保持2-6小時(shí)，得到固定化載體N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球。
(2)過(guò)濾除去凝固液，將N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球置于溶有戊二醛的0.05-0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉、pH值為3.0-5.0的緩沖溶液中，溶液中戊二醛的體積百分比濃度為0.5-1.5％，N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球與交聯(lián)劑戊二醛的質(zhì)量(濕重)體積比為1∶3～1∶10，室溫下連續(xù)振蕩4-12小時(shí)，然后過(guò)濾收集交聯(lián)N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球，用水或0.05-0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液反復(fù)洗滌，直至洗滌液在245nm處無(wú)吸收，得到交聯(lián)固定化載體。
(3)將與固定化載體重量比為0.2-1.5的中性蛋白酶溶于0.05-0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉、pH為3.0-5.0的緩沖溶液中，在此酶溶液中加入交聯(lián)固定化載體，室溫連續(xù)振蕩2-6小時(shí)，過(guò)濾除去酶溶液，再用0.05-0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉、pH為3.0-5.0的緩沖溶液中洗滌固定化酶，直至洗滌液在280nm處無(wú)吸收，獲得固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶。
(4)將脫乙酰度范圍在75％-95％的殼聚糖溶解于體積百分比濃度為0.5-1.5％醋酸溶液中，用0.05-1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到5.0-6.0，然后加入固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶，加入的酶為殼聚糖質(zhì)量的3％-10％，在45-55℃連續(xù)振蕩所需時(shí)間，過(guò)濾收集降解產(chǎn)物，得到低分子量殼聚糖或殼寡糖。
將降解產(chǎn)物真空濃縮后用1-5mol/l的氫氧化鈉調(diào)pH 8-9，用乙醇沉降、洗滌，真空干燥可獲得重均分子量在2.35萬(wàn)～1900的自由氨基形式低分子量殼聚糖和殼寡糖。當(dāng)酶催化水解反應(yīng)時(shí)間為0.5-5小時(shí)之間時(shí)，獲得低分子量殼聚糖，當(dāng)酶催化水解反應(yīng)時(shí)間大于等于5小時(shí)，獲得殼寡糖。
如果將使用過(guò)的固定化酶用0.2M檸檬酸-磷酸氫二鈉、pH值為3.0-5.0的緩沖溶液中洗滌，可除去固定化酶上吸附的降解產(chǎn)物，使固定化酶重復(fù)使用，若再加入新的殼聚糖溶液，就可實(shí)現(xiàn)連續(xù)制備不含酶蛋白復(fù)合物的低分子量殼聚糖和殼寡糖。
該方法中所用殼聚糖的分子量范圍最好為12.8萬(wàn)-64.8萬(wàn)。
N-琥珀酰殼聚糖是殼聚糖的衍生物，可由殼聚糖和丁二酸酐反應(yīng)制備(N-琥珀酰殼聚糖的制備方法可以參照有關(guān)文獻(xiàn)制備)。由于丁二酸酐在取代一部分殼聚糖氨基的同時(shí)引入了羧基，阻止了殼聚糖的氨基和羥基形成氫鍵，從而提高了水溶性。同時(shí)，N-琥珀酰殼聚糖取代了一部分殼聚糖氨基，降低了交聯(lián)劑戊二醛的用量，保持了固定化酶較高的酶活。此外，在固定化酶載體上引入羧基，增加了載體與酶的親和力，提高了酶的固定化率。所以，N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球適合作為酶的固定化載體。本發(fā)明提供的N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球具有較好的機(jī)械性能，且此固定化酶在反復(fù)使用過(guò)程中酶活損失較小，連續(xù)降解殼聚糖40小時(shí)仍保持了其最初活力的82.5％。使用固定化酶降解殼聚糖，水解產(chǎn)物中幾乎不含有糖/酶蛋白的復(fù)合物，所以，由此方法制得的低分子量殼聚糖和殼寡糖不會(huì)由于復(fù)合的酶蛋白而產(chǎn)生熱原反應(yīng)，所以尤其適用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的制備無(wú)酶蛋白復(fù)合物的低分子量殼聚糖或殼寡糖的方法作詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1將N-琥珀酰殼聚糖制成0.25g/ml水溶液，在磁力攪拌下用注射器(3#針頭)逐滴擠入30ml 0.3g/ml氯化鈣和70ml無(wú)水乙醇形成的混和溶液中，室溫持續(xù)攪拌6小時(shí)，獲得N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球。稱取此水凝膠球4g(濕重)，置于12ml溶有體積百分比為0.5％戊二醛的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(0.05M，pH 3.0)中，室溫振蕩12小時(shí)。過(guò)濾收集交聯(lián)N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球，用水反復(fù)洗滌，直至洗滌液在245nm處無(wú)吸收。將與固定化載體重量(濕重)比為0.2的中性蛋白酶溶于0.05M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 3.0)中，在此酶溶液中加入交聯(lián)固定化載體，室溫連續(xù)振蕩6小時(shí)。然后，過(guò)濾除去酶溶液，用0.05M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 3.0)洗滌固定化酶，直至洗滌液在280nm處無(wú)吸收，獲得固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶。將0.1g殼聚糖(重均分子量64.8萬(wàn)，脫乙酰度75％)溶解于10ml 0.5％(v/v)醋酸溶液中，用0.05mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到5.0，加入酶蛋白與殼聚糖質(zhì)量比為3％的固定化酶，在45℃連續(xù)振蕩0.5小時(shí)，過(guò)濾收集降解產(chǎn)物，真空濃縮后用1mol/l的氫氧化鈉調(diào)pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為2.35萬(wàn)，分子量分布5.31，產(chǎn)率91.4％的自由氨基形式低分子量殼聚糖。
實(shí)施例2將N-琥珀酰殼聚糖制成0.30g/ml水溶液，在磁力攪拌下用注射器(4#針頭)逐滴擠入40ml 0.15g/ml氯化鈣和60ml無(wú)水乙醇形成的混和溶液中，室溫持續(xù)攪拌3小時(shí)，獲得N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球。稱取此水凝膠球4g(濕重)，置于16ml溶有體積百分比為0.8％戊二醛的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(0.2M，pH 3.5)中，室溫振蕩10小時(shí)。過(guò)濾收集交聯(lián)N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球，用水反復(fù)洗滌，直至洗滌液在245nm處無(wú)吸收。將與固定化載體重量(濕重)比為0.45的中性蛋白酶溶于0.2M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 3.5)中，在此酶溶液中加入交聯(lián)固定化載體，室溫連續(xù)振蕩3小時(shí)。然后，過(guò)濾除去酶溶液，用0.2M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 3.5)洗滌固定化酶，直至洗滌液在280nm處無(wú)吸收，獲得固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶。將0.1g殼聚糖(重均分子量38.6萬(wàn)，脫乙酰度86％)溶解于10ml 0.8％(v/v)醋酸溶液中，用0.1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到5.4，加入酶蛋白與殼聚糖質(zhì)量比為5％的固定化酶，在50℃連續(xù)振蕩1小時(shí)，過(guò)濾收集降解產(chǎn)物，真空濃縮后用2mol/l的氫氧化鈉調(diào)pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為1.58萬(wàn)，分子量分布4.77，產(chǎn)率87.9％的自由氨基形式低分子量殼聚糖。
實(shí)施例3將N-琥珀酰殼聚糖制成0.30g/ml水溶液，在磁力攪拌下用注射器(5#針頭)逐滴擠入50ml 0.2g/ml氯化鈣和50ml無(wú)水乙醇形成的混和溶液中，室溫持續(xù)攪拌4小時(shí)，獲得N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球。稱取此水凝膠球4g(濕重)，置于20ml溶有體積百分比為1.0％戊二醛的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(0.3M，pH 4.0)中，室溫振蕩8小時(shí)。過(guò)濾收集交聯(lián)N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球，用0.3M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH 4.0)反復(fù)洗滌，直至洗滌液在245nm處無(wú)吸收。將與固定化載體重量(濕重)比為0.6的中性蛋白酶溶于0.3M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 4.0)中，在此酶溶液中加入交聯(lián)固定化載體，室溫連續(xù)振蕩4小時(shí)。然后，過(guò)濾除去酶溶液，用0.3M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 4.0)洗滌固定化酶，直至洗滌液在280nm處無(wú)吸收，獲得固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶。將0.1g殼聚糖(重均分子量26.8萬(wàn)，脫乙酰度92％)溶解于10ml 1.0％(v/v)醋酸溶液中，用0.5mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到5.7，加入酶蛋白與殼聚糖質(zhì)量比為5％的固定化酶，在55℃連續(xù)振蕩2小時(shí)，過(guò)濾收集降解產(chǎn)物，真空濃縮后用3mol/l的氫氧化鈉調(diào)pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為1.08萬(wàn)，分子量分布4.18，產(chǎn)率81.3％的自由氨基形式低分子量殼聚糖。
實(shí)施例4將N-琥珀酰殼聚糖制成0.40g/ml水溶液，在磁力攪拌下用注射器(6#針頭)逐滴擠入60ml 0.3g/ml氯化鈣和40ml無(wú)水乙醇形成的混和溶液中，室溫持續(xù)攪拌6小時(shí)，獲得N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球。稱取此水凝膠球4g(濕重)，置于30ml溶有體積百分比為1.2％戊二醛的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(0.45M，pH 4.5)中，室溫振蕩6小時(shí)。過(guò)濾收集交聯(lián)N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球，用0.45M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH 4.5)反復(fù)洗滌，直至洗滌液在245nm處無(wú)吸收。將與固定化載體重量(濕重)比為1.2的中性蛋白酶溶于0.45M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 4.5)中，在此酶溶液中加入交聯(lián)固定化載體，室溫連續(xù)振蕩4小時(shí)。然后，過(guò)濾除去酶溶液，用0.45M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 4.5)洗滌固定化酶，直至洗滌液在280nm處無(wú)吸收，獲得固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶。將0.1g殼聚糖(重均分子量12.8萬(wàn)，脫乙酰度95％)溶解于10ml 1.0％(v/v)醋酸溶液中，用0.8mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到5.4，加入酶蛋白與殼聚糖質(zhì)量比為8％的固定化酶，在48℃連續(xù)振蕩4小時(shí)，過(guò)濾收集降解產(chǎn)物，真空濃縮后用4mol/l的氫氧化鈉調(diào)pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為4500，分子量分布3.32，產(chǎn)率72.4％的自由氨基形式低分子量殼聚糖。
實(shí)施例5將N-琥珀酰殼聚糖制成0.40g/ml水溶液，在磁力攪拌下用注射器(7#針頭)逐滴擠入70ml 0.1g/ml氯化鈣和30ml無(wú)水乙醇形成的混和溶液中，室溫持續(xù)攪拌2小時(shí)，獲得N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球。稱取此水凝膠球4g(濕重)，置于40ml溶有體積百分比為1.5％戊二醛的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(0.5M，pH 5.0)中，室溫振蕩4小時(shí)。過(guò)濾收集交聯(lián)N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球，用用0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH 5.0)反復(fù)洗滌，直至洗滌液在245nm處無(wú)吸收。將與固定化載體重量(濕重)比為1.5的中性蛋白酶溶于0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 5.0)中，在此酶溶液中加入交聯(lián)固定化載體，室溫連續(xù)振蕩2小時(shí)。然后，過(guò)濾除去酶溶液，用0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中(pH 5.0)洗滌固定化酶，直至洗滌液在280nm處無(wú)吸收，獲得固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶。將0.1g殼聚糖(重均分子量50.8萬(wàn)，脫乙酰度81％)溶解于10ml 1.5％(v/v)醋酸溶液中，用1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到6.0，加入酶蛋白與殼聚糖質(zhì)量比為10％的固定化酶，在50℃連續(xù)振蕩5小時(shí)，過(guò)濾收集降解產(chǎn)物，真空濃縮后用5mol/l的氫氧化鈉調(diào)pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為1900，分子量分布1.28，產(chǎn)率61.4％的自由氨基形式殼寡糖。
權(quán)利要求
1.一種低分子量殼聚糖或殼寡糖的制備方法，其特征在于制備低分子量殼聚糖或殼寡糖時(shí)首先用N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球作為中性蛋白酶固定化的載體，以戊二醛作交聯(lián)劑，制得固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶，然后用制得的固定化酶水解殼聚糖，按需控制酶解反應(yīng)時(shí)間，即可得到所需低分子量殼聚糖或殼寡糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量殼聚糖或殼寡糖的制備方法，其特征在于采用的具體步驟如下(1)將N-琥珀酰殼聚糖溶于水中，制得濃度為0.25-0.40g/ml的N-琥珀酰殼聚糖水溶液，在磁力攪拌下將此溶液逐滴擠入由0.1-0.3g/ml的氯化鈣溶液和無(wú)水乙醇以體積比3∶7～7∶3混合形成的凝固液中獲得N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球，將N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球在凝固液體系中保持2-6小時(shí)，得到固定化載體N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球。(2)過(guò)濾除去凝固液，將N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球置于溶有戊二醛的0.05-0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉、pH值為3.0-5.0的緩沖溶液中，溶液中戊二醛的體積百分比濃度為0.5-1.5％，N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球與交聯(lián)劑戊二醛的質(zhì)量(濕重)體積比為1∶3～1∶10，室溫下連續(xù)振蕩4-12小時(shí)，然后過(guò)濾收集交聯(lián)N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球，用水或0.05-0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液反復(fù)洗滌，直至洗滌液在245nm處無(wú)吸收，得到交聯(lián)固定化載體。(3)將與固定化載體重量比為0.2-1.5的中性蛋白酶溶于0.05-0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉、pH為3.0-5.0的緩沖溶液中，在此酶溶液中加入交聯(lián)固定化載體，室溫連續(xù)振蕩2-6小時(shí)，過(guò)濾除去酶溶液，再用0.05-0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉、pH為3.0-5.0的緩沖溶液中洗滌固定化酶，直至洗滌液在280nm處無(wú)吸收，獲得固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶。(4)將脫乙酰度范圍在75％-95％的殼聚糖溶解于體積百分比濃度為0.5-1.5％醋酸溶液中，用0.05-1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到5.0-6.0，然后加入固定在N-琥珀酰殼聚糖水凝膠球上的中性蛋白酶，加入的酶為殼聚糖質(zhì)量的3％-10％，在45-55℃連續(xù)振蕩所需時(shí)間，過(guò)濾收集降解產(chǎn)物，得到低分子量殼聚糖或殼寡糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低分子量殼聚糖或殼寡糖的制備方法，其特征在于將過(guò)濾收集的降解產(chǎn)物真空濃縮后用1-5mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到8-9，用乙醇沉淀、洗滌，真空干燥獲得重均分子量在2.35萬(wàn)～1900的自由氨基形式的低分子量殼聚糖或殼寡糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低分子量殼聚糖或殼寡糖的制備方法，其特征在于當(dāng)酶催化水解反應(yīng)時(shí)間為0.5-5小時(shí)之間時(shí)，獲得低分子量殼聚糖，當(dāng)酶催化水解反應(yīng)時(shí)間大于等于5小時(shí)，獲得殼寡糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低分子量殼聚糖或殼寡糖的制備方法，其特征在于最后將用過(guò)的固定化酶用0.05-0.5M檸檬酸-磷酸氫二鈉、pH為3.0-5.0的緩沖溶液洗滌，除去固定化酶上吸附的降解產(chǎn)物，使其能重復(fù)使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低分子量殼聚糖或殼寡糖的制備方法，其特征在于所用殼聚糖的分子量范圍在12.8萬(wàn)-64.8萬(wàn)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備低分子量殼聚糖或殼寡糖的方法，該方法將中性蛋白酶用交聯(lián)法固定在N－琥珀酰殼聚糖水凝膠球上，然后用固定化酶降解殼聚糖，控制酶解反應(yīng)時(shí)間，降解產(chǎn)物用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8－9，乙醇沉淀、洗滌，真空干燥獲得自由氨基形式的低分子量殼聚糖和殼寡糖。與自由酶水解殼聚糖相比，固定化酶提高了低分子量殼聚糖或殼寡糖的產(chǎn)率，減小了分子量分布。這種固定化酶水解殼聚糖制得的低分子量殼聚糖或殼寡糖幾乎不含有糖/酶蛋白的復(fù)合物，從而更加適合應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的低分子量殼聚糖和殼寡糖的生產(chǎn)。而且此固定化酶水解殼聚糖重復(fù)使用40h仍然保持其最初酶活力的82.5％以上，可以適用于工業(yè)連續(xù)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1746193SQ200510019438
公開(kāi)日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2005年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日
發(fā)明者杜予民, 李瑾 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)