專利名稱：一種多色量子點(diǎn)微球編碼方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米生物技術(shù)和生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)微球進(jìn)行多色量子點(diǎn)光譜編碼的方法。編碼微球在經(jīng)過生物學(xué)修飾后在基因表達(dá)、蛋白質(zhì)間相互作用、高通量篩選、多通道生物學(xué)測(cè)定、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)和組合化學(xué)等方面都有廣闊的應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
近年來，對(duì)各類復(fù)雜體系中活性生物分子分析研究興趣的快速增長，要求和刺激著新型分析檢測(cè)技術(shù)的發(fā)明和發(fā)展。與傳統(tǒng)分析檢測(cè)技術(shù)如多孔板技術(shù)相比，最近發(fā)明的基于微球的分析檢測(cè)技術(shù)，即懸浮陣列技術(shù)，由于在儀器裝置中具有更好的傳輸流動(dòng)性，并且單位體積能提供更多的分子識(shí)別位點(diǎn)(這有助于改進(jìn)它的探測(cè)限制)等優(yōu)點(diǎn)，在生物多元分析、基因表達(dá)、醫(yī)學(xué)診斷、藥物高通量篩選和組合化學(xué)等方面都具有很好的應(yīng)用前景，近年來日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。但是，該技術(shù)的瓶頸在于對(duì)微球進(jìn)行有效的編碼。這幾年，出現(xiàn)了許多對(duì)微球的編碼方法。其中，利用量子點(diǎn)熒光信號(hào)對(duì)微球進(jìn)行多色編碼的技術(shù)由于具有更好的穩(wěn)定性、可重復(fù)性、易于實(shí)現(xiàn)高通量探測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，而深受關(guān)注。然而，目前已報(bào)道的基于量子點(diǎn)的多色編碼，由于沒有考慮到生物學(xué)應(yīng)用中生物探針熒光特性的特殊要求，在實(shí)用性方面還存在缺陷(如編碼信號(hào)與探針信號(hào)存在交疊，不利于檢測(cè)等)，有待進(jìn)一步改善和提高。因此根據(jù)生物學(xué)研究特定的需要，選擇合適發(fā)射波長的QDs對(duì)微球進(jìn)行定量控制的多色編碼，讓出特定的波長段作為標(biāo)記物信號(hào)的探測(cè)窗口，是很有必要而且很有實(shí)用價(jià)值的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種多色量子點(diǎn)微球編碼方法，該方法具有精確性和可重復(fù)性較高，操作簡(jiǎn)單易行。
本發(fā)明提供的一種多色量子點(diǎn)微球編碼方法，其步驟為(1)根據(jù)待使用的熒光標(biāo)記探針的發(fā)射波長，選擇N種發(fā)射波長不與熒光標(biāo)記探針發(fā)生重疊的量子點(diǎn)，2≤N≤10；(2)配制上述量子點(diǎn)的三氯甲烷溶液或甲苯溶液，分別測(cè)量其摩爾濃度；取上述量子點(diǎn)溶液，加入到稀釋液中得到量子點(diǎn)混合溶液，作為裝載液，稀釋液由三氯甲烷和丙醇或正丁醇構(gòu)成，其中三氯甲烷的體積比為40-80％，計(jì)算得到混合溶液中各量子點(diǎn)的摩爾濃度以及摩爾濃度比率；(3)將待編碼微球加入到裝載液中，充分均勻吸附后取出，并將微球清洗干凈；(4)檢測(cè)步驟(3)得到的編碼微球的熒光光譜；(5)選定兩種量子點(diǎn)，計(jì)算若干個(gè)編碼微球的熒光光譜在選定的兩種量子點(diǎn)的峰位處的熒光強(qiáng)度比值，將其比值的平均值作為該濃度比率裝載液得到的編碼微球的編碼信號(hào)的平均值，將單球光譜兩峰強(qiáng)度比值與平均值偏差的最大值作為其偏差值；分別以裝載液中選定的兩種量子點(diǎn)摩爾濃度比率和其對(duì)應(yīng)編碼微球兩峰處熒光強(qiáng)度比值或其對(duì)數(shù)值作為橫、縱坐標(biāo)，繪制坐標(biāo)點(diǎn)，并得到偏差值信息；(6)改變選定的兩種量子點(diǎn)的摩爾濃度比率，配置不同濃度比率的裝載液，重復(fù)步驟(3)-(5)，得到相應(yīng)的編碼微球及對(duì)應(yīng)的信號(hào)和偏差，繪制坐標(biāo)點(diǎn)，得到工作曲線；(7)根據(jù)步驟(6)得到的工作曲線，評(píng)估編碼容量，指導(dǎo)微球的定量編碼。
當(dāng)N≥3時(shí)，在N種量子點(diǎn)中選取另外兩種量子點(diǎn)，重復(fù)步驟(3)-(6)，繪制另一工作曲線。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了由控制QDs裝載液中不同發(fā)射波長QDs的摩爾濃度比率來控制微球中的編碼信號(hào)，并且可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果從理論上對(duì)QDs編碼微球進(jìn)行指導(dǎo)，具有很好的精確性和重復(fù)性，操作簡(jiǎn)單易行，而且采用光譜儀能對(duì)編碼微球進(jìn)行快速準(zhǔn)確的識(shí)別，有利于促進(jìn)量子點(diǎn)編碼微球的發(fā)展和應(yīng)用。


圖1為量子點(diǎn)的紫外吸收和熒光光譜，其中(a)和(b)分別為黃色(575nm)量子點(diǎn)的紫外吸收和熒光光譜。(c)和(d)分別為紅色(628nm)量子點(diǎn)的紫外吸收和熒光光譜。
圖2為不同濃度比率的裝載液得到的編碼微球的編碼信號(hào)。
圖3為編碼微球信號(hào)強(qiáng)度比率與對(duì)應(yīng)裝載液中兩種QDs濃度比率分別取對(duì)數(shù)后的關(guān)系曲線，其中，縱坐標(biāo)是lg(Iy/Ir)，橫坐標(biāo)是lg(Cy/Cr)。
具體實(shí)施例方式
下面以二種量子點(diǎn)為例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
(1)根據(jù)生物研究需要用到的特定熒光標(biāo)記探針如GFP、FITC、Rh.6G、FAM、HEX、TET、Texas Red、Cascade Blue、Cy3TM、Cy5TM等的發(fā)光特點(diǎn)，選擇兩種以上合適發(fā)射波長的量子點(diǎn)對(duì)微球進(jìn)行多色編碼。選擇的原則是量子點(diǎn)的發(fā)射波長要避開標(biāo)記探針的發(fā)射波長，避免量子點(diǎn)發(fā)射峰與探針發(fā)射峰出現(xiàn)交疊。
(2)配制上述兩種量子點(diǎn)的三氯甲烷溶液或甲苯溶液，分別測(cè)量其摩爾濃度。分別取少量確定體積的量子點(diǎn)溶液，加入到由三氯甲烷和丙醇或三氯甲烷和正丁醇組成的一定體積的稀釋液中，稀釋得到量子點(diǎn)的混合溶液作為裝載液，稀釋液中三氯甲烷的體積比為4080％。計(jì)算得到混合溶液中上述兩種量子點(diǎn)的摩爾濃度以及摩爾濃度比率。
(3)將待編碼的微球一次性加入到裝載液中，加入了微球的裝載液放置搖床上充分振搖動(dòng)，微球充分均勻吸附量子點(diǎn)后，離心取出，用乙醇清洗掉附著在微球表面的量子點(diǎn)，得到這一摩爾濃度比率的裝載液得到的編碼微球。
(4)隨機(jī)挑(3)得到的若干個(gè)編碼微球，測(cè)出編碼微球的熒光光譜，分別計(jì)算這些單球光譜在兩個(gè)峰位處的熒光強(qiáng)度比值，求出比值的平均值作為這一濃度比率裝載液得到的對(duì)應(yīng)編碼微球的編碼信號(hào)的平均值，取單球光譜兩峰強(qiáng)度比值與平均值偏差的最大值作為這一樣品的偏差值。裝載液中兩種量子點(diǎn)摩爾濃度比值和其對(duì)應(yīng)編碼微球兩峰處熒光強(qiáng)度比值或其對(duì)數(shù)值，分別作為橫、縱坐標(biāo)，繪制坐標(biāo)點(diǎn)，及其偏差值信息。
(5)重復(fù)(3)至(4)步，得到一系列摩爾濃度比率的裝載液相對(duì)應(yīng)的編碼微球的編碼信號(hào)及其偏差。在坐標(biāo)軸中，描出由點(diǎn)(lg(Iy/Ir)，lg(Cy/Cr))(或(Iy/Ir，Cy/Cr)構(gòu)成的工作曲線。其中，Iy和Ir分別為微球光譜在兩個(gè)峰位處的熒光強(qiáng)度，Cy和Cr分別為裝載液中兩種量子點(diǎn)的摩爾濃度。
(6)根據(jù)步驟(5)得到的工作曲線，如果相鄰點(diǎn)之間的偏差值不存在交疊，則它們是能被鑒別區(qū)分的；如果存在偏差值的交疊，則會(huì)給它們的鑒別帶來影響，那么它們不宜同時(shí)用于同一實(shí)驗(yàn)的編碼應(yīng)用。此外，如果想要得到這兩種量子點(diǎn)的編碼信號(hào)為(Iy/Ix)的編碼小球，在工作曲線上我們可以找到(Iy/Ix)對(duì)應(yīng)的點(diǎn)讀出相應(yīng)的裝載液濃度比率值，配置該濃度比率的裝載液對(duì)這種小球進(jìn)行編碼，就可得到所需要的編碼信號(hào)的編碼小球。
(7)對(duì)于兩種以上量子點(diǎn)的情況，即N＝3、4、…或10時(shí)，任意選取其中兩種量子點(diǎn)，固定其余量子點(diǎn)的摩爾濃度，改變選定的兩種量子濃度，得到一系列不同濃度比值的裝載液。以選定的兩種量子點(diǎn)，重復(fù)步驟(3)-(5)，繪制工作曲線。改變選取的兩種量子點(diǎn)，固定其它量子點(diǎn)的摩爾濃度，又可以得到一條工作曲線，按此方法，可得到多條工作曲線。
實(shí)施例這里以結(jié)合使用熒光染料FITC(520nm)作為標(biāo)記探針為例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
(1)考慮到FITC(520nm)的發(fā)射波長在藍(lán)色區(qū)域，我們選擇黃色(575nm)和紅色(628nm)CdSe/ZnS量子點(diǎn)對(duì)商業(yè)化的聚苯乙烯微球進(jìn)行兩色編碼。測(cè)量并計(jì)算黃、紅兩種量子三氯甲烷溶液摩爾原始濃度分別為5.663×107M和8.594108M。
(2)改變裝載液中兩種量子點(diǎn)的摩爾濃度比率，我們配置得到了一系列濃度比率梯度變化的裝載液(溶劑由60％三氯甲烷和40％丙醇組成，裝載液總體積保持在0.5ml)，裝載液中黃色與紅色量子點(diǎn)摩爾濃度比值范圍是0.3～659(具體0.3，0.6，3.3，6.6，9.9，19.8，39.5，79.0，164.7，329.5，659)。稱量0.5mg聚苯乙烯微球11份，分別一次性加入到各濃度比率的裝載液中，放置到搖床上振蕩24小時(shí)，過濾得到編碼微球，用無水乙醇清洗微球3次。
(3)檢測(cè)編碼微球的光譜信號(hào)。用光譜儀對(duì)每個(gè)樣品隨機(jī)測(cè)量30個(gè)單球光譜，求出其平均值作為該樣品的單球光譜平均值，取最大偏差值最為光譜偏差，如圖2。由圖2可知，通過控制裝載液中兩種量子點(diǎn)濃度比率的梯度變化，我們得到了一系列信號(hào)強(qiáng)度比率呈梯度變化的編碼微球，a~k光譜的Iy∶Ir分別是1∶15.8，1∶9.8，1∶6.2，1∶2.9，1∶2.4，1∶1.7，1∶1.2，1.3∶1，3.3∶1，4.7∶1，9.1∶1。圖3中，Iy和Ir分別為編碼微球在575nm和628nm處熒光強(qiáng)度，Cy和Cr分別為裝載液中黃、紅兩種量子點(diǎn)的摩爾濃度。
(4)根據(jù)圖3的工作曲線，可以看到，多數(shù)相鄰的編碼點(diǎn)之間偏差值存在交疊，它們不宜同時(shí)用于同一編碼應(yīng)用。我們可以挑出沒有交疊的編碼進(jìn)行同時(shí)應(yīng)用。此外，通過配制曲線上點(diǎn)對(duì)應(yīng)的(Cy/Cr)裝載液，對(duì)微球進(jìn)行編碼，可以得到我們想要的編碼微球。
權(quán)利要求
1.一種多色量子點(diǎn)微球編碼方法，其步驟為(1)根據(jù)待使用的熒光標(biāo)記探針的發(fā)射波長，選擇N種發(fā)射波長不與熒光標(biāo)記探針發(fā)生重疊的量子點(diǎn)，2≤N≤10；(2)配制上述量子點(diǎn)的三氯甲烷溶液或甲苯溶液，分別測(cè)量其摩爾濃度；取上述量子點(diǎn)溶液，加入到稀釋液中得到量子點(diǎn)混合溶液，作為裝載液，稀釋液由三氯甲烷和丙醇或正丁醇構(gòu)成，其中三氯甲烷的體積比為40-80％，計(jì)算得到混合溶液中各量子點(diǎn)的摩爾濃度以及摩爾濃度比率；(3)將待編碼微球加入到裝載液中，充分均勻吸附后取出，并將微球清洗干凈；(4)檢測(cè)步驟(3)得到的編碼微球的熒光光譜；(5)選定兩種量子點(diǎn)，計(jì)算若干個(gè)編碼微求的熒光光譜在選定的兩種量子點(diǎn)的峰位處的熒光強(qiáng)度比值，將其比值的平均值作為該濃度比率裝載液得到的編碼微球的編碼信號(hào)的平均值，將單球光譜兩峰強(qiáng)度比值與平均值偏差的最大值作為其偏差值；分別以裝載液中選定的兩種量子點(diǎn)摩爾濃度比率和其對(duì)應(yīng)編碼微球兩峰處熒光強(qiáng)度比值或其對(duì)數(shù)值作為橫、縱坐標(biāo)，繪制坐標(biāo)點(diǎn)，并得到偏差值信息；(6)改變選定的兩種量子點(diǎn)的摩爾濃度比率，配置不同濃度比率的裝載液，重復(fù)步驟(3)-(5)，得到相應(yīng)的編碼微球及對(duì)應(yīng)的信號(hào)和偏差，繪制坐標(biāo)點(diǎn)，得到工作曲線；(7)根據(jù)步驟(6)得到的工作曲線，評(píng)估編碼容量用于微球的定量編碼。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于當(dāng)N≥3時(shí)，在N種量子點(diǎn)中選取另外兩種量子點(diǎn)，重復(fù)步驟(3)-(6)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多色量子點(diǎn)微球編碼方法，它根據(jù)生物學(xué)研究特定的需要，選擇合適的量子點(diǎn)做多色編碼。通過控制裝載液中多色QDs的摩爾濃度比率來得到不同熒光強(qiáng)度比率的編碼微球。對(duì)于確定的各量子點(diǎn)，首先描出關(guān)于微球中不同信號(hào)強(qiáng)度比率和裝載液中QDs濃度比率的工作曲線，通過這條曲線，初步評(píng)估量子點(diǎn)的有效編碼庫容量，并且用于指導(dǎo)微球的光學(xué)編碼。本發(fā)明具有很好的精確性和重復(fù)性，操作簡(jiǎn)單易行，而且采用光譜儀能對(duì)編碼微球進(jìn)行快速準(zhǔn)確的識(shí)別，有利于促進(jìn)量子點(diǎn)編碼微球的發(fā)展和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1779461SQ20051001962
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2005年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者王海橋, 黃振立, 曹元成, 趙元弟 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)