專利名稱：耐氯菌株3號的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐氯菌株3號的基因，它是松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3的16S rRNA基因。其中，松鼠葡萄球菌B723-3已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏日期是2005年10月24日，保藏號是CCTCC NO.M205121。通過經(jīng)典表型鑒定和16S rRNA核苷酸序列分析相結(jié)合的方法，對耐氯菌株3號進行了生理生化和16S rRNA分子水平的鑒定，由此確定它為松鼠葡萄球菌，同時將它的16S rDNA序列于2005年4月27日提交國際Genbank進行了登記，登記號為AB212276。
背景技術(shù)：
自然界中，存在著一些可以在含有高濃度甚至是極端高濃度氯離子的環(huán)境中正常生長的微生物。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，這些微生物并非都可以應用于含高濃度氯離子廢水(氯離子濃度為5000-80000mg/L)的處理，只有對其經(jīng)過嚴格的篩選和馴化后得到的耐氯微生物才能做到。耐氯微生物既可耐受高濃度氯離子環(huán)境，又可降解廢水中高濃度的有機物。篩選耐氯微生物的首選取樣點就是所要處理的廢水中，因為在廢水中存在著一定數(shù)量的微生物，這些微生物對廢水環(huán)境有較好的適應能力。初篩選出來的耐氯微生物經(jīng)過馴化后，即可作為耐氯微生物菌株應用到廢水處理實踐中。
微生物的分類方法常用的有經(jīng)典分類方法和分子生物學分類法。經(jīng)典分類方法主要指依據(jù)形態(tài)特征(Morphological characteristics)、培養(yǎng)特征(Cultural characteristics)及生理生化特征(Physiological characteristics)等分類的方法。分子生物學分類法，又稱分子分類方法，是指在分子水平上對生物個體的核酸及蛋白質(zhì)進行研究，并據(jù)此對生物個體進行分類的方法。由于16S rRNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分類方法采用。
目前，16S rRNA序列分析的方法主要有兩種一種是16S rRNA提純后用反轉(zhuǎn)錄酶和保守引物進行測序，另一種是擴增16S rRNA基因?qū)腄NA序列，然后將PCR產(chǎn)物回收后直接測序。它們是研究rRNA同源性最直接可靠的方法。
耐氯菌由于具有耐氯特性，其形態(tài)、胞壁、細胞內(nèi)蛋白、脂肪酸等大分子組成在有鹽存在的情況下會發(fā)生不同程度的改變，在菌株鑒定過程中，僅從形態(tài)上很難判斷它們的歸屬，而從生理特征和化學特征上鑒定又十分費時費力，對于大量的分離菌株更是如此。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過16S rRNA序列分析方法，快速對耐氯菌株3號進行分子水平的鑒定，確定其為松鼠葡萄球菌。該菌株是新發(fā)現(xiàn)的能夠在高濃度氯離子環(huán)境下生存的耐氯菌株，它有助于降解廢水中的有機物。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下提供松鼠葡萄球菌B723-3CCTCC NO.M205121的16S rRNA基因，其全長1484個核苷酸。
本發(fā)明基因序列，通過提取細菌核DNA，16S rRNA基因的PCR擴增，PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測定和分析而獲得。
本發(fā)明具有快速、簡便的優(yōu)點。所提供的基因序列已獲得國際Genbank的認可，并且給予了登記，這必將有助于推動我國廢水處理事業(yè)的發(fā)展。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明提供的CCTCC NO.M205121菌株的基因，其16S rDNA全序列全長1515個核苷酸。
采用BLAST分析法，將松鼠葡萄球菌B723-3CCTCC NO.M205121的菌株的16S rDNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較，該菌株與松鼠葡萄球菌的同源性為99.0％，由此可以從分子水平確定本菌株是松鼠葡萄球菌。同時，結(jié)合經(jīng)典分類方法所獲得的形態(tài)及生理生化特征，最終確定本菌株是松鼠葡萄球菌。
本菌株的菌落形態(tài)特征菌落菌斑較大(5mm)、呈米黃色、規(guī)則圓形、緣齊、不透明表面光滑、微凸，粘稠。生理特征球形，直徑0.5～1.5μm，單個、成對或不規(guī)則堆狀，革蘭氏陽性。主要生化特征兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，接觸酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶和脲酶等，從D-纖維二糖、D-巖糖、D-甘露醇、D-核糖、果糖、蔗糖產(chǎn)酸，不運動，不生孢，最適生長溫度30～37℃。
本發(fā)明采用提取細菌核DNA、16S rRNA基因的PCR擴增、PCR產(chǎn)物的回收，以及16SrDNA的全序列測定和分析步驟，來獲取CCTCC NO.M205121菌株的16S rDNA基因全序列。
上述步驟具體如下(1)提取細菌核DNAa.集菌用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液管內(nèi)培養(yǎng)18小時，取菌懸液1ml于1.5ml的離心管中8000rpm離心5min，棄上清液。
b.加STE 1ml洗一次，振蕩重懸細菌，8000rpm離心5min，棄上清液。
c.加600μlTE，劇烈振蕩重懸細菌，加入10％的SDS 65μl，65℃水浴5-10min。
d.加等積體酚氯仿抽提三次。
e.小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3MNaAc，12000rpm離心10min，徹底棄上清。
f.DNA沉淀用70％乙醇洗一次，風干后溶于20μlTE備用。
TE緩沖液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0。
STE緩沖液0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0。
(2)16S rRNA基因的PCR擴增在50μL反應體積中加入1μL模板DNA，0.1μg；0.5μL P1和P2，終濃度為0.5μM；1μLdNTP，每種NTP0.2mM；0.5μLTaq聚合酶，2U；5μL 10×PCR緩沖液。
PCR擴增條件為94℃預變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min。
PCR擴增的引物是P1正向引物為5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物為5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’。
(3)PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風干后溶于適量滅菌雙蒸水。
(4)16S rDNA的全序列測定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR擴增30個循環(huán)，其條件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應；然后，在AppliedBiosystem 373ADNA測序儀上測序；然后采用BLAST軟件，將測得的16S rDNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終確定其為松鼠葡萄球菌株的基因全序列。
在PCR測序時，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
本實施例中，未具體說明本發(fā)明菌株的篩選和馴化等內(nèi)容。其詳情可參閱由本申請人同日申請的“耐氯菌株3號及其篩選方法”和“耐氯菌株3號的應用”兩項發(fā)明專利文獻內(nèi)容。
CCTCC NO.M205121的菌株的16S rDNA全序列agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga60acagatgaga agcttgcttc tctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa120cctacctata agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat aatattttga180accgcatggt tcaatagtga aagacggttt cggctgtcac ttatagatgg acccgcgccg240tattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcgacg atacgtagcc gacctgagag300ggtgatcggc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtagg360gaatcttccg caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtctt420cggatcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaaatttgt tagtaactga acaagtcttg480cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt540ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgt aggcggtttc ttaagtctga600tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtgggagg gtcattggaa actggggaaa cttgagtgca660gaaaaaggag agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gcagaagata tggaggaacc720cccagtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gatgtgcgaa agcgtgggga780tcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct agtgttaggg840ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc900gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt960aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa atcttgacat cctttgaccg ctctagagat1020agagtcttcc ccttcggggg acaaagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt1080cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct taagcttagt tgccatcatt1140aagttgggca ctctaggttg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca1200aatcatcatg ccccttatga tttgggctac acacgtgcta caatggataa tacaaagggc1260agcgaatccg cgaggccaag caaatcccat aaaattattc tcagttcgga ttgtagtctg1320caactcgact acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgtag atcagcatgc tacggtgaat1380acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagc1440cggtggagta accttttagg agctagccgt cgaaggtggg acaaatgatt ggggtgaagt1500cgtaacaagg taacc 151權(quán)利要求
1.耐氯菌株3號的基因，其特征是松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3CCTCC NO.M205121的16S r RNA基因，其菌株的16S r DNA全序列如下AGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACAGATGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAATTTGTTAGTAACTGAACAAGTCTTGCGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAAACTTGAGTGCAGAAAAAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAAGATATGGAGGAACCCCCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCGCTCTAGAGATAGAGTCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATAATACAAAGGGCAGCGAATCCGCGAGGCCAAGCAAATCCCATAAAATTATTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAAATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC上述16S r DNA序列全長1515個核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐氯菌株3號的基因，其特征在于采用BLAST分析法，將松鼠葡萄球菌B723-3CCTCC NO.M205121的菌株的16S r DNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較，該菌株與松鼠葡萄球菌的同源性為99.0％。
3.一種獲取權(quán)利要求1或2所述耐氯菌株3號的基因的方法，其采用了提取細菌核DNA、16S r RNA基因的PCR擴增、PCR產(chǎn)物的回收，以及16S r DNA的全序列測定和分析步驟，其特征在于(1)在提取細菌核DNA的過程中，采用了如下的緩沖液，TE緩沖液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0，STE緩沖液0.1mol/LNaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0，(2)在16S r RNA基因的PCR擴增過程中，采用了如下的擴增條件和擴增的引物PCR擴增條件為94℃預變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min，PCR擴增的引物是P1正向引物為5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物為5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’，(3)PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風干后溶于適量滅菌雙蒸水，(4)16S rDNA的全序列測定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR擴增30個循環(huán)，其條件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應；然后，在AppliedBiosystem 373A DNA測序儀上測序；然后采用BLAST軟件，將測得的16S r DNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終確定其為松鼠葡萄球菌株的基因全序列，在PCR測序時，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
全文摘要
本發(fā)明涉及耐氯菌株3號的基因，它是松鼠葡萄球菌(Staphy/ococcus sciuri)B723－3的16S rRNA基因，其菌株的16S rDNA序列全長1515個核苷酸。本發(fā)明基因序列，通過提取細菌核DNA，16S rRNA基因的PCR擴增，PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測定和分析而獲得。本發(fā)明具有快速、簡便的優(yōu)點。所提供的基因序列已獲得國際Genbank的認可，并且給予了登記，這必將有助于推動我國廢水處理事業(yè)的發(fā)展。
文檔編號C12N1/20GK1831130SQ200510019750
公開日2006年9月13日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者鮑建國, 王焰新, 劉慧 , 張彩香, 信欣, 李耀晨, 劉雙, 李平, 張莉君 申請人:中國地質(zhì)大學(武漢)