專利名稱：一種超氧化物歧化酶提取修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超氧化物歧化酶的提取與修飾方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD，Superoxide dismutace)屬于肽鏈大分子金屬酶，它能專一消除人體內(nèi)的超氧陰離子O2-，以解除超氧陰離子氧化體內(nèi)成分造成對(duì)機(jī)體的損害。醫(yī)學(xué)研究和臨床證明，它具有美容抗衰老，延年益壽的保健作用。并可用于治療1、全身紅斑痕癔、皮膚炎、硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，自身免疫性溶血性貧血，血小板減少等自身免疫性疾?。?、治療心肌缺血與缺血再灌注綜合癥；3、也可用于斷肢再植、整形、美容及腎、肝、心臟等器官的保護(hù)和移植等手術(shù)過程。但是采用現(xiàn)有方法提取制備的超氧化物歧化酶的活力不穩(wěn)定，尤其是常溫保存時(shí)間很短，僅為1個(gè)月左右，使含超氧化物歧化酶產(chǎn)品的有效期很短，其儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷售、使用周期也相應(yīng)變短，嚴(yán)重阻礙了含超氧化物歧化酶產(chǎn)品的開發(fā)、生產(chǎn)與推廣。
本發(fā)明的目的就是提供一種超氧化物歧化酶提取修飾方法，用該種方法提取修飾的超氧化物歧化酶的活力穩(wěn)定性明顯提高，存活期大大增長，從而有利于含超氧化物歧化酶產(chǎn)品的開發(fā)、生產(chǎn)與推廣，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決其技術(shù)問題，所采用的技術(shù)方案為一種超氧化物歧化酶提取修飾方法，其步驟是a、取動(dòng)物血紅細(xì)胞，用其2-4倍體積量的0.7-0.9％的生理鹽水，離心洗浮2-3次；再將血紅細(xì)胞用0.5-1.5倍體積的去離子水，在4-8℃溫度下溶血18-21小時(shí)，得溶血液；b、往a步的溶血液中加入0.2-0.3倍體積，且溫度為-25℃的乙醇及0.12-0.14倍體積的氯仿，產(chǎn)生穩(wěn)定的沉淀后，取上清液；然后，將上清液加熱到60-80℃，靜置15-25分鐘，除去不溶物，收集上清液，重復(fù)2-3次；c、在b步制得的上清液中，加入3倍體積且溫度為-10℃至-20℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；d、將c步的超氧化物歧化酶沉淀加去離子水溶解后，動(dòng)態(tài)透析得到透析液，將透析液加到已用PH7.6的2.5mmol/L磷酸緩沖液平衡好的色譜柱上吸附，并用PH7.6的2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，將洗脫液超濾即得超氧化物歧化酶；e、將d步的超氧化物歧化酶加入去離子水溶解后，將溫度降到7℃，再加入右旋糖酐混勻，在5-10℃溫度下，靜置40-60小時(shí)，制得修飾后的超氧化物歧化酶；f、將e步的超氧化物歧化酶，用75-85％的食用酒精滅菌24-28小時(shí)，再冷凍干燥、密封后即制得成品。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是用低溫乙醇、氯仿去掉血紅細(xì)胞中的血紅蛋白，再經(jīng)過熱變性處理去掉熱變性蛋白，再用低溫丙酮得到的超氧化物歧化酶沉淀，最后采用螺旋洗度法得到超氧化物歧化酶，其提取經(jīng)過低溫、高溫，溶解、沉淀多種方式組合的去雜、匯聚，提取出的超氧化物歧化酶純度高、活力強(qiáng)。高純度高活力的超氧化物歧化酶再經(jīng)右旋糖酐修飾后，酶中的銅、鋅等金屬輔基與右旋糖酐結(jié)合而不易解離，從而使酶活力的穩(wěn)定性大大增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)證明用本發(fā)明方法提取修飾得到的超氧化物歧化酶可在45℃條件存放5個(gè)月酶活力不降低，常溫條件下存放4年酶不失活。因此，本發(fā)明將大大延長超氧化物歧化酶產(chǎn)品的保質(zhì)期，必將有力的促進(jìn)含超氧化物歧化酶的各種醫(yī)療與保健產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一本例的具體實(shí)施方式
為一種超氧化物歧化酶提取修飾方法，其步驟是a、取動(dòng)物血紅細(xì)胞，用其3倍體積量的0.8％的生理鹽水，離心洗浮3次；再將血紅細(xì)胞用1倍體積的去離子水，在5℃溫度下溶血21小時(shí)，得溶血液；b、往a步的溶血液中加入0.25倍體積，且溫度為-25℃的乙醇及0.14倍體積的氯仿，產(chǎn)生穩(wěn)定的沉淀后，取上清液；然后，將上清液加熱到72℃，靜置21分鐘，除去不溶物，收集上清液，重復(fù)3次；c、在b步制得的上清液中，加入3倍體積且溫度為-20℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；d、將c步的超氧化物歧化酶沉淀加去離子水溶解后，動(dòng)態(tài)透析得到透析液，將透析液加到已用PH7.6的2.5mmol/L磷酸緩沖液平衡好的色譜柱上吸附，并用PH7.6的2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，將洗脫液超濾即得超氧化物歧化酶；e、將d步的超氧化物歧化酶加入去離子水溶解后，將溫度降到7℃，再加入右旋糖酐混勻，在7℃溫度下，靜置48小時(shí)，制得修飾后的超氧化物歧化酶；f、將e步的超氧化物歧化酶，用85％的食用酒精滅菌28小時(shí)，再冷凍干燥、密封后即制得成品。
實(shí)施例二本例的具體作法是a、取動(dòng)物血紅細(xì)胞，用其4倍體積量的0.9％的生理鹽水，離心洗浮2次；再將血紅細(xì)胞用0.5倍體積的去離子水，在4℃溫度下溶血20小時(shí)，得溶血液；b、往a步的溶血液中加入0.20倍體積，且溫度為-15℃的乙醇及0.12倍體積的氯仿，產(chǎn)生穩(wěn)定的沉淀后，取上清液；然后，將上清液加熱到60℃，靜置15分鐘，除去不溶物，收集上清液，重復(fù)3次；c、在b步制得的上清液中，加入2倍體積且溫度為-10℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；d、將c步的超氧化物歧化酶沉淀加去離子水溶解后，動(dòng)態(tài)透析得到透析液，將透析液加到已用PH7.6的2.5mmol/L磷酸緩沖液平衡好的色譜柱上吸附，并用PH7.6的2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，將洗脫液超濾即得超氧化物歧化酶；e、將d步的超氧化物歧化酶加入去離子水溶解后，將溫度降到4℃，再加入右旋糖酐混勻，在4℃溫度下，靜置40小時(shí)，制得修飾后的超氧化物歧化酶；f、將e步的超氧化物歧化酶，用75％的食用酒精滅菌24小時(shí)，再冷凍干燥、密封后即制得成品。
實(shí)施例三本例的具體作法是a、取動(dòng)物血紅細(xì)胞，用其2倍體積量的0.7％的生理鹽水，離心洗浮2次；再將血紅細(xì)胞用1.5倍體積的去離子水，在8℃溫度下溶血18小時(shí)，得溶血液；b、往a步的溶血液中加入0.30倍體積，且溫度為-20℃的乙醇及0.13倍體積的氯仿，產(chǎn)生穩(wěn)定的沉淀后，取上清液；然后，將上清液加熱到80℃，靜置25分鐘，除去不溶物，收集上清液，重復(fù)2次；c、在b步制得的上清液中，加入2.5倍體積且溫度為-15℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；d、將c步的超氧化物歧化酶沉淀加去離子水溶解后，動(dòng)態(tài)透析得到透析液，將透析液加到已用PH7.6的2.5mmol/L磷酸緩沖液平衡好的色譜柱上吸附，并用PH7.6的2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，將洗脫液超濾即得超氧化物歧化酶；e、將d步的超氧化物歧化酶加入去離子水溶解后，將溫度降到10℃，再加入右旋糖酐混勻，在10℃溫度下，靜置60小時(shí)，制得修飾后的超氧化物歧化酶；f、將e步的超氧化物歧化酶，用75％的食用酒精滅菌24小時(shí)，再冷凍干燥、密封后即制得成品。
權(quán)利要求
1.一種超氧化物歧化酶提取修飾方法，其步驟是a、取動(dòng)物血紅細(xì)胞，用其2-4倍體積量的0.7-0.9％的生理鹽水，離心洗浮2-3次；再將血紅細(xì)胞用0.5-1.5倍體積的去離子水，在4-8℃溫度下溶血18-21小時(shí)，得溶血液；b、往a步的溶血液中加入0.2-0.3倍體積，且溫度為-15℃至-25℃的乙醇及0.12-0.14倍體積的氯仿，產(chǎn)生穩(wěn)定的沉淀后，取上清液；然后，將上清液加熱到60-80℃，靜置15-25分鐘，除去不溶物，收集上清液，重復(fù)2-3次；c、在b步制得的上清液中，加入2-3倍體積且溫度為-10℃至-20℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；d、將c步的超氧化物歧化酶沉淀加去離子水溶解后，動(dòng)態(tài)透析得到透析液，將透析液加到已用PH7.6的2.5mmol/L磷酸緩沖液平衡好的色譜柱上吸附，并用PH7.6的2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，將洗脫液超濾即得超氧化物歧化酶；e、將d步的超氧化物歧化酶加入去離子水溶解后，將溫度降到4℃-10℃，再加入右旋糖酐混勻，在4℃-10℃溫度下，靜置40-60小時(shí)，制得修飾后的超氧化物歧化酶；f、將e步的超氧化物歧化酶，用75-85％的食用酒精滅菌24-28小時(shí)，再冷凍干燥、密封后即制得成品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超氧化物歧化酶提取修飾方法，其步驟是取動(dòng)物血紅細(xì)胞，離心洗浮、溶血后；再用－15℃至－25℃的乙醇及氯仿沉淀去除血紅蛋白，并加熱除去熱變性蛋白后，再用溫度為－10℃至－20℃的丙酮沉淀收集超氧化物歧化酶；然后進(jìn)行透析、吸附、洗脫、超濾即得超氧化物歧化酶；最后將超氧化物歧化酶用右旋糖酐進(jìn)行化學(xué)修飾。它提取出的超氧化物歧化酶純度高、活力強(qiáng)；酶活力的穩(wěn)定性大大增強(qiáng)，可在45℃條件存放5個(gè)月酶活力不降低，常溫條件下存放4年酶不失活。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1814754SQ200510021328
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者周興和, 周開洪 申請(qǐng)人:周興和, 周開洪