專利名稱：一種鑒定結(jié)核分支桿菌菌種的多重pcr的引物設(shè)計(jì)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種一次性擴(kuò)增多個(gè)細(xì)菌的基因片段，從而鑒定結(jié)核分支桿菌菌種的多重PCR的引物設(shè)計(jì)方法。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)90年代以來，隨著分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得的飛速發(fā)展，研究者也將分子生物學(xué)技術(shù)引入了結(jié)核病研究范圍。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種以核酸生物化學(xué)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)，是生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)最有價(jià)值的技術(shù)之一。自1989年引入結(jié)核病的診斷以來，立即成為結(jié)核病細(xì)菌診斷領(lǐng)域中備受關(guān)注的焦點(diǎn)。經(jīng)過多年的科學(xué)研究和臨床檢驗(yàn)，使這一方法不斷完善，其反應(yīng)靈敏、快速、特異的特性在多數(shù)報(bào)告中得到驗(yàn)證。
該項(xiàng)目以臨床上常見的4種結(jié)核分支桿菌菌種(牛型、人型、鳥型、鼠型)為研究對(duì)象，選擇各自不同類型結(jié)核桿菌的基因序列而設(shè)計(jì)特異性引物，在同一體系同時(shí)檢測多種細(xì)菌，建立一種全新的多重PCR檢測結(jié)核桿菌菌種，用于結(jié)核桿菌的快速診斷、分型。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)的應(yīng)用，開辟了分類鑒定的新途徑。目前基因鑒定技術(shù)具有快速、簡便、分辨率高的特點(diǎn)，并可進(jìn)行多相分類鑒定，能按照種系進(jìn)化的關(guān)系確定精確的位置和定種，使分類鑒定方法更客觀合理。
多重PCR即是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣產(chǎn)生不同特異性靶區(qū)域片段，經(jīng)凝膠電泳觀察各特異擴(kuò)增片段，用于鑒定結(jié)核分枝桿菌至屬種的水平。Thierry等在《Research inMicrobiology》1995年第146期中發(fā)表的《Mycobacteriumtuberculosis strains unidentified using the IS6110 probe canbe detected by oligonucleotides derived from the Mt308sequence》文章中設(shè)計(jì)了擴(kuò)增IS6110序列片段(325bp)及65kD蛋白基因片段(383bp)并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，取得了較好的結(jié)果。Liebana等在《Journal of Clinical Microbiology》1996年34期中發(fā)表的《Assessment of genetic markers for speciesdifferentiation within the Mycobacterium tuberculosiscomplex》文章報(bào)道了擴(kuò)增16srDNA(1030bp)和MAB70的372bp基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳均可快速鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。Ikonomopoulos JA等在《Moden Pathology》.1999年12期中發(fā)表的《Multiplex polymerase chain reaction for thedetection of mycobacterial DNA in cases of tuberculosis andsarcoidosis》文章則應(yīng)用mpb64(243bp)，IS6110(916bp)及65kD蛋白(383bp)的基因片段，對(duì)300個(gè)臨床標(biāo)本進(jìn)行分析，可以快速檢測結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、慢生長分枝桿菌復(fù)合群。
上述是目前國內(nèi)外利用多重PCR技術(shù)用于結(jié)核桿菌檢測的例子。他們只是簡單的將多重不同的檢測的結(jié)核桿菌基因進(jìn)行混合，在同一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而達(dá)到多重PCR的目的。這些方法存在的問題是(1)需要嚴(yán)格的PCR反應(yīng)條件，例如各種反應(yīng)成分的濃度、反應(yīng)成分之間的比例、PCR擴(kuò)增的溫度、時(shí)間等。(2)由于多種不同的引物存在于同一反應(yīng)管中，導(dǎo)致引物之間的反應(yīng)比較明顯，如引物二聚體的形成等，會(huì)導(dǎo)致很大量的引物的丟失，很容易導(dǎo)致到這種多重PCR反應(yīng)的失敗。(3)引物的選擇將非常的嚴(yán)格，必須保證它們之間不會(huì)形成引物二聚體，這將大大降低多種不同類型結(jié)核分支桿菌一起多重PCR的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于結(jié)核桿菌檢測、效率高、靈敏度高的多重PCR的引物設(shè)計(jì)方法。
本發(fā)明方法的基本思路是選取一對(duì)非細(xì)菌基因組的短DNA片段作為放量擴(kuò)增引物對(duì)YB1和YB2，并在能與細(xì)菌基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端分別加上該引物對(duì)YB1和YB2，從而得到特異性長引物YB1-P1和YB2-P2。
此處，能夠與細(xì)菌基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2亦即是可以與待擴(kuò)增基因座的細(xì)菌基因組結(jié)合的原始引物。由于多重PCR反應(yīng)是同時(shí)對(duì)多個(gè)基因座進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，相對(duì)于不同基因座來說，能夠與該基因座的細(xì)菌基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2是不同的，與之相對(duì)應(yīng)，各個(gè)待擴(kuò)增基因座的特異性長引物YB1-P1和YB2-P2也因P1、P2的不同而不相同。
在進(jìn)行多重PCR反應(yīng)時(shí)，同時(shí)在PCR反應(yīng)體系中加入上述放量擴(kuò)增引物和針對(duì)不同待擴(kuò)增基因座的特異性長引物(當(dāng)然還需加入常規(guī)PCR反應(yīng)所需的耐熱聚合酶和單核苷酸等)。由于各個(gè)待擴(kuò)增基因座的細(xì)菌基因組序列中并不含有放量擴(kuò)增引物YB1、YB2所對(duì)應(yīng)的序列，所以在該反應(yīng)體系進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)時(shí)(經(jīng)歷變性、退火、延伸的一次循環(huán)過程)，引物對(duì)YB1和YB2并不會(huì)與細(xì)菌基因組序列結(jié)合，所擴(kuò)增的DNA片段還是由特異性長引物YB1-P1和YB2-P2中所含的原來的引物對(duì)P1、P2所決定。但是，第一輪反應(yīng)結(jié)束后，在待擴(kuò)增基因座將會(huì)產(chǎn)生同時(shí)具有目的基因片段和非細(xì)菌基因組序列YB1、YB2的擴(kuò)增產(chǎn)物。在PCR反應(yīng)體系進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)(即經(jīng)歷變性、退火、延伸的第二次循環(huán)過程)時(shí)，上述同時(shí)具有目的基因片段和非細(xì)菌基因組序列YB1、YB2的產(chǎn)物被進(jìn)一步擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物仍然是特異性長引物YB1-P1和YB2-P2，反應(yīng)完成后，所得到的產(chǎn)物同時(shí)具有目的基因片段和與引物對(duì)YB1和YB2配對(duì)的非細(xì)菌基因組序列。在本發(fā)明中，我們將上述以特異性長引物作為反應(yīng)引物的第一輪和第二輪PCR反應(yīng)稱之為第一階段的反應(yīng)，即多重PCR過程中第一階段的聚合酶鏈反應(yīng)。換句話說，復(fù)合擴(kuò)增過程中第一階段的聚合酶鏈反應(yīng)包括了上述第一輪和第二輪反應(yīng)。該階段反應(yīng)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)具有目的基因片段和與引物對(duì)YB1和YB2配對(duì)的非細(xì)菌基因組序列，此處將其稱之為多重PCR第一階段的產(chǎn)物。從第三輪PCR反應(yīng)開始，由于對(duì)于各個(gè)基因座已經(jīng)具有上述第一階段的產(chǎn)物，這樣，放量擴(kuò)增引物YB1、YB2就可以作為上述各個(gè)擴(kuò)增基因座的引物，PCR反應(yīng)就能以上述第一階段的產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。與此相類似，在第三輪之后的各輪PCR反應(yīng)中，均能夠以放量擴(kuò)增引物YB1、YB2充當(dāng)各個(gè)擴(kuò)增基因座的引物。在經(jīng)歷多輪(如30輪)PCR循環(huán)反應(yīng)之后，上述第一階段的產(chǎn)物就會(huì)被擴(kuò)增至上百萬倍。在本發(fā)明中，我們將上述以放量擴(kuò)增引物引物作為反應(yīng)引物的PCR反應(yīng)稱之為第二階段的反應(yīng)，即多重PCR過程中第二階段的聚合酶鏈反應(yīng)。需要說明的是，在本發(fā)明的上述設(shè)計(jì)思路中，第一階段和第二階段的反應(yīng)是在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行的，而不是截然地分成兩次反應(yīng)。實(shí)際上，即使是在第三輪及第三輪之后的PCR反應(yīng)中，仍然存在著上述第一階段的反應(yīng)，只是其所占比例極低而已。另外，在進(jìn)行第一階段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)有多對(duì)引物同時(shí)參與反應(yīng)，即相對(duì)于多個(gè)待擴(kuò)增基因座且序列不同的多對(duì)特異性長引物同時(shí)參與反應(yīng)(如前所述，各個(gè)待擴(kuò)增基因座的特異性長引物YB1-P1和YB2-P2并不相同)，引物與引物間的反應(yīng)與競爭在所難免，從而大大降低了PCR擴(kuò)增的效率，這一弊端在前面討論現(xiàn)有技術(shù)時(shí)已經(jīng)提及。但是，就本發(fā)明來說，第一階段的PCR擴(kuò)增的目的并不是希望獲得大量的擴(kuò)增片段，而僅僅是使同時(shí)帶有目的基因片段和與YB1、YB2配對(duì)的非細(xì)菌基因組序列的產(chǎn)物(第一階段的產(chǎn)物)產(chǎn)生即可，因此上述弊端對(duì)整個(gè)多重PCR反應(yīng)過程產(chǎn)生的影響是極其微弱的。而在第一階段的PCR擴(kuò)增之后，需要擴(kuò)增的各個(gè)目的基因片段的5′端都帶有與YB1、YB2配對(duì)的非細(xì)菌基因組序列，所以加入一對(duì)放量擴(kuò)增引物(YB1、YB2)之后，就可以對(duì)多個(gè)基因座同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。由于在此后進(jìn)行的第二階段擴(kuò)增中，參與反應(yīng)的引物只有一對(duì)，即放量擴(kuò)增引物對(duì)YB1、YB2，不存在引物間的競爭與反應(yīng)，也無需調(diào)整引物間的濃度，從而大大提高了各基因座的擴(kuò)增效率。因此可以說，第一階段的PCR反應(yīng)是僅需擴(kuò)增出少量模板，而第二階段的擴(kuò)增是高效率擴(kuò)增所有基因座。就其實(shí)質(zhì)而言，在第二階段的PCR反應(yīng)中，是把現(xiàn)有復(fù)合擴(kuò)增方法中的多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因座，轉(zhuǎn)變?yōu)橐粚?duì)引物(YB1、YB2)同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因座；同時(shí)，相對(duì)于被擴(kuò)增的各個(gè)特異性DNA片段來說，YB1、YB2并非是特異引物，因此，上述過程還由現(xiàn)有復(fù)合擴(kuò)增方法中的由多對(duì)特異引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)特異性基因片段，轉(zhuǎn)變成了由一對(duì)非特異引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)特異性基因片段。
在本發(fā)明中，上述放量擴(kuò)增引物YB1、YB2的選擇是極為關(guān)鍵的，其設(shè)計(jì)需要考慮以下三個(gè)要素①、它必須是非細(xì)菌基因組序列，即它的序列不會(huì)與細(xì)菌基因組序列相同；②、選取適當(dāng)?shù)囊镩L度，18～24個(gè)堿基構(gòu)成的寡核苷酸鏈?zhǔn)潜容^優(yōu)化的引物長度；③、選取引物中堿基GC的含量和引物的退火溫度Tm。
本發(fā)明在設(shè)計(jì)引物的Tm值時(shí)選擇的溫度是55℃，因?yàn)樵谠摐囟认拢嘀豍CR中絕大多數(shù)的PCR反應(yīng)都能進(jìn)行，同時(shí)此溫度將會(huì)使首次PCR反應(yīng)后出現(xiàn)大量的非特異的雜帶，我們就必須通過降低特異性長引物的濃度來減少雜帶。降低長引物濃度后，各引物之間的相互作用降低，非特異性的產(chǎn)物減少，與此同時(shí)，我們所需的特異性的產(chǎn)物也降低，但是這并不會(huì)影響整個(gè)擴(kuò)增效率。前已述及，前兩輪PCR反應(yīng)僅僅是上述復(fù)合擴(kuò)增過程的開端，該輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物并不要求有較大的量，只需產(chǎn)生少量同時(shí)具有非細(xì)菌基因組序列和目的基因的DNA片段，即生成少量用于第二階段的PCR反應(yīng)的模板，就能通過其后的PCR反應(yīng)對(duì)該模板進(jìn)行放量擴(kuò)增。在第一階段的PCR反應(yīng)之后，參與反應(yīng)的引物就不再是特異性長引物對(duì)(YB1-P1、YB2-P2)，而是放量擴(kuò)增引物對(duì)(YB1、YB2)。
但是，并不是簡單地滿足上述三個(gè)要素的引物對(duì)就能夠充當(dāng)本發(fā)明中所說的放量擴(kuò)增引物對(duì)YB1、YB2。雖然從理論上講，該引物對(duì)YB1、YB2可以按一定的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)并得出，但在實(shí)踐中可以發(fā)現(xiàn)，依據(jù)引物設(shè)計(jì)原理所設(shè)計(jì)出的引物能夠?qū)嶋H應(yīng)用且能取得較佳效果的并不多。也就是說，真正能夠?qū)嶋H應(yīng)用的“引物對(duì)”必須經(jīng)過大量的、艱苦的試驗(yàn)才能得到，這是一個(gè)對(duì)引物的優(yōu)選過程。
例如，基于上述三個(gè)要素的限制，我們?cè)?jīng)設(shè)計(jì)出了如下7對(duì)引物(YB3-YB16)
YB3(5′-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3′)YB4(5′-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3′)]]>YB5(5′-GGTCTATCACCCTATTAACCAC-3′)YB6(5′-CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA-3′)]]>YB7(5′-GGTGTTGATGATGACATGGCG-3′)YB8(5′-GTACCCTCTGCAGCATGAGAGTAG-3′)]]>YB9(5′-TGGAGAAATCTGGCACCAC-3′)YB10(5′-GAGGCGTACAGGGATAGCAC-3′)]]>YB11(5′-TTGTCAACTTCAGATACCACTGGAG-3′)YB12(5′-CAAGGCAGATTTAACCACAGGTG-3′)]]>YB13(5′-AGGGAAGAGGAGAGAGAAAGAGC-3′)YB14(5′-CGGCAGTTAGTAGACTATCCAGG-3′)]]>YB15(5′-GATTGCTCAACAACCATG-3′)YB16(5′-TTTCACTCTAGACCAAGCTTTG-3′)]]>通過檢索細(xì)菌基因數(shù)據(jù)庫，在細(xì)菌基因組中并不存在與上述引物YB3～YB16相對(duì)應(yīng)的序列，從而確保了這些引物不與細(xì)菌基因組序列發(fā)生結(jié)合。
但是，在其后的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述7對(duì)引物并不能夠成功地進(jìn)行第二階段的放量擴(kuò)增。
另外，與上述例子相類似，在形成本發(fā)明技術(shù)方案的過程中，我們還依據(jù)待擴(kuò)增對(duì)象的特性，對(duì)滿足上述三個(gè)要素的大量引物對(duì)進(jìn)行了篩分、研究和實(shí)驗(yàn)，以期找到能夠?qū)嶋H應(yīng)用且能取得較佳效果的“引物對(duì)”。
正是通過上述大量的篩分、研究和實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明方法優(yōu)選出了引物對(duì)YB1、YB2YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′通過檢索細(xì)菌基因數(shù)據(jù)庫，在細(xì)菌基因組中并不存在與上述引物YB1、YB2相對(duì)應(yīng)的序列，從而確保了上述引物不與細(xì)菌基因組序列發(fā)生結(jié)合。同時(shí)，更為重要的是實(shí)驗(yàn)研究表明，引物對(duì)(YB1，YB2)能夠成功地進(jìn)行第二階段的放量擴(kuò)增，從而構(gòu)成了本發(fā)明所說的放量擴(kuò)增引物。
將上述放量擴(kuò)增引物加在能與細(xì)菌基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端，就得到特異性長引物YB1-P1和YB2-P2。
綜上所述，本發(fā)明的鑒定結(jié)核分支桿菌菌種的多重PCR的引物設(shè)計(jì)方法是a、分別在能夠與細(xì)菌基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非細(xì)菌的基因組序列YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′，從而得到特異性長引物YB1-P1和YB2-P2，以此作為復(fù)合擴(kuò)增過程中第一階段聚合酶鏈反應(yīng)的引物對(duì)，即特異性長引物對(duì)；b、直接以非細(xì)菌的基因組序列YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′作為復(fù)合擴(kuò)增第二階段聚合酶鏈反應(yīng)的引物對(duì)，即放量擴(kuò)增引物對(duì)。
與前述現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明對(duì)多重PCR反應(yīng)的引物進(jìn)行了設(shè)計(jì)，從而能夠高效率地大量擴(kuò)增目的基因片段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重現(xiàn)性極高，同時(shí)，無需在實(shí)驗(yàn)過程中繁瑣地調(diào)整各對(duì)引物的濃度，簡化了整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。另外，采用本發(fā)明方法設(shè)計(jì)出的引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)之后，可以采用硝酸銀染色方式檢測結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的成本要求不高，因此本發(fā)明的方法更具優(yōu)點(diǎn)有中國特色，符合當(dāng)前中國大多數(shù)分子醫(yī)院細(xì)菌檢驗(yàn)的需要。
具體實(shí)施例方式
在本實(shí)施例中，所設(shè)計(jì)的引物用于在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)四個(gè)基因hsp65基因、32-KDa蛋白基因、IS6110基因和mtp40基因進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。
所設(shè)計(jì)的放量擴(kuò)增引物為YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′與上述放量擴(kuò)增引物相對(duì)應(yīng)，各基因座所設(shè)計(jì)的特異性長引物YB1-P1、YB2-P2為hsp65基因YB1-P15′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′YB2-P25′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′32-KDa蛋白基因YB1-P15′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT CGGCAACGCGCCGTCGGTGG-3′YB2-P25′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CCCCCCACGGCACCGCCGGG-3′IS6110基因YB1-P15′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT CGGAGACGGTGCGTAAGTGG-3′YB2-P25′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT GATGGACCGCCAGGGCTTGC-3′mtp40基因YB1-P15′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT TTCCTGACCAGCGAGCTGCCG-3′YB2-P25′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CCCCAGTACTCCCAGCTGTGC-3′需要說明的是，細(xì)菌基因組序列特異性結(jié)合的引物P1、P2分別為hsp65基因P15′-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′P25′-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′32-KDa蛋白基因P15′-CGGCAACGCGCCGTCGGTGG-3′P25′-CCCCCCACGGCACCGCCGGG-3′IS6110基因P15′-CGGAGACGGTGCGTAAGTGG-3′P25′-GATGGACCGCCAGGGCTTGC-3′
mtp40基因P15′-TTCCTGACCAGCGAGCTGCCG-3′P25′-CCCCAGTACTCCCAGCTGTGC-3′為進(jìn)一步說明本實(shí)施例中所設(shè)計(jì)引物的使用方法和使用效果，下面繼續(xù)說明本實(shí)施例中所設(shè)計(jì)引物用于鑒定結(jié)核分支桿菌菌種的多重PCR反應(yīng)時(shí)的具體過程。
多重PCR反應(yīng)在PE-9600擴(kuò)增儀中進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系中的成份主要有模板DNA(細(xì)菌基因組序列)、特異性長引物對(duì)、放量擴(kuò)增引物對(duì)、耐熱DNA聚合酶、MgCl2、脫氧核苷三磷酸dNTP、BSA(小牛血清蛋白)、1×Buffer(緩沖液)和雙蒸水DDH2O。其中，DNA耐熱聚合酶、Mgl2和10×Buffer(緩沖液)直接由市售的PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家為華美公司，中國，品名為耐熱TaqDNA聚合酶)提供。
PCR反應(yīng)體系中的各成份的濃度如下表

擴(kuò)增過程如下a、第一輪及第二輪PCR反應(yīng)，即第一階段擴(kuò)增(少量擴(kuò)增)，發(fā)生反應(yīng)的引物是長引物。
①、變性加熱至94℃，使雙鏈DNA解開；②、退火降溫至55℃，在此溫度下，長引物與模板DNA相結(jié)合；③、延伸升溫至72℃，此溫度是DNA聚合酶反應(yīng)的最適合溫度，聚合酶在Mgcl2等作用下，在長引物的5’端延著模板的5’→3’方向加入dNTP。
經(jīng)第一輪及第二輪PCR反應(yīng)之后，得到同時(shí)帶有目的基因片段和與YB1、YB2配對(duì)的非細(xì)菌基因組序列的產(chǎn)物(第一階段的產(chǎn)物)。
b、第三輪及其之后的PCR反應(yīng)，即第二階段擴(kuò)增，起反應(yīng)的引物是放量擴(kuò)增引物。變性、退火和延伸的PCR反應(yīng)機(jī)理與前幾輪擴(kuò)增相似，但在退火過程中，是以放量擴(kuò)增引物與模板相結(jié)合，且該模板的5’端帶有與YB1、YB2配對(duì)的非細(xì)菌基因組序列；同時(shí)，在延伸過程中，是在放量擴(kuò)增引物的5’端延著上述模板的5’→3’方向加入dNTP。整個(gè)復(fù)合擴(kuò)增共循環(huán)36輪，循環(huán)參數(shù)如下預(yù)變性94℃3分鐘變性94℃ 50秒復(fù)性55℃ 50秒延伸72℃ 50秒循環(huán)次數(shù) 36延伸72℃ 10分鐘另外，鑒于擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小、片段長短不同，特別地利用電泳檢測法對(duì)其進(jìn)行分離檢測，以便檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。進(jìn)行分離檢測時(shí)，先將擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液以一定的比例混勻，加入電泳槽中的聚丙烯酰胺凝膠孔中，在其兩端加以電壓進(jìn)行電泳。由于各擴(kuò)增產(chǎn)物的分子大小不同，在相同電場力的作用下，其在單位時(shí)間內(nèi)在相同的介質(zhì)中所運(yùn)行的距離也不等。因此，在電泳儀中處理一段時(shí)間之后，各擴(kuò)增產(chǎn)物的差距逐漸拉開，此后取出凝膠，對(duì)其進(jìn)行染色(本例采用銀染法)，最后即能直觀地看到擴(kuò)增結(jié)果。
所采用的電泳檢測原料、設(shè)備及條件如下聚丙烯酰胺凝膠成份30％聚丙烯酰胺(PAG)溶液9.5ml
5×TBE溶液7mlDDH2O 18.5ml10％過硫酸銨(PA) 300μlTEMED 30μl電泳槽DYY-III電泳槽(北京六一儀器廠)電泳儀pharmacia1000型多功能電泳儀電泳條件1.上樣量樣本3μl 凝膠載樣緩沖液2μl電極緩沖液1×TBE溶液2.采用恒流方式電泳 電流80mA 時(shí)間1小時(shí)30分染色過程如下采用銀染法1、10％乙醇固定10分鐘2、DD H2O洗2次3、1％硝酸固定3分鐘4、DD H2O洗2次5、1％硝酸銀染色20分鐘6、DD H2O洗3次7、3％Na2CO3，甲醛溶液顯色8、DD H2O洗停止顯色采用本實(shí)施例設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行多基因座擴(kuò)增所得結(jié)果同采用原來的特異性引物(即P1、P2)進(jìn)行多基因座擴(kuò)增的片段大小比較如下hsp65基因用原來特異性引物擴(kuò)增的片段大小為443bp用實(shí)施例引物復(fù)合擴(kuò)增后的片段大小為485bp32-KDa蛋白基因用原來特異性引物擴(kuò)增的片段大小為396bp用實(shí)施例引物復(fù)合擴(kuò)增后的片段大小為438bpIS6110基因用原來特異性引物擴(kuò)增的片段大小為986bp用實(shí)施例引物復(fù)合擴(kuò)增后的片段大小為1028bp
Mtp40基因座用原來特異性引物擴(kuò)增的片段大小為506bp用實(shí)施例引物復(fù)合擴(kuò)增后的片段大小為548bp經(jīng)電泳和染色處理后可以看到，采用本實(shí)施例設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行多基因座擴(kuò)增后，其擴(kuò)增效率高，擴(kuò)增產(chǎn)物生成量大，凝膠經(jīng)染色后譜帶清晰易辨；同時(shí)，所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過測序儀測序后，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列與目的DNA片段序列一致。而采用原來的特異性引物(P1、P2)進(jìn)行多基因座擴(kuò)增時(shí)，由于受到引物與引物間的反應(yīng)與競爭的影響，其擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量極少，凝膠經(jīng)染色后譜帶完全無法辨認(rèn)，擴(kuò)增效果很差。
利用我們的引物設(shè)計(jì)方法和全新的結(jié)核分支桿菌菌種的多重PCR鑒定方法，我們成功的對(duì)100多個(gè)不同種類(人型，牛型，鳥型)的臨床樣本進(jìn)行了檢測，對(duì)照正常的樣本和標(biāo)準(zhǔn)的分型樣本，證實(shí)利用我們的方法能夠成功的進(jìn)行分型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重現(xiàn)性極高。
本發(fā)明所涉及的基因組序列表<210>1<211>443<212>DNA<213>細(xì)菌(Mycobacterium sapiens)<220>
<221>
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<400>1tcaccaacga tggtgtgtcc atcgccaagg agatcgagct ggaggacccgtacgagaaga 60tcggcgctga gctggtcaag gaagttgcca agaagactga cgacgtcgcgggtgacggca 120ctactaccgc caccgtgctt gcccaggctc tggtcaagga aggtctgcgtaacgtcgctg 180ccggcgctaa cccgctcggc ctgaagcgcg gcatcgagaa ggccgtggaggccgtcacca 240
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<400>2cggcaacgcg ccgtcggtgg ttcccaacac cacgttaggg atgcactgcggcagcttcgg 60cagcgctccc agcaacgggt ggctcaagtt gggtctggtc gaattcggtggagtcgcaaa 120gttgaacgct gaggtcatgt cgccaaccac gccgtcgcgc caggcggtcatgttgggaac 180cggcacgccg aaccgggcgc gaatcaactt caattgcgag gtgtggtcgaacgtgtcgga 240gaccatcagc gggccgcggc tgtacggcga aatgacaatg cagggaacgcgaaaacccag 300accgagcgga ccacgaatgc caccggaccc gggtactgcg tcgatgttgggcaccgtgac 360gaattcgccg ggtgtcccgg gcggtgccgt gggggg420<210>3<211>986
<212>DNA<213>細(xì)菌(Mycobacterium sapiens)<220>
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<400>3gatggaccgc cagggcttgc cgggtttgat cagctcggtc ttgtataggccgttgatcgt 60ctcggctagt gcattgtcat aggagcttcc gaccgctccg accgacggttggatgcctgc 120ctcggcgagc cgctcgctga accggatcga tgtgtactga gatcccctatccgtatggtg 180gataacgtct ttcaggtcga gtacgccttc ttgttggcgg gtccagatggct tgctcgat 240cgcgtcgagg accatggagg tggccatcgt ggaagcgacc cgccagcccaggaatcctgc 300gagcgtaggc gtcggtgaca aaggccacgt aggcgaaccc tgcccaggtcgacacatagg 360
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<221>repeat_region<222>(87)...(134)<400>4ttcctgacca gcgagctgcc gtcgtacctg gcctccaaca agggtgtgaagcgcaccggc 60aacgccgcag tcggcatctc gatgtccgga tcctcggcga tgatcctggccgtcaaccat 120cccgaccaat tcatctatgc cggatcgctc tcggccctgc tcgacccgtcccagggcatg 180
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權(quán)利要求
1.一種鑒定結(jié)核分支桿菌菌種的多重PCR的引物設(shè)計(jì)方法，其特征是按以下方式進(jìn)行a、分別在能夠與細(xì)菌基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5’端加上一段非細(xì)菌的基因組序列YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′，從而得到特異性長引物YB1-P1和YB2-P2，以此作為復(fù)合擴(kuò)增過程中第一階段聚合酶鏈反應(yīng)的引物對(duì)，即特異性長引物對(duì)；b、直接以非細(xì)菌的基因組序列YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′作為復(fù)合擴(kuò)增第二階段聚合酶鏈反應(yīng)的引物對(duì)，即放量擴(kuò)增引物對(duì)。
全文摘要
一種鑒定結(jié)核分支桿菌菌種的多重PCR的引物設(shè)計(jì)方法，其特征是按以下方式進(jìn)行a.分別在能夠與細(xì)菌基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5’端加上一段非細(xì)菌的基因組序列，從而得到特異性長引物YB1－P1和YB2－P2，以此作為復(fù)合擴(kuò)增過程中第一階段聚合酶鏈反應(yīng)的引物對(duì)，即特異性長引物對(duì)；b.直接以非細(xì)菌的基因組序列作為復(fù)合擴(kuò)增第二階段聚合酶鏈反應(yīng)的引物對(duì)，即放量擴(kuò)增引物對(duì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1834258SQ200510022138
公開日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者范紅, 應(yīng)斌武, 王蘭蘭, 文富強(qiáng) 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院