專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低熱原葡激酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程制藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種葡激酶(Staphylokinase，SAK)的制備方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，藥物中熱原的含量直接影響藥物使用的安全性，而基因工程藥物、微生物來(lái)源藥物以及其它生化藥物由于其來(lái)源的特殊性，其中的熱原去除和控制一直是其生產(chǎn)和使用中的關(guān)鍵問(wèn)題。主要的熱原物質(zhì)內(nèi)毒素在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿下都頗穩(wěn)定，傳統(tǒng)的加熱、蒸餾、過(guò)濾、反相滲透、活性碳粉、各種柱層析方法只能去除或滅活部分內(nèi)毒素。多數(shù)方法都很難將內(nèi)毒素一次性徹底去除，甚至經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟后，仍達(dá)不到臨床要求。而且由于內(nèi)毒素的性質(zhì)極不均一，很難找到一種針對(duì)性的去除熱原的方法(陳昕 下游層析工藝中熱原的去除 中國(guó)生物工程雜志2002年第4期100-104)。目前基因工程藥物生產(chǎn)中熱原去除的主要原則是在目標(biāo)產(chǎn)物純化過(guò)程中盡可能將內(nèi)毒素除去，盡量不添加額外的除熱原步驟和化學(xué)制劑。
葡激酶是金葡菌溶源性噬菌體合成的一種胞外蛋白質(zhì)(de Waart.J.，K.C.Winkler and C.Grootsen Nature 1962，195407～408 Winkler K.C.，deWaart.J.，and C.Grootsen J.Gen.Microbiol.1965，39321～333 Kondo.I.，Kiyotaka F.，Infection and Immunity 1977，18266～272)。由于金葡菌合成和分泌葡激酶水平低、純化困難及早期在動(dòng)物模型狗溶栓試驗(yàn)中發(fā)生大出血現(xiàn)象等原因，使得葡激酶的臨床使用受到限制。迫切需要符合臨床用藥安全、可控的低熱原葡激酶。
目前公開(kāi)的葡激酶生產(chǎn)制備的方法主要有一、國(guó)外文獻(xiàn)中報(bào)道的方法1、采用CM-cellulose柱層析方法氯化鈉連續(xù)梯度洗脫一步純化(Sako TOverproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization.FEBS.1985，149(3)557-63)，SDS-PAGE純度在90％左右，內(nèi)毒素含量未報(bào)道。
2、采用離子交換層析和分子篩方法純化(Gerlach D，Kraft R，Behnke DPurification and characterization of the bacterial plasminogen activatorstaphylokinase secreted by a recombinant Bacillus subtilis.Zentralb BakteriolMikrobiol Hyg [A].1988，269(3)314-22.)，SDS-PAGE純度在90％左右，內(nèi)毒素含量未報(bào)道。
3、采用SP-Sepharose和Phenyl-Sepharose層析兩步純化方法(Schlott B，Hartmann M，Guhrs KH，etal.Biotechnology 1994，12(2)185-9.)，SDS-PAGE純度在95％以上，內(nèi)毒素小于10Eu/mg。
4、采用金屬離子柱方法一步純化(純化N端缺失10個(gè)氨基酸的葡激酶)(Chattopadhyay D，Stewart JE，DeLucas LJ.Large-scale preparation of the delta10form of staphylokinase by in vitro processing of recombinant staphylokinase withpurified human plasminogen.Appl Biochem Biotechnol.1998，69(3)147-56.)。
二、國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的主要純化方法1、CN1096325A，菌體破菌用S-Sepharose離子交換，再結(jié)合分子篩方法純化SDS-PAGE純度為90～99％。
2、CN1307129A，主要使用了兩步柱層析(SP-Sepharose F.F，和Phenyl-Sepharose F.F)純化，未報(bào)道純度及內(nèi)毒素含量。
3、CN1394952A，菌體破菌后用50KD超濾膜除雜蛋白，加入NaCL，直接在Phenyl-Sepharose H.P疏水層析柱上經(jīng)梯度純化。所純化的葡激酶為N-端缺失10個(gè)氨基酸的衍生物，其純度可達(dá)95％以上(電泳純)。
4、CN1511952A，菌體破菌用100KD超濾膜除雜蛋白，濾出液上pH8.0PB直接在Q-Sepharose F.F柱上經(jīng)0.25M NaCL洗脫純化，所純化的葡激酶為N-端缺失15個(gè)氨基酸的衍生物。其電泳純度和HPLC純度均可達(dá)98％以上5、CN1446912A，使用了陰離子交換層析(Q-Sepharose F.F)穿濾、陽(yáng)離子交換層析(SP-Sepharose F.F)、凝膠過(guò)濾層析(Sephacryl S-200)三步連用，純化重組葡激酶，結(jié)果為最終洗脫液電泳檢測(cè)無(wú)雜條帶。
以上的純化方法僅僅在于提高葡激酶的純度，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，針對(duì)基因工程藥物、微生物來(lái)源藥物以及其它生化藥物，尤其針對(duì)葡激酶，同時(shí)達(dá)到高純度、低熱源，目前尚無(wú)合適的方法報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種葡激酶(Staphylokinase，SAK)。該葡激酶的內(nèi)毒素含量小于3Eu/mgSAK(“Eu/mgSAK”表示每mg的SAK中的內(nèi)毒素的含量)。
進(jìn)一步的，該葡激酶的內(nèi)毒素含量等于或小于1Eu/mgSAK。
更進(jìn)一步的，該葡激酶的HPLC純度等于或大于90％。
第二個(gè)目的是提供一種制備上述葡激酶的方法。該方法包括以下步驟a、將含葡激酶的原料破碎離心，取上清液；b、將步驟a上清液用DEAE凝膠柱穿濾，收集濾液，除鹽，濃縮；c、將步驟b濃縮液過(guò)CM凝膠柱，收集含葡激酶樣品峰的洗脫液，濃縮；d、將步驟c濃縮液用Q凝膠柱穿濾，收集濾液，濃縮、干燥，即得。
進(jìn)一步的，上述的DEAE凝膠柱為DEAE-Sepharose F.F柱、CM凝膠柱為CM-Sepharose F.F柱、Q凝膠柱為Q-Sepharose F.F柱。
更進(jìn)一步的，上述的各種凝膠柱中的層析介質(zhì)的粒徑為50～150μm。
優(yōu)選的，上述的各種凝膠柱中的層析介質(zhì)的粒徑為70～120μm。
更進(jìn)一步的，上述方法包括以下步驟a、將原料破碎離心后的上清液超濾除鹽，將濾液轉(zhuǎn)換介質(zhì)為磷酸緩沖液，濃縮；b、將步驟a濃縮液用DEAE-Sepharose F.F柱穿濾，流動(dòng)相為磷酸緩沖液，將濾液濃縮；c、將步驟b濃縮液轉(zhuǎn)換介質(zhì)為NaAc-HAc緩沖液，過(guò)CM-Sepharose F.F柱，再以NaAc-HAc緩沖液洗脫，收集樣品峰所在的洗脫液后濃縮；d、將步驟c濾液轉(zhuǎn)換介質(zhì)為含NaCL的磷酸緩沖液，用Q-Sepharose F.F穿濾，將濾液濃縮、干燥，即得；上述各步驟中流動(dòng)相的流速為5～35ml/min。
更進(jìn)一步的，上述方法中a步驟中所述的磷酸緩沖液為pH8.0的8～12mM磷酸緩沖液；b步驟中所述的磷酸緩沖液為pH8.0的8～12mM磷酸緩沖液；c步驟中所述的NaAc-HAc緩沖液為18～12mM的NaAc-HAc緩沖液，pH5.0～6.0；
d步驟中所述的含NaCL的磷酸緩沖液為含0.10～0.35mol/L NaCL的20mM磷酸緩沖液，pH7.0；上述步驟中流動(dòng)相過(guò)凝膠柱時(shí)的流速為5～30ml/min。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種治療急性心肌梗死或血栓性疾病的藥物組合物，它是由上述的葡激酶添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的制劑。
進(jìn)一步的，上述的藥物制劑的劑型為注射制劑或口服制劑。
本發(fā)明中方法中用于制備葡激酶的原料是各種常見(jiàn)的能表達(dá)葡激酶的工程菌或能分泌表達(dá)葡激酶的野生型菌株，如抗生素檢定用金葡球菌。本發(fā)明低熱原葡激酶是重組葡激酶、天然葡激酶或其突變體。本發(fā)明中超濾步驟可以選用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜。
本發(fā)明方法中所使用的層析柱均為在市場(chǎng)上銷(xiāo)售的常規(guī)層析柱，使用的各種層析柱填料也是蛋白質(zhì)純化制備領(lǐng)域中常用的填料，均按常規(guī)方法裝柱或購(gòu)買(mǎi)預(yù)裝柱。在本發(fā)明方法中自DEAE-Sepharose F.F穿濾步驟后所使用的其它溶液均為無(wú)熱原溶液，所使用的儀器設(shè)備也要經(jīng)過(guò)無(wú)熱原處理和檢驗(yàn)，以確保不會(huì)在制備過(guò)程中產(chǎn)生新的熱原物質(zhì)。本發(fā)明方法緩沖液的流速是常規(guī)流速，可以做適當(dāng)調(diào)整。本方法各步驟持續(xù)的時(shí)間可以根據(jù)層析柱體積，緩沖液流速，上樣量等具體情況按常識(shí)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
本發(fā)明方法步驟b中的DEAE凝膠柱穿濾或步驟d中的Q凝膠柱穿濾中所述的穿濾是指目的蛋白在此步驟中主要存在于穿出的液體中，而在層析介質(zhì)上不能結(jié)合或結(jié)合極少，這時(shí)應(yīng)收集穿出的濾出液作為該步驟的目標(biāo)產(chǎn)物。
本發(fā)明葡激酶與藥學(xué)上中可以接受的相應(yīng)藥用輔料或載體等輔助添加成分組合，并按相應(yīng)的相應(yīng)制藥方法加工，可制成為相應(yīng)的劑型的藥物制劑。例如，與注射藥物中允許使用的適當(dāng)溶劑和/或附加劑配合并按相應(yīng)的工藝操作處理后，即可以制備成相應(yīng)的水針、粉針或凍干制劑等肌肉或靜脈形式的注射制劑藥物。與藥學(xué)上可以被接受的崩解劑、賦形劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、填充劑等常用的輔助添加成份混合后，按相應(yīng)的常規(guī)工藝方法處理，即可制成為片劑、丸劑、膠囊劑或適當(dāng)形式的緩釋劑、控釋劑等固體制劑形式的口服制劑；與常用的增溶劑、乳化劑、潤(rùn)濕劑、起泡或消泡劑等表面活性劑、稀釋劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、矯味劑、增稠劑等混合，按相應(yīng)的常規(guī)工藝方法處理，即可制成為水劑、糖漿等液體制劑形式的口服藥物或口含制劑。
本發(fā)明葡激酶可按下述步驟制備成凍干制劑。按葡激酶蛋白量的1.5～3.0倍加入15％～30％注射用人白蛋白，并用無(wú)熱原0.15M NaCL pH7.020mM磷酸緩沖液定容，配制成5mg/ml的r-Sak蛋白液，用無(wú)熱原0.22μm膜過(guò)濾后即得半成品，檢測(cè)內(nèi)毒素含量符合藥用要求后，在100級(jí)潔凈度下，1ml/瓶分裝，冷凍干燥，包裝即得成品。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明葡激酶熱原低、純度高、活性強(qiáng)，整體品質(zhì)優(yōu)于目前公開(kāi)的產(chǎn)品，并且完全符合《中國(guó)藥典》2005版第三部對(duì)該類(lèi)產(chǎn)品的相關(guān)要求。本發(fā)明方法明確了純化制備葡激酶的合適的凝膠柱種類(lèi)和這些凝膠柱的最佳使用順序，同時(shí)對(duì)使用方法進(jìn)行了優(yōu)化，使用本發(fā)明方法既能高效去除熱原，又能同時(shí)純化產(chǎn)品。該方法步驟簡(jiǎn)便，材料設(shè)備易得，成本低廉，效果可靠，是一種優(yōu)秀的葡激酶制備方法，能夠大規(guī)模應(yīng)用。本發(fā)明葡激酶添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分所制備的治療急性心肌梗死或血栓性疾病的藥物制劑，經(jīng)臨床研究證實(shí)具有良好的溶栓效果，并且沒(méi)有任何與熱原相關(guān)的不良反應(yīng)出現(xiàn)，是一種安全有效的治療急性心肌梗死或血栓性疾病的藥物，具有很好的市場(chǎng)前景。


附圖1為重組葡激酶質(zhì)粒pBV220/Sak構(gòu)建示意圖附圖2為DEAE-Sepharose F.F穿濾收集樣品的電泳圖其中上為上柱樣品，1-6號(hào)為穿透樣品，合并2、3號(hào)收集樣。
附圖3為CM-Sepharose F.F純化樣品的電泳圖其中1，純化樣品；2，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量附圖4為Q-Sepharose F.F穿濾的層析圖。
下面結(jié)合附圖，通過(guò)對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的詳細(xì)描述對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。但這種說(shuō)明不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的技術(shù)思想，均屬于本發(fā)明權(quán)利要求所定義的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 工程菌的制備以能分泌葡激酶的金黃色葡萄球菌全DNA為模板，以引物1、2為作PCR擴(kuò)增引物1(SEQ ID NO.1)5’GGT GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC AA3’；引物2(SEQ ID NO.2)5’GGA GGA TCC TTA TTT CTT TTC TAT AAC AA 3’。
引物1包含EcoR I位點(diǎn)，引物2包含BamH I位點(diǎn)，得到葡激酶基因，該葡激酶基因的DNA序列(5’至3’)見(jiàn)表1表1 葡激酶基因的DNA序列(SEQ ID NO.3)Tcaagttcat tcgacaaagb aaaatataaa 30aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact 90ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta120tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa150cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt180gaatactatg tcgaatggga cttagatgcg210acagcatata aagagtttad agtagttgaa240ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact270tattttgata agaataagaa aaaagaagaa300acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt330tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt360aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag390gttgttatag aaaagaaa 408該DNA序列所編碼的氨基酸序列(N端至C端)見(jiàn)表2表2葡激酶氨基酸序列(SEQ ID NO.4)Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser1 5 10 15Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val20 25 30Glu Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro35 40 45Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val50 55 60Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu65 70 75 80Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Phe Asp Lys Asn Lys85 90 95Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val100 105 110
Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile115 120 125Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys130 135將得到的基因進(jìn)行測(cè)序分析確認(rèn)無(wú)誤后，克隆到pBV220載體上，插入位點(diǎn)為EcoR I-BamH I，構(gòu)建質(zhì)粒pBV220/Sak(構(gòu)建流程如圖1所示)?；蛘呖衫矛F(xiàn)有常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)合成得到如SEQ ID NO.3所示的DNA。
將制備得到的重組載體用常規(guī)方法導(dǎo)入大腸桿菌DH5a以構(gòu)建重組葡激酶以可溶形式存在于菌體內(nèi)的基因工程菌，篩選出組建成功的基因工程菌。經(jīng)穩(wěn)定性測(cè)定和N-末端15個(gè)氨基酸分析測(cè)定正確后，保存r-SAK表達(dá)量不低于25％的工程菌，作為生產(chǎn)用工程菌菌種，并以甘油菌或牛奶凍干菌種形式保存。
將1ml由甘油保存的工程菌種子，接種于400mlLB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中，在250rpm搖床上，30℃下培養(yǎng)至A6002.0左右，再接種到3600mlLB培養(yǎng)基中同前培養(yǎng)至A6003.0左右作為種子液接種于裝有36L的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的B.Braun D50發(fā)酵罐中，控制pH在7.0左右、溶氧在15～75％、溫度30℃培養(yǎng)至A60015.0左右，快速升溫至42℃誘導(dǎo)同前培養(yǎng)3～4小時(shí)。離心(5～15℃、5000rpm)收集細(xì)菌。
實(shí)施例二 葡激酶的制備1、材料和設(shè)備破菌工具勻質(zhì)機(jī)；超濾系統(tǒng)Millipore Pellicon 0.5m2×3，膜截留分子量為5000；SDS-PAGE電泳掃描儀DS-700Bio-Rad；層析柱50×400mm、100×400mm上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；層析介質(zhì)DEAE-Sepharose F.F、CM-Sepharose F.F、Q-Sepharose F.F均為Pharmacia Biotech產(chǎn)品，顆粒直徑均為90μm。
層析檢測(cè)系統(tǒng)紫外檢測(cè)儀(HD-93-1型)上海金達(dá)生化儀器廠(chǎng)。
2、制備過(guò)程取發(fā)酵所得的濕重為1610g工程菌，用10000ml pH8.010mM磷酸緩沖液懸浮菌體，破菌后得上清液9000ml，上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳掃描r-SAK含量為36.9％，蛋白濃度16.60mg/ml，總蛋白量為149400mg，r-SAK含量為55129mg。
將上述上清液用15％(NH4)2SO4沉淀處理后，經(jīng)超濾(5KD)除鹽、轉(zhuǎn)換介質(zhì)為pH8.010mM磷酸緩沖液。濃縮至1500ml，蛋白濃度為86mg/ml(總蛋白量129000mg)。
DEAE-Sepharose F.F穿濾層析柱規(guī)格為100×400mm(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))、DEAE-Sepharose F.F柱高300mm、流動(dòng)相為pH8.0的10mM磷酸緩沖液(流速10ml/min)。收集穿透樣品，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果合并葡激酶樣品，得3000ml溶液，濃度35mg/ml(總蛋白量105000mg)。超濾除鹽濃縮并轉(zhuǎn)換介質(zhì)為20mM的NaAc-HAc緩沖液，pH為5.0。凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1(其中“上”為上柱樣品，1-6號(hào)為穿透樣品，合并2、3號(hào)樣品)。
CM-Sepharose F.F純化層析柱50×400mm(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))、CM-Sepharose F.F柱高200mm、流動(dòng)相pH5.0～6.020mM NaAc-HAc緩沖液(流速20ml/min)。先用含0.15mol/L NaCl流動(dòng)相洗雜蛋白，再用含0.3mol/L NaCl流動(dòng)相洗脫，收集洗脫峰，得2400ml蛋白溶液，濃度為10.1mg/ml，總蛋白量為24240mg。CM樣品超濾濃縮并轉(zhuǎn)換介質(zhì)為含0.15mol/L NaCL pH7.020mM磷酸緩沖液，體積1500ml。結(jié)果見(jiàn)圖2Q-Sepharose F.F穿濾 層析柱為100×400mm(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))、Q-Sepharose F.F柱高250mm、流動(dòng)相含0.15mol/L NaCL pH7.020mM磷酸緩沖液(流速5ml/min)。收集穿透樣品峰(見(jiàn)圖3)。
經(jīng)過(guò)上述步驟得樣品2510ml，是蛋白濃度為8.8mg/ml的原液，其葡激酶純化得率為40.1％(各步純化效果對(duì)比見(jiàn)表3)表3 各步純化效果對(duì)比

純化所得蛋白產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目和結(jié)果見(jiàn)表4表4 產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)或測(cè)定方法均采用《中國(guó)藥典》2005版三部附錄所收錄的同種方法。檢測(cè)結(jié)果表明本實(shí)施例制得的葡激酶均符合相關(guān)要求。
實(shí)施例三 葡激酶的制備1、材料和設(shè)備(同實(shí)施例二)2、制備過(guò)程取濕重為800g的工程菌，用5500ml pH8.010mM磷酸緩沖液懸浮菌體，破菌后得上清液5000ml，上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳掃描r-SAK含量為38.9％，蛋白濃度10.40mg/ml，總蛋白量為52000mg，r-SAK含量為20228mg。
將上述上清液用15％(NH4)2SO4沉淀處理后，經(jīng)超濾(5KD)除鹽、轉(zhuǎn)換介質(zhì)為pH8.010mM磷酸緩沖液。濃縮至1000ml，蛋白濃度為43.4mg/ml(總蛋白量43400mg)。
DEAE-Sepharose F.F穿濾 層析柱100×400mm(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))、DEAE-Sepharose F.F柱高300mm、流動(dòng)相pH8.0 10mM磷酸緩沖液(流速15ml/min)。收集穿透樣品，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果合并葡激酶樣品，得2100ml溶液，濃度16.8mg/ml(總蛋白量35280mg)。超濾除鹽濃縮并轉(zhuǎn)換介質(zhì)為20mM NaAc-HAc緩沖液，pH5.0。
CM-Sepharose F.F純化 柱層析50×400mm(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))、CM-Sepharose F.F柱高200mm、流動(dòng)相為pH5.0～6.020mM NaAc-HAc緩沖液。先用含0.15mol/L NaCl流動(dòng)相洗雜蛋白，再用含0.3mol/L NaCl流動(dòng)相洗脫(流速15ml/min)，收集洗脫峰，得1100ml蛋白溶液，濃度為8.2mg/ml，總蛋白量為9020mg。CM樣品超濾濃縮并轉(zhuǎn)換介質(zhì)為含0.15mol/L NaCL pH7.020mM磷酸緩沖液，體積為700ml。
經(jīng)Q-Sepharose F.F穿濾 層析柱100×400mm(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))、Q-Sepharose F.F介質(zhì)柱高250mm、流動(dòng)相含0.15mol/L NaCL pH7.020mM磷酸緩沖液(流速25ml/min)。得樣品790ml，濃度10.57mg/ml的蛋白原液。
上述步驟持續(xù)的時(shí)間在不同情況下根據(jù)上樣量、緩沖液流速的變化等會(huì)有所變化。本實(shí)施例經(jīng)過(guò)上述步驟后的葡激酶純化得率為41.2％(各步純化效果對(duì)比見(jiàn)表5)表5 各步驟純化效果對(duì)比

純化所得蛋白產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目和結(jié)果見(jiàn)表6。檢測(cè)或測(cè)定方法均采用《中國(guó)藥典》2005版三部附錄所收錄的同種方法。檢測(cè)結(jié)果表明本實(shí)施例制得的葡激酶均符合相關(guān)要求。
表6 產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果


實(shí)施例四 本發(fā)明制備的葡激酶的熱原含量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取上述實(shí)施例二第二步所得產(chǎn)物和最后一步所得產(chǎn)物參照《中國(guó)藥典》三部相關(guān)內(nèi)毒素測(cè)定方法鱟試劑法(0.5Eu/ml)進(jìn)行熱原測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 熱原驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在基因工程蛋白質(zhì)藥物的制備過(guò)程中，每一步都要注意熱原。由表5可見(jiàn)，在經(jīng)過(guò)本發(fā)明方法前兩步的處理之后，葡激酶原液的熱原物質(zhì)含量已經(jīng)很低，多數(shù)的內(nèi)毒素已經(jīng)被去除，但還是不能達(dá)到藥典的內(nèi)毒素控制要求，并且殘余的少量?jī)?nèi)毒素極難去除。在前面步驟的基礎(chǔ)上，最后一步的Q-Sepharose F.F穿濾可以把剩余的內(nèi)毒素去除至很低的水平，使產(chǎn)品熱原達(dá)到要求，是本發(fā)明方法中對(duì)葡激酶熱原量有影響的關(guān)鍵步驟之一。同時(shí)，最后一步同時(shí)也使葡激酶的純度達(dá)到了99％(HPLC純度)以上，滿(mǎn)足了大規(guī)模純化生產(chǎn)的需要。當(dāng)然，這樣的效果的取得是需要和前幾個(gè)步驟進(jìn)行配合才能達(dá)到的。
實(shí)施五 本發(fā)明制備的葡激酶制劑的制備取實(shí)施例三中得到的葡激酶蛋白原液790ml(r-SAK量為8350mg)，按2.0倍的蛋白量加入20％注射用人白蛋白，并用無(wú)熱原0.15M NaCL pH7.020mM磷酸緩沖液定容至1670ml，配制成5mg/ml的r-Sak蛋白液，迅速用無(wú)熱原0.22μm膜過(guò)濾后即得半成品，檢測(cè)內(nèi)毒素含量符合藥用要求后，100級(jí)潔凈度下，1ml/瓶分裝，冷凍干燥(-40℃預(yù)凍2～6小時(shí)后，抽真空，緩慢升溫至-20℃，保持4～8小時(shí)，1小時(shí)內(nèi)快速升溫至0℃，在20～35℃保持2小時(shí)，結(jié)束凍干后，可真空或充氮封口)，即得成品。
采用《中國(guó)藥典》2005版三部附錄所收錄的同種標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢定。檢定結(jié)果(見(jiàn)表8)表明本實(shí)施例制得的葡激酶均符合相關(guān)要求。
表8 制劑質(zhì)量檢定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)例一 本發(fā)明制備的葡激酶制劑的藥效實(shí)驗(yàn)本發(fā)明葡激酶(recombinant staphylokinase，)為一種新型溶栓劑，它通過(guò)與人血漿中纖溶酶原結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物特異性地與血栓表面的纖維蛋白結(jié)合，使纖維蛋白降解，血栓溶解，具有溶栓能力強(qiáng)，纖維蛋白結(jié)合專(zhuān)一性好，纖維蛋白原降解活性低，免疫原性低等特點(diǎn)。
取上述實(shí)施例五所制備的葡激酶制劑進(jìn)行臨床試驗(yàn)，結(jié)果如下。
一、I期臨床試驗(yàn)及結(jié)果經(jīng)衛(wèi)生部藥政局[(96)制申體第36號(hào)文件]批準(zhǔn)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院臨床藥理基地于1999年6月至1999年9月進(jìn)行了本發(fā)明葡激酶制劑I期臨床試驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)果顯示所有健康志愿者對(duì)本發(fā)明葡激酶制劑20mg耐受良好，無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)，無(wú)因不良事件停藥者。本發(fā)明葡激酶制劑人體藥代動(dòng)力學(xué)符合靜脈注射二室開(kāi)放模型。藥物主要分布于血液中，在血管內(nèi)發(fā)揮作用，消除相半衰期在2.5到20mg無(wú)顯差，平均為47.21±10.28min。
二、II期臨床預(yù)試驗(yàn)及結(jié)果經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局[(2000)制申體字第08號(hào)]批準(zhǔn)，2000年8月至2001年1月，在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院和北京大學(xué)第三醫(yī)院進(jìn)行了10例20mg本發(fā)明葡激酶制劑治療急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)患者的II期臨床試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)果顯示90分鐘冠狀動(dòng)脈造影達(dá)心肌梗死溶栓試驗(yàn)(thrombolysisin myocardial ischemia，TIMI)TIMI3級(jí)血流者7例，TIMI2級(jí)血流者2例，TIMI1級(jí)血流者1例。效果良好。
三、II期臨床試驗(yàn)及結(jié)果經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院作為組長(zhǎng)單位，上海第二醫(yī)科大學(xué)瑞金醫(yī)院、北京大學(xué)第三醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)朝陽(yáng)醫(yī)院、沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院、遼寧省人民醫(yī)院、第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)安貞醫(yī)院、上海市第六人民醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)友誼醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院作為參研單位，于2002年1月至2003年10月進(jìn)行了本發(fā)明重組葡激酶的II期臨床試驗(yàn)，本試驗(yàn)為多中心、隨機(jī)平行對(duì)照研究。
1、試驗(yàn)對(duì)象及分組隨機(jī)分為①本發(fā)明葡激酶制劑組，在30分鐘內(nèi)靜脈輸注20mg；在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，由于1例發(fā)生腦出血，本發(fā)明葡激酶制劑組使用劑量由20mg調(diào)整為15mg，其中3mg靜脈推注，12mg在30分鐘內(nèi)靜脈輸注；②重組人組織纖溶酶原激活劑(Recombinant human tissue plasminogenactivator，rt-PA)組，在90分鐘內(nèi)輸注50mg，先靜注8mg沖擊量，余下42mg在90分鐘內(nèi)靜滴完畢；③直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(Percutaneous TransluminalCoronary Angioplasty，PTCA)組。
12個(gè)臨床試驗(yàn)中心共納入本發(fā)明葡激酶制劑組108例、rt-PA組107例，直接PTCA組111例。(其中兩溶栓組由于誤納年齡大于70歲的病例違反方案的納入標(biāo)準(zhǔn)而剔除3例)。有3例本發(fā)明葡激酶制劑劑量20mg(其中1例年齡大于70歲者剔除)。僅對(duì)符合入選標(biāo)準(zhǔn)的治療病例本發(fā)明葡激酶制劑組104例，rt-PA組106例進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。
其中，本發(fā)明葡激酶制劑和rt-PA組病例入選時(shí)年齡均數(shù)及構(gòu)成比、性別、體重均數(shù)、體重指數(shù)、身高、血壓(收縮壓和舒張壓)、脈搏、入院時(shí)心功能(Killip)分級(jí)、高血壓病史、既往心絞痛史、既往心肌梗死史、吸煙史及現(xiàn)在仍吸煙者比例、糖尿病史、胰島素治療史、冠心病家族史、高膽固醇血癥史、CK、MB-CK峰值、癥狀開(kāi)始至到達(dá)醫(yī)院時(shí)間、到達(dá)醫(yī)院至治療的間隔時(shí)間、癥狀開(kāi)始至治療的間隔時(shí)間均無(wú)顯著差別，具有良好的可比性。本發(fā)明葡激酶制劑組99例，rt-PA組101例完成了90分鐘冠狀動(dòng)脈造影。
2、試驗(yàn)結(jié)果A、主要終點(diǎn)(1)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果評(píng)價(jià)本發(fā)明葡激酶制劑組90分鐘TIMI3級(jí)血流為57.58％，rt-PA組為48.51％，P＝0.1929，兩組間無(wú)顯著性差別；本發(fā)明葡激酶制劑組90分鐘通暢率(TIMI2級(jí)和TIMI3級(jí)血流)為77.78％，rt-PA組為63.37％，P＝0.0277，兩組間有顯著性差別，本發(fā)明葡激酶制劑組優(yōu)于rt-PA組。
本發(fā)明葡激酶制劑組90分鐘造影校正TIMI血流幀數(shù)38.89±21.49，rt-PA組為45.52±37.63，P＝0.2665，兩組間無(wú)顯著性差別。
本發(fā)明葡激酶制劑組90分鐘梗死相關(guān)冠狀動(dòng)脈殘余狹窄80.22±19.82％，rt-PA組為82.94±20.49％，P＝0.3412，兩組間無(wú)顯著性差別。
(2)臨床復(fù)合終點(diǎn)一月內(nèi)本發(fā)明葡激酶制劑組死亡9例(8.65％)，對(duì)照組rt-PA死亡6例(5.66％)，P＝0.3997，兩組間無(wú)顯著性差別。
一月內(nèi)非致死性再梗死本發(fā)明葡激酶制劑組3例(2.88％)，對(duì)照組rt-PA 4例(3.77％)，P＝1.000，兩組間無(wú)顯著性差別。
一月內(nèi)心絞痛復(fù)發(fā)本發(fā)明葡激酶制劑組9例(8.65％)，對(duì)照組rt-PA17例(16.04％)，P＝0.1043，兩組間無(wú)顯著性差別。
一月內(nèi)進(jìn)行靶血管重建術(shù)(TVR)本發(fā)明葡激酶制劑組32例(30.77％)，對(duì)照組rt-PA26例(24.53％)，P＝0.3119，兩組間無(wú)顯著性差別。
上述四項(xiàng)的總合(復(fù)合臨床終點(diǎn))本發(fā)明葡激酶制劑組46例(44.23％)，對(duì)照組rt-PA42例(39.62％)，P＝0.5185，兩組間無(wú)顯著性差別。
B、次要終點(diǎn)(1)心力衰謁或肺水腫發(fā)生率本發(fā)明葡激酶制劑組14例(13.46％)，對(duì)照組rt-PA 12例(11.32％)，P＝0.6377兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(2)一月時(shí)左室EF本發(fā)明葡激酶制劑組0.56±0.12，對(duì)照組rt-PA 0.70±0.80，P＝0.1969兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(3)出血本發(fā)明葡激酶制劑組發(fā)生出血30例(28.85％)，對(duì)照組rt-PA 29(27.36％)，P＝0.8105，兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
嚴(yán)重或威脅生命的出血本發(fā)明葡激酶制劑組2例，對(duì)照組rt-PA 4例，包括顱內(nèi)、胃腸道、生殖泌尿道、口咽部、皮膚及導(dǎo)管部位的嚴(yán)重出血。其中顱內(nèi)出血本發(fā)明葡激酶制劑組1例(0.96％)，痊愈出院；對(duì)照組rt-PA 4例(3.77％)，其中有2例因顱內(nèi)出血死亡，2例痊愈出院(1例為可疑顱內(nèi)出血，未經(jīng)CT確診)，P＝0.3691，兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中度出血本發(fā)明葡激酶制劑組4例，對(duì)照組rt-PA 4例；輕度出血本發(fā)明葡激酶制劑組24例，對(duì)照組rt-PA 21例，P＝0.4597，兩組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(4)其它并發(fā)癥心臟破裂、心臟停搏、心房顫動(dòng)、心房撲動(dòng)、持續(xù)性室性心動(dòng)過(guò)速、心室顫動(dòng)、2-30房室傳導(dǎo)阻滯、持續(xù)低血壓、心源性休克、心力衰謁與肺水腫、缺血性腦卒中等并發(fā)癥的發(fā)生率兩組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
C、不良事件(1)死亡事件本發(fā)明葡激酶制劑組死亡9例(8.65％)，其中心臟破裂死亡4例，心源性休克死亡5例；對(duì)照組rt-PA死亡6例(5.66％)，其中心源性休克死亡3例，介入治療并發(fā)癥死亡1例，顱內(nèi)出血死亡2例，P＝0.3997，兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(2)出血本發(fā)明葡激酶制劑組發(fā)生出血30例(28.85％)，對(duì)照組rt-PA 29例(27.36％)，P＝0.8105，兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。嚴(yán)重或威脅生命的出血本發(fā)明葡激酶制劑組2例，對(duì)照組rt-PA 4例，包括顱內(nèi)、胃腸道、生殖泌尿道、口咽部、皮膚及導(dǎo)管部位的嚴(yán)重出血；其中顱內(nèi)出血本發(fā)明葡激酶制劑組1例(0.96％)，痊愈出院；對(duì)照組rt-PA 4例(3.77％)，其中有2例因顱內(nèi)出血死亡，2例痊愈出院(1例為可疑顱內(nèi)出血，未經(jīng)CT確診)，P＝0.3691，兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中度出血本發(fā)明葡激酶制劑組4例，對(duì)照組rt-PA 4例；輕度出血本發(fā)明葡激酶制劑組24例，對(duì)照組rt-PA 21例，P＝0.4597，兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(3)本發(fā)明葡激酶制劑組及rt-PA組均沒(méi)有觀(guān)察到明顯的血液系統(tǒng)和肝、腎功能損害及過(guò)敏、發(fā)熱、寒戰(zhàn)等不良反應(yīng)。沒(méi)有出現(xiàn)任何由內(nèi)毒素等熱原物質(zhì)引起的不良反應(yīng)。
(4)給予本發(fā)明葡激酶制劑20mg者3例中，(其中1例年齡大于70歲者剔除)，腦出血1例，存活，無(wú)死亡。
(5)剔除的3例患者均為70歲以上患者，其中本發(fā)明葡激酶制劑組2例，rt-PA組1例，溶栓后90分鐘冠狀動(dòng)脈造影均為T(mén)IMI3級(jí)血流，無(wú)死亡。
D、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本發(fā)明葡激酶制劑在30分鐘內(nèi)靜脈輸注15mg治療AMI，其用藥后90分鐘血管通暢率77.8％，優(yōu)于對(duì)照藥rt-PA(63.4％，P＝0.0277)；TIMI3級(jí)血流為57.6％，與rt-PA(48.5％)相似，臨床復(fù)合終點(diǎn)兩組無(wú)顯著差別。出血(包括腦出血)發(fā)生率與rt-PA亦無(wú)顯著差別。結(jié)果表明本發(fā)明葡激酶制劑是一安全、有效的治療急性心肌梗死的溶栓藥物。
通過(guò)以上實(shí)例表明，本發(fā)明葡激酶熱原低，各批次內(nèi)毒素含量均＜0.5EU/mg，熱原含量完全符合《中國(guó)藥典》三部對(duì)同類(lèi)產(chǎn)品的要求；純度高，其HPLC純度在99％以上；活性強(qiáng)，效價(jià)高。由本發(fā)明葡激酶添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分所制備的治療急性心肌梗死或血栓性疾病的制劑，在人體實(shí)際臨床應(yīng)用中在表現(xiàn)出很好療效的同時(shí)，也沒(méi)有出現(xiàn)任何由內(nèi)毒素等熱原物質(zhì)引起的不良反應(yīng)，是一種安全有效的治療急性心肌梗死或血栓性疾病的藥物，具有很好的市場(chǎng)前景。
以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的思想作出各種改變及變形，比如選用與本發(fā)明所使用的凝膠柱內(nèi)填料的商品名不同但種類(lèi)相同且指標(biāo)相同或接近的產(chǎn)品，調(diào)節(jié)層析步驟的流速等，只要不脫離本發(fā)明的精神，均屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。
一種低熱原葡激酶及其制備方法.ST25SEQUENCE LISTING<110>成都地奧九泓制藥廠(chǎng)<120>一種低熱原葡激酶及其制備方法<130>050234<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>29<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>引物序列1<400>1ggtgaattca tgtcaagttc attcgacaa 29<210>2<211>29<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>引物序列2<400>2ggaggatcct tatttctttt ctataacaa 29<210>3<211>408<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌<400>3tcaagttcat tcgacaaagb aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta120tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt180gaatactatg tcgaatggga cttagatgcg acagcatata aagagtttad agtagttgaa240ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattttgata agaataagaa aaaagaagaa300acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt360aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaa 408<210>4<211>136<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<400>4Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser1 5 10 15Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val20 25 30Glu Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro35 40 45
一種低熱原葡激酶及其制備方法.ST25Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val50 55 60Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu65 70 75 80Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Phe Asp Lys Asn Lys85 90 95Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val100 105 110Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile115 120 125Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys130 13權(quán)利要求
1.一種葡激酶，其特征在于其內(nèi)毒素含量小于3Eu/mg SAK。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡激酶，其特征在于其內(nèi)毒素含量等于或小于1Eu/mg SAK。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡激酶，其特征在于其HPLC純度等于或大于99％。
4.一種權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述葡激酶的制備方法，其特征在于它包括以下步驟a、將含葡激酶的原料破碎離心，取上清液；b、將步驟a上清液用DEAE凝膠柱穿濾，收集濾液，除鹽，濃縮；c、將步驟b濃縮液過(guò)CM凝膠柱，收集含葡激酶樣品峰的洗脫液，濃縮；d、將步驟c濃縮液用Q凝膠柱穿濾，收集濾液，濃縮、干燥，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的DEAE凝膠柱為DEAE-Sepharose F.F柱；CM凝膠柱為CM-Sepharose F.F柱；Q凝膠柱為Q-Sepharose F.F柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的各種凝膠柱中的凝膠填料的粒徑為50～150μm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的各種凝膠柱中的凝膠填料的粒徑為70～120μm。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于包括以下步驟a、將原料破碎離心后的上清液超濾除鹽，將濾液轉(zhuǎn)換介質(zhì)為磷酸緩沖液，濃縮；b、將步驟a濃縮液用DEAE-Sepharose F.F柱穿濾，流動(dòng)相為磷酸緩沖液，將濾液濃縮；c、將步驟b濃縮液轉(zhuǎn)換介質(zhì)為NaAc-HAc緩沖液，過(guò)CM-Sepharose F.F柱，再以NaAc-HAc緩沖液洗脫，收集樣品峰所在的洗脫液后濃縮；d、將步驟c濃縮液轉(zhuǎn)換介質(zhì)為含NaCL的磷酸緩沖液，用Q-Sepharose F.F穿濾，將濾液濃縮、干燥，即得；上述b、c、d各步驟中流動(dòng)相過(guò)凝膠柱時(shí)的流速為5～40ml/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于a步驟中所述的磷酸緩沖液為pH8.0的8～12mM磷酸緩沖液；b步驟中所述的磷酸緩沖液為pH8.0的8～12mM磷酸緩沖液；c步驟中所述的NaAc-HAc緩沖液為18～12mM的NaAc-HAc緩沖液，pH5.0～6.0；d步驟中所述的含NaCL的磷酸緩沖液為含0.10～0.35mol/L NaCL的20mM磷酸緩沖液，pH7.0；上述步驟中流動(dòng)相過(guò)凝膠柱時(shí)的流速為5～30ml/min。
10.一種治療急性心肌梗死或血栓性疾病的藥物組合物，它是由權(quán)利要求1或2所述的葡激酶添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其特征在于所述的制劑為注射制劑或口服制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域，提供了一種低熱原的葡激酶(Staphylokinase，SAK)及其制備該葡激酶的方法。該葡激酶熱原低、純度高、活性強(qiáng)，完全符合藥用要求。本發(fā)明制備方法包括以下步驟a.將含葡激酶的原料破碎離心，取上清液；b.將步驟a產(chǎn)物用DEAE凝膠柱穿濾，除鹽，濃縮；c.將步驟b產(chǎn)物過(guò)CM凝膠柱，收集樣品峰，濃縮洗脫液并轉(zhuǎn)換介質(zhì)；d.將步驟c產(chǎn)物用Q凝膠柱穿濾后，得葡激酶原液。該方法步驟簡(jiǎn)便，成本低廉，效果可靠，能夠大規(guī)模應(yīng)用。由本發(fā)明葡激酶制備成的制劑經(jīng)研究證實(shí)具有良好的溶栓效果，并且沒(méi)有任何與熱原相關(guān)的不良反應(yīng)出現(xiàn)，安全有效，具有良好的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12N9/50GK1807603SQ20051002249
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月31日
發(fā)明者吳洽慶, 楊衛(wèi)華, 梁波, 黃坤, 石金發(fā), 劉忠榮, 及元喬, 王若竹, 李伯剛 申請(qǐng)人:成都地奧九泓制藥廠(chǎng)