專利名稱:一種超氧化物歧化酶的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及超氧化物歧化酶的生產(chǎn)提取方法,特別是從一種微生物釀酒酵母中提取精制銅/鋅超氧化物歧化酶的提取方法。
背景技術(shù):
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutise)簡(jiǎn)稱SOD,是一種普遍存在于生物體的金屬酶。根據(jù)其結(jié)合的金屬離子主要分為Cu/ZnSOD、Fe-SOD和Mn-SOD,它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)與過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶共同組成抗氧化物酶系,催化超氧陰離子自由基O2--.歧化為H2O2和O2,從而阻止超氧陰離子自由基在需氧生物體內(nèi)的積聚,消除其對(duì)機(jī)體的損傷(如圖1)。
圖1.生物體內(nèi)的抗氧化酶體系CAT過(guò)氧化氫酶 GSH還原型谷胱甘肽GSSG氧化型谷胱甘肽 GSH-PX谷胱甘肽過(guò)氧化物酶由于超氧化物歧化酶所具有的特殊生物學(xué)功能,它與人體健康密切相關(guān),在臨床上可用于治療缺血再灌流綜合癥、氧中毒、自身免疫性疾病,治療和防止老年性白內(nèi)障及一些炎癥。此外,SOD還可用于治療一些皮膚病,如銀屑病、皮炎、射線光致敏皮膚病等;在化妝品應(yīng)用中,超氧化物歧化酶具有祛斑、抗皺、抗炎、防止皮膚衰老的功能;在食品工業(yè)中,超氧化物歧化酶可作為功效因子或食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用,目前已有SOD牛奶、飲料、罐頭、啤酒等多種功能食品面市。
據(jù)專利檢索,現(xiàn)有的超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法分別從動(dòng)物血液、肝臟,藻類,植物種子如大豆,玉米等中提取生產(chǎn),如專利申請(qǐng)?zhí)?3133482.2的專利,公開了玉米超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法,專利申請(qǐng)?zhí)?2150920.4的專利公開了從海藻中提取鐵超氧化物酶的方法,專利申請(qǐng)?zhí)?2147888的專利涉及一種對(duì)豬血超氧化物歧化酶的提取方法,專利申請(qǐng)?zhí)?21014公開了以大豆為原料生產(chǎn)大豆超氧化物歧化酶的方法,以上專利方法均為從植物、動(dòng)物中提取生產(chǎn)超氧化物歧化酶,在生產(chǎn)中受原料、季節(jié)、生產(chǎn)周期、安全性等因素的影響較大,以微生物為原料發(fā)酵生產(chǎn)超氧化物歧化酶的方法,僅有專利申請(qǐng)?zhí)枮?3103774.3和CN01106224.X的專利,前者為蠟質(zhì)芽胞桿菌,后者為乳酸菌,菌種來(lái)源均為細(xì)菌,菌體生物量很低,SOD含量也較低,前者采用硫銨沉淀的工藝必須經(jīng)過(guò)脫鹽才能應(yīng)用,且其提取的SOD比活僅為1200u/mg蛋白,而后者只涉及SOD乳酸菌的發(fā)酵技術(shù),不經(jīng)過(guò)純化只能直接用于酸奶的生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種超氧化物歧化酶的提取方法,它以微生物為原料發(fā)酵生產(chǎn),培養(yǎng)周期短,易于規(guī)?;a(chǎn),且產(chǎn)品成本低,安全性及穩(wěn)定性高,產(chǎn)品得率高,具有較高的使用價(jià)值。
本發(fā)明通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn),提供一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是它用釀酒酵母菌體提取純化得到銅/鋅超氧化物歧化酶。
所述的用釀酒酵母菌體提取純化銅/鋅超氧化物歧化酶的生產(chǎn)工藝過(guò)程是將釀酒酵母菌體經(jīng)過(guò)破壁提酶,丙酮二次沉淀,DEAE-32纖維素柱層析得到純化精制的酶。
所述的破壁提酶是將釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)后,離心或板框過(guò)濾得到菌體;1∶0.8(M/V)加入甲苯30~35℃作用45分鐘破碎菌體細(xì)胞壁釋放酶;20~25℃條件下,以1∶5(M/M),加入0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液提取粗酶4~5小時(shí),4000r/min離心15分鐘,收集上清液即為粗酶液;再用2mol/LHCl調(diào)節(jié)粗酶液pH至4.8~5.0,4000r/min離心15min,收集上清液,除去沉淀雜蛋白。
所述的丙酮二次沉淀;先進(jìn)行丙酮一次沉淀,將上清液在鹽冰浴條件下攪拌加入1∶0.6(V/V)冷丙酮,靜置10分鐘,4000r/min離心15分鐘,收集上清液;再進(jìn)行丙酮二次沉淀將上清液用2mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至4.0左右,在鹽冰浴條件下繼續(xù)攪拌加入1∶0.3(V/V)的冷丙酮,4000r/min離心15分鐘,收集沉淀,將沉淀用適量的0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液溶解。
所述的DEAE纖維素-32柱層析將步驟4得到的溶液上1.5cm×20cm的DE-32纖維素柱,用0.0025mol/L-0.05mol/L,pH7.8的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫,流速控制為1ml/3min,每管收集3ml;經(jīng)蛋白含量測(cè)定和SOD酶活性測(cè)定,將含SOD活性高的洗脫液合并,即可得到高活力的SOD酶液。
所述的磷酸緩沖液是含0.1mmol/L EDTA的緩沖溶液。
所述的鹽冰浴條件是用每33克鹽加100克碎冰。
所述的冷丙酮是將丙酮預(yù)冷至-15℃。
本發(fā)明的特點(diǎn)是由于本發(fā)明所用菌種為釀酒酵母,其生物量為30~40克左右/L發(fā)酵液,SOD含量為2000~2600u/g濕菌體,其菌體生物量及SOD含量均高于其它微生物,培養(yǎng)周期短,成本低,易于規(guī)?;a(chǎn),且產(chǎn)品安全性及穩(wěn)定性高。本發(fā)明提純技術(shù)采取丙酮分級(jí)沉淀,選擇性地除去雜蛋白,不需脫鹽工藝,提高了純化效率,簡(jiǎn)化了純化工藝,并選擇合理的參數(shù)提高了得率,純化得到的純化酶比活達(dá)3500u/mg蛋白,可應(yīng)用于醫(yī)療,食品,化妝品等多個(gè)領(lǐng)域,具有較高的使用價(jià)值。它相對(duì)于菌種來(lái)源均為細(xì)菌的專利,如專利申請(qǐng)?zhí)朇N01106224.X的專利為乳酸菌,專利申請(qǐng)?zhí)枮?3103774.3為蠟質(zhì)芽胞桿菌,它采用硫銨沉淀的工藝必須經(jīng)過(guò)脫鹽才能應(yīng)用,且其提取的SOD比活僅為1200u/mg蛋白。
下面結(jié)合實(shí)施例附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
附圖1是釀酒酵母超氧化物歧化酶提取純化工藝路線;附圖2是釀酒酵母分步純化結(jié)果;附圖3是SOD聚丙烯酰胺凝膠電泳后的活性染色圖譜;附圖4是SOD酶類型鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例如圖1所示實(shí)施例11、1L釀酒酵母(原編號(hào)2.346,中科院微生物研究所菌種保藏中心)發(fā)酵液得到40克酵母菌菌泥,用蒸餾水洗滌兩次,離心收集釀酒酵母菌體;以1∶0.8(M/V)的比例加入32ml甲苯,35℃磁力攪拌破壁45分鐘;以1∶5(M/V)的比例加入0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA)200ml,25℃浸提5小時(shí);4000r/min離心15分鐘,收集上清液約180ml,即為粗酶液,總酶活為0.98×105u;2、用2mol/L HCL調(diào)節(jié)粗酶液至pH4.8,4000r/min離心15分鐘,收集上清液約170ml,總酶活為0.94×105u,除去沉淀雜蛋白;;3、丙酮一次沉淀沿?zé)谝?∶0.6(V/V)的比例緩緩加入預(yù)冷至-15℃的丙酮102ml,磁力攪拌,燒杯壁外套夾層,內(nèi)裝鹽冰浴(用165克鹽加500克碎冰)。靜置10分鐘,充分沉降,4000r/min離心15分鐘,收集上清液約260ml,總酶活為0.76×105u;4、丙酮二次沉淀將上清液用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.0左右,沿?zé)谝?∶0.3(V/V)的比例緩緩加入預(yù)冷至-15℃的丙酮78ml,磁力攪拌,燒杯壁外套夾層,內(nèi)裝鹽冰浴(同上)。靜置10分鐘,充分沉降,4000r/min離心15分鐘,收集沉淀,溶于12ml 0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA),總酶活為0.67×105u;5、將上述酶液上1.5×20cmDEAE-32纖維素柱層析,用0.0025mol/L-0.05mol/L pH7.8的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫,流速控制1ml/3min,每管收集3ml。經(jīng)蛋白含量測(cè)定和SOD酶活性測(cè)定,將含SOD活性高的洗脫液合并,即可得到高活力的SOD酶液18ml,總酶活為0.56×105u。最后用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定超氧化物歧化酶的酶純度;經(jīng)酶類型鑒定為Cu/Zn超氧化物歧化酶。其結(jié)果如附圖3所示,SOD聚丙烯酰胺凝膠電泳后的活性染色圖譜。附圖4是SOD酶類型鑒定結(jié)果,如圖4所示,超氧化物歧化酶的酶類型鑒定純化酶樣品在H2O2作用下10分鐘內(nèi)急速失活,KCN處理10分鐘失活60%左右,氯仿-醇對(duì)該酶活性基本無(wú)影響,因此鑒定為Cu/Zn超氧化物歧化酶。
實(shí)施例21、1L釀酒酵母(原編號(hào)2.400,中科院微生物研究所菌種保藏中心)發(fā)酵液得到42克酵母菌菌泥,用蒸餾水洗滌兩次,離心收集釀酒酵母菌體;以1∶0.8(M/V)的比例加入33.6ml甲苯,32℃磁力攪拌破壁45分鐘;以1∶5(M/V)的比例加入0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA)210ml,25℃浸提4小時(shí);4000r/min離心15分鐘,收集上清液約200ml,即為粗酶液,總酶活為0.88×105u;2、用2mol/LHCL調(diào)節(jié)粗酶液至pH5.0,4000r/min離心15分鐘,收集上清液約185ml,總酶活為0.84×105u,除去沉淀雜蛋白;3、丙酮一次沉淀沿?zé)谝?∶0.6(V/V)的比例緩緩加入預(yù)冷至-15℃的丙酮111ml,磁力攪拌,燒杯壁外套夾層,內(nèi)裝鹽冰浴(用165克鹽加500克碎冰)。靜置10分鐘,充分沉降,4000r/min離心15分鐘,收集上清液約280ml,總酶活為0.68×105u;4、丙酮二次沉淀將上清液用2mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至4.0左右,沿?zé)谝?∶0.3(V/V)的比例緩緩加入預(yù)冷至-15℃的丙酮84ml,磁力攪拌,燒杯壁外套夾層,內(nèi)裝鹽冰浴(同上)。靜置10分鐘,充分沉降,4000r/min離心15分鐘,收集沉淀,溶于10ml 0.05mol/LpH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/LEDTA),總酶活為0.60×105u;5、將上述酶液上1.5×20cm DEAE-32纖維素柱層析,用0.0025mol/L-0.05mol/L pH7.8磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫,流速控制1ml/3min,每管收集3ml。經(jīng)蛋白含量測(cè)定和SOD酶活性測(cè)定,將含SOD活性高的洗脫液合并,即可得到高活力的SOD酶液18ml,總酶活為0.51×105u。最后用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定超氧化物歧化酶的酶純度;經(jīng)酶類型鑒定為Cu/Zn超氧化物歧化酶。
實(shí)施例31、釀酒酵母(原編號(hào)2.536,中科院微生物研究所菌種保藏中心)發(fā)酵液得到36克酵母菌菌泥,用蒸餾水洗滌兩次,離心收集釀酒酵母菌體;1∶0.8(M/V)的比例加入28.8ml甲苯,30℃磁力攪拌破壁45分鐘;以1∶5(M/V)的比例加入0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA)180ml,20℃浸提5小時(shí);4000r/min離心15分鐘,收集上清液約170ml,即為粗酶液,總酶活為0.92×105u;2、用2mol/LHCL調(diào)節(jié)粗酶液至pH4.8,4000r/min離心15分鐘,收集上清液約160ml,總酶活為0.88×105u,除去沉淀雜蛋白;3、丙酮一次沉淀沿?zé)谝?∶0.6(V/V)的比例緩緩加入預(yù)冷至-15℃的丙酮96ml,磁力攪拌,燒杯壁外套夾層,內(nèi)裝鹽冰浴(用165克鹽加500克碎冰)。靜置10分鐘,充分沉降,4000r/min離心15分鐘,收集上清液約240ml,總酶活為0.70×105u;4、丙酮二次沉淀將上清液用2mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至4.0左右,沿?zé)谝?∶0.3(V/V)的比例緩緩加入預(yù)冷至-15℃的丙酮72ml,磁力攪拌,燒杯壁外套夾層,內(nèi)裝鹽冰浴(同上)。靜置10分鐘,充分沉降,4000r/min離心15分鐘,收集沉淀,溶于10ml 0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA),總酶活為0.63×105u;5、將上述酶液上1.5×20cm DEAE-32纖維素柱層析,用0.0025mol/L-0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫,流速控制1ml/3min,每管收集3ml。經(jīng)蛋白含量測(cè)定和SOD酶活性測(cè)定,將含SOD活性高的洗脫液合并,即可得到高活力的SOD酶液15ml,總酶活為0.53×105u。最后用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定超氧化物歧化酶的酶純度;經(jīng)酶類型鑒定為Cu/Zn超氧化物歧化酶。
實(shí)施例41、1L釀酒酵母(原編號(hào)2.434,中科院微生物所菌種保藏中心)發(fā)酵液得到46克酵母菌菌泥,用蒸餾水洗滌兩次,離心收集釀酒酵母菌體;1∶0.8(M/V)的比例加入36.8ml甲苯,35℃磁力攪拌破壁45分鐘;以1∶5(M/V)的比例加入0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA)230ml,23℃浸提4.5小時(shí);4000r/min離心15分鐘,收集上清液約210ml,即為粗酶液,總酶活為1.08×105u;2、用2mol/LHCL調(diào)節(jié)粗酶液至pH4.8,4000r/min離心15分鐘,收集上清液約200ml,總酶活為1.04×105u;3、丙酮一次沉淀沿?zé)谝?∶0.6(V/V)的比例緩緩加入預(yù)冷至-15℃的丙酮120ml,磁力攪拌,燒杯壁外套夾層,內(nèi)裝鹽冰浴(用165克鹽加500克碎冰)。靜置10分鐘,充分沉降,4000r/min離心15分鐘,收集上清液約280ml,總酶活為0.85×105u;4、丙酮二次沉淀將上清液用2mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至4.0左右,沿?zé)谝?∶0.3(V/V)的比例緩緩加入預(yù)冷至-15℃的丙酮84ml,磁力攪拌,燒杯壁外套夾層,內(nèi)裝鹽冰浴(同上)。靜置10分鐘,充分沉降,4000r/min離心15分鐘,收集沉淀,溶于12ml0.05mol/LpH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA),總酶活為0.74×105u;5、將上述酶液上1.5×20cm DEAE-32纖維素柱層析,用0.0025mol/L-0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫,流速控制1ml/3min,每管收集3ml。經(jīng)蛋白含量測(cè)定和SOD酶活性測(cè)定,將含SOD活性高的洗脫液合并,即可得到高活力的SOD酶液18ml,總酶活為0.63×105u。用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定超氧化物歧化酶的酶純度;經(jīng)酶類型鑒定為Cu/Zn超氧化物歧化酶。
以上實(shí)施例從釀酒酵母分步純化結(jié)果如圖2所示,經(jīng)上述所用釀酒酵母作為生產(chǎn)菌種提取酵母SOD,提純化的SOD收率為58.3%,比活為3500u/mg蛋白,可應(yīng)用于化妝品,保健食品的生產(chǎn)應(yīng)用,具有一定的使用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是它用釀酒酵母菌體提取純化得到銅/鋅超氧化物歧化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是所述的用釀酒酵母菌體提取純化銅/鋅超氧化物歧化酶的生產(chǎn)工藝過(guò)程是將釀酒酵母菌體經(jīng)過(guò)破壁提酶,丙酮二次沉淀,DEAE-32纖維素柱層析得到純化精制的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是所述的破壁提酶是將釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)后,離心或板框過(guò)濾得到菌體;1∶0.8(M/V)加入甲苯30~35℃作用45分鐘破碎菌體細(xì)胞壁釋放酶;20~25℃條件下,以1∶5(M/M),加入0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液提取粗酶4~5小時(shí),4000r/min離心15分鐘,收集上清液即為粗酶液;再用2mol/LHCl調(diào)節(jié)粗酶液pH至4.8~5.0,4000r/min離心15min,收集上清液,除去沉淀雜蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是所述的丙酮二次沉淀;先進(jìn)行丙酮一次沉淀,將上清液在鹽冰浴條件下攪拌加入1∶0.6(V/V)冷丙酮,靜置10分鐘,4000r/min離心15分鐘,收集上清液;再進(jìn)行丙酮二次沉淀將上清液用2mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至4.0左右,在鹽冰浴條件下繼續(xù)攪拌加入1∶0.3(V/V)的冷丙酮,4000r/min離心15分鐘,收集沉淀,將沉淀用適量的0.05mol/L pH7.8磷酸緩沖液溶解。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是所述的DEAE纖維素-32柱層析將步驟4得到的溶液上1.Scm×20cm的DE-32纖維素柱,用0.0025mol/L-0.05mol/L,pH7.8的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫,流速控制為1ml/3min,每管收集3ml;經(jīng)蛋白含量測(cè)定和SOD酶活性測(cè)定,將含SOD活性高的洗脫液合并,即可得到高活力的SOD酶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是所述的磷酸緩沖液是含0.1mmol/L EDTA的緩沖溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是所述的鹽冰浴條件是用每33克鹽加100克碎冰。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是所述的冷丙酮是將丙酮預(yù)冷至-15℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及超氧化物歧化酶的生產(chǎn)提取方法,特別是從一種微生物釀酒酵母中提取精制銅/鋅超氧化物歧化酶的提取方法。一種超氧化物歧化酶的提取方法,其特征是它用釀酒酵母菌體提取純化得到銅/鋅超氧化物歧化酶。所述的用釀酒酵母菌體提取純化銅/鋅超氧化物歧化酶的生產(chǎn)工藝過(guò)程是將釀酒酵母菌體經(jīng)過(guò)破壁提酶,丙酮二次沉淀,DEAE-32纖維素柱層析得到純化精制的酶。這種超氧化物歧化酶的提取方法,它以微生物為原料發(fā)酵生產(chǎn),培養(yǎng)周期短,易于規(guī)?;a(chǎn),且產(chǎn)品成本低,安全性及穩(wěn)定性高,產(chǎn)品得率高,具有較高的使用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/08GK1800377SQ20051002274
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者楊明琰, 張曉琦 申請(qǐng)人:陜西省微生物研究所