專(zhuān)利名稱(chēng)：分泌人白介素－2的重組卡介苗及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分泌人白介素-2的重組卡介苗及其構(gòu)建方法，具體涉及一種包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號(hào)肽片段和白介素-2(IL-2)的重組卡介苗及其構(gòu)建方法，得到的重組卡介苗rBCGIL-2用于預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤及結(jié)核病，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自從1976年Morales首次報(bào)告應(yīng)用卡介苗(BCG)膀胱灌注治療表淺性膀胱腫瘤以來(lái)，BCG作為一種有效的免疫佐劑已在防治膀胱腫瘤方面取得了良好效果，目前BCG膀胱灌注已被視為膀胱腫瘤最有效的輔助治療之一。盡管BCG在預(yù)防和治療表淺性膀胱腫瘤方面具有良好的療效，但仍有許多問(wèn)題需要解決。首先是進(jìn)一步增強(qiáng)膀胱腫瘤對(duì)BCG灌注的免疫反應(yīng)性。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)表明，表淺性膀胱腫瘤切除術(shù)后，即使進(jìn)行規(guī)范的BCG膀胱灌注治療，仍有10％-20％的患者缺乏免疫反應(yīng)而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[茍欣等“卡介苗和白細(xì)胞介素-2預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)長(zhǎng)期觀(guān)察”，醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)第21卷第9期(2000)]。其次是減少其副作用。在BCG膀胱灌注后，患者常有尿頻、尿急、尿痛、血尿等膀胱炎癥狀，多數(shù)可自行緩解，但仍有少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)膀胱攣縮、BCG敗血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥。再者細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2聯(lián)合BCG灌注治療雖效果良好，但存在半衰期短、用量大及毒性強(qiáng)的缺點(diǎn)，同時(shí)高昂的治療費(fèi)用限制了其在臨床上的推廣[王緒雷等“卡介苗聯(lián)合白細(xì)胞介素-2防治膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)”醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)第21卷第9期(2000)]。
國(guó)外研究認(rèn)為BCG的抗瘤機(jī)制與局部細(xì)胞免疫、直接細(xì)胞毒性作用、細(xì)胞因子的細(xì)胞殺傷等密切相關(guān)，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α等多種細(xì)胞因子參與到免疫反應(yīng)中并發(fā)揮重要的作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家開(kāi)始重視BCG轉(zhuǎn)變?yōu)橐呙巛d體的分子生物學(xué)研究，并取得了明顯的進(jìn)展。目前，國(guó)內(nèi)外已將重組BCG疫苗應(yīng)用于日本血吸蟲(chóng)病、結(jié)核病的動(dòng)物試驗(yàn)及臨床中，并取得了良好的效果[甘燕等“多糖佐劑FQ2對(duì)日本血吸蟲(chóng)rBCG Sj26GST疫苗增效作用及其機(jī)理的初步探討”中國(guó)人獸共患病雜志，19.2(2003)]。國(guó)外也成功構(gòu)建分泌鼠白介素-2的重組BCG，并對(duì)膀胱腫瘤動(dòng)物模型的免疫刺激作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)行研究[Yamada等“分泌小鼠白細(xì)胞介素-2的重組卡介苗增強(qiáng)單核細(xì)胞介導(dǎo)的膀胱腫瘤的殺傷作用”J Urol，164(2)526(2000)]，發(fā)現(xiàn)重組卡介苗具有明顯抗腫瘤活性及高效表達(dá)IL-2的作用，同時(shí)可以減少卡介苗的用量及毒副作用。國(guó)內(nèi)曾星等構(gòu)建表達(dá)和分泌人IL-2的重組卡介苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組卡介苗能夠通過(guò)提高荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO抑制腫瘤生長(zhǎng)[“重組卡介苗及豬苓多糖對(duì)荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞NO釋放量的影響”細(xì)胞與分子生物學(xué)雜志，18(3)292(2003)]。但上述重組卡介苗存在著IL-2分泌量低的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種分泌人白介素-2的重組卡介苗rBCGIL-2及其構(gòu)建方法，得到的rBCGIL-2具有BCG和IL-2的雙重效果，通過(guò)促進(jìn)IL-2的高效分泌來(lái)增強(qiáng)膀胱腫瘤患者對(duì)BCG免疫治療的反應(yīng)性，能夠有效預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤；利用rBCGIL-2在膀胱腔內(nèi)的局部協(xié)同作用減少BCG和外用IL-2的用量，可以克服BCG治療的毒副作用。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號(hào)肽片段和人IL-2的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSIL-2，然后采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將pMSIL-2導(dǎo)入BCG構(gòu)建重組卡介苗rBCGIL-2，Ag85B信號(hào)肽是BCG自身起分泌作用的抗原，可以協(xié)助外源基因分泌至細(xì)胞外。依靠pMSIL-2在BCG的復(fù)制和信號(hào)肽的分泌作用，能夠高效分泌IL-2。
本發(fā)明分泌人白介素-2的重組卡介苗rBCG IL-2的構(gòu)建方法通過(guò)下述步驟實(shí)現(xiàn)步驟1卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GeneBank已有的卡介苗BCG主要分泌抗原Ag85B信號(hào)肽和IL-2的基因序列，分別設(shè)計(jì)Ag85B信號(hào)肽和IL-2的擴(kuò)增引物，Ag85B信號(hào)肽的上下游酶切位點(diǎn)分別為BamHI和EcorI，IL-2的上下游酶切位點(diǎn)分別為EcorI和SalI。經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分別合成得到Ag85B信號(hào)肽和IL-2的基因片段。先將Ag85B信號(hào)肽克隆到pMV261載體中，得到pMS，再將IL-2基因片段與pMS載體的信號(hào)肽連接，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSIL-2。
步驟2卡介苗的培養(yǎng)選取卡介苗BCG為上海丹麥株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG專(zhuān)用液體培養(yǎng)基為含有10％的營(yíng)養(yǎng)劑ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐溫80和0.2％甘油的Middlebrook7H9broth(Difco產(chǎn)品)。將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分，三周后卡介苗處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600值＝0.6)，制得感受態(tài)卡介苗。
本發(fā)明所用的液體培養(yǎng)基中還可以加入青霉素100μg/ml、放線(xiàn)菌酮100μg/ml預(yù)防細(xì)菌感染。
步驟3電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建重組卡介苗rBCGIL-2制備好感受態(tài)卡介苗后，在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態(tài)卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達(dá)載體pMSIL-2，置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化得到陽(yáng)性重組子，電轉(zhuǎn)參數(shù)電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω。陽(yáng)性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選，培養(yǎng)兩周后得到陽(yáng)性克隆rBCGIL-2，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基搖床生長(zhǎng)，大量培養(yǎng)。
電轉(zhuǎn)化構(gòu)建rBCGIL-2采用含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基Middlebrook 7H10(Difco產(chǎn)品)進(jìn)行抗性篩選，液體培養(yǎng)基為含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9broth。固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基還可加入青霉素100μg/ml、放線(xiàn)菌酮100μg/ml預(yù)防細(xì)菌感染。
步驟4重組卡介苗rBCGIL-2的鑒定與功能檢測(cè)進(jìn)行抗酸染色初步確定rBCGIL-2為抗酸桿菌，抽提rBCGIL-2質(zhì)粒DNA后，PCR擴(kuò)增得到IL-2的基因片段，Western blotting檢測(cè)到rBCGIL-2培養(yǎng)上清中和菌體中有IL-2蛋白的表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)到rBCGIL-2培養(yǎng)上清中有高含量的IL-2。
本發(fā)明所用試劑均為市購(gòu)，本發(fā)明所用電轉(zhuǎn)化方法及檢測(cè)方法為常規(guī)已知方法。
本發(fā)明構(gòu)建的重組卡介苗rBCGIL-2具有BCG和IL-2的雙重效果，與傳統(tǒng)卡介苗比較，在采用相同劑量(106cfu/0.1ml)的情況下，能夠在體外明顯抑制膀胱腫瘤細(xì)胞，差別有顯著性。分別應(yīng)用于8只T739小鼠膀胱腫瘤模型(來(lái)自于該品系的膀胱腫瘤細(xì)胞種植于小鼠大腿內(nèi)側(cè)形成腫瘤)，采用腫瘤局部注射治療的方法，發(fā)現(xiàn)重組卡介苗在腫瘤消退的小鼠數(shù)目(8/8vs.2/8)、腫瘤消退時(shí)間(1Wvs.3W)、無(wú)瘤生存時(shí)間(8W vs.2W)及對(duì)該腫瘤細(xì)胞的免疫力方面，均優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗。
本發(fā)明構(gòu)建的rBCGIL-2能夠有效預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤及結(jié)核??；利用重組卡介苗rBCGIL-2在膀胱腔內(nèi)的局部協(xié)同作用可減少BCG和外用IL-2的用量，可以克服BCG治療的毒副作用，不僅可以提高傳統(tǒng)BCG的藥物療效，減少患者腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，而且可以減少膀胱腫瘤患者的醫(yī)療支出，既有利于患者，也有利于減輕社會(huì)醫(yī)療費(fèi)用負(fù)擔(dān)，因而有良好的推廣價(jià)值和臨床應(yīng)用趨向。


圖1為卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號(hào)肽片段的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖2為卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號(hào)肽片段的測(cè)序圖。
圖3為人IL-2的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖4為人IL-2的測(cè)序圖。
圖5為人卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSIL-2的酶切電泳圖。
圖6為人卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSIL-2的測(cè)序圖。
圖7為rBCGIL-2的抗酸染色圖。
圖8為rBCGIL-2抽提質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖9為rBCGIL-2的SDS-PAGE結(jié)果。
圖10為rBCGIL-2的Western Blotting結(jié)果。
圖11為ELISA檢測(cè)rBCGIL-2的分泌結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1步驟1卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建1.合成擴(kuò)增引物根據(jù)GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號(hào)肽和人IL-2的基因序列，設(shè)計(jì)Ag85B信號(hào)肽和IL-2的擴(kuò)增引物，分別為Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′IL-2 sense5′-AGCGAATTCATGGCACCTACTTCAAGTTC-3′antisense5′-AGCGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGC-3′pMV261載體上的測(cè)序引物5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′2.Ag85B信號(hào)肽基因裝載到pMV261載體中合成信號(hào)肽基因并將其克隆到pUCm-T載體中連接(TAKARA)體系pUCm-T載體 1μl信號(hào)肽片段(約50ng/μl) 4μlSolμtion I5μl16℃，連接過(guò)夜。
次日將pUCm-TAg85B質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，步驟如下(1).取出凍存的DH5a(200μl/Tube)，冰中溶解；(2).取5μl連接液加入菌液中，輕輕混勻，冰浴30min；(3).42℃熱休克1min 30sec，冰浴2min；(4).加入500μl LB液體培養(yǎng)基，于37℃搖床培養(yǎng)，100rpm×45min；(5).取200μl涂布至含有氨芐抗性的培養(yǎng)板上(100μg/ml)；(6).37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，至菌落長(zhǎng)出；(7).挑取單克隆至3ml含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，于37℃搖床培養(yǎng)，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。
抽提pUCm-TAg85B質(zhì)粒DNA挑選沒(méi)有突變的菌落，抽提質(zhì)粒。按照質(zhì)粒抽提試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟如下(1).將培養(yǎng)過(guò)夜的2ml菌液移至2ml離心管中，最高速離心30sec，棄盡上清；(2).在細(xì)菌沉淀中加入250μl Solution 1液，振蕩至徹底懸?。?3).加入250μl Solution 2溶液，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管5-10次以混勻，使菌體充分裂解直至形成透亮的溶液，此步驟應(yīng)在5min內(nèi)完成；(4).加入400μl 4℃預(yù)冷的Solution 3溶液，立即溫和并充分地翻轉(zhuǎn)離心管5-10次以混勻，室溫靜置2min，最高速離心10min；(5).將上清倒入新的離心管中，再次最高速離心10min；(6).小心吸取上清轉(zhuǎn)移到DNA吸附柱中(吸附柱置于廢液收集管中)，離心1min，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中；(7).在吸附柱中加入500μl W1液，離心30sec，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中；(8).在吸附柱中加入700μl W2液，離心30sec，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中，重復(fù)一次；(9).最高速離心1min；(10).將吸附柱移入新的干凈的1.5ml離心管中，在DNA吸附膜中央加入60μl預(yù)熱到60℃的去離子水，室溫靜置1min，最高速離心1min，得到的即為質(zhì)粒DNA溶液。
PCR擴(kuò)增及電泳以抽提質(zhì)粒DNA為模板，用合成的信號(hào)肽兩端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體系去離子水 40.5μlbuffer 5μldNTPs 1μlPrimer sig-F 1μlPrimer sig-R 1μlTemplate 1μl
Taq酶0.5μl反應(yīng)條件 94℃ 3min94℃ 30sec54℃ 1min72℃ 30sec30cycles72℃ 10min結(jié)果如圖1所示2-5為PCR擴(kuò)增條帶，與分子質(zhì)量標(biāo)記比較顯示約120bp，與理論上所得的擴(kuò)增片段大小相同。
對(duì)抽提的pUCm-TAg85B質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序鑒定測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2，通過(guò)NCBI網(wǎng)站BLAST對(duì)照，堿基序列與Ag85B信號(hào)肽基因完全一致。表明PCR擴(kuò)增得到的Ag85B信號(hào)肽基因完全正確。
將信號(hào)肽基因克隆到pMV261載體中(1).分別酶切信號(hào)肽基因所在的T載體和pMV261載體酶切體系去離子水 2μl 去離子水 7μlbuffer 2μl buffer 2μlpUCm-TAg85B15μl pMV26 110μlEcoRI 0.5μlEcoRI 0.5μlBamHI 0.5μlBamHI 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳。
(2).回收信號(hào)肽片段和切后的pMV261載體(申友凝膠回收試劑盒)，步驟如下①.在紫外燈切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體并切碎，計(jì)算凝膠重量；②.加入三個(gè)凝膠體積的DE-A溶液，混勻后于75℃加熱，期間混和幾次，直至凝膠塊完全溶化(約5min)；③.加入1/2個(gè)DE-A體積的DE-B溶液，混和均勻；④.吸取上述步驟中的混和液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管)中，離心3600rpm×1min，棄濾液；⑤.將制備管置回離心管，加500μl W1溶液，離心3600rpm×30sec，棄濾液；⑥.將制備管置回離心管，加700μl W2溶液，離心3600rpm×30sec，棄濾液；以同樣的方法再用W2溶液洗滌一次；⑦.將制備管置回離心管中，最高速離心1min，凈棄W2溶液；⑧.將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25μl預(yù)熱到60℃的水，室溫靜置1min，最高速離心1min，得到DNA溶液。
(3).連接信號(hào)肽和pMV261連接體系連接buffer1μlpMV261載體3μl信號(hào)肽片段5.5μl連接酶0.5μl16℃連接過(guò)夜，得到含有信號(hào)肽基因的質(zhì)粒pMS。
(4).轉(zhuǎn)化(化轉(zhuǎn)，步驟同前，菌液的抗性為卡那霉素)3.目的基因IL-2電泳鑒定和DNA測(cè)序以抽提的質(zhì)粒DNA為模板，用合成的IL-2基因的兩端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體系去離子水 40.5μlbuffer 5μldNTPs1μlPrimer F 1μlPrimer R 1μlTemplate 1μlTaq酶0.5μl反應(yīng)條件94℃ 3min94℃ 30sec54℃ 1min72℃ 30sec 35cvcles
72℃ 10min1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實(shí)。結(jié)果圖3示IL為PCR擴(kuò)增條帶，與分子質(zhì)量標(biāo)記比較顯示約399bp，與理論上所得的擴(kuò)增片段大小相同。
DNA測(cè)序驗(yàn)證目的基因IL-2將IL-2的PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中(步驟同信號(hào)肽克隆到pUCm-T載體)，得到質(zhì)粒pUCm-TIL-2，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，分別抽提質(zhì)粒DNA后，進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖4，通過(guò)NCBI網(wǎng)站BLAST對(duì)照，堿基序列與IL-2基因完全一致。表明PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段完全正確。
目的基因IL-2全長(zhǎng)cDNA裝載入穿梭質(zhì)粒pMS中回收目的基因IL-2片段酶切pMS和pUCm-TIL-2酶切體系water 2μlbuffer2μlpUCm-TIL-210μlEcoR I0.5μlSal I 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實(shí)片段大小分別為4602bp和399bp。回收pMS載體、IL-2片段。
連接反應(yīng)分別將pMS載體和IL-2片段行體外連接，得到穿梭表達(dá)載體pMSIL-2連接體系連接buffer 1μlpMS載體 2μl外源基因片段6.5μl連接酶 0.5μl酶切驗(yàn)證穿梭表達(dá)載體酶切體系water 2μlbuffer2μl穿梭表達(dá)載體 15μlEcoR I0.5μlSal I 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實(shí)。結(jié)果見(jiàn)圖5示IL為pMSIL-2以EcoR I、SalI雙酶切結(jié)果為4.6kb、399bp兩條條帶，同預(yù)期結(jié)果。
測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的穿梭表達(dá)載體用pMV261載體上的測(cè)序引物對(duì)抽提的穿梭表達(dá)載體pMSIL-2進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖6，通過(guò)NCBI網(wǎng)站BLAST對(duì)照，堿基序列與IL-2基因+Ag85B信號(hào)肽基因完全一致。
步驟2卡介苗的培養(yǎng)選取卡介苗BCG為上海丹麥株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG專(zhuān)用液體培養(yǎng)基為含有10％的營(yíng)養(yǎng)劑ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐溫80和0.2％甘油的Middlebrook7H9 broth(Difco產(chǎn)品)。將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分，三周后卡介苗處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600值＝0.6)，按照下列步驟制備感受態(tài)卡介苗◆BCG在Middlebrook 7H9培養(yǎng)基37℃搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為100-120rpm)◆待培養(yǎng)液OD600值約0.6時(shí)將BCG菌液加入離心管中，冰浴2hr；◆將BCG菌液加入離心管中，在冰盒中預(yù)冷2hr；◆4℃離心8000g/min×15min，丟棄上清；用原始體積的1/10、預(yù)冷的濃度為10％甘油重懸菌體；◆重復(fù)上述操作共五次；◆棄上清，加入原始體積1/50的10％甘油重懸菌體即得到感受態(tài)細(xì)菌，放置室溫下備用。
本發(fā)明所用的液體培養(yǎng)基中還可以加入青霉素100μg/ml、放線(xiàn)菌酮100μg/ml預(yù)防細(xì)菌感染。
步驟3電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建重組卡介苗rBCGIL-2◆在一離心管中混勻400μl感受態(tài)BCG(1×108cfu)和2μl穿梭表達(dá)載體pMSIL-2(0.4μg)；◆冰浴10min后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2CM的電擊轉(zhuǎn)化杯中再冰浴10min，置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)參數(shù)電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω；◆質(zhì)粒pMSIL-2、pMV261及單純BCG的作用時(shí)間分別為23.8、25、26毫秒；◆電轉(zhuǎn)完成后，迅速加入1000μl液體培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)3hr；◆取100-200μl菌液涂抹于含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選，先正面朝上培養(yǎng)，3hr后翻轉(zhuǎn)平皿，繼續(xù)培養(yǎng)；◆兩周后得到陽(yáng)性克隆rBCGIL-2，然后接種在含2-3ml液體培養(yǎng)基的試管里搖床生長(zhǎng)，大量培養(yǎng)。
▲注此處感受態(tài)BCG在轉(zhuǎn)化時(shí)各做一陽(yáng)性對(duì)照pBCG(BCG中只含有空白質(zhì)粒pMV261)及陰性對(duì)照(BCG)。
電轉(zhuǎn)化構(gòu)建rBCGIL-2采用含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基Middlebrook 7H10(Difco產(chǎn)品)進(jìn)行抗性篩選，液體培養(yǎng)基為含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9 broth。固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基還可加入青霉素100μg/ml、放線(xiàn)菌酮100μg/ml預(yù)防細(xì)菌感染。
步驟4重組卡介苗rBCGIL-2的鑒定與功能檢測(cè)1.rBCGIL-2的Z-N法抗酸染色(初步鑒定)結(jié)果見(jiàn)圖7染色后光學(xué)顯微鏡鏡檢(目鏡10×，油鏡100×)。在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌呈紅色。
2.rBCGIL-2DNA水平鑒定(PCR擴(kuò)增、電泳鑒定)rBCGIL-2質(zhì)粒DNA的提取◆rBCG質(zhì)粒DNA的提取將在三角燒瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)四周的rBCG分瓶至15ml試管中，再在試管里搖床培養(yǎng)2周后使OD600約為1，收獲前加入甘氨酸至20mg/ml以干擾胞壁的合成，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后收集菌體；◆菌體用生理鹽水洗兩次后懸浮在裂解液(2mg/ml溶菌酶，0.3mol/L蔗糖，25mmol/L Tris-Cl(pH＝8.0)，25mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.2mg/ml溴甲酚綠)中溫浴24-48hr后，加入堿性SDS(20mg/mlSDS，3mol/LNaOH)；◆37℃水浴12-48hr直至液體清亮，加入3mol/L的NaAc(pH＝4.8)；◆40℃水浴12hr，離心收集上清；◆往溶解的菌體里加入600μl預(yù)冷的Nuclei Lysis Solution，輕微振蕩10sec；◆加入3μlRNase Solution混合均勻。37℃放置15-30min；◆加入200μlProtein Precipitation Solution混合均勻，置于冰上5min；◆離心13000rpm×4min；◆將上清轉(zhuǎn)入含有600μl的異丙醇里，上下混合均勻，離心13000rpm×1min；◆棄上清，用70％乙醇洗滌一次，離心13000rpm×1min；◆小心吸棄上清，室溫干燥；◆加入TE溶解DNA。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)及電泳鑒定PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件、方法同步驟1。電泳鑒定結(jié)果圖8示1-5為PCR擴(kuò)增條帶，與分子質(zhì)量標(biāo)記比較顯示約399bp，與理論上所得的擴(kuò)增片段大小相同。
3.rBCGIL-2蛋白水平鑒定在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值約為1時(shí)，先誘導(dǎo)rBCG分泌表達(dá)細(xì)胞因子(45℃，30min)，4000g/min×10min，離心2次，收獲菌體及上清后，菌體先用超聲裂解法破碎，再加入裂解液(2％SDS，0.1M DT，0.01％溴甲酚綠，0.06MTris-Cl，10％甘油)煮沸5min提取蛋白。分別將樣品用1×PBS洗滌三遍，以去除培養(yǎng)液中的白蛋白。收集第一遍洗滌液和最終的沉淀進(jìn)行western blot鑒定。
SDS-PAGE分離rBCGIL-2總蛋白將洗滌液和2×SDS上樣緩沖液按1∶1混合(10μl+10μl)，沸水中變性10min后直接上樣。
制備凝膠板按下列條件配制12％的分離膠和5％的濃縮膠
12％分離膠(6ml) 5％濃縮膠(3ml)30％丙烯酰胺溶液 2.4ml 0.5ml1.5mmol/L Tris-HClpH8.8 1.55ml /0.5mmol/L Tris-HClpH6.8 / 0.38ml去離子水 1.93ml 2.1ml10％SDS 60μl 30μl10％APS 60μl 30μlTEMED 2.4μl 3μl電泳濃縮膠用8V/cm，分離膠用15V/cm，恒壓電泳2hr，待溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)結(jié)束。染色觀(guān)察。
結(jié)果見(jiàn)圖9示泳道1顯示為IFN-α2a蛋白的條帶(相對(duì)分子質(zhì)量約19KD)，泳道2顯示為IL-2蛋白的條帶(約15.5KD)，泳道3，4在相應(yīng)位置未見(jiàn)蛋白條帶。
Western blotting檢測(cè)IL-2的蛋白表達(dá)◆常規(guī)蛋白電泳分離樣品；◆PVDF膜用甲醇浸濕，去離子水沖洗，再轉(zhuǎn)移到Transferring buffer中平衡20min，電泳膠置Transferring buffer中平衡20min，裁4張與膠同樣大小的Whatman 3mm濾紙，置Transferring buffer中平衡；◆按下列順序裝好blot負(fù)極—2層濾紙—電泳膠—PVDF膜—2層濾紙—正極；◆5％脫脂牛奶/PBST 20ml，水平搖床，室溫封閉1hr；也可以先室溫封閉若干時(shí)間，4℃過(guò)夜；◆用PBST稀釋一抗，5％BSA，稀釋倍數(shù)1000倍，將膜封在塑料袋中，不留氣泡，用膠帶固定在可垂直旋轉(zhuǎn)的小搖床上，偏轉(zhuǎn)角度70-80度，水平搖床，室溫1hr；先用PBST短暫地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗15min；◆用PBST稀釋二抗，5000倍或10000倍稀釋5％BSA，水平搖床，室溫1hr；先用PBST短暫地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗15min；◆將檢測(cè)試劑(ECL plus)從4℃取出，在打開(kāi)前平衡至室溫，檢測(cè)試劑的A液與B液以40∶1的比例混合，檢測(cè)試劑的用量為0.1ml/cm2；◆膜置于吸水紙上干燥，蛋白面朝上，檢測(cè)試劑加在膜上，覆蓋整個(gè)膜表面，室溫2min；◆用鑷子夾起PVDF膜，使膜的下邊角搭在紙巾上，吸干多余的檢測(cè)試劑；◆PVDF膜用保鮮膜封起，暗室曝光，時(shí)間10sec。
結(jié)果圖10示1-2分別為rBCGIL-2中的菌體和培養(yǎng)上清，均可見(jiàn)15.5KD的IL-2蛋白表達(dá)；3-4為pBCG的菌體和培養(yǎng)上清，未見(jiàn)蛋白表達(dá)；5-6為BCG的菌體和培養(yǎng)上清，未見(jiàn)蛋白表達(dá)。
3.rBCGIL-2自分泌IL-2的測(cè)定rBCG IL-2在試管中搖床培養(yǎng)10天，OD600值約為0.5時(shí)，裝入離心管中，離心2000rpm×10min，仔細(xì)吸取上清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-2的水平。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)品OD620值作縱坐標(biāo)，以平滑線(xiàn)連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；通過(guò)待測(cè)標(biāo)本的OD620值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出濃度。結(jié)果見(jiàn)圖11，與rBCGIFN-α2a相比，只在r BCG IL-2培養(yǎng)上清中檢測(cè)到高表達(dá)的IL-2為865.68pg/ml；而pBCG和BCG的培養(yǎng)上清中均未檢測(cè)到IL-2的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種分泌人白介素-2的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟1)卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)已有的卡介苗分泌抗原Ag85B信號(hào)肽和IL-2的基因序列，分別設(shè)計(jì)Ag85B信號(hào)肽和IL-2的擴(kuò)增引物，Ag85B信號(hào)肽的上下游酶切位點(diǎn)分別為BamHI和EcorI，IL-2的上下游酶切位點(diǎn)分別為EcorI和SalI，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別合成得到Ag85B信號(hào)肽和IL-2的基因片段，將Ag85B信號(hào)肽克隆到pMV261載體中，得到pMS，再將IL-2基因片段與pMS載體的信號(hào)肽連接，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSIL-2；2)卡介苗的培養(yǎng)選取卡介苗為上海丹麥株，將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基含有10％的營(yíng)養(yǎng)劑ADC、0.5％吐溫80和0.2％甘油，搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分，三周后卡介苗處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600值＝0.6，制得感受態(tài)卡介苗；3)電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建重組卡介苗rBCGIL-2在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態(tài)卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達(dá)載體pMSIL-2，置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化得到陽(yáng)性重組子，電轉(zhuǎn)參數(shù)電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω，陽(yáng)性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選，培養(yǎng)兩周后得到陽(yáng)性克隆rBCGIL-2，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基搖床生長(zhǎng)，大量培養(yǎng)；4)重組卡介苗rBCGIL-2的鑒定與功能檢測(cè)進(jìn)行抗酸染色初步確定rBCGIL-2為抗酸桿菌，抽提rBCGIL-2質(zhì)粒DNA后，PCR擴(kuò)增得到IL-2的基因片段，Western blotting檢測(cè)到rBCGIL-2培養(yǎng)上清中和菌體中有IL-2蛋白的表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)到rBCGIL-2培養(yǎng)上清中有高含量的IL-2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分泌人白介素-2的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述的Ag85B和IL-2的擴(kuò)增引物分別為Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′IL-2sense35′-AGCGAATTCATGGCACCTACTTCAAGTTC-3′antisense5′-AGCGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGC-3′。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的分泌人白介素-2的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述的pMV261載體上的測(cè)序引物為5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的分泌人白介素-2的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中均含有100μ/ml青霉素和100μg/ml放線(xiàn)菌酮。
5.一種采用權(quán)利要求1或2的方法構(gòu)建的分泌人白介素-2的重組卡介苗，其特征在于重組卡介苗包含Ag85B信號(hào)肽和IL-2基因片段。
6.一種權(quán)利要求5的分泌人白介素-2的重組卡介苗的應(yīng)用，其特征在于用于人的膀胱腫瘤及結(jié)核病的預(yù)防和治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分泌人白介素－2的重組卡介苗rBCGIL－2及其構(gòu)建方法，利用基因工程技術(shù)將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號(hào)肽片段和人IL－2的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSIL－2，然后采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將pMSIL－2導(dǎo)入BCG構(gòu)建重組卡介苗rBCGIL－2，依靠pMSIL－2在BCG的復(fù)制和信號(hào)肽的分泌作用，能夠高效分泌IL－2。本發(fā)明得到的重組卡介苗rBCGIL－2具有BCG和IL－2的雙重效果，能夠有效預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤及結(jié)核??；利用重組卡介苗rBCGIL－2在膀胱腔內(nèi)的局部協(xié)同作用減少BCG和外用IL－2的用量，可以克服BCG治療的毒副作用。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1710072SQ20051002577
公開(kāi)日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2005年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月12日
發(fā)明者夏術(shù)階, 劉海濤, 孫曉文, 凡杰, 張沂南 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)