專利名稱：一種重組人角質(zhì)細胞生長因子－2的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，更具體地涉及一種優(yōu)化的人角質(zhì)細胞生長因子-2(rhKGF-2)編碼序列、生產(chǎn)重組人角質(zhì)細胞生長因子-2的方法，以及用于該方法的表達載體和宿主細胞。
背景技術：
重組人角質(zhì)細胞生長因子-2(Recombinant Human Keratinocyte GrowthFactor-2，rhKGF-2)是治療糖尿病性靜脈潰瘍、潰瘍性結腸炎、高劑量化療引起的粘膜炎、燒燙傷等頑固性、慢性創(chuàng)傷的國家治療用生物制品1類新藥。它可特異性地刺激上皮細胞的增殖，同時促使表皮細胞生長和肉芽組織形成，降解多余膠原，減少疤痕的產(chǎn)生。
rhKGF-2最初通過序列同源性分析被列為FGF家族成員，又稱為FGF-10，該家族是參與軟組織生長的一個大家族，迄今發(fā)現(xiàn)的18個成員均有廣闊的促有絲分裂譜，即它們能促進中胚層和神經(jīng)外胚層起源的各種細胞的增殖和/或促進血管形成。rhKGF-2由208個氨基酸組成，它能特異性地結合于靶細胞表面的成纖維細胞生長因子受體2IIIb(fibroblast growth factor recptor-2IIIb，F(xiàn)GFR2IIIb)和成纖維細胞生長因子受體1IIIb(fibroblast growth factor recptor-1IIIb，F(xiàn)GFR1IIIb)，兩個受體觸發(fā)信號傳導，從而發(fā)揮生理作用。由于FGFR主要存在于上皮組織中，因此rhKGF-2可特異性地刺激上皮細胞的增殖，同時促使表皮細胞生長和肉芽組織形成，如刺激肝、腎、胰腺、膀胱上皮細胞的增殖和胃腸道細胞數(shù)量的增加；同時它通過激活膠原酶，降解疤痕組織中過多的膠原，抑制病理性疤痕的增生，使傷口愈合后不留明顯疤痕，是一種對傷口愈合非常有治療潛力的蛋白因子，因此凡有上皮組織的損傷處均可使用該產(chǎn)品，故在創(chuàng)傷愈合方面起著重要的作用。
Repifermin是美國HUMAN GENOME SCIENCES，Inc(HGS)開發(fā)的rhKGF-2產(chǎn)品。1998年2月開始進行rhKGF-2用于創(chuàng)口愈合的兩個I期試驗研究，其中一個是皮膚表面的局部用藥，另一個是通過注射的全身用藥。試驗的目的在于評價rhKGF-2的安全性、藥物動力學以及恰當?shù)膭┝?。試驗結果表明，在選定的劑量下，在人體系統(tǒng)中應用rhKGF-2是安全的，健康志愿者能夠良好耐受，幾乎無副作用。2001年4月5日HGS公司已開始更大規(guī)模的IIb試驗，在美國70個臨床試驗點考察700名患者以進一步評價KGF-2的使靜脈潰瘍完全愈合的效力。2003年4月2日HGS公司結束了Repifermin針對化療引起的粘膜炎臨床II期研究，結果表明Repifermin安全性好，且療效顯著。
目前國際上的rhKGF-2大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)工藝，其表達產(chǎn)物無論是否以包涵體形式存在，因密碼子未經(jīng)優(yōu)化，載體選擇不適當，造成表達量低，且必須經(jīng)過4-5步層析純化法才能獲得純度為90％的成品的結果。
在中國專利申請CN02110808.0中公開了一種利用大腸桿菌表達系統(tǒng)來生產(chǎn)人角質(zhì)細胞生長因子-2的方法。雖然該方法對選用的表達載體進行了優(yōu)化，使得表達量得以提高(約200ug/ml)，并優(yōu)化了分離純化工藝，然而由于選用的hKGF-2編碼序列仍然是天然的人hKGF-2序列，因此表達量的提高仍受到很大限制。
然而，目前為止用大腸桿菌生產(chǎn)人角質(zhì)細胞生長因子-2的效率還較低。因此，本領域迫切需要開發(fā)新的高效簡便的生產(chǎn)人角質(zhì)細胞生長因子-2的工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效和簡便的生產(chǎn)rhKGF-2的工藝。
本發(fā)明的另一目的是提供用于該方法的表達載體和宿主細胞。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種優(yōu)化的編碼人角質(zhì)細胞生長因子-2的DNA序列，其DNA序列如SEQ ID NO1所示。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達載體，它含有本發(fā)明上述優(yōu)選的hKGF-2編碼序列(包括DNA序列或RNA序列)。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體是插入了SEQ ID NO1所示序列的pET30a(+)/rhKGF-2。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發(fā)明上述的表達載體或所述的優(yōu)化的編碼人角質(zhì)細胞生長因子-2的DNA序列。更佳地，所述的宿主細胞是大腸桿菌。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)人角質(zhì)細胞生長因子-2的方法，它包括步驟(a)在適合表達人角質(zhì)細胞生長因子-2的條件下，用發(fā)酵罐培養(yǎng)本發(fā)明上述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出人角質(zhì)細胞生長因子-2。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體是含IPTG誘導的啟動子的表達載體pET30a(+)/rhKGF-2，或者所述的宿主細胞是大腸桿菌。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中進行高密度發(fā)酵。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(b)包括步驟(i)破碎發(fā)酵菌體，離心獲得破菌上清液；(ii)通過鹽析和/或超濾對破菌液上清液進行初步純化；(iii)層析純化，所述的層析純化選自親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、及其組合。
在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為30-40℃，更佳地34-38℃；pH在6～8之間，更佳地在6.5～7.5之間；葡萄糖或甘油濃度為0.1～5％，更佳地在0.3～3％；誘導劑為1mM IPTG，誘導前OD600在0.5～20之間，更佳地在1～10之間；誘導時間0.5～10小時，更佳地1～5小時。


圖1顯示了人KGF-2天然序列與本發(fā)明優(yōu)化序列的序列比對圖。顯示兩者的相同性較低，約70％。
圖2表達載體pET30a(+)/rhKGF-2的構建線路圖。
圖3重組表達載體pET30a(+)/rhKGF-2的酶切鑒定。各泳道如下1，5DNAMarker(New England公司)；2pET30a(+)/KGF-2質(zhì)粒；3pET30a(+)/KGF-2經(jīng)PstI酶切；4pET30a(+)/KGF-2經(jīng)NdeI+SalI酶切。
圖4不同培養(yǎng)基的SDS-PAGE電泳圖。各泳道如下1分子量標準品；2誘導前；3～6M9培養(yǎng)基(誘導1，2，3，4hr)；7～9M9-4培養(yǎng)基(誘導3，2，1hr)。
圖5高密度發(fā)酵電泳圖。1分子量標準品；2、51號和2號罐的誘導前；3、41號罐誘導2、3hr；6、72號罐誘導2、3hr。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過對hKGF-2編碼序列的一系列優(yōu)化，并經(jīng)篩選，在多個修飾序列中獲得了一個特別適合大腸桿菌表達的優(yōu)化序列(SEQ ID NO1)。該優(yōu)化序列不僅選用了大腸桿菌的優(yōu)選密碼子，還消除了一些不利于表達的二級結構，因此有助于在原核細胞高效、穩(wěn)定地表達的rhKGF-2。經(jīng)轉化的大腸桿菌，表達量可達約800mg/L。在此基礎上完成了本發(fā)明。
在另一優(yōu)選例中，用優(yōu)選的載體pET30a(+)進行表達，該載體有助于rhKGF-2真核基因在原核中的正確折疊，并以可溶性形式存在，從而簡化了分離純化工藝。
在另一優(yōu)選例中，用本發(fā)明優(yōu)化的hKGF-2編碼序列轉化的大腸桿菌(簡稱為“工程菌”)，經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導，rhKGF-2以可溶、活性形式存在于胞間質(zhì)，同時簡便純化工藝，通過簡便的二步純化方法，即可得到純度達95％的純品，獲得高表達、高得率、極具產(chǎn)業(yè)化價值的一種生產(chǎn)rhKGF-2的方法。
hKGF-2的cDNA序列是已知的，其成熟蛋白由170個氨基酸組成，理論分子量為19.3kD。成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
本發(fā)明人先根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性，在不改變其氨基酸序列的前提下對hKGF-2的cDNA序列進行了優(yōu)化，然后還消除了一些不利于表達的二級結構(如不利于轉錄的發(fā)夾結構等)，經(jīng)過測試，在眾多修飾序列中獲得了一個特別優(yōu)化的編碼序列。此優(yōu)化的編碼hKGF-2的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，與hKGF-2天然序列的同源性較低，僅約70％(見圖1)。本發(fā)明優(yōu)化的hKGF-2編碼序列仍然編碼天然的hKGF-2成熟多肽，即全長170個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ IDNO2)。
本發(fā)明的發(fā)明點主要在于改構的hKGF-2的全新基因設計。至于將改構的hKGF-2基因插入質(zhì)粒、轉化大腸桿菌細胞、工程菌的篩選、工程菌的發(fā)酵、以及產(chǎn)物的分離等技術基本上按本領域已知的常規(guī)方法進行(例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件)或按照中國專利申請CN02110808.0中所述的方法。
本發(fā)明的載體包括表達質(zhì)粒，例如含IPTG誘導的啟動子的質(zhì)粒表達載體，且在所述表達載體中插入了人角質(zhì)細胞生長因子-2(rhKGF-2)的編碼序列。一種特別優(yōu)選的表達載體是載體pET30a(+)、pSE280、pSE380和pSE420。
適用于本發(fā)明的宿主菌是原核宿主細胞，尤其是大腸桿菌(E.coli)。
通常，在KGF-2優(yōu)選序列的5’端與3’端分別加起始密碼子和終止密碼子，并引入特異性酶切位點，然后克隆入含IPTG誘導的啟動子的表達質(zhì)粒中，轉化與表達載體相容的大腸桿菌宿主菌，經(jīng)篩選鑒定后獲得工程菌。本發(fā)明的工程菌屬于IPTG誘導型。
在本發(fā)明中，工程菌表達rhKGF-2的發(fā)酵條件沒有特別限制?？梢圆捎帽绢I域常規(guī)的發(fā)酵條件。通常，工程菌在以蛋白胨、酵母粉、NH4Cl或(NH4)2SO4等為氮源，甘油、葡萄糖、乳糖等為碳源，維生素B1作為補充維生素的基礎培養(yǎng)基中，搖瓶內(nèi)或發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)、表達。
此外，通過控制添加各營養(yǎng)成分，控制培養(yǎng)、誘導階段溶氧(DO)、pH、溫度、時間、菌密度、比生長速率等因素，可以進一步提高表達量。
對于培養(yǎng)基的選擇，通常包括氮源、碳源、無機鹽、維生素、微量元素等的選擇。
(a)氮源含有機氮源和無機氮源，其中有機氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無機氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(b)無機鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩沖體系濃度20-200mM，pH5-8；Mg2+鹽0-5mM。
(c)在培養(yǎng)基中添加維生素B1作為補充維生素，濃度1～1000PPM。
(d)根據(jù)M9培養(yǎng)基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(e)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等?？梢允菃我惶荚矗部梢允腔旌咸荚?。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-5％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-5％。
對于誘導劑而言，可以單獨使用IPTG做誘導劑；對于誘導溫度而言，誘導溫度30-40℃，較佳地34-38℃，更佳地約37℃。
對于溶氧(DO)的控制而言，通常培養(yǎng)階段在30％以上，誘導階段在50％以上。
在發(fā)酵表達rhKGF-2后，對表達的rhKGF-2進行常規(guī)分離。
通常，發(fā)酵樣品先以離心、過濾等方式去除發(fā)酵液上清，獲得菌體。緩沖溶液懸浮菌體后，以超聲波破碎、高壓機械破碎等方式進行完全破菌，獲得破菌液。然后對破菌液進行離心以去除菌體碎片，獲得破菌液上清液。破菌液上清含目的蛋白質(zhì)rhKGF-2。破菌液上清可通過鹽析、超濾等方法進行初步純化后再進行層析純化，也可直接進行層析純化。
適用于本發(fā)明的層析技術包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
(a)親和層析選擇肝素親和凝膠介質(zhì)，鹽梯度或肝素梯度洗脫。
(b)陰離子層析。
經(jīng)過2-3步純化，可得到rhKGF-2純品，純化得率40％以上，純度95％以上。在本發(fā)明中，通過hKGF-2編碼序列的優(yōu)化，可將hKGF-2表達量從200mg/升提高到800～1000mg/升。
純化后rhKGF-2可用常規(guī)技術制成各種劑型。
在本發(fā)明的一個實例中，選擇了有助于真核基因在原核細胞中正確翻譯的質(zhì)粒載體含IPTG誘導的啟動子的表達載體，且在所述表達載體中插入了rhKGF-2的編碼序列，構建高效、穩(wěn)定表達的rhKGF-2工程菌(大腸桿菌)。經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導，rhKGF-2以可溶形式存在于胞內(nèi)及胞間質(zhì)；表達水平高，占菌體總蛋白50％左右，rhKGF-2表達量達800～1000mg/L發(fā)酵液。由于表達水平較高，rhKGF-2又具有天然活性，避免了復雜的復性過程，通過簡便、快速的二步純化方法，即獲得高質(zhì)量的rhKGF-2純品，每升發(fā)酵液可得rhKGF-2純品300mg，產(chǎn)品純度95％以上。
純化后原液加入適當輔料，制成rhKGF-2的注射用粉針劑。初步穩(wěn)定性試驗表明，該粉針劑穩(wěn)定。
中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液可獲得rhKGF-2純品約300mg或更多，因此適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)表達工藝簡單。
(2)表達量高。通過控制關鍵的發(fā)酵工藝條件，使表達水平達到800mg/L。
(3)純化工藝簡便，回收率高。由于蛋白是以可溶形式表達，因此簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規(guī)模生產(chǎn)rhKGF-2成為可能。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1rhKGF-2表達工程菌的構建1.目的基因的合成根據(jù)已知的hKGF-2的天然氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性并考慮消除發(fā)夾結構等不利于表達的二級結構，在不改變氨基酸序列的條件下，設計hKGF-2的編碼序列(如SEQ ID NO1所示)。委托上海生工生物工程技術有限公司合成所設計的hKGF-2優(yōu)化序列。
人工合成重組人角質(zhì)細胞生長因子-2(rhKGF-2)基因的全序列時，在該基因的5’端引入NdeI位點及在3’端引入Sal I位點。
2.表達質(zhì)粒-pET30a(+)/rhKGF-2的構建與轉化宿主菌表達質(zhì)粒為購自invitrogen公司的pET30a(+)表達載體(該表達載體含有IPTG誘導的啟動子)，宿主菌為常規(guī)的大腸桿菌BL21(DE3)。
參見圖2。用NdeI和SalI雙酶切分別處理基因rhKGF-2和表達載體pET30a(+)，37℃酶切3小時回收相應的片段用T4 DNA連接酶在16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉化進入大腸桿菌，在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB平板上挑選陽性克隆并進行質(zhì)粒酶切鑒定抽提的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶PstI及NdeI+SalI在37℃反應3小時，得到在pET30a(+)中插入了rhKGF-2基因的重組質(zhì)粒pET30a(+)/rhKGF-2。
利用Pst I進行酶切鑒定。Pst I酶切位點存在于KGF-2基因內(nèi)部，而載體上沒有該位點。如果Nde I+SalI雙酶切時，能切出大小約500bp的片段，就表明序列已正確插入載體pET30a(+)中。
酶切鑒定結果如圖3所示。結果顯示采用Pst I單酶切后(泳道3)，質(zhì)粒呈線性化狀態(tài)，大小在接近6000bp的位置；另經(jīng)過Nde I+SalI雙酶切后(泳道4)，能從電泳上看到大小約500bp左右的片段，以上情況說明KGF-2基因已正確插入載體pET30a(+)中。
此外，用常規(guī)方法進行正、逆向序列分析，證實克隆序列與設計序列完全一致。
搖瓶試驗，該工程菌培養(yǎng)后，經(jīng)IPTG誘導2小時后，目的蛋白表達量占總蛋白30％左右。
實施例2合適表達載體的選擇按照實施例1類似的方法，將SEQ ID NO1分別插入幾個不同的表達載體，如pTrc/HisA(購自invitrogen公司)、pBAD/HisA(購自invitrogen公司)、pSE380(購自invitrogen公司)的相同酶切位點(NdeI/SalI)，獲得質(zhì)粒pTrc/HisA/rhKGF-2、pBAD/HisA/rhKGF-2，pSE380/rhKGF-2。
將質(zhì)粒pTrc/HisA/rhKGF-2、pBAD/Hi sA/rhKGF-2，pSE380/rhKGF-2分別轉化相應的宿主菌，挑選出抗性菌株。與含質(zhì)粒pET30a(+)/rhKGF-2的工程菌一起進行搖瓶試驗，經(jīng)IPTG(或阿拉伯糖)誘導2小時后，含質(zhì)粒pET30a(+)/rhKGF-2的工程菌表達的目的蛋白表達量占總蛋白30％左右，而含質(zhì)粒pTrc/HisA/rhKGF-2、pBAD/HisA/rhKGF-2，pSE380/rhKGF-2的工程菌表達的目的蛋白表達量分別占總蛋白15％，18％和20％。
這表明，pET30a(+)/rhKGF-2表達載體優(yōu)于其他表達載體。
實施例3選擇最佳培養(yǎng)基挑實施例1中制備的轉入pET30a(+)/rhKGF-2的大腸桿菌BL21(DE3)(以下簡稱為“工程菌”)單克隆，接種到LB一級種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶30的比例二級接種于250ml LB的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)2～3hr左右，待OD600達到0.5～1即上罐發(fā)酵(M9培養(yǎng)基、改良M9-2培養(yǎng)基、或改良M9-4培養(yǎng)基)，pH6.8～7.2、溫度37℃、DO＞50％，待OD600達到3～4加入1mM的IPTG開始誘導，待pH上升(碳源耗盡)后以合適轉度流加10％的碳源(葡萄糖)及氮源補料維持pH在6.8～7.2，誘導3hr結束。樣品進行SDS-PAGE檢測(并掃描)、測定蛋白含量。
蛋白含量測定結果如圖4所示。結果表明，M9和M9-4培養(yǎng)基都可用于表達hKGF-2，而M9-4培養(yǎng)基優(yōu)于M9。
另外，用M9-2培養(yǎng)基培養(yǎng)基也可獲得較高的蛋白含量。
培養(yǎng)基配方

實施例4工程菌高密度發(fā)酵的研究挑工程菌單克隆，接種到高密度改良M9培養(yǎng)基種子液中，過夜培養(yǎng)，OD600達到1～4即上罐發(fā)酵(高密度改良M9培養(yǎng)基)，控制pH7.0、溫度37℃、DO＞50％，大約3～4hr后開始流加補料，待OD600達到10左右加入1mM的IPTG開始誘導，每1hr留樣，誘導3hr結束。樣品檢測SDS-PAGE(并掃描)、測定蛋白含量。
蛋白含量結果見圖5。結果表明，運用高密度發(fā)酵工藝對KGF-2的產(chǎn)量進行優(yōu)化，結果證明是非常成功的，在表達水平基本未下降的基礎上(30％左右)，由于大大提高了菌密度，使每升培液的濕菌重進一步達到25g以上，目的蛋白表達量提高到800～1000mg/L培液，大大提高了hKGF-2的生產(chǎn)效率。
實施例5rhKGF-2的純化發(fā)酵液4℃下5000rpm離心10min，得菌體，菌體高壓破菌，8000rpm離心30min，得上清。超濾濃縮及更換緩沖液使用Millipore超濾器，超濾膜截流分子量為10KD，超濾時留取濃縮液(作用是去除小分子雜質(zhì)和鹽類)。發(fā)酵液上清超濾至體積剩下500ml左右，加入PBS(PH7.4，20mM)，繼續(xù)超濾；反復此程序，直至樣品的電導水平和PBS(PH7.4，20mM)緩沖液的電導水平接近。
1.層析1(親和層析)層析介質(zhì)肝素緩沖液溶液APBS(PH7.4，20mM)溶液BPBS(PH7.4，20mM)+1M NaCl上樣將超濾濃縮的rhKGF-2溶液上樣。
清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集rhKGF-2樣品峰。
2.層析2(陰離子層析)層析介質(zhì)Q Sepharose FF緩沖液溶液APBS(PH7.4，20mM)溶液BPBS(PH7.4，20mM)+1M NaCl
上樣將rhKGF-2溶液上樣。
清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集rhKGF-2樣品峰。
樣品經(jīng)過此二步純化，即親和層析、陰離子層析以后，純度提高至95％以上。
用常規(guī)的MTT顯色法測定hKGF-2對常規(guī)的NIH3T3細胞(小鼠成纖維細胞)的促進增生作用。結果表明，純化后的hKGF-2具有促進NIH3T3細胞的促進增生作用，且活性與市售的hKGF-2相同。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2的生產(chǎn)方法<130>054737<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>510<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(510)<223>優(yōu)化的人角質(zhì)細胞生長因子-2(rhKGF-2)編碼序列<400>1gcattaggtc aagatatggt gagcccggaa gcgaccaaca gcagcagcag cagctttagc 60agcccgagca gcgcgggccg ccatgtgcgc agctataacc atctgcaggg cgatgtgcgc120tggcgcaaac tgtttagctt taccaaatat tttctgaaaa ttgaaaaaaa cggcaaagtg180agcggcacca aaaaagaaaa ctgcccgtat agcattctgg aaattaccag cgtggaaatt240ggcgtggtgg cggtgaaagc gattaacagc aactattatc tggcgatgaa caaaaaaggc300aaactgtatg gcagcaaaga atttaacaac gattgcaaac tgaaagaacg cattgaagaa360aacggctata acacctatgc gagctttaac tggcagcata acggccgcca gatgtatgtg420gcgctgaacg gcaaaggcgc gccgcgccgc ggccagaaaa cccgccgcaa aaacaccagc480gcgcattttc tgccgatggt ggtgcatagc 510<210>2<211>170<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2
Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser1 5 10 15Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr20 25 30Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr35 40 45Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys50 55 60Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile65 70 75 80Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met85 90 95Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys100 105 110Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser115 120 125Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly130 135 140Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser145 150 155 160Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser165 170
權利要求
1.一種編碼人角質(zhì)細胞生長因子-2的DNA序列，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO1所示。
2.一種表達載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA序列。
3.如權利要求2所述的表達載體，其特征在于，所述的表達載體是插入了SEQ ID NO1所示序列的pET30a(+)/rhKGF-2。
4.一種宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求2所述的表達載體或權利要求1所述的編碼人角質(zhì)細胞生長因子-2的DNA序列。
5.如權利要求4所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞是大腸桿菌。
6.一種生產(chǎn)人角質(zhì)細胞生長因子-2的方法，其特征在于，它包括步驟(a)在適合表達人角質(zhì)細胞生長因子-2的條件下，用發(fā)酵罐培養(yǎng)權利要求4所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出人角質(zhì)細胞生長因子-2。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的表達載體是含IPTG誘導的啟動子的表達載體pET30a(+)/rhKGF-2，或者所述的宿主細胞是大腸桿菌。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中進行高密度發(fā)酵。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步驟(b)包括步驟(i)破碎發(fā)酵菌體，離心獲得破菌上清液；(ii)通過鹽析和/或超濾對破菌液上清液進行初步純化；(iii)層析純化，所述的層析純化選自親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、及其組合。
10.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為30-40℃，更佳地34-38℃；pH在6～8之間，更佳地在6.5～7.5之間；葡萄糖或甘油濃度為0.1～5％，更佳地在0.3～3％；誘導劑為1mM IPTG，誘導前OD600在0.5～20之間，更佳地在1～10之間；誘導時間0.5～10小時，更佳地1～5小時。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的人角質(zhì)細胞生長因子－2(rhKGF－2)編碼序列、生產(chǎn)重組人角質(zhì)細胞生長因子－2的方法，以及用于該方法的表達載體和宿主細胞。通過采用的優(yōu)化hKGF－2序列，本發(fā)明方法不僅表達量高，而且分離純化工藝簡便。本發(fā)明還提供了相應的表達載體和工程菌。
文檔編號C12N15/70GK1888066SQ20051002720
公開日2007年1月3日 申請日期2005年6月28日 優(yōu)先權日2005年6月28日
發(fā)明者任軍, 黃陽濱, 孫九如, 豐濤, 杜碧金 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司