專利名稱：一種制備那西肽預(yù)混劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種藥用飼料添加劑的制備方法，具體涉及一種制備含硫多肽類抗生素那西肽預(yù)混劑的方法。
背景技術(shù)：
飼料安全是綠色環(huán)保食品的基本點(diǎn)，我國幅員遼闊，人口眾多，隨著改革開放的步伐加快，人民生活水平提高，畜禽水產(chǎn)的需求量也日益增多。另外我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，禽畜產(chǎn)品出口量很大，但藥物殘留問題很嚴(yán)重，因此研究和開發(fā)綠色飼料添加劑對保障人民身體健康和發(fā)展我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)十分必要。2001年7月農(nóng)業(yè)部頒發(fā)了《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》的通知，并列出了33種符合規(guī)范的飼料藥物添加劑，那西肽是其中之一。它是一種新型非吸收型的飼用抗生素。
新獸藥那西肽(又名諾西肽，英文名Nosiheptide)是生物工程的產(chǎn)物，由Streptomyces actuosus發(fā)酵產(chǎn)生，為含硫多肽類抗生素，其結(jié)構(gòu)為12種氨基酸及衍生物合成的多肽，分子量為1222。那西肽是一種黃色結(jié)晶，較難溶于水。其結(jié)構(gòu)(Merck index，fourth edtion)見圖7。分子中由五個(gè)噻唑環(huán)、一個(gè)吡啶環(huán)、一個(gè)吲哚環(huán)、一個(gè)蘇氨酸和一個(gè)谷氨酸組成，側(cè)鏈?zhǔn)且粋€(gè)脫氫丙氨酸。那西肽對革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的抑制作用，其作用機(jī)理是抑制翻譯過程中的延長因子Tu和G，抑制革蘭氏陽性菌的生長。同時(shí)抑制鳥苷三、四磷酸酶的合成。
那西肽是國外1961年發(fā)現(xiàn)的化合物，70年代法國朗普洛克公司曾對其進(jìn)行研究，80年代未由日本三菱公司開發(fā)成新型非吸收型的飼用抗生素，并于1987年12月25日被日本政府批準(zhǔn)為法定的飼料添加劑，列入了日本飼料安全法，其商品名為PrilnofaX(Hess & Clark)。由于其在體內(nèi)不殘留的性質(zhì)，目前被歐共體、北美、日本等國廣泛使用那西肽作為飼料用添加劑具有以下特點(diǎn)1，動(dòng)物專用抗生素，不引起交叉耐藥。2，在動(dòng)物體內(nèi)不殘留，不污染食品。3，添加量少(5-10ppm)，促生長效果明顯(增重8-10％)。并提高飼料報(bào)酬。4，.應(yīng)用范圍廣，可用于禽、畜、魚等。
1988年上海醫(yī)科大學(xué)對那西肽進(jìn)行開發(fā)研究，1998年6月獲農(nóng)業(yè)部頒發(fā)那西肽新獸藥證書(三類)(原料藥和預(yù)混劑)。并經(jīng)中國獸藥監(jiān)察所對那西肽樣品的測試鑒定，產(chǎn)品質(zhì)量與國外同類產(chǎn)品完全一致。2002年，浙江杭州匯能生物技術(shù)公司與復(fù)旦大學(xué)合作將那西肽產(chǎn)業(yè)化，其中，那西肽產(chǎn)生菌S.actuosus Z13，為生產(chǎn)菌種，商品名為“諾農(nóng)”。目前年銷售產(chǎn)值7000萬。并在禽、畜和水產(chǎn)上廣泛應(yīng)用，獲得良好的社會效益。但是綜觀國內(nèi)外文獻(xiàn)，尚未見有關(guān)那西肽預(yù)混劑制備方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的的目的是提供一種制備那西肽預(yù)混劑的方法。尤其是制備含硫多肽類抗生素那西肽預(yù)混劑的方法。
本發(fā)明方法包括下述步驟1，基因工程制備那西肽產(chǎn)生菌Streptomyces actuosus本發(fā)明在已知的那西肽產(chǎn)生菌S.actuosusZ13的研究基礎(chǔ)上，采用基因工程技術(shù)改變那西肽產(chǎn)生菌Z13的代謝，提高其產(chǎn)量。
首先，采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建含透明顫菌血紅蛋白(VHb)的基因vhb的重組DNA(基因工程操作見附圖1，2)，通過轉(zhuǎn)化和結(jié)合轉(zhuǎn)移方法將含vhb基因的重組DNA轉(zhuǎn)入Z13，獲得工程鏈霉菌Streptomyces actuosus，(工程菌代號Z14，Z15)。在工業(yè)生產(chǎn)供氧不足的情況下，由于VHb蛋白的大量表達(dá)，提高了活躍鏈霉菌Streptomyces.actuosus Z14，Z15對氧的利用效率，使菌體生長旺盛，從而達(dá)到提高那西肽產(chǎn)率和降低生產(chǎn)成本的目的。
第二，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建含S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMs的基因sam的重組DNA(基因工程操作見附圖3，4)，通過轉(zhuǎn)化和結(jié)合轉(zhuǎn)移方法將含sam基因的重組DNA轉(zhuǎn)入Z13，獲得工程鏈霉菌Streptomyces actuosus工程菌(工程菌代號Z16，Z17)。通過SAMs蛋白的表達(dá)，改變了活躍鏈霉菌Streptomyces.actuosus Z13的硫代謝，提高了S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量，從而達(dá)到提高那西肽產(chǎn)量的目的。
第三，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)構(gòu)建含vhb和sam兩個(gè)基因的重組DNA，(基因工程操作見附圖5，6)，通過轉(zhuǎn)化和結(jié)合轉(zhuǎn)移方法將含vhb和sam兩個(gè)基因的重組DNA轉(zhuǎn)入Z13，獲得工程鏈霉菌Streptomyces actuosus(工程菌代號Z18，Z19)，通過VHb和SAMs蛋白的表達(dá)改變活躍鏈霉菌的代謝，達(dá)到提高那西肽產(chǎn)量的目的。
2.那西肽發(fā)酵；那西肽發(fā)酵培養(yǎng)基由黃豆粉、葡萄糖、無機(jī)鹽等組成，控制最佳溫度為26-30℃，pH為中性，發(fā)酵周期為9-10天。
3，分離提取那西肽采用溶媒法將菌體內(nèi)的那西肽提取，發(fā)酵液量取體積數(shù)，加入等體積酒精，均漿、離心、收集上清、濃縮、用正丁醇萃取、濃縮蒸干、加入二氧六環(huán)溶解，再加入水沉淀那西肽、沉淀的那西肽用水洗，且烘干。用HPLC測定含量和按獸藥典檢測生物活性。
4制備那西肽預(yù)混劑取那西肽，加入淀粉、黃豆餅粉、米糠粉、玉米粉、麩皮、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等輔料，逐級稀釋，混合拌勻、做成0.25％-10％不同規(guī)格的預(yù)混劑。用HPLC測定含量和按藥典檢測生物活性。


圖.1vhb轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖2，含vhb整合載體的構(gòu)建圖.3含sam轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖4，含sam整合載體的構(gòu)建圖5，含vhb和sam轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建圖6，含vhb和sam整合載體的構(gòu)建圖7，那西肽結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1那西肽產(chǎn)生菌Z13接種于種子罐，生長40-48小時(shí)，按5％接種量接入30噸發(fā)酵罐，以1∶1通氣量，控制溫度為28-30℃，攪拌160-180轉(zhuǎn)/分其中根據(jù)pH和糖含量、菌體形態(tài)補(bǔ)料，培養(yǎng)9天，出料20噸，每升發(fā)酵單位達(dá)2.3克。經(jīng)提取獲那西肽23.46公斤(純度85％)；加入加入淀粉、黃豆餅粉、米糠粉、玉米粉、麩皮、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等輔料，逐級稀釋，混合拌勻，得預(yù)混劑7.98噸(0.25％規(guī)格)。
實(shí)施例2，那西肽產(chǎn)生菌Z14接種于種子罐，生長40-48小時(shí)，按5％接種量接入30噸發(fā)酵罐，以1∶0.5通氣量，控制溫度為28-30℃，攪拌160-180轉(zhuǎn)/分，其中根據(jù)pH和糖含量、菌體形態(tài)補(bǔ)料，培養(yǎng)9天，出料20噸，每升發(fā)酵單位達(dá)3.2克。經(jīng)提取獲那西肽32.6公斤(純度85％)；加入淀粉、黃豆餅粉、麩皮、米糠粉、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等，逐級稀釋，混合拌勻，得預(yù)混劑11.08噸(0.25％規(guī)格)。
實(shí)施例3，那西肽產(chǎn)生菌Z15接種于種子罐，生長40-48小時(shí)，按5％接種量接入30噸發(fā)酵罐，以1∶0.5通氣量，控制溫度為28-30℃，攪拌160-180轉(zhuǎn)/分，其中根據(jù)pH和糖含量、菌體形態(tài)補(bǔ)料，培養(yǎng)9天，出料21噸，每升發(fā)酵單位達(dá)4.2克。經(jīng)提取獲那西肽44.982公斤(純度85％)；加入淀粉、黃豆餅粉、米糠粉、麩皮、玉米粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等，逐級稀釋，混合拌勻，得預(yù)混劑(0.5％規(guī)格)7.65噸。
實(shí)施例4，那西肽產(chǎn)生菌Z16接種于種子罐，生長40-48小時(shí)，按5％接種量接入50噸發(fā)酵罐，以1∶0.8通氣量，控制溫度為28-30℃，攪拌160轉(zhuǎn)/分，其中根據(jù)pH和糖含量、菌體形態(tài)補(bǔ)料，培養(yǎng)9天，出料35噸，每升發(fā)酵單位達(dá)4.5克。經(jīng)提取獲那西肽80.33公斤(純度85％)；加入米糠粉、麩皮、玉米粉、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等，逐級稀釋，混合拌勻，得預(yù)混劑(0.5％規(guī)格)13.656噸。
實(shí)施例5，那西肽產(chǎn)生菌Z19接種于種子罐，生長40-48小時(shí)，按5％接種量接入50噸發(fā)酵罐，以1∶0.5通氣量，控制溫度為28-30℃，攪拌160轉(zhuǎn)/分，其中根據(jù)pH和糖含量、菌體形態(tài)補(bǔ)料，培養(yǎng)9天，出料35噸，每升發(fā)酵單位達(dá)5.0克。經(jīng)提取獲那西肽89.25公斤(純度85％)；加入米糠粉、麩皮、玉米粉、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等，逐級稀釋，混合拌勻，得預(yù)混劑(5％規(guī)格)1.517噸。
權(quán)利要求
1.一種制備那西肽預(yù)混劑的方法，其特征是包括下述步驟1)基因工程制備那西肽產(chǎn)生菌；2)那西肽發(fā)酵；3)分離提取那西肽；4)取上述那西肽，加入輔料，逐級稀釋，混合拌勻、制備那西肽預(yù)混劑。
2.按權(quán)利要求1所述的制備那西肽預(yù)混劑的方法，其特征是所述的步驟1中采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建含透明顫菌血紅蛋白的基因vhb的重組DNA，通過轉(zhuǎn)化和結(jié)合轉(zhuǎn)移將含vhb基因的重組DNA轉(zhuǎn)入Z13，獲得工程鏈霉菌Z14，Z15；構(gòu)建含S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMs的基因sam的重組DNA，通過轉(zhuǎn)化和結(jié)合轉(zhuǎn)移將含sam基因的重組DNA轉(zhuǎn)入Z13，獲得工程鏈霉菌Z16，Z17；建含vhb和sam兩個(gè)基因的重組DNA，通過轉(zhuǎn)化和結(jié)合轉(zhuǎn)移將含vhb和sam兩個(gè)基因的重組DNA轉(zhuǎn)入Z13，獲得工程鏈霉菌Z18，Z19。
3.按權(quán)利要求1所述的制備那西肽預(yù)混劑的方法，其特征是所述的步驟2其中那西肽發(fā)酵培養(yǎng)基含黃豆粉、葡萄糖和無機(jī)鹽成份，控制溫度為26-30℃，pH為中性，發(fā)酵周期為9-10天。
4.按權(quán)利要求1所述的制備那西肽預(yù)混劑的方法，其特征是所述的步驟3其中采用溶媒法提取菌體內(nèi)的那西肽，發(fā)酵液量取體積數(shù)，加入等體積酒精，均漿、離心、收集上清、濃縮、用正丁醇萃取、濃縮蒸干、加入二氧六環(huán)溶解，再加入水沉淀那西肽，水洗沉淀物，烘干，測定含量和檢測生物活性。
5.按權(quán)利要求1所述的制備那西肽預(yù)混劑的方法，其特征是所述的步驟4其中那西肽的含量為0.25％-10％，所述輔料包括淀粉、黃豆餅粉、米糠粉、玉米粉、麩皮、大米蛋白粉、CaCO3和沸石粉。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種藥用飼料添加劑的制備方法，具體涉及一種制備含硫多肽類抗生素那西肽預(yù)混劑的方法。本發(fā)明通過基因工程制備那西肽產(chǎn)生菌，進(jìn)行那西肽發(fā)酵，分離提取后加入輔料，逐級稀釋，混合拌勻、制備那西肽預(yù)混劑。檢測結(jié)果表明本方法能提高活躍鏈霉菌對氧的利用效率，使菌體生長旺盛，從而達(dá)到提高那西肽產(chǎn)率和降低生產(chǎn)成本的目的。
文檔編號C12P21/02GK1899599SQ20051002787
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月19日
發(fā)明者周珮, 陳貴才, 馮美卿, 李繼揚(yáng), 萬睿, 文勇 申請人:復(fù)旦大學(xué)