專利名稱：一種基因突變的古紫質(zhì)4蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程和信息材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因突變古紫質(zhì)4及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自然界中存在一類對(duì)光敏感的蛋白家族，稱之為光色蛋白。盡管這類蛋白十分稀少，但其在光合作用，光感知等方面扮演了重要的角色，引起人們廣泛的重視和深入的研究，它們的各種技術(shù)應(yīng)用也在不斷被開(kāi)發(fā)。其中，細(xì)菌視紫紅質(zhì)(菌紫質(zhì))蛋白是被研究最深入、技術(shù)應(yīng)用開(kāi)發(fā)最多的光色蛋白之一。細(xì)菌視紫紅質(zhì)(BR)是一種生長(zhǎng)在鹽湖中的嗜鹽菌上的含有視黃醛的膜蛋白，光照下產(chǎn)生光循環(huán)，包括一系列不同吸收峰值的光循環(huán)中間體，具有光致變色的性質(zhì)；其天然的晶體結(jié)構(gòu)以及極端的生存環(huán)境(高鹽、缺氧)使其高度穩(wěn)定、耐溫、耐酸堿，優(yōu)于絕大多數(shù)生物大分子；其千百萬(wàn)年生物進(jìn)化形成的光學(xué)敏感性和光循環(huán)周期性的大大優(yōu)于現(xiàn)有的無(wú)機(jī)和有機(jī)合成的光致變色材料。細(xì)菌視紫紅質(zhì)這種獨(dú)到的性能使其可以應(yīng)用在光信息存儲(chǔ)(包括兩維存儲(chǔ)、三維存儲(chǔ)和全息存儲(chǔ)等)和光信息處理(包括光轉(zhuǎn)換、光過(guò)濾和信號(hào)調(diào)節(jié)等)等方面。(Hampp，N.Chem.Rev.2000，100，1755-1776)古紫質(zhì)(Archaerhodopsin，AR)是另一類光致變色蛋白，與細(xì)菌視紫紅質(zhì)具有十分相似的結(jié)構(gòu)和功能，屬于菌紫質(zhì)大家族的一個(gè)重要分支(Mukohata，Y.et al.Biophys.Chem.1994，50，191-201)。古紫質(zhì)一詞由Mukohata等人最先提出(Mukohata，Y.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.1988，151，1339-1345)，用來(lái)描述在澳大利亞發(fā)現(xiàn)的兩種同樣含有視黃醛的光致變色蛋白，分別被命名為古紫質(zhì)1(AR1)和古紫質(zhì)2(AR2)。AR和BR被認(rèn)為是菌紫質(zhì)家族中不同的屬。第三種古紫質(zhì)(AR3)由Ihara等人描述(Ihara，K.et al.J.Mol.Biol.1999，285，163-17)，但卻難以分離純化。我們從西藏鹽湖中發(fā)現(xiàn)了另一種嗜鹽菌株xz515，從中分離出一種同樣具有光循環(huán)特性的膜蛋白，其序列與AR1具有87％的同源性，與AR2具有97％的同源性，我們把它命名為古紫質(zhì)4(AR4)(Li，Q.G.et al.Biochim.Biophys.Acta-Biomembr.2000，1466，260-266)。
在光信息存儲(chǔ)和處理方面，關(guān)鍵是能夠找到光色蛋白易于區(qū)分的雙穩(wěn)態(tài)。菌紫質(zhì)蛋白光循環(huán)中M態(tài)吸收峰位于410nm左右，而其基態(tài)吸收峰則位于570nm附近，是一個(gè)理想的選擇。然而，無(wú)論是野生細(xì)菌視紫紅質(zhì)還是野生古紫質(zhì)，其在溶液環(huán)境中整個(gè)光循環(huán)只有幾十毫秒，M態(tài)壽命則更短，難以應(yīng)用于光信息的存儲(chǔ)和處理。對(duì)其進(jìn)行改性，使其功能得到優(yōu)化就顯得十分重要。從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和專利檢索中來(lái)看，已經(jīng)有大量的對(duì)細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白(BR)進(jìn)行化學(xué)、物理和基因工程改性的技術(shù)應(yīng)用，但至今沒(méi)有基于古紫質(zhì)的光致變色特性方面的應(yīng)用。其中一個(gè)原因在于這些古紫質(zhì)周圍的脂環(huán)境中都含有一種玉紅素，無(wú)法在分離膜蛋白的過(guò)程當(dāng)中被除去，而玉紅素的特征吸收峰恰好掩蓋了菌紫質(zhì)的正常吸收峰，并且不隨菌紫質(zhì)光循環(huán)變化而變化，因而嚴(yán)重虛弱了菌紫質(zhì)光致變色的反差，使其很難得以應(yīng)用。
目前尚未見(jiàn)有關(guān)古紫質(zhì)4的基因工程方面的報(bào)道，也未見(jiàn)任何關(guān)于所有古紫質(zhì)與聚合物復(fù)合膜的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種具有優(yōu)良光信息存儲(chǔ)性能的基因突變修飾的古紫質(zhì)4及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明提出的基因突變的古紫質(zhì)4蛋白，是對(duì)古紫質(zhì)4蛋白的光循環(huán)、質(zhì)子泵有重要影響的氨基酸進(jìn)行突變修飾而獲得，其光循環(huán)中間體壽命在相同條件下與野生古紫質(zhì)4蛋白相比有數(shù)量級(jí)上的延長(zhǎng)。
上述的進(jìn)行突變修飾的氨基酸，是位于古紫質(zhì)4蛋白質(zhì)子泵通道內(nèi)的對(duì)質(zhì)子傳遞有重要作用的極性氨基酸，包括第96位的天冬氨酸、第212位的天冬氨酸，或者第194位的谷氨酸和第204位谷氨酸等其它氨基酸。
上述的突變修飾，既可以是上述位點(diǎn)的極性氨基酸單獨(dú)的突變修飾，也可以是上述位點(diǎn)極性氨基酸的任意排列組合的共同的突變修飾，并且突變的目的氨基酸是任意一種非極性氨基酸。
上述的基因突變的古紫質(zhì)4蛋白，是一種紫色蛋白，不含玉紅素成分，具有顯著的光致變色的特性，因而可用于光信息存儲(chǔ)和處理。
本發(fā)明還提出上述的可應(yīng)用于光信息存儲(chǔ)和處理的基因突變的古紫質(zhì)4蛋白的制備方法利用基因工程技術(shù)，將經(jīng)過(guò)關(guān)鍵位點(diǎn)突變修飾的古紫質(zhì)4基因轉(zhuǎn)入到原本不產(chǎn)生古紫質(zhì)的菌株中、并表達(dá)古紫質(zhì)突變體，通過(guò)菌體放大培養(yǎng)、分離、提取、純化得到不含玉紅素的基因突變的古紫質(zhì)4蛋白。其具體步驟如下(1)利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得上述的關(guān)鍵位點(diǎn)修飾的古紫質(zhì)4蛋白的目的基因。
(2)利用pXLNov-r-AR4質(zhì)粒為模板，用Taq DNA聚合酶PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因的突變點(diǎn)上游(N端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段，擴(kuò)增得到759bp的DNA片段，PCR擴(kuò)增所用的引物為5’-CGGGATCCGACGTGAAGATG-3’(引物1)和5’-CCAGCAGGGCGAGGACGAGCAGCAG-3’(引物2)，其中下劃線的部分是新導(dǎo)入BamHI限制位點(diǎn)。
(3)PCR擴(kuò)增古紫質(zhì)4突變點(diǎn)下游(C端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段，擴(kuò)增得到502bp的DNA片段，所用的引物為5’-CTGCTGCTCGTCCTCGCCCTGCTGG-3’(引物3)和5’-GCGCAAGCTTCCCTTCACTCTCAAGTGCCG-3’(引物4)，下劃線部分是新導(dǎo)入的HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
(4)將PCR擴(kuò)增的細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因突變點(diǎn)上游(N端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段和下游(C端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段混合在一起，利用引物1和引物4重新用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增得到一個(gè)兩端分別帶有BamHI和HindIII限制位點(diǎn)的1.2kb的基因序列，命名為bp-mAR4。
(5)將這個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物bp-mAR4克隆到pSK質(zhì)粒上，進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明其序列與目的基因序列完全匹配。
(6)將克隆在pSK質(zhì)粒上并經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的bp-mAR4基因以BamHI和HindIII這兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到pXLNov-r質(zhì)粒上，將構(gòu)建形成的pXLNov-bp-mAR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到嗜鹽菌株(H.salinarium)L33中。
(7)轉(zhuǎn)化株在含有0.3μg/mL新生酶素(novobiocin)中培養(yǎng)12-16天，然后取出10個(gè)克隆分別在JL培養(yǎng)液中(含0.3μg/mL新生酶素)37℃下震蕩培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株經(jīng)過(guò)逐級(jí)放大培養(yǎng)、分離、純化，最終得到基因工程表達(dá)的不含玉紅素的基因突變的古紫質(zhì)4蛋白。
本發(fā)明還提出上述基因突變的古紫質(zhì)4蛋白制備聚合物復(fù)合膜的應(yīng)用，該復(fù)合膜由古紫質(zhì)4蛋白和聚合物組合構(gòu)成，具有可加工性和一定規(guī)則形狀，并具有光致變色特性。
上述復(fù)合膜中，聚合物為不導(dǎo)致古紫質(zhì)變性的聚合物，一般為水溶性聚合物，并具有良好成膜性能，如聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺(PAAM)、明膠或者它們的各種混合物，或者它們的衍生物。
上述的復(fù)合膜，其特征是外觀均勻平整，具有各種規(guī)則形狀，可進(jìn)一步加工，568nm處的光密度(OD)值為0.5～2。
上述復(fù)合膜的制備方法如下將基因突變修飾的古紫質(zhì)4蛋白冷凍干燥，制成干粉，加入到水溶性聚合物溶液中，混合液中突變古紫質(zhì)4蛋白的含量為10mg/mL～15mg/mL，水溶性聚合物(聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺(PAAM)及其它們的混合物和衍生物)溶液的質(zhì)量百分比為10％～30％；并且用NaOH溶液或tris溶液調(diào)節(jié)pH值為7～12；將混合液放在細(xì)胞粉碎機(jī)上冰水浴超聲，超聲功率100-250W，超聲時(shí)間3-15s，間隔30s以上，超聲次數(shù)10-100次，使蛋白均勻分散在聚合物溶液中。將混合液滴加在模具中，使其自然鋪展；將載有聚合物和突變古紫質(zhì)4蛋白混合液的模具平放入盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，并將干燥器置于1-10℃的環(huán)境中20-30小時(shí)，得到均勻平整的基因突變古紫質(zhì)4蛋白/聚合物復(fù)合膜。
本發(fā)明是利用基因工程定點(diǎn)突變的辦法和獲得基因突變的古紫質(zhì)4蛋白，既成功去除了現(xiàn)有各種方法無(wú)法去除的古紫質(zhì)中的玉紅素的成分，又使得經(jīng)過(guò)兩種途徑同時(shí)修飾的古紫質(zhì)4蛋白光循環(huán)中M中間態(tài)的壽命有了數(shù)量級(jí)以上的延長(zhǎng)，從而使古紫質(zhì)蛋白的光致變色特性能夠應(yīng)用于光信息的存儲(chǔ)與處理等方面；同細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白一樣，古紫質(zhì)長(zhǎng)期的進(jìn)化使得其許多方面的特性，特別是光敏感性和光致變色的可重復(fù)性，大大優(yōu)于絕大多數(shù)無(wú)機(jī)和有機(jī)光致變色材料，而且具有無(wú)毒、無(wú)害、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1.實(shí)施例3中的突變型AR4(D96V)、AR4(D212G)與野生型AR4(WT)的M中間體衰減速率的比較。(水溶液中，pH＝7.0)圖2.本發(fā)明實(shí)施例5中的D96V AR4/PVA復(fù)合膜的光循環(huán)中的M態(tài)衰減。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得將第96位天冬氨酸(Asp)突變成纈氨酸(Val)的古紫質(zhì)4蛋白的目的基因。利用pXLNov-r-AR4質(zhì)粒為模板，用Taq DNA聚合酶PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因的第96位點(diǎn)上游(N端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段，擴(kuò)增得到759bp的DNA片段，PCR擴(kuò)增所用的引物為5’-CGGGATCCGACGTGAAGATG-3’(引物1)和5’-CCAGCAGGGCGAGGACGAGCAGCAG-3’(引物2)，其中下劃線的部分是新導(dǎo)入BamHI限制位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增古紫質(zhì)4突變的第96位點(diǎn)下游(C端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段，擴(kuò)增得到502bp的DNA片段，所用的引物為5’-CTGCTGCTCGTCCTCGCCCTGCTGG-3’(引物3)和5’-GCGCAAGCTTCCCTTCACTCTCAAGTGCCG-3’(引物4)，下劃線部分是新導(dǎo)入的HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增的細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因突變點(diǎn)上游(N端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段和下游(C端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段混合在一起，利用引物1和引物4重新用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增得到一個(gè)兩端分別帶有BamHI和HindIII限制位點(diǎn)的1.2kb的基因序列，命名為bp-mAR4。將這個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物bp-mAR4克隆到pSK質(zhì)粒上，進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明其序列與目的基因序列完全匹配。將克隆在pSK質(zhì)粒上并經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的bp-mAR4基因以BamHI和HindIII這兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到pXLNov-r質(zhì)粒上，將構(gòu)建形成的pXLNov-bp-mAR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到嗜鹽菌株(H.salinarium)L33中。轉(zhuǎn)化株在含有0.3μg/mL新生酶素(novobiocin)中培養(yǎng)兩個(gè)星期，然后取出10個(gè)克隆分別在JL培養(yǎng)液中(含0.3μg/mL新生酶素)37℃下震蕩培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株經(jīng)過(guò)逐級(jí)放大培養(yǎng)、分離、純化，最終得到基因工程表達(dá)的不含玉紅素的第96位天冬氨酸(Asp)突變成纈氨酸(Val)的古紫質(zhì)4蛋白。
實(shí)施例2利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得將第212位天冬氨酸(Asp)突變成甘氨酸(Gly)的古紫質(zhì)4蛋白的目的基因。利用pXLNov-r-AR4質(zhì)粒為模板，用Taq DNA聚合酶PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因的第212位點(diǎn)上游(N端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段，擴(kuò)增得到759bp的DNA片段，PCR擴(kuò)增所用的引物為5’-CGGGATCCGACGTGAAGATG-3’(引物1)和5’-CCAGCAGGGCGAGGACGAGCAGCAG-3’(引物2)，其中下劃線的部分是新導(dǎo)入BamHI限制位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增古紫質(zhì)4突變的第212位點(diǎn)下游(C端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段，擴(kuò)增得到502bp的DNA片段，所用的引物為5’-CTGCTGCTCGTCCTCGCCCTGCTGG-3’(引物3)和5’-GCGCAAGCTTCCCTTCACTCTCAAGTGCCG-3’(引物4)，下劃線部分是新導(dǎo)入的HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增的細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因突變點(diǎn)上游(N端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段和下游(C端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段混合在一起，利用引物1和引物4重新用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增得到一個(gè)兩端分別帶有BamHI和HindIII限制位點(diǎn)的1.2kb的基因序列，命名為bp-mAR4。將這個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物bp-mAR4克隆到pSK質(zhì)粒上，進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明其序列與目的基因序列完全匹配。將克隆在pSK質(zhì)粒上并經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的bp-mAR4基因以BamHI和HindIII這兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到pXLNov-r質(zhì)粒上，將構(gòu)建形成的pXLNov-bp-mAR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到嗜鹽菌株(H.salinarium)L33中。轉(zhuǎn)化株在含有0.3μg/mL新生酶素(novobiocin)中培養(yǎng)兩個(gè)星期，然后取出10個(gè)克隆分別在JL培養(yǎng)液中(含0.3μg/mL新生酶素)37℃下震蕩培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株經(jīng)過(guò)逐級(jí)放大培養(yǎng)、分離、純化，最終得到基因工程表達(dá)的不含玉紅素的第212位天冬氨酸(Asp)突變成甘氨酸(Gly)的古紫質(zhì)4蛋白。
實(shí)施例3分別用動(dòng)力學(xué)光譜儀探測(cè)從xz515菌株中提取的野生AR4、實(shí)施例1中的AR4(D96V)蛋白和實(shí)施例2中的AR4(D212G)蛋白在水溶液中(pH＝7.0)的M衰減的動(dòng)力學(xué)光譜。AR4(D96V)和AR4(D212G)的M中間態(tài)壽命與野生AR4相比，有數(shù)量級(jí)的延長(zhǎng)，如圖1所示。
實(shí)施例4稱取10g分子量80000、醇解度98％的聚乙烯醇(PVA)加入到90mL水中加熱至90℃攪拌直至完全溶解，形成濃度10％(wt)的透明溶液，冷卻至室溫。將實(shí)施例1中的第96位天冬氨酸(Asp)突變成纈氨酸(Val)的古紫質(zhì)4蛋白(D96V AR4)冷凍干燥制成干粉，稱取10mg蛋白加入到1mL聚乙烯醇溶液中，蛋白的含量為10mg/mL。調(diào)節(jié)pH值～7。將混合液在JY92-II型，寧波產(chǎn)的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上冰水浴超聲，采用Φ3探頭，超聲功率200W，超聲時(shí)間5s，間隔30s，超聲次數(shù)30次，使蛋白均勻分散在聚合物溶液中。然后將混合液在室溫放置30min，使超聲產(chǎn)生氣泡上浮到混合液表面，不干擾鋪膜。吸取適量混合液，滴加在圓形、直徑1.6cm的模具中使其自然鋪展。將載有聚合物和D96V AR4混合液的模具平放入盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，并將干燥器置于4℃的環(huán)境中24小時(shí)，得到均勻平整的D96V AR4/PVA信息存儲(chǔ)復(fù)合膜。
實(shí)施例5用200W的鹵鎢燈經(jīng)過(guò)濾熱、濾波(＞500nm)后照射實(shí)施例4中的D96V AR4/PVA信息存儲(chǔ)復(fù)合膜5秒鐘，立即用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)記錄其在412nm處的吸收變化，得到該膜的M衰減的動(dòng)力學(xué)光譜，制膜后的M態(tài)壽命比該蛋白在溶液狀態(tài)下的M壽命有顯著延長(zhǎng)，如圖2所示。
實(shí)施例6稱取10g分子量3,000,000的聚丙烯酰胺(PAAM)加入到90mL水中加熱至40℃攪拌直至完全溶解，形成濃度10％(wt)的透明溶液，冷卻至室溫。將實(shí)施例1中的第96位天冬氨酸(Asp)突變成纈氨酸(Val)的古紫質(zhì)4蛋白(D96V AR4)冷凍干燥制成干粉，稱取10mg蛋白加入到1mL聚丙烯酰胺溶液中，蛋白的含量為10mg/mL。調(diào)節(jié)pH值～7。將混合液在JY92-II型，寧波產(chǎn)的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上冰水浴超聲，采用Φ3探頭，超聲功率200W，超聲時(shí)間5s，間隔30s，超聲次數(shù)30次，使蛋白均勻分散在聚合物溶液中。然后將混合液在室溫放置30min，使超聲產(chǎn)生氣泡上浮到混合液表面，不干擾鋪膜。吸取適量混合液，滴加在正方形、邊長(zhǎng)2cm的模具中使其自然鋪展。將載有聚合物和D96V AR4混合液的模具平放入盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，并將干燥器置于4℃的環(huán)境中24小時(shí)，得到均勻平整的D96V AR4/PAAM信息存儲(chǔ)復(fù)合膜。
實(shí)施例7稱取10g分子量80000、醇解度98％的聚乙烯醇(PVA)加入到90mL水中加熱至90℃攪拌直至完全溶解，形成濃度10％(wt)的透明溶液，冷卻至室溫。將實(shí)施例2中的第212位天冬氨酸(Asp)突變成甘氨酸(Gly)的古紫質(zhì)4蛋白(D212G AR4)冷凍干燥制成干粉，稱取10mg蛋白加入到1mL聚乙烯醇溶液中，蛋白的含量為10mg/mL。調(diào)節(jié)pH值～7。將混合液在JY92-II型(寧波產(chǎn))超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上冰水浴超聲，采用Φ3探頭，超聲功率200W，超聲時(shí)間5s，間隔30s，超聲次數(shù)30次，使蛋白均勻分散在聚合物溶液中。然后將混合液在室溫放置30min，使超聲產(chǎn)生氣泡上浮到混合液表面，不干擾鋪膜。吸取適量混合液，滴加在圓形、直徑1.6cm的模具中使其自然鋪展。將載有聚合物和D212G AR4混合液的模具平放入盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，并將干燥器置于4℃的環(huán)境中24小時(shí)，得到均勻平整的D212G AR4/PVA信息存儲(chǔ)復(fù)合膜。
實(shí)施例8稱取10g分子量3,000,000的聚丙烯酰胺(PAAM)加入到90mL水中加熱至40℃攪拌直至完全溶解，形成濃度10％(wt)的透明溶液，冷卻至室溫。將實(shí)施例2中的第212位天冬氨酸(Asp)突變成甘氨酸(Gly)的古紫質(zhì)4蛋白(D212G AR4)冷凍干燥制成干粉，稱取10mg蛋白加入到1mL聚丙烯酰胺溶液中，蛋白的含量為10mg/mL。調(diào)節(jié)pH值～7。將混合液在JY92-II型，寧波產(chǎn)的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上冰水浴超聲，采用Φ3探頭，超聲功率200W，超聲時(shí)間5s，間隔30s，超聲次數(shù)30次，使蛋白均勻分散在聚合物溶液中。然后將混合液在室溫放置30min，使超聲產(chǎn)生氣泡上浮到混合液表面，不干擾鋪膜。吸取適量混合液，滴加在正方形、邊長(zhǎng)2cm的模具中使其自然鋪展。將載有聚合物和D212G AR4混合液的模具平放入盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，并將干燥器置于4℃的環(huán)境中24小時(shí)，得到均勻平整的D212G AR4/PAAM信息存儲(chǔ)復(fù)合膜。
權(quán)利要求
1.一種基因突變的古紫質(zhì)4蛋白，其特征是對(duì)古紫質(zhì)4蛋白的光循環(huán)、質(zhì)子泵有重要影響的氨基酸進(jìn)行突變修飾而獲得，其光循環(huán)中間體壽命在相同條件下與野生古紫質(zhì)4蛋白相比有數(shù)量級(jí)上的延長(zhǎng)；其中，所述的進(jìn)行突變修飾的重要氨基酸是位于古紫質(zhì)4蛋白質(zhì)子泵通道內(nèi)的對(duì)質(zhì)子傳遞有重要作用的極性氨基酸包括第96位的天冬氨酸、第212位的天冬氨酸，或者第194位的谷氨酸和第204位谷氨酸等其它氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因突變的古紫質(zhì)4蛋白，其特征是所述的突變修飾是所述位點(diǎn)極性氨基酸單獨(dú)的突變修飾，或者是所述位點(diǎn)極性氨基酸的任意組合的突變修飾，突變的目的氨基酸是非極性氨基酸。
3.一種如權(quán)利要求1所述的基因突變的古紫質(zhì)4蛋白的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得上述的關(guān)鍵位點(diǎn)修飾的古紫質(zhì)4蛋白的目的基因，這些關(guān)鍵位點(diǎn)包括第96位的天冬氨酸、第212位的天冬氨酸，或者第194位的谷氨酸和第204位谷氨酸等其它氨基酸；(2)利用pXLNov-r-AR4質(zhì)粒為模板，用Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因的突變點(diǎn)上游(N端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段，擴(kuò)增得到759bp的DNA片段，PCR擴(kuò)增所用的引物為5’-CGGGATCCGACGTGAAGATG-3’(引物1)和5’-CCAGCAGGGCGAGGACGAGCAGCAG-3’(引物2)，其中下劃線的部分是新導(dǎo)入BamHI限制位點(diǎn)；(3)PCR擴(kuò)增古紫質(zhì)4突變點(diǎn)下游(C端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段，擴(kuò)增得到502bp的DNA片段，所用的引物為5’-CTGCTGCTCGTCCTCGCCCTGCTGG-3’(引物3)和5’-GCGCAAGCTTCCCTTCACTCTCAAGTGCCG-3’(引物4)，下劃線部分是新導(dǎo)入的HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；(4)將PCR擴(kuò)增的細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因突變點(diǎn)上游(N端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段和下游(C端)部分對(duì)應(yīng)的DNA片段混合在一起，利用引物1和引物4重新用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增得到一個(gè)兩端分別帶有BamHI和HindIII限制位點(diǎn)的1.2kb的基因序列，命名為bp-mAR4；(5)將這個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物bp-mAR4克隆到pSK質(zhì)粒上，進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明其序列與目的基因序列完全匹配；(6)將克隆在pSK質(zhì)粒上并經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的bp-mAR4基因以BamHI和HindIII這兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到pXLNov-r質(zhì)粒上，將構(gòu)建形成的pXLNov-bp-mAR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到嗜鹽菌株(H.salinarium)L33中；(7)轉(zhuǎn)化株在含有0.3μg/mL新生酶素中培養(yǎng)12-16天，然后取出10個(gè)克隆分別在JL培養(yǎng)液中37℃下震蕩培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株經(jīng)過(guò)逐級(jí)放大培養(yǎng)、分離、純化，最終得到基因工程表達(dá)的不含玉紅素的基因突變的古紫質(zhì)4蛋白。
4.一種如權(quán)利要求1所述的基因突變的古紫質(zhì)4蛋白在制備聚合物復(fù)合膜中的應(yīng)用，該復(fù)合膜由基因突變的古紫質(zhì)4蛋白和聚合物復(fù)合組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征是所述聚合物是具有良好成膜性能、且不會(huì)引起古紫質(zhì)突變體變性的水溶性聚合物，包括聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、明膠及其它們的混合物和衍生物。
全文摘要
本發(fā)明屬高分子材料、基因工程和信息材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于基因突變古紫質(zhì)4的、可用于信息存儲(chǔ)和處理的薄膜，尤其是該蛋白質(zhì)與聚合物的功能復(fù)合膜及其制備方法。通過(guò)基因工程技術(shù)，對(duì)古紫質(zhì)4蛋白的光循環(huán)、質(zhì)子泵有重要影響的氨基酸進(jìn)行突變修飾，并轉(zhuǎn)入到嗜鹽菌株L33中進(jìn)行蛋白表達(dá)，經(jīng)過(guò)逐級(jí)放大培養(yǎng)L33菌株、分離純化得到光信息存儲(chǔ)和處理功能得到優(yōu)化的基因突變古紫質(zhì)4蛋白。并將其與成膜性能良好的聚合物聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、明膠及其它們的各種衍生物復(fù)合制成均勻平整、易于加工、可應(yīng)用于光信息存儲(chǔ)與處理的膜器件。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1733799SQ20051002891
公開(kāi)日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月18日
發(fā)明者丁建東, 明明, 馬德旺, 吳佳, 黃偉達(dá), 洪潔, 李慶國(guó) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)