專利名稱：一種動物細胞高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物細胞大規(guī)模、高密度、無血清連續(xù)灌注培養(yǎng)方法。
背景技術：
生物反應器中動物細胞的培養(yǎng)過程可以有不同的操作方式，如分批培養(yǎng)(Batch)、連續(xù)培養(yǎng)(Continuous)、灌注培養(yǎng)(Perfusion)以及流加培養(yǎng)(Fed-batch)等，不同的操作方式有其不同的特點。
連續(xù)灌注培養(yǎng)，就是在培養(yǎng)過程中以一定速率加入新鮮營養(yǎng)液，并以相同速率排出上清液，同時通過反應器上附加的細胞截留系統(tǒng)將大多數(shù)活細胞與上清液及死細胞、細胞碎片等分離，活細胞返回至反應器內繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)灌注培養(yǎng)不僅保持了較恒定的培養(yǎng)狀態(tài)，避免了有害代謝副產物的積累，而且使反應器內的細胞達到比較高的密度。
近年來動物細胞培養(yǎng)在細胞生理學研究，特別是在認識影響細胞生長與活力的不利因素方面已經取得了很大的進步。通過分子遺傳控制，細胞更易于在不含動物蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在工程研究中，得到高細胞密度和高細胞活性逐漸成為普遍的話題。關于補料培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)中補料的控制方案，越來越多的努力投向過程控制和監(jiān)測，這對于保證產品質量和過程的連貫性是有益的。大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中由于大量細胞的代謝，培養(yǎng)過程中細胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變，在線過程監(jiān)控十分重要。在線測定反應器中培養(yǎng)條件、代謝產物和目的產物等大量數(shù)據(jù)，并對測定結果進行分析處理，及時對培養(yǎng)系統(tǒng)進行反饋控制，才能成功地進行大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)。
對于任何給定的動物細胞，目標產物濃度與細胞密度和培養(yǎng)時間的積分成正比，即P＝q∫Xvdt，因此要提高產物濃度及其產率有兩個途徑，首先是提高活細胞的密度，其次是維持盡可能長的培養(yǎng)時間，而這與培養(yǎng)基組成和細胞培養(yǎng)環(huán)境密切相關。眾所周知，動物細胞維持生長、成活并進行產物合成需要三十多種營養(yǎng)成分，包括葡萄糖、必需氨基酸、維生素、某些血清成分和無機鹽等，其中葡萄糖和谷氨酰胺是細胞生長、代謝和產物合成中最主要的碳源和能源物質，同時動物細胞還需要適宜的培養(yǎng)環(huán)境，包括pH、滲透壓、溶解氧和溫度等。在細胞培養(yǎng)過程中只要有一種營養(yǎng)物被耗竭，就會限制細胞生長、代謝和產物合成，因此細胞培養(yǎng)過程中各種營養(yǎng)物的供給往往決定了生物反應器的產率。然而，動物細胞生長除了要消耗營養(yǎng)物之外，還會生成許多代謝副產物，如氨、乳酸、非必需氨基酸和CO2等。這些副產物積累到一定程度往往會對細胞產生毒性作用或改變培養(yǎng)環(huán)境的pH和滲透壓，從而抑制細胞生長和產物合成?，F(xiàn)有大量研究證明動物細胞培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物耗竭和代謝副產物積累的矛盾是限制細胞密度、產物濃度和培養(yǎng)過程產率的主要因素。為了消除營養(yǎng)限制，有人曾試圖在滲透壓許可范圍內對培養(yǎng)基進行濃縮或添加營養(yǎng)成分，然而最終的結果是雖然營養(yǎng)物仍大量富余，但收效卻甚微，究其原因是培養(yǎng)基中的高濃度葡萄糖和谷氨酰胺等營養(yǎng)物質促使了乳酸、氨和丙氨酸等代謝副產物的大量積累所致。為了減少乳酸和氨的生成與積累，近幾年有研究者也作了多種嘗試。例如有學者用果糖、麥芽糖和半乳糖作為碳源代替葡萄糖，雖然乳酸生成顯著減少，但細胞的能量代謝更多的轉向谷氨酰胺，從而生成更多的氨。另一方面，有研究者使用通過水解能生成谷氨酰胺的二肽(丙氨?！劝滨０泛透拾滨！劝滨０?來代替培養(yǎng)基中游離的谷氨酰胺，雖然在培養(yǎng)基高溫消毒和長期保存方面有一定優(yōu)勢，但未能達到預期的降氨效果，相反導致了大量的丙氨酸和甘氨酸積累，使培養(yǎng)基滲透壓顯著升高至對細胞生長有害的水平。其它在降氨方面的嘗試還包括通過誘導使細胞完全不需要谷氨酰胺，克隆谷氨酰胺合成酶至細胞中，以及使用滲透膜和電解等手段選擇性去除氨或銨離子等，但所有這些努力至今仍未獲任何理想結果。
事實上，動物細胞在培養(yǎng)過程中對營養(yǎng)物質的代謝途徑受到培養(yǎng)環(huán)境和營養(yǎng)物濃度的嚴格調控，營養(yǎng)物代謝途徑不同，能量利用率和副產物生成具有顯著差異，最典型的是細胞對葡萄糖和谷氨酰胺的代謝。在一般批式培養(yǎng)過程中，由于葡萄糖濃度比較高，促使大部分(大于70％)葡萄糖通過糖酵解途徑代謝，導致乳酸的大量積累，且只能生成2mmolATP/mmol葡萄糖；谷氨酰胺代謝也是如此，高濃度的谷氨酰胺將加速脫氨降解使谷氨酸和氨大量積累，同時高濃度的谷氨酸又通過谷氨酸—丙酮酸轉氨酶途徑生成α-酮戊二酸進入三羧酸循環(huán)，導致丙氨酸大量積累，使培養(yǎng)基滲透壓升高，且只生成9mmolATP/mmol谷氨酰胺。細胞代謝過程生化反應動力學研究表明，細胞對葡萄糖的消耗主要受易化擴散控制，細胞膜上的葡萄糖濃度梯度是其唯一的推動力。當葡萄糖濃度較低時，細胞也可通過由Na+離子梯度推動的高親和性(米氏常數(shù)Km低于0.2mM)同向轉運過程攝取葡萄糖。另外，轉化細胞的線粒體己糖激酶活性高，且不受葡萄糖-6-P的反饋調節(jié)，因此高濃度的葡萄糖-6-P往往會強化糖酵解途徑。同樣，培養(yǎng)基中高濃度谷氨酰胺也導致細胞對谷氨酰胺的高速攝取，谷氨酰胺脫氨降解的第一步與谷氨酰胺酶同功酶的米氏常數(shù)Km相對較高(2.2至4.5mM)有關，且這一步在熱力學上是相當有利的(平衡常數(shù)K＝320)，但它同時對降低胞內谷氨酰胺濃度非常敏感。糖酵解和谷氨酰胺脫氨降解途徑的終點都在丙酮酸，致使它在線粒體兩側積聚。當過量的丙酮酸積累超過了線粒體的氧化能力時，將迫使細胞以乳酸和丙氨酸形式分泌過剩的碳源。動物細胞的上述代謝特點就是導致為什么在批式培養(yǎng)中不可能解決營養(yǎng)物耗竭和副產物積累這一矛盾的根本原因。
采用葡萄糖和谷氨酰胺限制的流加培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)，可望消除批式培養(yǎng)中一開始濃度過高而后耗竭的缺陷，通過加料使培養(yǎng)基中的葡萄糖和谷氨酰胺濃度控制在比較低的水平并得到不斷補充，代謝副產物不斷被稀釋或排除，近幾年國外許多研究者的實驗結果預示這種培養(yǎng)方式可為調控細胞進入高能代謝途徑并減少副產物積累提供幫助。例如，Glacken等人(1998，Biotechnol. Bioeng.32491-506)通過流加谷氨酰胺使其濃度在MDCK細胞的微載體培養(yǎng)中維持低水平，結果氨的生成減少了60％，同樣，Ljunggren和Haggestrom(1992，Cytotechnology 845-56)在骨髓瘤細胞培養(yǎng)中采用谷氨酰胺限制的流加培養(yǎng)，使氨生成降低了50％。進而，他們研究了在雜交瘤細胞培養(yǎng)中同時限制葡萄糖和谷氨酰胺的流加培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)乳酸、氨和丙氨酸生成顯著減少，而能量利用率、細胞密度和產物濃度得到顯著提高(1994，Biotechnol. Bioeng.44808-818)。然而，這些學者的研究工作尚存在一些不足，主要是他們往往只考慮了葡萄糖和/或谷氨酰胺，流加的培養(yǎng)基是非平衡培養(yǎng)基，限制補料一段時間后其它營養(yǎng)物質成為細胞生長的限制性因素，最后往往是造成細胞大量死亡，死細胞數(shù)大于活細胞數(shù)，而活細胞密度和產物濃度的提高仍然有限。雖然培養(yǎng)基連續(xù)灌注培養(yǎng)比流加培養(yǎng)更有優(yōu)勢，除了能不斷補充營養(yǎng)物之外還能及時排去代謝副產物，因此所獲得的細胞密度可比批式培養(yǎng)提高一至二個數(shù)量級，但是目前所研究和應用的灌注培養(yǎng)，由于其培養(yǎng)基是非平衡的，因此往往以高速率培養(yǎng)基灌注為代價，且使產物濃度大量稀釋，在經濟上得不償失。

發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的技術問題是公開一種動物細胞高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)方法，以克服現(xiàn)有技術存在的缺陷，滿足有關方面的需要。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)目標細胞株在初始培養(yǎng)基中進行批培養(yǎng)；(2)計算培養(yǎng)過程中的細胞生長、培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物消耗和代謝副產物生成以及目標產物生成等動力學參數(shù)；(3)根據(jù)計算結果重新設計灌注培養(yǎng)過程中的初始培養(yǎng)基和灌注培養(yǎng)基的營養(yǎng)物組成，并進行灌注培養(yǎng)；重復(3)～(4)步驟對計算結果進行迭代優(yōu)化，并根據(jù)培養(yǎng)過程所需達到的細胞密度和生產能力設定培養(yǎng)基連續(xù)灌注的速率，以獲得高的細胞密度和目標產物濃度。動力學方程及計算批培養(yǎng)參數(shù)計算動力學方程細胞dXVdt=μXV]]>或μ=1t2-t1lnXV2XV1]]>(計算細胞的比生長速率)營養(yǎng)物dSdt=-qSXV]]>或qS=-1XVdSdt=-dSdXV]]>(計算營養(yǎng)物的比消耗速率)產物dPdt=qP·XV]]>或qP=1XVdPdt=μdPdXV]]>(計算細胞產生代謝副產物的比生成速率)產物濃度P＝qP∫Xvdt灌注培養(yǎng)參數(shù)計算動力學方程物料進出速率相等，大部分細胞截留在反應器中，總稀釋率D＝F/V，上清流出率Ds＝Fs/V，細胞流出率Db＝Fb/V。
細胞dXvdt=(μ-kd-Db)Xv;dXddtkdXv-DbXd]]>營養(yǎng)物dSdt=D(Sf-S)-qsXv]]>產物dPdt=qPXv-DP]]>在穩(wěn)定狀態(tài)下，μ＝kd+Db，qs=D(Sf-S)Xv,qP=DPXv.]]>其中目標產物濃度可表示為P=qPXvD.]]>符號說明Xv 活細胞密度(106cells/mL)Xt 總細胞密度(106cells/mL)Viability 細胞活性(％)
μ細胞比生長速率(day-1)D 灌注速率或稱稀釋率(day-1)F 流加速率(mL/day)Gluc，Gln 底物濃度(mM)Lac，Amm 副產物濃度(mM)MAb單抗?jié)舛?mg/L)qGlucqGln或qs底物比消耗速率(mmol/109cells/day)pLacpAmmpAla副產物比生成速率(mmol/109cells/day)pMAb單抗比生產速率(mg/109cells/day)Yx/GlueYx/Gln單位底物消耗的細胞產率(109cells/mmol)Ylac/GlucYAmm/Gln單位營養(yǎng)物消耗的副產物產率(mmol/mmol)V 培養(yǎng)體積(mL)更具體的包括如下步驟(1)將需要培養(yǎng)的細胞在無血清培養(yǎng)基中采用常規(guī)的方法進行傳代適應后，接種于生物反應器中，接種密度為1.5～3.0×105細胞/ml；(2)反應器設置為溫度37℃，pH為7.2，溶氧50％，攪拌轉速40～80轉/分鐘。在無血清初始培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50～60小時后，將無血清灌注培養(yǎng)基以灌注速率D＝1.0v/vday-1的速度進入生物反應器進行灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為30～60天，從第10天起開始收液，細胞密度可達1.0～2.40×107cells/ml，產物濃度可達批培養(yǎng)的10倍以上；所說的細胞包括雜交瘤細胞、重組CHO細胞、293細胞、昆蟲細胞、NSO等工程細胞無血清初始培養(yǎng)基的組分和含量如下



無血清灌注培養(yǎng)基的組分和含量如下



本發(fā)明的方法具有以下特點1.本發(fā)明中所用的培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基；2.在無血清培養(yǎng)基中添加了葡萄糖、谷氨酰胺、必需氨基酸以及細胞生長所需的其它營養(yǎng)物質；3.無血清培養(yǎng)基中所添加的物質是根據(jù)培養(yǎng)過程中細胞生長和代謝的特性，對動力學參數(shù)進行分析、計算和優(yōu)化后，形成營養(yǎng)平衡的無血清培養(yǎng)基，既避免了營養(yǎng)物不足造成限制，也避免了營養(yǎng)物過剩造成代謝副產物的大量積累；4.利用本發(fā)明優(yōu)化的培養(yǎng)基和優(yōu)化的灌注策略，可以在較低的灌注速率下獲得較高的細胞密度，從而使產物濃度得到顯著提高，避免了高灌注速率下目標產物的稀釋。
動物細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基除無機鹽外還有葡萄糖、谷氨酰胺、各種氨基酸、各種生長因子、調節(jié)和運輸?shù)鞍椎?0多種營養(yǎng)成分組成，任何一種營養(yǎng)物的缺乏都會造成細胞生長受到限制甚至導致細胞死亡；而營養(yǎng)物過度豐富則會使代謝副產物如氨和乳酸的大量積累，同樣可導致細胞停止生長或死亡。研究表明，要有效地降低氨和乳酸的產量，必需降低葡萄糖和谷氨酰胺的濃度。本發(fā)明通過研究細胞生長、營養(yǎng)物消耗和代謝副產物積累的動力學特性，來研究細胞生長和營養(yǎng)物消耗和代謝副產物積累之間的代謝規(guī)律，確定和控制細胞生長的最佳營養(yǎng)環(huán)境，通過化學計量關系和灌注培養(yǎng)策略滿足細胞生長所需的營養(yǎng)物質量，從而解決了營養(yǎng)物耗竭和副產物積累之間的矛盾。采用本發(fā)明所形成的工藝可將各種營養(yǎng)物控制在一個較低的合適濃度，既可保證細胞的營養(yǎng)供應，不會限制細胞的生長，又可降低有毒廢物的產生，從而可獲得高的細胞密度和產物濃度。


圖1為雜交瘤細胞連續(xù)灌注培養(yǎng)細胞生長與產物表達；圖2為CHO細胞連續(xù)灌注培養(yǎng)細胞生長與產物表達；具體實施方式
實施例1將HB58雜交瘤細胞(從ATCC獲得)在無血清培養(yǎng)基中采用？？？文獻公開的方法進行傳代適應后，在50升生物反應器中接種，接種密度2.0×105cells/ml。
(2)在37℃、pH為7.2的條件下在無血清初始培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60小時后，將無血清灌注培養(yǎng)基以1.0v/v day-1的灌注速率灌注進入生物反應器進行灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為60天，從第10天起開始收液，細胞密度可達2.40×107cells/ml，產物濃度可達624mg/ml；培養(yǎng)過程的細胞變化見圖1，圖中，曲線1為活細胞密度，曲線2為單抗?jié)舛取?br> 通過本發(fā)明對培養(yǎng)過程的優(yōu)化，細胞對于葡萄糖、谷氨酰胺以及其它各種氨基酸等營養(yǎng)物的利用率得到了極大的提高，乳酸、氨、丙氨酸等代謝副產物的生成速率大幅下降，細胞密度和產物濃度都獲得了顯著提高。與批培養(yǎng)的結果相比，反應器中細胞密度是批培養(yǎng)的11.32倍，產物濃度為9.18倍，過程產率為38.24倍(見表1)。


實施例2將重組CHO細胞(rCHO SS3 A2，表達人抗凝血因子III)在B.BRAUN 2升生物反應器中接種，接種密度2.75×105cells/ml。
(2)在37℃、pH為7.2的條件下在無血清初始培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40小時后，將無血清灌注培養(yǎng)基以0.58v/v day-1的灌注速率灌注進入生物反應器進行灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為28天，從第8天起開始收液，最高細胞密度可達1.1×107cells/ml，產物濃度可達390U/ml；培養(yǎng)過程的細胞變化見圖2，圖中，曲線3為活細胞密度，曲線4為總細胞密度，曲線5為產物(ATIII)表達量。
通過本發(fā)明對培養(yǎng)基和培養(yǎng)過程的優(yōu)化，培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物被控制在較低的合適水平，使代謝副產物的生成速率大幅下降，因此細胞密度和產物濃度都獲得了顯著提高。與普通培養(yǎng)基批培養(yǎng)的結果相比，細胞密度和產物濃度分別提高6倍和5倍。
權利要求
1.一種動物細胞高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)目標細胞株在初始培養(yǎng)基中進行批培養(yǎng)；(2)計算培養(yǎng)過程中的細胞生長、培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物消耗和代謝副產物生成以及目標產物生成等動力學參數(shù)；(3)根據(jù)計算結果重新設計灌注培養(yǎng)過程中的初始培養(yǎng)基和灌注培養(yǎng)基的營養(yǎng)物組成，并進行灌注培養(yǎng)；重復(3)～(4)步驟對計算結果進行迭代優(yōu)化，并根據(jù)培養(yǎng)過程所需達到的細胞密度和生產能力設定培養(yǎng)基連續(xù)灌注的速率，以獲得高的細胞密度和目標產物濃度。動力學方程及計算批培養(yǎng)參數(shù)計算動力學方程細胞dXVdt=μXV]]>或μ=1t2-t1lnXV2XV1]]>(計算細胞的比生長速率)營養(yǎng)物dSdt=-qSXV]]>或qS=-1XVdSdt=-μdSdXV]]>(計算營養(yǎng)物的比消耗速率)產物dPdt=qPXV]]>或qP=1XVdPdt=μdPdXV]]>(計算細胞產生代謝副產物的比生成速率)產物濃度P＝qP∫Xvdt灌注培養(yǎng)參數(shù)計算動力學方程物料進出速率相等，大部分細胞截留在反應器中，總稀釋率D＝F/V，上清流出率Ds＝Fs/V，細胞流出率Db＝Fb/V。細胞dXvdt=(μ-kd-Db)Xv;dXddt=kdXv-DbXd]]>營養(yǎng)物dSdt=D(Sf-S)-qsXv]]>產物dPdt=qPXv-DP]]>在穩(wěn)定狀態(tài)下，μ=kd+Db,qs=D(Sf-S)Xv,qP=DPXv.]]>其中目標產物濃度可表示為P=qPXvD]]>符號說明Xv 活細胞密度(106cells/mL)Xt 總細胞密度(106cells/mL)Viability 細胞活性(％)μ 細胞比生長速率(day-1)D 灌注速率或稱稀釋率(day-1)F 流加速率(mL/day)Gluc，Gln 底物濃度(mM)Lac，Amm副產物濃度(mM)MAb 單抗?jié)舛?mg/L)qGlucqGln或qs底物比消耗速率(mmol/109cells/day)pLacpAmmpAla副產物比生成速率(mmol/109cells/day)pMAb單抗比生產速率(mg/109cells/day)Yx/GlucYx/Gln單位底物消耗的細胞產率(109cells/mmol)Ylac/GlucYAmm/Gln單位營養(yǎng)物消耗的副產物產率(mmol/mmol)V 培養(yǎng)體積(mL)。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將需要培養(yǎng)的細胞在無血清培養(yǎng)基中采用常規(guī)的方法進行傳代適應后，接種于生物反應器中，接種密度為1.0～3.0×105細胞/ml；(2)反應器設置為溫度37℃，pH為7.0～7.2，溶氧40～60％，攪拌轉速40～80轉/分鐘。在無血清初始培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50～60小時后，將無血清灌注培養(yǎng)基以灌注速率D＝1.0v/v day-1的速度進入生物反應器進行灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10～60天。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所說的細胞包括雜交瘤細胞、重組CHO細胞、293細胞、昆蟲細胞或NSO細胞。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，無血清初始培養(yǎng)基的組分和含量如下
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，無血清灌注培養(yǎng)基的組分和含量如下
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動物細胞高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)方法。其特點是通過研究細胞生長、營養(yǎng)物消耗和代謝副產物積累的動力學特性來研究細胞生長和營養(yǎng)物消耗及代謝副產物積累之間的代謝規(guī)律，確定和控制細胞生長的最佳營養(yǎng)環(huán)境，通過化學計量關系和灌注培養(yǎng)策略滿足細胞生長所需的營養(yǎng)物質量。從而解決了營養(yǎng)物耗竭和副產物積累之間的矛盾。采用本發(fā)明所形成的工藝可將各種營養(yǎng)物控制在一個較低的合適濃度，既可保證細胞的營養(yǎng)供應，不會限制細胞的生長，又可降低有毒廢物的產生，從而可獲得高的細胞密度和產物濃度。
文檔編號C12N5/06GK1778903SQ200510030199
公開日2006年5月31日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權日2005年9月29日
發(fā)明者譚文松, 朱明龍, 牛紅星, 周燕, 華平, 顧小華 申請人:華東理工大學