專利名稱：口腔粘膜細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于個人家庭健康保健和/或醫(yī)藥用口腔粘膜脫落細(xì)胞采集與保存的試劑盒技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在我國，口腔癌的發(fā)病率約占全部惡性腫瘤的3％，而在印度、菲律賓、巴西和斯里蘭卡等發(fā)展中國家發(fā)病率較高，可占全部惡性腫瘤的25％。近年來，口腔癌發(fā)病率和病死率在我國及美國、日本、法國和德國等國家均呈上升趨勢，因此，口腔癌的化學(xué)預(yù)防研究具有重要意義?？谇徽衬ぐ装呤荳HO認(rèn)定的口腔癌前病變，其癌變率為7％～15％，非均質(zhì)型白斑可達(dá)15％～40％。因此，阻斷口腔粘膜白斑的發(fā)展和惡變是預(yù)防口腔癌的重要措施。白斑癌變可經(jīng)歷幾年到幾十年，問題是如何確定這些病損的轉(zhuǎn)歸，因此，許多學(xué)者開始致力于口腔白斑癌變標(biāo)志物的研究。口腔粘膜脫落細(xì)胞微核是近年來國外研究較多的標(biāo)志物。研究表明，口腔白斑患者病損區(qū)脫落粘膜細(xì)胞微核細(xì)胞率增高，由于脫落粘膜細(xì)胞取材方便，對機(jī)體無損傷性，所以在以口腔白斑為研究對象進(jìn)行的口腔癌干預(yù)試驗研究中已被廣泛用于反映DNA損傷的中間生物學(xué)終點(diǎn)。
不僅如此，對于臨床其它疾病和生物分子檢測，同樣由于脫落粘膜細(xì)胞取材方便，對機(jī)體無損傷性，體細(xì)胞的取樣也可使用脫落粘膜細(xì)胞。
現(xiàn)行的口腔粘膜脫落細(xì)胞的取樣，一般用竹制刮板或普通棉簽刮取口腔粘膜細(xì)胞，然后送到實驗室進(jìn)行檢測。這對于專業(yè)人員，如醫(yī)生、專門的研究人員來說沒多大問題，但是對于普通人或樣本不能及時處理的情況來講，就存在很多弊端。首先，普通的竹制刮板或棉簽刮取效果不佳，需要反復(fù)多次才能采集到足夠檢測用的脫落細(xì)胞，而且，是否刮取到足夠的量，無法目測辨別，也沒有其他定性識別采樣量的辦法，只有等到實驗室檢驗結(jié)果出來才能了解先前的口腔粘膜脫落細(xì)胞取樣量是否滿足實驗室要求的量，從而無法保證普通人自行采樣的有效性。其次，現(xiàn)有的使用方法有將粘有口腔粘膜細(xì)胞的竹制刮板或普通棉簽放在塑料袋里進(jìn)行保存，再送至醫(yī)院進(jìn)行檢驗。一般來說，送樣過程需要一段時間。現(xiàn)有的使用方法也有在醫(yī)院里進(jìn)行采樣，但即使在醫(yī)院里采樣者進(jìn)行了采樣，醫(yī)院的檢驗人員也不一定能及時把此樣品進(jìn)行核酸檢測或是進(jìn)行樣品保存處理，這樣，棉簽和細(xì)胞樣本就很容易腐敗變質(zhì)，使得樣品中的DNA被酶解，導(dǎo)致核酸結(jié)構(gòu)不完整，無法達(dá)到試驗要求。再者，對于實驗室檢驗而言，實驗室檢驗人員希望不同的采樣者相對集中地送樣，以便相對集中地進(jìn)行樣品的核酸檢測。但是由于不同采樣者，通常是普通人，送樣時間不同，就使得樣品不能相對集中，為了不耽擱樣品處理時間，即保證樣品不腐敗變質(zhì)，實驗室檢驗人員不得不針對少量樣品做一次檢測。這樣就浪費(fèi)了實驗室檢測的效率，增大了批量檢測的成本。另外，現(xiàn)有的方法都是就醫(yī)者去醫(yī)院排隊，醫(yī)護(hù)人員依次發(fā)放刮取棒進(jìn)行采樣，如果就醫(yī)者較多送樣比較集中的時候，醫(yī)院實驗室門口就很喧囂雜亂，醫(yī)院要進(jìn)行管理很可能需要進(jìn)行場所擴(kuò)建或另外安排現(xiàn)場管理人員，提高了醫(yī)院的成本；另一面，對于就醫(yī)者來說，長時間的排隊非常不方便，雜亂的現(xiàn)場也使就醫(yī)者不舒服。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是克服以上不足，提供一種口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒。
本發(fā)明所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，由外包裝盒、外包裝盒內(nèi)的口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管、核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管和口腔粘膜脫落細(xì)胞采集棒組成，其中口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管裝有透明等滲溶液，核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管裝有核酸提取液。
其中所說的口腔粘膜脫落細(xì)胞采集棒可以是各種材質(zhì)和形狀，只要方便刮取口腔細(xì)胞并消毒無菌即可，如普通的棉簽、竹制刮板等。為了提高刮取效率，可以是帶齒的、帶網(wǎng)格紋的、或凹凸點(diǎn)的采集棒，目的是為了增加口腔粘膜細(xì)胞刮取的摩擦力。材料可以是木質(zhì)、竹制、金屬、橡膠或塑料等多種類型。
透明等滲溶液的作用是將采集棒上的細(xì)胞洗下來，并根據(jù)等滲溶液的透明狀況判斷刮取的細(xì)胞是否夠量。為了使細(xì)胞在等滲溶液內(nèi)仍能保持滲透壓平衡，不致招到破壞，這里所用的等滲溶液可以是生理鹽水、復(fù)方乳酸氯化鈉溶液、5％的葡萄糖溶液、林格氏液、PH緩沖液等。采集棒上的細(xì)胞洗過后，如果等滲溶液變得渾濁，則可判斷刮取的細(xì)胞足量；如果等滲溶液任然清澈，則繼續(xù)用采集棒刮取，在等滲溶液內(nèi)清洗，直至等滲溶液變渾濁。這樣就免去了細(xì)胞樣本到達(dá)實驗室檢測階段才知道不夠用而重新取樣的麻煩。為了便于觀測，裝等滲溶液的容器要求透明，玻璃或塑料制品均可，但都需要消毒無菌。透明等滲溶液本身也進(jìn)行過符合醫(yī)藥條件的消毒處理。
核酸提取穩(wěn)定液的作用是初步提取核酸，使細(xì)胞裂解，釋放出核酸，同時又要使核酸制品結(jié)構(gòu)完整，不降解。為了滿足這個條件，核酸提取液必須使細(xì)胞內(nèi)特定酶和其它的雜蛋白迅速變質(zhì)、失活，如核酸酶、內(nèi)切酶、外切酶等；同時還需滿足對核酸不具有氧化、降解作用等。因此符合條件的核酸提取液可以是1)4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸鈉；2)6M鹽酸胍，20mM Tris-HCl(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸鈉；3)6M異硫氰酸胍，20mM Tris-HCl(pH7.0)；4)6M NaI，10mM Tris-HCl(pH7.0)。
將核酸提取液倒入洗脫液內(nèi)即可制得核酸預(yù)提取穩(wěn)定液，并可穩(wěn)定保存。這種核酸預(yù)提取穩(wěn)定液可在0℃以下長期保存，也可在0℃以上50℃以下保存14天以上，便于常溫條件下遞送和運(yùn)輸。這種核酸預(yù)提取穩(wěn)定液在送達(dá)實驗室后，可進(jìn)一步純化獲得高純度、高質(zhì)量的基因組DNA，可適用于PCR擴(kuò)增檢測，基因克隆、突變檢測，SNP分析及臨床檢測操作等。
本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，刮取口腔粘膜脫落細(xì)胞非常方便，由于使用特定的帶有齒狀或網(wǎng)格狀的刮取棒，刮取效率高，效果好；而且，對于普通人就可目測定性判斷采集的細(xì)胞是否足量用作檢測，滿足了實驗室DNA檢測對于樣品量的要求，避免了重新取樣。
2、由于樣品得到及時處理，制成核酸預(yù)提取穩(wěn)定液，可在常溫保存兩周左右DNA無損傷，滿足試驗要求，方便運(yùn)輸和儲存，也為試驗人員進(jìn)行批量檢測提供了技術(shù)條件。
3、所有操作不需要專業(yè)知識，對于普通老百姓來說在家里就可完成，可隨時進(jìn)行取樣；對于醫(yī)院來說，可接收病人在家里自行采集的細(xì)胞樣本進(jìn)行集中處理，節(jié)約了人力和場所；對于整個檢測過程而言，本發(fā)明的采樣不需要在醫(yī)院實驗室完成，樣品的核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存在進(jìn)入實驗室之前就已經(jīng)完成，從而改變了檢測的流程，提高了檢測的效率，醫(yī)患雙方都非常方便，因此，具有很好的市場推廣價值。


圖1為本發(fā)明所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞表明具有凹凸點(diǎn)結(jié)構(gòu)的采集棒。
圖3為PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果。
具體實施例方式
如圖1所示，在外包裝盒1內(nèi)放置有兩個透明的可密封的容器，一個是口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管2，另一個是核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管3，外包裝盒1內(nèi)還放置有口腔粘膜脫落細(xì)胞采集棒4?？谇徽衬っ撀浼?xì)胞采集管2內(nèi)裝有等滲溶液，核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管3內(nèi)裝有核酸提取液。
使用時，用采集棒4刮取口腔粘膜脫落細(xì)胞，然后放入口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管2內(nèi)洗脫，直到口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管2內(nèi)的等滲溶液變混濁，將核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管3內(nèi)的核酸提取液倒入口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管2內(nèi)并混勻，制得核酸預(yù)提取穩(wěn)定液，密封。這樣試劑盒就可以送至實驗室檢測用。
下面以幾個具體的試驗例來說明本發(fā)明所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒的使用和應(yīng)用效果。
實驗例1～4讓受試者在家里使用本發(fā)明所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，受試者分別是10個兒童，20個成年男女和10位老人。受試者是兒童組的為試驗例1，20個成年男女組分別為試驗例2和3，老人組的采集細(xì)胞樣本為試驗例4。具體的試驗樣品和條件參數(shù)見表一。
將得到的四組核酸預(yù)提取穩(wěn)定液送至實驗室，可以用96孔板的方式純化基因組DNA，如用Axygen公司脫落細(xì)胞96-DNA純化試劑盒按操作指南提取純化DNA，具體方法是1.4000rpm低速離心30秒，將核酸預(yù)提取穩(wěn)定液管蓋上溶液離心到管中。
2.將管轉(zhuǎn)移至65℃水浴中，加熱10分鐘，再Vortex 30秒。置冰水浴中溫育5分鐘。
3.在每管中加入4℃預(yù)冷的300μLBuffer M-B，擰緊螺旋蓋管，用力搖勻，或Vortex混合均勻。
4.4℃、12000×g離心5分鐘。
5.將96孔過濾板置于2.2ml深孔板上。吸取700μl上清并轉(zhuǎn)移至96孔過濾板中，蓋上塑料蓋，3000rpm離心3分鐘。(注意如微量過濾器中仍然殘留液體，提到離心力再離一次。)6.棄96孔過濾板。在2.2ml深孔板的濾液中加200μl含0.5％冰乙酸的異丙醇。
7.將96-DNA制備板置于廢液盒上。用8道或12道移液器吸注2.2ml深孔板中的液體兩次，使溶液充分混合。將混合液轉(zhuǎn)移到在96-DNA制備板中，將96-DNA制備板置于2.2ml深孔板上，蓋上塑料蓋，3000rpm離心3分鐘。
8.將96-DNA制備板連同2.2ml深孔板一起取出。取下塑料蓋，在96-DNA制備板的每孔中加500μlBuffer W1A，蓋上塑料蓋，3000rpm離心3分鐘。
9.棄2.2ml深孔板，將96-DNA制備板轉(zhuǎn)移到新的2.2ml深孔板上。取下塑料蓋，在96-DNA制備板的每孔中加800μl Buffer W2，蓋上塑料蓋，1500×g離心1分鐘。
10.棄2.2ml深孔板中的溶液。將96-DNA制備板置回到2.2ml深孔板上。取下塑料蓋，加800μl Buffer W2，蓋上塑料蓋，6000rpm離心10分鐘。
11.仔細(xì)將DNA制備板轉(zhuǎn)移到96-V形底板上，在膜中央加60μl水或洗脫液，室溫靜置1分鐘。6000rpm離心5分鐘收集DNA。
12.用硅膠片封上各孔。取樣時只要用槍頭硅膠片中央的十字處扎破即可。
也可以用單管的方式純化基因組DNA，如用Axygen公司脫落細(xì)胞DNA純化試劑盒按操作指南提取純化DNA，具體方法是1.4000rpm低速離心30秒，將管蓋上溶液離心到管中。
2.將管轉(zhuǎn)移至65℃水浴中，加熱15分鐘，再Vortex 30秒。置冰水浴中溫育5分鐘。
3.在每管中加入4℃預(yù)冷的300μl Buffer M-B，擰緊螺旋蓋管，用力搖勻，或Vortex混合均勻。
4.4℃、12000×g離心5分鐘。
5.將微量過濾器置于2ml微量離心管中。吸取700μl上清并轉(zhuǎn)移至微量過濾器中，6000×g離心1分鐘。
注意如微量過濾器中仍然殘留液體，提到離心力再離一次。
6.棄微量過濾器。在2ml微量離心管的濾液中加200μl含0.5％冰乙酸的異丙醇，混合均勻。
7.將步驟6中的混合液轉(zhuǎn)移到在DNA制備管中，將DNA制備管置于2ml微量離心管中，6000×g離心1分鐘。
8.棄2ml微量離心管中的溶液，將DNA制備管置回2ml微量離心管中。加500μl BufferW1，6000×g離心1分鐘。
9.棄2ml微量離心管中的溶液，將DNA制備管置回2ml微量離心管中。加700μl BufferW2，6000×g離心1分鐘。
10.棄2ml微量離心管中的溶液，將DNA制備管置回2ml微量離心管中。加400μlBuffer W2，12000×g離心1分鐘。
11.仔細(xì)將DNA制備管轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中(勿使2ml微量離心管中溶液濺到DNA制備管上)，在膜中央加60μl水或洗脫液，室溫靜置1分鐘。12000×g離心1分鐘收集DNA。
除Axygen公司的產(chǎn)品可用于上述基因組DNA純化外，Qiagen公司的產(chǎn)品及其它公司的類似產(chǎn)品，以及實驗室常規(guī)的堿法小量制備DNA方法都能從本發(fā)明的核酸預(yù)提取穩(wěn)定液中純化出高質(zhì)量的基因組DNA。
表一

四組核酸預(yù)提取穩(wěn)定液的受試條件見表二。
表二


所提取出來的基因組DNA紫外分光光度計測定見表三。
表三

PCR檢測對樣品進(jìn)行PCR檢測一.PCR反應(yīng)體系20μl體系10×buffer 2uldNTP(2.5mM) 1.6ul3’primer(10uM) 0.8ul5’primer(10uM) 0.8ulrTaq(5u/ul，TAKARA) 0.2ulDNA模板 1ul加Mili-Q水至 20ul二.PCR反應(yīng)條件1.PCR引物GAPDHGAPDH-F5’-ggg AAg gTg AAg gTC ggA gTC-3’GAPDH-R5’-CTg ATg ATC TTg Agg CTg TTg-3’PCR條件94℃1min

72℃ 5min4℃ forever電泳結(jié)果見圖3，表示四組核酸預(yù)提取穩(wěn)定液的PCR擴(kuò)增出現(xiàn)了4條清晰的條帶，結(jié)果為陽性。四組核酸預(yù)提取穩(wěn)定液均達(dá)到DNA檢測的試驗要求，檢測結(jié)果見表四。
表四

對比例另找10個成年男女用普通棉簽刮取口腔粘膜脫落細(xì)胞，其中5個棉簽在未作處理后的3～5天腐敗變質(zhì)，所攜帶的粘膜細(xì)胞全部受損無法滿足試驗檢測要求。另外五個及時做處理進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗，平均可滿足十幾次的擴(kuò)增。
由表三可見，利用本發(fā)明所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，所得到的核酸預(yù)提取和穩(wěn)定液可滿足1000次以上PCR擴(kuò)增(根據(jù)稀釋的倍數(shù)推算)。這種DNA制品主要是人的基因組DNA，可以滿足對遺傳基因檢測的需要(如Snp檢測)，以反映個體對疾病易感性、藥物耐受性等要求，且使用方便。
權(quán)利要求
1.一種口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，由外包裝盒、外包裝盒內(nèi)的口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管、核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管和口腔粘膜脫落細(xì)胞采集棒組成，其中口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管內(nèi)裝有透明等滲溶液，核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管內(nèi)裝有核酸提取液。
2.如權(quán)利要求1所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，其特征在于，所說的透明等滲溶液是指生理鹽水、復(fù)方乳酸氯化鈉溶液、5％的葡萄糖溶液、林格氏液或PH緩沖液。
3.如權(quán)利要求1所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，其特征在于，所說的核酸提取液是1)4M異硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉(pH7.0)和0.5％十二烷基肌氨酸鈉；2)6M鹽酸胍、20mM Tris-HCl(pH7.0)和0.5％十二烷基肌氨酸鈉；3)6M異硫氰酸胍和20mM Tris-HCl(pH7.0)或4)6M NaI和10mM Tris-HCl(pH7.0)。
4.如權(quán)利要求1所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，其特征在于，口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管和核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管是指可密封的透明、無菌的玻璃或塑料容器。
5.如權(quán)利要求1所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，其特征在于，所說的口腔粘膜脫落細(xì)胞采集棒是指木質(zhì)、竹制、金屬、橡膠或塑料等材質(zhì)制備的帶齒、網(wǎng)格紋或凹凸點(diǎn)的采集棒。
全文摘要
本發(fā)明屬于個人家庭健康保健和/或醫(yī)藥用口腔粘膜脫落細(xì)胞采集與保存的試劑盒技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的口腔粘膜脫落細(xì)胞自行采集與核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存的試劑盒，由外包裝盒、外包裝盒內(nèi)的口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管、核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管和口腔粘膜脫落細(xì)胞采集棒組成，其中口腔粘膜脫落細(xì)胞采集管裝有透明等滲溶液，核酸預(yù)提取并穩(wěn)定保存管裝有核酸提取液。本發(fā)明所述的試劑盒，對于普通人就可目測定性判斷采集的細(xì)胞是否足量用作檢測，避免了重新取樣，并且可在家里完成，對醫(yī)患雙方都非常方便，具有很好的市場推廣價值。
文檔編號C12Q1/68GK1943517SQ20051003031
公開日2007年4月11日 申請日期2005年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月8日
發(fā)明者應(yīng)康 申請人:上海聯(lián)眾基因科技研究院, 應(yīng)康