專利名稱：免疫磁性納米粒子細菌分離器及其制法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米生物分離器，更具體地說，本發(fā)明涉及一種免疫磁性納米粒子細菌分離器。本發(fā)明還涉及該分離器的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
眾所周知，納米技術(shù)領(lǐng)域是當今最熱門的科學技術(shù)研究領(lǐng)域，將納米技術(shù)應用于生物科學領(lǐng)域中所形成的新興科學技術(shù)-納米生物技術(shù)，是利用納米技術(shù)研究和解決生命科學領(lǐng)域中的重大問題的科學，它正成為當前重要的前沿科學研究領(lǐng)域之一。
現(xiàn)在，磁性納米粒子在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應用前景日益受到人們的關(guān)注。磁性納米粒子經(jīng)常被用作生物樣品磁場分離的分離介質(zhì)。用磁性納米粒子的分離方法操作簡便、所需設備廉價，同時分離速度快，有利于保持樣品的生物活性。目前，運用越來越廣泛。
大腸桿菌O157是產(chǎn)Vero毒性大腸埃希氏菌(Verotoxigenic Escherichia coli)中一群治病性極強的大腸桿菌，為一種新的人畜共患病病源，已經(jīng)成為進出口動物源性產(chǎn)品A類檢驗對象它除引起腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等嚴重的并發(fā)征，后者病情兇險，病死率高。自1982年在美國首次發(fā)現(xiàn)該細菌以來，疫情開始逐漸擴散和蔓延，相繼在英國、加拿大、日本等多個國家引起腹瀉暴發(fā)和流行。我國自1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測工作以來，已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到腸出血性大腸桿菌O157:H7，特別是1999年我國部分地區(qū)發(fā)生了腸出血性大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉的暴發(fā)，表明腸出血性大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。因此對于大腸桿菌的檢測顯得尤為重要。我國已加入WTO，畜禽產(chǎn)品國際貿(mào)易量日益增加，為了達到進入國際市場所必須的安全和品質(zhì)標準，為了保證廣大消費者的生命與健康，禽畜產(chǎn)品的安全檢測技術(shù)迫切需要快速，自動化和標準化在動物產(chǎn)品中建立一個價格低廉，快速簡便，重復性好的大腸桿菌O157的檢測方法已經(jīng)迫在眉睫。
目前，我國畜禽產(chǎn)品安全檢測技術(shù)主要是采用了一些傳統(tǒng)的方法如分離培養(yǎng)和鑒定，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等方法，存在操作過程復雜，檢測時間長等諸多缺陷，國外的方法通常使用的檢測大腸桿菌的方法主要有特點雖也能精確地檢測出大腸桿菌O157，但具有花費時間較長，代價較高等缺點，國外的方法如免疫乳膠，免疫金檢測試劑盒等方法，存在易凝結(jié)，價格昂貴等問題。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種具有自主知識產(chǎn)權(quán)且技術(shù)含量高，操作簡便，準確，快速的畜禽產(chǎn)品安全檢測的免疫磁性納米粒子細菌分離器，以便方便、快捷和高效的分離出細菌表面具有特定抗原標志物的細菌，如E.coli O157細菌、沙門氏桿菌等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種免疫磁性納米粒子細菌分離器。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備該免疫磁性納米粒子細菌分離器的方法。
本發(fā)明的再一個目的是將該免疫磁性納米粒子細菌分離器應用于分離具有特定細菌表面標記物的細菌。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種免疫磁性納米粒子細菌分離器，它含有如下的三層結(jié)構(gòu)(1)由核殼型磁性納米粒子構(gòu)成的內(nèi)核層；(2)包覆內(nèi)核層的中間層；較好地，所述中間層為AEAPS[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]；(3)包覆中間層的抗體/配體外殼層，所述的抗體是抗E.coil O157:H7單克隆抗體或抗沙門氏桿菌單克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的核殼型磁性納米粒子內(nèi)核層包括內(nèi)核和外殼。所述內(nèi)核層的內(nèi)核成分選自鐵的氧化物、鐵、鎳、鎳-鐵合金、或其組合。較佳地，所述內(nèi)核層的內(nèi)核成分是鐵的氧化物。所述內(nèi)核層的外殼成分選自二氧化硅、瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物、或其組合。較佳地，所述內(nèi)核層的外殼成分是二氧化硅。
其中，所述抗體/配體外殼層是通過固化劑或交聯(lián)劑(例如乙醇、甲醛、戊二醛)與中間層連接的抗體或配體。更佳地，所述的固化劑或交聯(lián)劑選自戊二醛。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備免疫磁性納米粒子細菌分離器的方法，它包括以下步驟(1)在含磁性納米粒子和內(nèi)核層外殼形成劑(如正硅酸乙酯)的微乳液體系中，通過油包水型反相微乳液法，形成核殼型磁性納米粒子，所述的核殼型磁性納米粒子包括內(nèi)核和外殼，所述的磁性納米粒子選自鐵的氧化物、鐵、鎳、鎳-鐵合金、或其組合；所述的內(nèi)核層外殼形成劑形成成分選自下組的外殼二氧化硅、瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物、或其組合；(2)使用[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]對步驟(1)的核殼型磁性納米粒子表面進行修飾，得到修飾了氨基的磁性納米粒子；(3)使用抗體或配體對步驟(2)的修飾了氨基的磁性納米粒子的表面進行修飾，形成免疫磁性納米粒子細菌分離器。
其中，所述微乳液體系中TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷按1∶(1～3)∶(4～6)的比例均勻混合；或是異丙醇和水按1～10∶1的體積比例均勻混合，優(yōu)選5∶1的比例進行混合。
在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明所述的免疫磁性納米粒子細菌分離器的用途，它被用于分離細菌，所述的細菌的表面具有與所述抗體結(jié)合的抗原，或者與所述配體結(jié)合的受體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種分離細菌的方法，包括步驟將該免疫磁性納米粒子細菌分離器與含有目標細菌的溶液接觸，形成所述免疫磁性納米粒子細菌分離器與目標細菌的復合物，然后在外磁場的引導下分離出所述的復合物。


圖1是包裹了二氧化硅的磁性納米粒子的傅立葉轉(zhuǎn)換紅外圖譜，表明二氧化硅已經(jīng)很好地包裹在磁性納米粒子的表面。
圖2是修飾了氨基的磁性納米粒子的傅立葉轉(zhuǎn)換紅外圖譜，圖譜表明氨基已經(jīng)修飾在納米粒子的表面。
表3是利用免疫磁性納米粒子進行細菌分離的效果圖，表明該細胞分離器可以有效地分離H7細菌，有較好地分離效果。
具體實施例方式
本發(fā)明者經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)明了在磁性納米粒子的表面修飾能識別并結(jié)合抗體或配體等蛋白質(zhì)物質(zhì)，然后用這種磁性納米粒子去捕獲目標細菌，再在外磁場的作用下進行分離的技術(shù)。
細菌分離器的結(jié)構(gòu)本發(fā)明的細菌分離器含有如下的三層結(jié)構(gòu)(1)由核殼型磁性納米粒子構(gòu)成的內(nèi)核層；(2)包覆內(nèi)核層的中間層；(3)包覆中間層的抗體/配體外殼層，適用于本發(fā)明的抗體或配體沒有特別的限制。可以是任何針對細菌表面上的抗原或受體的抗體或配體。例如，抗E.coil O157:H7抗原的抗體。
所述抗體/配體外殼層是抗H7單克隆抗體或抗沙門氏桿菌單克隆抗體。
較佳地，核殼型磁性納米粒子內(nèi)核層包括內(nèi)核和外殼。
所述內(nèi)核層的內(nèi)核成分可以為鐵、鐵的氧化物、鐵與其他金屬的合金，較佳地選自鐵的氧化物、鐵、鎳、鎳-鐵合金、或其組合，更佳地為鐵的氧化物。
所述內(nèi)核層的外殼成分可以是無機包裹層，例如氨基硅烷、巰基硅烷，還可以是有機包裹層，例如糖苷、蛋白質(zhì)等。無機包裹層優(yōu)選氨基硅烷，有機包裹層優(yōu)選糖苷。較佳地，外殼成分選自二氧化硅、瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物、或其組合。更佳地，所述內(nèi)核層的外殼成分是二氧化硅。對于選定的外殼成分，可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)選用合適的內(nèi)核層外殼形成劑。例如當外殼成分為二氧化硅時，可選用正硅酸乙酯或其它合適的內(nèi)核層外殼形成劑。
所述抗體/配體外殼層是大腸桿菌單克隆抗體、沙門氏細菌單克隆抗體，較佳地，為通過戊二醛與中間層連接的抗體或配體。
制備方法本發(fā)明的制備免疫磁性納米粒子細菌分離器的方法，它包括以下步驟(1)在含磁性納米粒子和內(nèi)核層外殼形成劑的微乳液體系中，通過油包水型反相微乳液法，形成核殼型磁性納米粒子，所述的核殼型磁性納米粒子包括內(nèi)核和外殼，所述的磁性納米粒子選自鐵的氧化物、鐵、鎳、鎳-鐵合金、或其組合；所述的內(nèi)核層外殼形成劑形成成分選白下組的外殼二氧化硅、瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物、或其組合；(2)使用[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]對步驟(1)的核殼型磁性納米粒子表面進行修飾，得到修飾了氨基的磁性納米粒子；(3)用抗體或配體對步驟(2)的修飾了氨基的磁性納米粒子的表面進行修飾，形成免疫磁性納米粒子細菌分離器。
在本發(fā)明的一個實施例中，所述微乳液體系為TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷混合物，按1∶1～3∶4～6的體積比比例均勻混合。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述微乳液體系為異丙醇和水按1～10∶1的體積比比例均勻混合。
在一個優(yōu)選例中，本發(fā)明的制備免疫磁性納米粒子細菌分離器的方法包括以下步驟(1)制備磁性納米粒子用二次蒸餾水分別配制FeSO4.7H2O和FeCl3.6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在鐵鹽的混合溶液中Fe2+離子的濃度為0.1～0.2mol/l，F(xiàn)e3+離子的濃度為0.1～0.3mol/l，NaOH溶液的濃度為2～3mol/l。在劇烈攪拌下將體積為混合鹽溶液體積一半的NaOH溶液緩慢地滴加到混合鹽溶液中。將所得到的固體沉淀在40℃～60℃下陳化12h，用二次蒸餾水將沉淀物清洗數(shù)次，過濾后再在40℃～80℃的條件下干燥24h，在瑪瑙研缽中研磨后即得產(chǎn)物。
(2)二氧化硅在γ-Fe2O3表面的修飾將TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷按1∶(1～3)∶(4～6)的比例均勻混合，形成透明穩(wěn)定的微乳液體系。將上述微乳液體系置于超聲波中處理30-60分鐘，再向其中加入0.01～1g的γ-Fe2O3(磁性納米粒子)，用超聲波處理3分鐘后取出上層液倒入三頸燒瓶中，攪拌30～60分鐘使之均勻。取1ml一定濃度的濃氨水用2ml二次蒸餾水稀釋，將其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續(xù)攪拌10～60分鐘使氨水均勻分散在微乳液中。1小時后，向微乳液中滴加1～5ml的正硅酸乙酯(內(nèi)核層外殼形成劑)，同時不斷地攪拌10小時，并將體系的溫度保持在15～40℃之間。向體系中加入丙酮使粒子沉淀，或者將體系靜置過夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。將清洗后的粒子置于300～700℃的條件下鍛燒1～4個小時，收集核殼型磁性納米粒子。
(3)用[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷](AEAPS)修飾磁性納米粒子表面取15mg磁性納米粒子向其中加入30～50ml的甲醇和丙三醇的混合液(甲醇∶丙三醇的體積比為2∶3-2∶1)中，用超聲波處理20～60分鐘；稱取0.01～1g AEAPS([N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷])，用超聲波處理10～60分鐘；將這兩種溶液混合均勻，在10～95℃的條件下反應1-6小時，然后取出粒子并用甲醇清洗3次，接著在100-300℃真空干燥，收集粒子。
(4)抗體或配體在磁性納米粒子表面的修飾取步驟(3)中制備的粒子，加至pH為7.0-8.0的磷酸鹽緩沖體系中，加入用量為使交聯(lián)劑(或固化劑)在體系中的濃度約為0.5％-2％，形成混合溶液。所述的混合溶液用超聲波處理30-60分鐘。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌約1-5次(更佳地2-3次)。
取一定量的抗體或配體(與磁性納米粒子的濃度比通常為1∶6-1∶3)，加入到上述粒子的混合溶液中。在4-40℃的反應溫度下反應1-6小時，從而將抗體或配體上的NH2在固定劑的作用下與中間層上的功能基團反應，使抗體或配體通過共價鍵連接于中間層。反應結(jié)束后，磁性分離所述的粒子，用磷酸鹽緩沖液洗滌約2-3次。這樣得到的免疫磁性納米粒子細菌分離器可置于磷酸鹽緩沖液中保存?zhèn)溆谩?br> 適用于本發(fā)明的抗體或配體沒有特別的限制?？梢允侨魏吾槍毦砻嫔系目乖蚴荏w的抗體或配體。例如，抗E.coil O157:H7抗原的抗體。
核殼型磁性納米粒子內(nèi)核層的內(nèi)核成分除了鐵的氧化物以外，還可包括鐵、鎳(Ni)或者鎳(Ni)和鐵(Fe)等的合金。
核殼型磁性納米粒子內(nèi)核層的外殼成分除了二氧化硅等無機包裹層以外，還有瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物等有機包裹層。對于選定的外殼成分，可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)選用合適的內(nèi)核層外殼形成劑。例如當外殼成分為二氧化硅時，可選用正硅酸乙酯或其它合適的內(nèi)核層外殼形成劑。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)使用的磁性納米粒子是單分散性的且具有超順磁性，不產(chǎn)生團聚現(xiàn)象，磁性納米粒子的形狀和直徑易于控制；(2)能識別靶細菌的抗體或配體通過化學鍵與磁性納米粒子連接，牢固性好，不易脫落；(3)本發(fā)明方法簡便而高效。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1磁性納米粒子的內(nèi)核層的制備方法采用改進的化學共沉淀制備磁性粒子的內(nèi)核層，具體方法如下用二次蒸餾水分別配制FeSO4.7H2O和FeCl3.6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在鐵鹽的混合溶液中Fe2+離子的濃度為0.1～0.2mol/l，F(xiàn)e3+離子的濃度為0.1～0.3mol/l，NaOH溶液的濃度為2～3mol/l。在劇烈攪拌下將體積為混合鹽溶液體積一半的NaOH溶液緩慢地滴加到混合鹽溶液中。將所得到的固體沉淀在40℃～60℃陳化12h，用二次蒸餾水將沉淀物清洗數(shù)次，過濾后再在40℃～80℃的條件下干燥24h，在瑪瑙研缽中研磨后即得產(chǎn)物。
實施例2核殼型核酸磁性納米粒子的制備方法將TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷按1∶2∶5的比例均勻混合，形成透明穩(wěn)定的微乳液體系。將上述微乳液體系置于超聲波中處理30～60分鐘，再向其中加入0.5g的γ-Fe2O3，用超聲波處理6分鐘后取出上層液倒入三頸燒瓶中，攪拌30分鐘使之均勻。取1ml一定濃度的氨水用2ml二次蒸餾水稀釋，30分鐘后將其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續(xù)攪拌30分鐘使氨水均勻分散在微乳液中。1小時后，向微乳液中滴加1～3ml的正硅酸乙酯，同時不斷地攪拌10小時，并將體系的溫度保持在15～30℃之間。向體系中加入丙酮使粒子沉淀，或者將體系靜置過夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。將清洗后的粒子置于400～700℃的條件下，鍛燒1～4個小時，收集粒子。
實施例3核殼型核酸磁性納米粒子的制備方法將異丙醇和水按照5∶1的比例均勻混合，超聲5min。稱量約1.g的γ-Fe2O3加入到上述配制的溶液體系中，超聲處理10min。取上層清液倒入三頸燒瓶中，不斷攪拌使其保持分散狀態(tài)。取1ml一定濃度的濃氨水，將其緩慢加入到不斷攪拌的溶液體系中。接著取1～3ml的正硅酸乙酯，同樣將其緩慢加入到不斷攪拌的溶液體系中。體系在室溫的條件下反應3-5個小時。將反應產(chǎn)物倒出，用二次蒸餾水洗滌粒子3-5次。清洗后的粒子在20-50℃的溫度下真空干燥5小時，然后在500-600℃的條件下，煅燒1-4小時，收集粒子備用。
實施例4免疫磁性納米粒子細菌分離器的制備(a)用硅烷修飾磁性納米粒子表面取20mg實施例2中制得的磁性納米粒子，加入30-50ml的甲醇和丙三醇5∶3的組成的混合液中，用超聲波處理20～60分鐘；稱取1-3ml AEAPS，用超聲波處理10～60分鐘；將這兩種溶液混合均勻，在一定的溫度條件下反應5小時，然后取出粒子并用甲醇清洗3次，接著在40～80℃真空干燥2小時，收集粒子。
從圖1中可以看出，氨基被修飾到磁性納米粒子的表面。
(b)在磁性納米粒子的表面修飾抗體取1-3mg如上制備的粒子，加至pH為7.0-8.0的磷酸鹽緩沖體系中，加入用量為50-200μl交聯(lián)劑(戊二醛)，形成混合溶液。所述的混合溶液用超聲波處理10-30分鐘。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌2-3次。
取約3微克的抗H7單克隆抗體(購自Sigma Aldrich試劑公司)，加入到含約2ml的上述粒子的混合溶液中。在一定的反應溫度下反應3小時，從而將抗體上的氨基與中間層上的功能基團在固定劑的作用下進行反應，使抗體通過共價鍵直接連接于中間層。反應結(jié)束后，磁性分離出所述的粒子，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。這樣得到的免疫磁性納米粒子細菌分離器被置于磷酸鹽緩沖液中保存?zhèn)溆谩?br> 實施例5免疫磁性納米粒子細菌分離器的制備(a)用硅烷修飾磁性納米粒子表面取10-20mg實施例2中制得的磁性納米粒子，加入30-50ml的1∶1的甲醇和丙三醇組成的混合液中，用超聲波處理20～60分鐘；稱取2ml AEAPS，用超聲波處理10～60分鐘；將這兩種溶液混合均勻，在60-85℃的條件下反應2-4小時，然后取出粒子并用甲醇清洗3次，接著在60℃真空干燥2小時，收集粒子。
(b)抗體對磁性納米粒子的修飾取0.5mg如上制備的粒子，加至pH為7.0-8.0的磷酸鹽緩沖體系中，加入用量為50-100μl交聯(lián)劑(戊二醛)，形成混合溶液。所述的混合溶液用超聲波處理30-60分鐘。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌2-3次。
取約1.5微克的羊抗兔抗體(購自Sigma公司)，加入到含約0.5mg的上述粒子的混合溶液中。在一定的反應溫度下反應若干小時，從而將抗體上的NH2與中間層上的功能基團在固定劑的作用下進行反應，使抗體通過共價鍵直接連接于中間層。反應結(jié)束后，磁性分離出所述的粒子，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。這樣得到的免疫磁性納米粒子細菌分離器被置于磷酸鹽緩沖液中保存?zhèn)溆谩?br> 實施例6免疫磁性納米粒子細菌分離器的應用1取實施例4中制得的免疫磁性納米粒子細菌分離器50-100μl(0.5mg/ml)，向其中加入50μl的細菌溶液和一定量(50-200μl)的PBS緩沖溶液，在4±2℃的條件下反應20-40min，反應過程中不斷混搖使反應充分。
在外界磁場的作用下收集免疫磁性納米粒子，出去上清液。用PBS緩沖溶液洗滌3-5次。除去上清液，加入100-200μl的LB液體，混勻使粒子均勻分布，涂布營養(yǎng)瓊脂板在37℃的條件下，培養(yǎng)16-24小時。用顯微鏡觀察細菌集落的生長情況，從而判斷免疫磁性納米粒子細菌分離器的效能。
實施例7免疫磁性納米粒子細菌分離器的應用2取實施例5中制得的免疫磁性納米粒子細菌分離器100-200μl(0.5mg/ml)，向其中加入一定量的抗E.coil O157:H7單克隆抗體(Sigma-Aldrich)，在4±2℃不斷振蕩的條件下反應15-30min。在外界磁場的作用下進行磁性分離，除去上清液，用PBS緩沖溶液洗滌2-3次。將分離的免疫磁性納米粒子分散在PBS緩沖溶液中備用。
取上述分離得到的免疫磁性納米粒子細菌分離器50-100μl(0.5mg/ml)，向其中加入50-100μl的細菌溶液和一定量的(50-100μl)的PBS緩沖溶液，在37℃不斷振蕩的條件下反應20-30min。
在外在磁場的作用下收集磁性納米粒子，除去清液。用PBS緩沖溶液清洗磁性納米粒子3-5次。除去上清液，加入50-200μl的LB液體，混勻使粒子均勻分布，涂布營養(yǎng)瓊脂板在37℃的條件下，培養(yǎng)16-24小時。用顯微鏡觀察細菌集落的生長情況，從而判斷免疫磁性納米粒子細菌分離器的效能。
實施例8免疫磁性納米粒子細菌分離器的應用3取實施例5中制得的免疫磁性納米粒子細菌分離器100-200μl(0.5mg/ml)，向其中加入一定量的抗沙門氏桿菌單克隆抗體(Sigma-Aldrich)，在4±2℃不斷振蕩的條件下反應20-30min。在外界磁場的作用下進行磁性分離，除去上清液，用PBS緩沖溶液洗滌2-3次。將分離的免疫磁性納米粒子分散在PBS緩沖溶液中備用。
取上述分離得到的免疫磁性納米粒子細菌分離器50-100μl(0.5mg/ml)，向其中加入50-100μl的細菌溶液和一定量的(50-100μl)的PBS緩沖溶液，在37℃不斷振蕩的條件下反應20-30min。
在外在磁場的作用下收集磁性納米粒子，除去清液。用PBS緩沖溶液清洗磁性納米粒子3-5次。除去上清液，加入50-200μl的LB液體，混勻使粒子均勻分布，涂布營養(yǎng)瓊脂板在37℃的條件下，培養(yǎng)16-24小時。用顯微鏡觀察細菌集落的生長情況，從而判斷免疫磁性納米粒子細菌分離器的效能。
結(jié)果實施例3-5制得的核殼型核酸磁性納米粒子是單分散性的且具有超順磁性，不會產(chǎn)生團聚現(xiàn)象，且其形狀和直徑易于控制。此外，能特異性地識別H7細菌(靶細菌)，而且與H7細菌的結(jié)合牢固性好，不易脫落，因此分離效果非常好。從表2中可以看出免疫磁珠的分離效果達到了比較理想的結(jié)果，具有很好地特異性識別目標細菌地能力。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種免疫磁性納米粒子細菌分離器，它含有如下的三層結(jié)構(gòu)(1)由核殼型磁性納米粒子構(gòu)成的內(nèi)核層；(2)包覆內(nèi)核層的中間層；(3)包覆中間層的抗體/配體外殼層，其特征在于，所述抗體/配體外殼層是抗E.coil O157:H7單克隆抗體或抗沙門氏桿菌單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁性納米粒子細菌分離器，其特征在于，核殼型磁性納米粒子內(nèi)核層包括內(nèi)核和外殼。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫磁性納米粒子細菌分離器，其特征在于，所述內(nèi)核層的內(nèi)核成分選自鐵的氧化物、鐵、鎳、鎳-鐵合金、或其組合，優(yōu)選鐵的氧化物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫磁性納米粒子細菌分離器，其特征在于，所述內(nèi)核層的外殼成分選自二氧化硅、瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物、或其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫磁性納米粒子細菌分離器，其特征在于，所述內(nèi)核層的外殼成分是二氧化硅。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁性納米粒子細菌分離器，其特征在于，所述抗體/配體外殼層是通過戊二醛與中間層連接的抗體或配體。
7.一種制備權(quán)利要求1所述的免疫磁性納米粒子細菌分離器的方法，其特征在于，它包括以下步驟(1)在含磁性納米粒子和內(nèi)核層外殼形成劑的微乳液體系中，通過油包水型反相微乳液法，形成核殼型磁性納米粒子，所述的核殼型磁性納米粒子包括內(nèi)核和外殼，所述的磁性納米粒子選自鐵的氧化物、鐵、鎳、鎳-鐵合金、或其組合；所述的內(nèi)核層外殼形成劑形成成分選自下組的外殼二氧化硅、瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物、或其組合；(2)使用[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]對步驟(1)的核殼型磁性納米粒子表面進行修飾，得到修飾了氨基的磁性納米粒子；(3)用抗體或配體對步驟(2)的修飾了氨基的磁性納米粒子的表面進行修飾，形成免疫磁性納米粒子細菌分離器。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述微乳液體系中TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷按1∶1～3∶4～6的體積比例均勻混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述微乳液體系中異丙醇和水按1～10∶1的體積比比例均勻混合。
10.如權(quán)利要求1所述的免疫磁性納米粒子細菌分離器的用途，其特征在于，用于分離細菌，所述的細菌的表面具有與所述抗體結(jié)合的抗原，或者與所述配體結(jié)合的受體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫磁性納米粒子細菌分離器，它具有如下的三層結(jié)構(gòu)(1)由核殼型磁性納米粒子構(gòu)成的內(nèi)核層；(2)包覆內(nèi)核層的中間層；(3)包覆中間層的抗體/配體外殼層。本發(fā)明還涉及制備該免疫磁性納米粒子細菌分離器的方法。本發(fā)明的免疫磁性納米粒子細菌分離器可簡單有效地分離目標細菌，例如E.coil O157∶H7細菌。
文檔編號C12Q1/04GK1952113SQ20051003066
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者沈鶴柏, 陳偉, 嚴亞賢, 朱向玲 申請人:上海師范大學