專利名稱：受高鹽誘導(dǎo)的鹽藻基因片段和鈉／磷共轉(zhuǎn)運(yùn)通道基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，屬于受高鹽脅迫誘導(dǎo)的新的鹽藻差減cDNA文庫(kù)、基因片段的分離和一個(gè)受高鹽脅迫和無(wú)機(jī)磷饑餓誘導(dǎo)表達(dá)的新的鹽藻(Dunaliella viridis)的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
植物對(duì)滲透脅迫的反應(yīng)是一個(gè)多基因控制的復(fù)雜過(guò)程。不同植物對(duì)滲透脅迫的反應(yīng)也不盡相同，具有豐富的多樣性。但是，對(duì)滲透脅迫的細(xì)胞水平的反應(yīng)則似乎在整個(gè)生物界都是保守的(Yancey等.Living with water stressevolution of osmolyte systems.Science 1982，2171214-1222)。已有相當(dāng)多的例子表明，從高等植物中獲得的一些基因，往往是間接利用了從動(dòng)物、低等植物、甚至是酵母、細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的該類同源基因才分離出來(lái)的。實(shí)際上，這些同源基因也經(jīng)常被直接應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物遺傳改良中。
同樣的道理，從一些生存于極端環(huán)境如高鹽堿環(huán)境中的低等生物中，應(yīng)該能較方便地分離得到與抗?jié)B透脅迫相關(guān)的基因，這些基因很可能被直接或間接用于轉(zhuǎn)化各種重要農(nóng)作物。鹽藻(Dunaliella viridis)就是一個(gè)具有這樣特性的真核單細(xì)胞綠藻(Cowan.A.K等.Dunaliella salinaA model system for studying theresponase of plant cells to stress.J Exp Bot 1992；431535-1547)。它的抗環(huán)境脅迫的能力異乎尋常，是迄今所知的最耐鹽的真核生物，可以在從接近淡水(NaCl＜50mM)直到飽和鹽水(NaCl＞5M)的環(huán)境中生長(zhǎng)。同時(shí)還具有極強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力，其細(xì)胞一次可以耐受3-4倍滲透壓的變化(Sadka A等.A 150kilodalton cell surface protein is induced by salt in the halotolerantgreen alga Dunaliella salina.Plant physiol 1991；95822-831)。因此，鹽藻因其極強(qiáng)的耐受滲透脅迫和其它極端環(huán)境的能力被作為研究耐逆機(jī)制及其發(fā)掘抗逆基因的模式生物而倍受關(guān)注(Hans J.Bohnert等.A genomics approachtowards salt stress tolerance，Plant Physiol.Biochem.2001，39，295-311)。
抑制差減雜交(Suppression subtractive hybri dization，SSH)技術(shù)(Diatchenko L.等，Suppression subtractive hybridizationa method forgenerating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes andlibraries.Proc.Natl Acad Sci USA，1996，93(12)6025-6030)是近年興起并廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生殖、發(fā)育、分化、癌變、衰老及程序化死亡等生命過(guò)程有關(guān)基因的差異表達(dá)以及相關(guān)基因的分子克隆的最有效的方法之一。
為了更好地從分子水平上對(duì)鹽藻進(jìn)行耐鹽機(jī)制的研究、發(fā)掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因資源，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因及其編碼蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有鹽藻高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因及其分離鑒定的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人進(jìn)行了廣泛的研究，利用當(dāng)前的分子生物學(xué)技術(shù)如抑制差減雜交技術(shù)、基因芯片及生物信息學(xué)等構(gòu)建了極端耐鹽的模式生物鹽藻(Dunaliellaviridis)受高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)，并從中克隆到10個(gè)新的受鹽脅迫誘導(dǎo)的基因片段和1個(gè)Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白基因cDNA(DvSPT1)和基因組DNA(GDvSPT1)，并對(duì)DvSPT1基因進(jìn)行功能分析。
根據(jù)上述的研究工作，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)用于篩選鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)的基因。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)的cDNA片段。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之四是提供鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白基因的cDNA序列及其全長(zhǎng)基因序列。
另外，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的氨基酸序列。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下采用本領(lǐng)域常用的抑制差減雜交法構(gòu)建鹽藻高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)。優(yōu)選地鹽藻在低鹽條件下培養(yǎng)，用抑制差減雜交法構(gòu)建差減cDNA文庫(kù)。優(yōu)選地，鹽藻在低鹽條件下培養(yǎng)，然后經(jīng)4倍滲透壓的高鹽脅迫誘導(dǎo)，鹽藻從0.5M NaCl到2.0M NaCl誘導(dǎo)24小時(shí)，用抑制差減雜交法構(gòu)建差減cDNA文庫(kù)。
鹽藻高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法包括如下步驟(a)鹽藻從低鹽到高鹽脅迫誘導(dǎo)；(b)提取鹽藻誘導(dǎo)前后的mRNA；(c)將(b)所獲得的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，誘導(dǎo)后的cDNA為測(cè)試cDNA(Tester cDNA)，誘導(dǎo)前的cDNA為參照cDNA(Driver cDNA)；(d)將Tester cDNA和Driver cDNA均用RsaI酶切產(chǎn)生較短的平末端片段；將Tester產(chǎn)物分成兩等份，分別與不同的接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)連接，而Driver cDNA不與接頭連接；(e)兩份Tester(Tester cDNA-Adaptor 1和Tester cDNA-Adaptor2R)分別與Driver cDNA混合，進(jìn)行第一次差減雜交；(f)將(e)的兩份雜交產(chǎn)物未經(jīng)變性即進(jìn)行混合，并加入過(guò)量Driver cDNA混合，進(jìn)行第二次差減雜交；(g)接頭末端填平；(h)抑制性PCR擴(kuò)增差異表達(dá)的序列；(i)用巢式引物(Nested Primer)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，使差異表達(dá)的片段得到富集；(j)將(i)的擴(kuò)增產(chǎn)物插入克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建鹽藻高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)。
其中，提取鹽藻誘導(dǎo)前后的mRNA、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法在本領(lǐng)域是公知的，而且有商品化的產(chǎn)品可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員方便地實(shí)施之。通常將靶序列所在的樣本稱為檢測(cè)樣本(Tester)，而把用于參照的樣本稱為參照樣本(Driver)。在本發(fā)明中，鹽藻誘導(dǎo)后的mRNA即為測(cè)試樣本(Tester)而誘導(dǎo)前的mRNA即為參照樣本(Driver)。RsaI為四堿基位點(diǎn)(GTAC)識(shí)別酶，可以將由mRNA而來(lái)的雙鏈cDNA酶切為幾個(gè)片段并產(chǎn)生平末端，增加了差異表達(dá)基因檢出的幾率、防止長(zhǎng)鏈cDNA片段所形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)有效差減雜交的干擾。接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)是由一長(zhǎng)鏈(約40余個(gè)核苷酸)和一短鏈(約10余個(gè)核苷酸)組成的一端是平末端的雙鏈DNA片段，而且雙鏈兩個(gè)5’端均無(wú)磷酸基團(tuán)，保證了接頭以唯一的方向與cDNA片段連接即接頭長(zhǎng)鏈的3’端與cDNA的雙鏈5’端連接。接頭長(zhǎng)鏈外側(cè)序列與第一次PCR引物序列相同，內(nèi)側(cè)序列與第二次PCR引物序列相同。在接頭上含有T7啟動(dòng)子序列并含有內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(如Not I、Srf I、Sma I、Xba I)，為以后該片段插入克隆載體提供酶切位點(diǎn)。接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)的序列對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，或者采用商品化的產(chǎn)品。
在本發(fā)明構(gòu)建鹽藻差減cDNA文庫(kù)的步驟(h)中選用與接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)外側(cè)端核苷酸序列相同的引物進(jìn)行抑制差減PCR擴(kuò)增。在步驟(i)中選用一對(duì)與接頭內(nèi)側(cè)端核苷酸序列相同的引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。這樣經(jīng)過(guò)兩輪PCR、基于PCR抑制效應(yīng)的存在以及選用兩對(duì)引物可以特異擴(kuò)增代表了鹽藻經(jīng)高鹽脅迫誘導(dǎo)的差異表達(dá)的cDNA片段?；谏鲜雒枋?，接頭(Adaptor1和Adaptor 2R)的序列對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，或者采用商品化的產(chǎn)品，因而步驟(h)和(i)所選用的引物對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，或者采用商品化的產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增選用本領(lǐng)域常用的條件。
接頭上含有酶切位點(diǎn)，因而利用本領(lǐng)域公知的方法可以方便地實(shí)現(xiàn)將上述PCR產(chǎn)物插入克隆載體。用本領(lǐng)域常用的方法將插入了PCR產(chǎn)物的克隆載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
其中步驟(a)高鹽脅迫誘導(dǎo)鹽藻的方法是鹽藻在低鹽條件下培養(yǎng)，然后經(jīng)4倍滲透壓的高鹽脅迫誘導(dǎo)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，鹽藻在含有0.5M NaCl的DM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有2.0M NaCl的DM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24小時(shí)。
利用接頭引物(步驟(h)和步驟(i)的引物)對(duì)上述差減cDNA文庫(kù)的部分克隆進(jìn)行PCR鑒定。以差減cDNA第二輪PCR產(chǎn)物為探針，用d-32p dCTP標(biāo)記，通過(guò)Micro-Array技術(shù)對(duì)所得到上述差減cDNA文庫(kù)的克隆做進(jìn)一步鑒定，其中有11個(gè)cDNA克隆其表達(dá)明顯地受高鹽脅迫誘導(dǎo)而增強(qiáng)表達(dá)，并對(duì)這些克隆進(jìn)行了測(cè)序和BLASTX分析。
因而，本發(fā)明提供了鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)的cDNA片段，SEQ ID NO1～11。其中SEQ ID NO8編碼了一個(gè)已知的葉綠素a/b結(jié)合蛋白(chlorophyll a/bbinding protein)，其余包括SEQ ID NO1～7及SEQ ID NO9～11在基因庫(kù)(Genbank)中無(wú)同源序列發(fā)現(xiàn)，均為可能的新基因。
本發(fā)明的另一方面，利用鹽藻高鹽脅迫誘導(dǎo)的差異cDNA片段(SEQ IDNO1)為探針篩選鹽藻cDNA文庫(kù)，得到1個(gè)特異陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定結(jié)果表明，cDNA全長(zhǎng)是2649bp，含有綠藻基因特異的加尾信號(hào)TGTAA(Andrens HW等，Primary structure of the plasma membrane H-ATPase from the halotolerantalga Dunaliella bioculata.1995，Plant Mol Biol，28657-666)及poly(A)結(jié)構(gòu)，命名為DvSPT1，SEQ ID NO12，系編碼鹽藻(Dunaliella viridis)的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的全長(zhǎng)cDNA。其中79～2097編碼鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白。
在本發(fā)明的說(shuō)明中，鹽藻cDNA文庫(kù)是指用本領(lǐng)域常用的方法提取鹽藻mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后插入克隆載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞而得到的代表鹽藻基因表達(dá)的cDNA文庫(kù)。而鹽藻差減cDNA文庫(kù)指本發(fā)明用抑制差減雜交法構(gòu)建的鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)前后的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)。
本發(fā)明另一方面還提供鹽藻(Dunaliella viridis)的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白，命名為DvSPT1，其氨基酸序列為SEQ ID NO13。
本發(fā)明還提供了鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的全長(zhǎng)基因，命名為GDvSPT1，SEQ ID NO14。
本發(fā)明還提供了編碼鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的基因序列，SEQID NO15。由于密碼子具有簡(jiǎn)并性，因而本發(fā)明的范圍不限于SEQ ID NO15的序列，應(yīng)延及其編碼Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的任一核苷酸改變。
利用本發(fā)明提供的鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)可以篩選鹽藻在受高鹽脅迫誘導(dǎo)時(shí)特異表達(dá)基因，如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例篩選獲得了編碼鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的基因，SEQ ID NO12。因而利用本發(fā)明的成果能更好地從分子水平上對(duì)鹽藻進(jìn)行耐鹽機(jī)制的研究和發(fā)掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因資源。利用本發(fā)明的構(gòu)建鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)的方法及構(gòu)建的差減文庫(kù)可以快速、高效、高度靈敏地同時(shí)分離幾十甚至幾百個(gè)差異表達(dá)的基因。
本發(fā)明人提供的利用上述差減cDNA文庫(kù)分離獲得的受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因片段SEQ ID No.1～11，除SEQ ID No.8以外，均為新基因片段，這為進(jìn)一步分離鹽藻響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)基因的分離及耐鹽分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
另外，本發(fā)明提供的Na+/H2POx-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的基因DvSPT1基因cDNA及基因組序列GDvSPT1是首次從鹽藻中分離的新基因，其編碼了一個(gè)Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白，這個(gè)基因受高鹽脅迫和無(wú)機(jī)磷饑餓誘導(dǎo)特異表達(dá)，在鹽藻響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中起到重要的作用。由于該基因編碼的通道蛋白DvSPT1為一個(gè)受無(wú)機(jī)磷饑餓誘導(dǎo)而快速增強(qiáng)表達(dá)而提高細(xì)胞無(wú)機(jī)磷的吸收和運(yùn)輸，有望將該基因用于利用植物基因工程提高作物的土壤磷利用效率和分離得到一個(gè)受逆境特異誘導(dǎo)的啟動(dòng)子原件。


圖1顯示了鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白DvSPT1 cDNA序列及其編碼的氨基酸序列分析。
圖2顯示了鹽藻DvSPT1的氨基酸序列及同源蛋白的同源性比較分析，圖2A顯示的是N端同源性比較，圖2B顯示的是C端同源性比較。
圖3顯示了鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白全長(zhǎng)基因(GDvSPT1)5’-啟動(dòng)子區(qū)(圖3)。
圖4顯示了鹽藻DvSPT1基因在高鹽脅迫(圖4A)和無(wú)機(jī)磷饑餓(圖4B)條件下的Northern表達(dá)分析。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件和Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)或Melody S.Clark編《植物分子生物學(xué)—實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(PlantMolecular BiologyA Laboratory Manual)(Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)或迪芬巴赫(Dieffenbach，C.W)等《PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》(PCR PrimerALaboratory Manual)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2003，第二版)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。在描述了本發(fā)明和詳細(xì)描述了這些具體的實(shí)施方式之后，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)充分知曉如何設(shè)計(jì)其它可靠的方法，從而通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的成果獲得同樣的信息，因此無(wú)論描述得如何詳細(xì)具體，都不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的總體范圍。本發(fā)明的范圍僅為權(quán)利要求所記載的法律結(jié)構(gòu)所確定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)的差異cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及初步鑒定取在含有0.5mol/L NaCl的DM培養(yǎng)基(Sun Y等，Expression of foreigngene in Dunaliella by electroporation，Molecular Biotechnology，30(3)(2005)185-92)中穩(wěn)定培養(yǎng)的鹽藻細(xì)胞和再將上述培養(yǎng)狀態(tài)的鹽藻轉(zhuǎn)移到2mol/L NaCl濃度的培養(yǎng)基DM中繼續(xù)滲透振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后的鹽藻細(xì)胞提取mRNA(OligotexTMmRNA Kit，QIAGEN)。按試劑盒(PCR-selectedTMcDNAsubtraction kit，clontech)要求，每一個(gè)樣品需要2μg的mRNA，由于純化的mRNA樣品中有少量rRNA的殘留，各取了2.4μg在兩種狀態(tài)下獲得的mRNA樣品，進(jìn)行相應(yīng)的cDNA合成。為了很方便的檢測(cè)合成效率，在反應(yīng)中加入1μl以1/10稀釋的10mCi/ml，3000Ci/mmol的[α32-P]dCTP。第一鏈cDNA合成完成后，取出置于冰上終止第一鏈cDNA合成反應(yīng)，立即進(jìn)行第二鏈的合成。然后純化回收合成好的cDNA，并用蓋革計(jì)數(shù)器(Geiger counter)監(jiān)測(cè)沉淀的放射性以初步確認(rèn)合成效率，再電泳檢測(cè)合成cDNA片段的大小和效率。結(jié)果表明合成的cDNA主要集中分布在500bp到4000bp的范圍內(nèi)，質(zhì)量好。
然后，選用四堿基識(shí)別位點(diǎn)(GTAC)并產(chǎn)生平頭末端的RsaI酶對(duì)合成好的cDNA進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)主要集中在200bp-1000bp的范圍。
將酶切樣品取部分作為Tester cDNA，并且每一份樣品分作兩份，分別連接上有一段同源序列的接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)。其余的經(jīng)過(guò)酶切的誘導(dǎo)前的cDNA樣品則作為Driver cDNA。連接反應(yīng)完成后，取少量樣品進(jìn)行連接效率檢測(cè)，樣品內(nèi)源激動(dòng)蛋白的連接效率基本上＞25％，說(shuō)明連接反應(yīng)是成功的。
將以上兩端分別連有Adaptor 1和Adaptor 2R的cDNA作為Tester cDNA(2.0M)，與對(duì)應(yīng)的Driver cDNA(0.5M)進(jìn)行兩輪差減雜交反應(yīng)，富集得到由0.5M到2.0M NaCl滲透振蕩時(shí)特異表達(dá)或受誘導(dǎo)的基因片段。將兩輪差減雜交下來(lái)的cDNA群體經(jīng)過(guò)末端補(bǔ)平后，即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增之前，首先需要把cDNA的末端填平，以產(chǎn)生PCR Primer 1的結(jié)合位點(diǎn)。由于Adaptor1和Adaptor 2R的5’端有一個(gè)長(zhǎng)22個(gè)堿基的相同片段，因此第一次PCR擴(kuò)增時(shí)僅需使用一個(gè)引物，這就解決了引物聚合的問(wèn)題。另外，對(duì)于這些兩端連有不同Adaptor的差異表達(dá)分子而言，這個(gè)相同的片段就造成了一種抑制PCR效果，由于短分子更易形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此這種抑制效果對(duì)于非常短的cDNA(200bp以下)而言尤其明顯。這樣就大大的提高了長(zhǎng)分子的含量，從而平衡差減過(guò)程中由短片段更易雜交、擴(kuò)增和克隆而造成的潛在優(yōu)勢(shì)。第一次擴(kuò)增后，只有兩端含有不同Adaptor的ds cDNA片段能以指數(shù)形式擴(kuò)增。然后再用與接頭內(nèi)側(cè)序列互補(bǔ)的另一對(duì)巢式引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，以進(jìn)一步降低背景、富集差異表達(dá)的cDNA片段。
將經(jīng)過(guò)第二次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物直接與pMD18-T Vector(TaKaRa)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α熱激感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建了1個(gè)代表了鹽藻受0.5M～2.0M高鹽滲透誘導(dǎo)過(guò)程中特異表達(dá)基因片段的差減cDNA文庫(kù)(SSH cDNA文庫(kù))。利用接頭引物(Nested PCR primer 1，Nested PCR primer 2R)對(duì)SSH文庫(kù)的部分克隆進(jìn)行PCR鑒定，其插入片段的平均大小為300bp左右。
以差減cDNA第二輪PCR產(chǎn)物為探針，用α-32p dCTP標(biāo)記，通過(guò)Micro-Array技術(shù)對(duì)所得到的SSH cDNA文庫(kù)384個(gè)克隆做進(jìn)一步鑒定，每張膜上的矩陣分布為8*2，即每一個(gè)克隆在一個(gè)矩陣?yán)镉袃蓚€(gè)重復(fù)。根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，其中有11個(gè)cDNA克隆其表達(dá)明顯地受高鹽脅迫誘導(dǎo)而增強(qiáng)表達(dá)，并對(duì)這些克隆進(jìn)行了測(cè)序和BLASTX分析(表1)。SEQ ID NO1～11參見序列表SEQ ID NO1～11。其中SEQ ID NO8編碼了一個(gè)已知的葉綠素a/b結(jié)合蛋白(chlorophyll a/bbinding protein)，其余包括SEQ ID NO1～7及SEQ ID NO9～11在基因庫(kù)(Genbank)中無(wú)同源序列發(fā)現(xiàn)，均為可能的新基因。
實(shí)施例2鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道基因的分離及序列分析(a)鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及序列分析通過(guò)利用SSH差異片段CP1A60(SEQ ID NO1)為探針篩選鹽藻cDNA文庫(kù)，得到1個(gè)特異陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定結(jié)果表明，cDNA全長(zhǎng)是2649bp(SEQID NO12)，含有綠藻基因特異的加尾信號(hào)TGTAA(Andrens HW等，Primarystructure of the plasma membrane H-ATPase from the halotolerant algaDunaliella bioculata.1995，Plant Mol Biol，28657-666)及poly(A)結(jié)構(gòu)，命名為DvSPT1。Vector NTI8.0軟件的分析結(jié)果顯示，最長(zhǎng)讀碼框編碼了一個(gè)含672個(gè)氨基酸的蛋白(圖3)(SEQ ID NO13)，蛋白分子量大小為73.3kDa，蛋白分子量大小為73.4kDa，等電點(diǎn)為5.29的酸性蛋白，命名為DvSPT1。
表1 SSH陽(yáng)性克隆及可能編碼蛋白

序列分析顯示，CP1A60處在全長(zhǎng)cDNA的3’端非翻譯區(qū)的2064-2304bp處，可見，所獲得的SSH cDNA片段并不在基因編碼區(qū)而在多變的非編碼區(qū)。
利用BLASTP程序?qū)vSPT1預(yù)測(cè)得到的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與其它物種來(lái)源的無(wú)機(jī)磷通道中的鈉/磷共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白同源性較高(圖2)，如周氏扁藻的TcPHO，衣藻的B2型磷通道蛋白(BAB96548)，酵母的高親合性鈉依賴型磷通道蛋白PHO89(NP-009855)，鏈孢霉的高親合性鈉依賴型磷通道蛋白PHO4，白血病病毒受體高親合性鈉依賴型磷通道蛋白Na-Pi III(AAA52572)等。其中，DvSPT1編碼的蛋白同周氏扁藻TcPHO同源性最高，同源性可以達(dá)到31.2％，其次是衣藻的B2型磷通道蛋白，同源區(qū)段主要集中在N端和C端的跨膜區(qū)域(圖2)。進(jìn)一步對(duì)所編碼的蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)(http//www.ch.embnet.org/)顯示，DvSPT1蛋白為包含11個(gè)跨膜區(qū)的膜蛋白(圖1，圖2)，與以往描述的其它物種來(lái)源的無(wú)機(jī)磷通道蛋白有10-12個(gè)跨膜區(qū)的特征十分相似。但需要指出的是，DvSPT1的11個(gè)跨膜區(qū)呈不對(duì)稱分布，7個(gè)跨膜區(qū)分布在N-端，4個(gè)跨膜區(qū)分布在C-端，這與其它物種中發(fā)現(xiàn)的跨膜區(qū)通常呈對(duì)稱分布不同。
此外，DvSPT1這個(gè)蛋白中含有二段7個(gè)氨基酸殘基的保守重復(fù)序列-GANDVAN-(圖1，圖2)，與所有已報(bào)道的磷轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白中幾乎包含兩段-GANDVAN-保守序列的特征非常一致。DvSPT1的兩段-GANDVAN-保守序列處在N端的第一和第二跨膜區(qū)之間(57-63Aa)和C端的第八跨膜區(qū)(405-411Aa)處。
(b)鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道基因全長(zhǎng)基因組序列的克隆及序列分析用CP1A60(SEQ ID NO1)為探針，從鹽藻的基因組文庫(kù)(Yang Zhiyong等，Construction of a genomic DNA library of Dunaliella viridis.ActaPhytophysiologica sinica 26(2000)75-78)經(jīng)過(guò)兩輪篩選得到1個(gè)特異的噬菌體克隆(λGDvSPT1-1)。提取噬菌體DNA，SacI酶切電泳，利用DvSPT1全長(zhǎng)cDNA為探針進(jìn)行Southern分析，雜交后只有一個(gè)單一的雜交帶(～8kb)，說(shuō)明這個(gè)雜交片段已完全覆蓋了DvSPT1的cDNA全長(zhǎng)序列。
將與DvSPT1全長(zhǎng)cDNA雜交的λGDvSPT1-1#單一片段亞克隆并進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果顯示，得到的基因序列全長(zhǎng)為7925bp，包括位于第一翻譯起始密碼子上游的1321bp的5’啟動(dòng)子序列(圖3)，同時(shí)也包括終止密碼子下游的1921bp的3’端終止序列。將DvSPT1cDNA序列與得到的基因全長(zhǎng)序列通過(guò)GCG網(wǎng)站的BESTFIT程序進(jìn)行分析，這個(gè)片段確實(shí)完全覆蓋了DvSPT1的編碼區(qū)域，因此將這個(gè)基因命名為GDvSPT1(SEQ ID NO14)。該基因包括20個(gè)外顯子(平均大小132bp)和19個(gè)內(nèi)含子(平均大小185bp)，所有內(nèi)含子的5’端都是GT，3’端都是AG(表2)(Shapiro，M.B.等，RNA splice junctionsdifferent classes of eukaryotes sequence statistics and functionalimplications in gene expression.Nucleic Acids Res.15(1987)7155-7174)。
網(wǎng)上(http//genes.mit.edu/McPromoter.html)預(yù)測(cè)(圖3A)顯示，GDvSPT1基因啟動(dòng)子核心區(qū)域包括了一段50個(gè)堿基的序列，這段序列的起始點(diǎn)在-40bp處，在+10bp處終止，其中包括了可能的TATA box序列(TATAA)和轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn) 如果將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 定義為該基因序列的“+1”，其編碼區(qū)的第一個(gè)可能的起始密碼子ATG就位于在+462～+464bp處。值得注意的是，一個(gè)受Pho4p結(jié)合的核心序列(CACGT)(Uthappa T.Mukatira等，Negative regulation of phosphate Starvation-induced genes.PlantPhysiology.127(2001)1854-1862)位于-711～-715bp的位置，而Pho4p在酵母中研究的比較清楚，這提示從鹽藻克隆的這個(gè)基因很可能也是受PHO調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。而且，CACGT這個(gè)順式元件也是植物界一個(gè)與逆境相關(guān)的極其保守的調(diào)控元件(Heinemeyer T.等，Databases on transcriptionalregulationTRANSFAC，TRRD，and COMPEL.Nucleic Acids Res.26(1998)364-367)，表明所分離的這個(gè)基因跟適應(yīng)外界逆境具有極為密切的關(guān)系。
實(shí)施例3鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道基因在高鹽脅迫和無(wú)機(jī)磷饑餓條件下的誘導(dǎo)表達(dá)(a)鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道基因在高鹽脅迫條件下的誘導(dǎo)表達(dá)為了研究DvSPT1這個(gè)基因在鹽藻細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平及與鹽濃度之間的相關(guān)性，首先將鹽藻細(xì)胞在含1.0M NaCl的DM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在2×106cell/ml的時(shí)候收集細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)移至含有2.0M NaCl的新鮮DM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在含有2.0M NaCl的新鮮DM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)0分鐘、30分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、9小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)，然后提取鹽藻細(xì)胞總RNA，采用α-32P-dCTP標(biāo)記的DvSPT1(2121bp-2633bp)的3‘端特異片段(PCR擴(kuò)增引物DvT1RTS5’-ccctgttccactcactgc-3’(SEQ ID NO16)，DvT1RTA5’-gaacaggggtggtgcttaca-3’(SEQ ID NO17)，)為探針進(jìn)行Northern分析(圖4A)。結(jié)果表明，鹽藻細(xì)胞經(jīng)歷1.0M NaCl→2.0M NaCl高滲振蕩后，DvSPT1基因受到誘導(dǎo)而表達(dá)增強(qiáng)。從雜交信號(hào)可以看出，這兩個(gè)基因的表達(dá)模式基本一致，在高滲振蕩1小時(shí)后2小時(shí)之前就開始受到誘導(dǎo)，而且到3小時(shí)快速積累到最高的轉(zhuǎn)錄水平。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)錄水平又逐漸降低，到24小時(shí)基本降低到正常培養(yǎng)條件下的表達(dá)水平。
(b)鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道基因在無(wú)機(jī)磷饑餓條件下的誘導(dǎo)表達(dá)為了進(jìn)一步研究DvSPT1這個(gè)基因的表達(dá)水平是否受到無(wú)機(jī)磷饑餓的誘導(dǎo)，將生長(zhǎng)在含有2.0M NaCl的DM培養(yǎng)基(0.2mM KH2PO4)中的鹽藻細(xì)胞，在其生長(zhǎng)達(dá)到2×106cell/ml的時(shí)候收集，然后用新鮮的無(wú)磷培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，再重懸于無(wú)磷的等滲培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別取繼續(xù)培養(yǎng)0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、18小時(shí)和36小時(shí)的鹽藻細(xì)胞提取總RNA，同上述相關(guān)實(shí)驗(yàn)一樣，用α-32P-dCTP標(biāo)記的DvSPT1的3‘端特異片段為探針進(jìn)行Northern分析(圖4B)。結(jié)果顯示，DvSPT1的轉(zhuǎn)錄水平在無(wú)機(jī)磷饑餓處理1小時(shí)的時(shí)候開始受到明顯的誘導(dǎo)，在6小時(shí)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高，到18小時(shí)往后表達(dá)水平逐漸回落到一較為恒定的表達(dá)水平。Meira Weiss等(Meira Weiss，Gal Haimovich，Uri Pick，Phosphate and sulfate uptake in thehalotolerant alga Dunaliella are driven by Na+-symport mechanis m.J.Plant Physiology 158(2001)1519-1525)誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示鹽藻在無(wú)機(jī)磷饑餓3～6小時(shí)才可以檢測(cè)到無(wú)機(jī)磷的誘導(dǎo)吸收，這種誘導(dǎo)吸收主要是依賴于吸收速率的增加而不是Km值的變化，因此他們推測(cè)無(wú)機(jī)磷的誘導(dǎo)吸收是由于管家基因的誘導(dǎo)合成起作用而不是新的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的誘導(dǎo)產(chǎn)生。研究結(jié)果顯示DvSPT1在無(wú)機(jī)磷饑餓誘導(dǎo)6小時(shí)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高，這與Meria W.等所得到的動(dòng)力學(xué)結(jié)果正好相符合，可以推斷，無(wú)機(jī)磷的誘導(dǎo)吸收是發(fā)生在無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)通道誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄完成之后或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累到一定的量的時(shí)候才開始的，這時(shí)候重新合成的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過(guò)翻譯和后加工產(chǎn)生了足夠的無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)增加細(xì)胞對(duì)環(huán)境中有限的無(wú)機(jī)磷的吸收來(lái)滿足正常的生長(zhǎng)需要。
表2鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道基因(GDvSPT1)內(nèi)含子和外顯子組成

序列表<110>上海大學(xué)<120>受高鹽脅迫誘導(dǎo)的鹽藻基因片段和一個(gè)鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)通道基因的分離及鑒定<160>17<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>241<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>1gtacgagaac gtgtctgagc agaccatgcc ttaattctga agtcttgaca atcttttccc 60tgttccactc actgcactct tgctcttcag ttaccaattc atcctttttg aagtcttgct120tttgttctga gattgaacac taagcatgac ccgttctgtt gtgttcacat agccatatca180tttagtcagg tgttgtggct ggttcatatc ctgaccaaat ttagatctat tgctggtatt240g241<210>2<211>349<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>misc_feature<222>(174)..(175)<223>n is a，c，g，or t<220>
<221>misc_feature<222>(213)..(213)<223>n is a，c，g，or t<220>
<221>misc_feature
<222>(227)..(227)<223>n is a，c，g，or t<400>2cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 60ccattccaca ccacatacga gccggaagca taaagtgtaa aagctggggt gcctaatgag120tgagcttact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc ttccagtcgg ggannctgtc180gtgccagctg cattaatgat ccgccaacgc gcngggagag gccgttngcc tattgggcgc240tcttccggct tcctcgctca ctgactcgct gcggctcggt cgtttcggct gcggcgagcg300gtatcagctc actcaaaggc ggtattacgg gttattccac gaaatcagg349<210>3<211>257<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>3acaaacagga tgcattattc tcagatgcaa gtcacagatg cgagtcacaa aataccacca 60ggaaacaaga cgagctgcac atcaaacggg cagcaaagaa tagtattgag ttcagtgcac120agcacacatc cccaagccaa tggaaggtgt gtatgatctc aagccacagt tcggaaatcc180aaggggagtc cgcatgtgca tacagcattt atgaattgag tgaagcatac caatgaaatt240ccaattcagt tgtatgt 257<210>4<211>375<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>4acaggattgg gctagcttgg tcaggagcgt aactctgttt tgtgctgaga gttctgcttt 60aggcagcagg cacgcttgca tgagcagccc agttggatcc atttccaagc atgactcggt120tagcgcagtg ccaggcctaa taacagcact gttgctttcc aggtgcgcgg ttagagaaga180
gatgcacaca ttttgatgcc tgaataaact tgggaggcca tatctaggtc tgtgattttg240aacgggaagg gcagcttgct ctagaatttg aggtgtgata accttattat tttgctcggg300acccgtcttg gcagctctct cccgctggat tgtcatgcat agaaacatgt gtgttcatcg360gcgtgctttt aaagt 375<210>5<211>238<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>5accacataac accaaggtcg taaatatcta caaggatcca ctttcaggat ccccgccttg 60agtgcctgtc tctctcccga cagcttctac tactggcact actctctgcc tacccagcaa120tgccagctca gacacagagc tctaggtccc agctacaact acacctgcaa actacctagg180aaataatcta atctagacct cggccgcgac cacgctaatc tctagaggat ccccgggt 238<210>6<211>496<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>6acattcgcat gcgtcctttg tgtgcaccac caactctcca tccagtccct gctcatccct 60gtccttgtgt gtatgtgtgt gaggtgtttg aaactgtggc atctgtgcgt gtatgatgct120catgcgcagc gtggaaatgc acagatgtgt tcgcgtgtgc atgcctcagt gtgtgtgctt180gtaggccagg gaccccctgt agttgcctgg cacaaaaatg caatccctgc atctgccaat240gttgcagacg taggcaggga aggctgagaa gaacactctt aataggcctt tcccatgttt300cgcgcatgtc caagcattcc aagatgatcc tgcttgctct gttttcattt catggagacc360tcgacctagc ttgtttctct ctctgctaca ttgcacggat gagtgtgtgt gtgtgtgtgt420gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgttgtc ttcccgctca tatataagtg480
caattatatg taaaaa496<210>7<211>287<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>7acatgctgag gcagatcaac agcctgttca agttcacctt cttccccaga aacttctccg 60agttcgcggg cgcttctaac cagaccgttc cctagattag attatttcct aggtagtttg120caggtgtagt tgtagctggg acctagagct ctgtgtctga gctggcattg ctgggtaggc180agagagtagt gccagtagta gaagctgtcg ggagagagac aggcactcaa ggcggggatc240ctgaaagtgg atccttgtag atatttacga ccttggtgtt atgtggt 287<210>8<211>290<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>8acccaggcga ggccttcgac ccccctgggc ctggctgatg accctgacac cttcgctgag 60ctgaaggtca aggagatcaa gaacggccgt ctggctatgt tetcttgcct aggcttcttc120gtccaggcca ttgtgaccgg caagggcccc attgagaacc tgatggacca cctggccaac180cccgctgaga acaacgcctt cgccttcgcc accaagttca cccccaacgc ataaatgccg240gactctccct cccgatagta gttttcaatg taatgtaggt ctccagctgt 290<210>9<211>517<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>misc_feature<222>(491)..(491)
<223>n is a，c，g，or t<220>
<221>misc_feature<222>(510)..(510)<223>n is a，c，g，or t<400>9aactgcatgc ctgcatgtcg acgattagcg tggtcgcggc cgaggtaagg tgtttgagcc 60gcttgttgtg cttggaggca tcggccttgg cctcgctgcc tatgccctca agctcaagta120aggggtatgc tcgattcatg gctgtgttga acctctgaga gtttgcacct gagagtgact180tcaagcccaa ttggctggtt tgatttgagt gtagaaatgg tgatcacgtg atccatccag240ctttttccct tttcctttct tgtgctttgg acttaagttg cttcgagaaa ctttggcctt300tttatggcga gcttattcat tgtgcgctct gtgagcagct gaccacttca gtgaagctgg360acgcctgtgc tttattacgt tcatctactt gttggactgc taggtgtttt cagcacgtta420tgctgttaat tgattttggg attttatatg aacaggctga gaagtctgga tctgcatgcg480tgcacttgag nggactgagt taatgtgaan ggttgtt 517<210>10<211>242<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>10actaagcgca ccaccacgtg ctcctgttag cttggcccca tcagtcccca gcctctacta 60gatgacgtat gtgacacctg aagtgtgtgg gtttgtggtg tggccctgca cttgctgttg120cccaacgcgg cacaggcagt gagggtatgt aggtttactt cttgactgca gcagcagtgt180tctgcagttc gtgaagtggt gaggcagtgg atgtgtgttg caaacgcacc atcgctgcgt240gt 242<210>11<211>321
<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>11acaagctctc tcgttggcca ctcgataaca ccaacccagt gcagaaacaa taataaaatt 60ggcaatggaa atgctgtgca ttagagcaca tggagtggcc tttattcatc acagggctct120ggaaacaagc ttgctcacat cttactgttc aggatgcacc ttgttagcct ccttagtggc180ttccacgtcc gactttccac tgtcgctttc acctgctaga agcttctcat acgcagcctt240gccacgcatt gacctactct ccatggcaaa ccgcagaacc tgcccgggcg gccgctcgaa300atctctagag gatccccggg t 321<210>12<211>2649<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>CDS<222>(79)..(2097)<400>12cttgtacatc ggtgcacgca ccgagcccct ccccaccgcc acttcgtctg cgaaagcagg 60aggggtaggc acgcagcc atg acg gac gtg gac agc ttc agc ggc aac atg 111Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met1 5 10ccc aac ctc tcg ggc ttt gag tcc gca gcg ggc tgg caa ggc gag aac 159Pro Asn Leu Ser Gly Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gln Gly Glu Asn15 20 25ttc acc tac cac gat ggc aag tgg tct gcc tac gtg tgg ctg ctg gtc 207Phe Thr Tyr His Asp Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val30 35 40atc ggc tcc ttc acc tca ttc atg gct gca tgg ggc atc ggt gcc aac 255Ile Gly Ser Phe Thr Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly Ile Gly Ala Asn45 50 55
gat gtg gcc aac tcc ttc gcc aca agt gtg ggc tcc aag gct ttg acc303Asp Val Ala Asn Ser Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr60 65 70 75atg ttc caa gcc tgc gtg att gcg ggc atc ttt gaa ttt gtc ggc gct351Met Phe Gln Ala Cys Val Ile Ala Gly Ile Phe Glu Phe Val Gly Ala80 85 90gtg tcc ctg ggt ggt act gtt gtg aag acc gtg aag ggc tcc atc act399Val Ser Leu Gly Gly Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser Ile Thr95 100 105gac ccc tca atg ttc aag cac cag ccc cag att ttt gcg tac ggc atg447Asp Pro Ser Met Phe Lys His Gln Pro Gln Ile Phe Ala Tyr Gly Met110 115 120ctt ggt gcc tct act tct gta gcc att gtg ctc ttc ctg gcc aca tac495Leu Gly Ala Ser Thr Ser Val Ala Ile Val Leu Phe Leu Ala Thr Tyr125 130 135ttg aag cag gct gtg tcc acc aca cac act gca att ggg tct gtg ctt543Leu Lys Gln Ala Val Ser Thr Thr His Thr Ala Ile Gly Ser Val Leu140 145 150 155ggc ttc ggc ttg gtg tat gga ggc gct gat ggt gtg acc tgg aac gag591Gly Phe Gly Leu Val Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Val Thr Trp Asn Glu160 165 170gtg tcc gat gag ttc ccc ttc cgc aag ggg ttc aca cct gtc gtc atc639Val Ser Asp Glu Phe Pro Phe Arg Lys Gly Phe Thr Pro Val Val Ile175 180 185tcc tgg ttc gtc tcc ccc gtc ttc act gcc att ctg tcc tcc gga ttc687Ser Trp Phe Val Ser Pro Val Phe Thr Ala Ile Leu Ser Ser Gly Phe190 195 200ttc atc atc acc agg att gtc tgc ctg cag cgc cag caa tcc tac aag735Phe Ile Ile Thr Arg Ile Val Cys Leu Gln Arg Gln Gln Ser Tyr Lys205 210 215att gcc ttc ttc atg atc cct gtg ctg atg atg atc acc atc ttc att783Ile Ala Phe Phe Met Ile Pro Val Leu Met Met Ile Thr Ile Phe Ile220 225 230 235gtc ctg ctg gcc atc ttc ctg aag agt gtg gac tct gga cac gac cgt831Val Leu Leu Ala Ile Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg
240 245 250gag ggt gag ctg aac tgg tcc aca gac aag aag gcc tgg gtg gca att879Glu Gly Glu Leu Asn Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala Ile255 260 265gtt gtc ggt gct ggt gcc ggt ctg ctg acc atc ccc tac acc atc tgg927Val Val Gly Ala Gly Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro Tyr Thr Ile Trp270 275 280ctg agg aag tcc atg ctc cag gag gac cag gaa gtg cac gag gag aat975Leu Arg Lys Ser Met Leu Gln Glu Asp Gln Glu Val His Glu Glu Asn285 290 295atg gct cgt gat gct gag acc gcc cac gtc gca gct ggt ggc aca ctg 1023Met Ala Arg Asp Ala Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu300 305 310 315aag gag aag aac cct gag gat gat gtg cat gag ctg acc aag gct gag 1071Lys Glu Lys Asn Pro Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala Glu320 325 330aag ttt atg gag tgg ttc aac ggc acc tgg ttc ggc cag aga cag ttt 1119Lys Phe Met Glu Trp Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gln Arg Gln Phe335 340 345gtg aag aac ttt gtt gca gct atg aca tac gat gtg cac gcc cat gtg 1167Val Lys Asn Phe Val Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His Ala His Val350 355 360gcc acc atg gac aac ccc aag gtt gcc cag atg cat gca gat gct gag 1215Ala Thr Met Asp Asn Pro Lys Val Ala Gln Met His Ala Asp Ala Glu365 370 375gtc ttc gac ccc cgc act gag gat gtg ttt aag cgc atg cag atc atc 1263Val Phe Asp Pro Arg Thr Glu Asp Val Phe Lys Arg Met Gln Ile Ile380 385 390 395act gcc tct gct gtg gcc ttc gtg cac ggt gcc aat gat gtc gcc aac 1311Thr Ala Ser Ala Val Ala Phe Val His Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn400 405 410ggt gtg ggc cct ctt gcc ggt atc tgg gac acc tac aac acc tac cag 1359Gly Val Gly Pro Leu Ala Gly Ile Trp Asp Thr Tyr Asn Thr Tyr Gln415 420 425
tct ggc agt ggc aag gcg tct cag ccc cgc tgg att ctg gtc atc ggt1407Ser Gly Ser Gly Lys Ala Ser Gln Pro Arg Trp Ile Leu Val Ile Gly430 435 440gct gct ggc att gtg ttc ggc ctg gcc atg tac ggc tac cgt atc att1455Ala Ala Gly Ile Val Phe Gly Leu Ala Met Tyr Gly Tyr Arg Ile Ile445 450 455gcg acc ctg ggt gtg gac ttg gtg gtc atg acc ccc aac cgt ggt tac1503Ala Thr Leu Gly Val Asp Leu Val Val Met Thr Pro Asn Arg Gly Tyr460 465 470 475tct gtg gag ctg gca gca gct gct atc att gcc ctg gcc tcc acg tac1551Ser Val Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ile Ala Leu Ala Ser Thr Tyr480 485 490ggt ctg ccc gtc tcc act acg caa gtt gtg act ggc ggt aag ata ggg1599Gly Leu Pro Val Ser Thr Thr Gln Val Val Thr Gly Gly Lys Ile Gly495 500 505gtg ggc atg tgc gag agc tgg aag atg aca ggc gtg aac tgg ctc ctg1647Val Gly Met Cys Glu Ser Trp Lys Met Thr Gly Val Asn Trp Leu Leu510 515 520ttt atc cgc acc ttc tgg ggc tgg gtt ggt gct ctg gtg act ggc gcc1695Phe Ile Arg Thr Phe Trp Gly Trp Val Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala525 530 535atc ctc tca gct ctg ctc ttc tcc atc ggt gtg tac ggc ccc agc cgc1743Ile Leu Ser Ala Leu Leu Phe Ser Ile Gly Val Tyr Gly Pro Ser Arg540 545 550 555act gac ctg gac tac gtg acc cac tac cag agg gcg atg aag atc gac1791Thr Asp Leu Asp Tyr Val Thr His Tyr Gln Arg Ala Met Lys Ile Asp560 565 570atc gac cag tcc atg caa gct ctc ctt gac cg atgt gct gct gct cct1839Ile Asp Gln Ser Met Gln Ala Leu Leu Asp Arg Cys Ala Ala Ala Pro575 580 585gca cct acc aat ggt ggt gga ggc tgt ggc acc gga gac ttg aac tgc1887Ala Pro Thr Asn Gly Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Asp Leu Asn Cys590 595 600tct tgc cag cag agg atc ccc tac acc atg ggt gac ctg caa ggc ctg1935Ser Cys Gln Gln Arg Ile Pro Tyr Thr Met Gly Asp Leu Gln Gly Leu
605 610 615aag acg cag gtt gat ggg ctg ttc aac ttc gag gaa aat ggc cag atc1983Lys Thr Gln Val Asp Gly Leu Phe Asn Phe Glu Glu Asn Gly Gln Ile620 625 630 635aac gag tac aac atg atg tac atg ctg agg cag atc aac agc ctg ttc2031Asn Glu Tyr Asn Met Met Tyr Met Leu Arg Gln Ile Asn Ser Leu Phe640 645 650aag tac acc ttc ttc gat ggc gac ttc tct cag tac gag aac gtg tct2079Lys Tyr Thr Phe Phe Asp Gly Asp Phe Ser Gln Tyr Glu Asn Val Ser655 660 665gag cag acc atg cct taa ttctgaagtc ttgacaatct tttccctgtt 2127Glu Gln Thr Met Pro670ccactcactg cactcttgct cttcagttac caattcatcc tttttgaagt cttgcttttg 2187ttctgagatt gaacactaag catgacccgt tctgttgtgt tcacatagcc atatcattta 2247gtcaggtgtt gtggctggtt catatcctga ccaaatttag atctattgct ggtattgtgt 2307actggtggaa gcttgggttc ccagcatggt cgtctccctc aagtacgcag gctgtattgc 2367attacctctt gttgaccgaa gacagtatct cttctaccaa tgcttgttgc ctgaacctca 2427agcgtgactg tttcgttgct tcactcttgt gtgttggctc atatttcatt ttcaccttct 2487tcagcccact gaactgattg aataatgcaa ctgcaagaat aaacacacgt ctatgtatct 2547gcactgtttg tgcaattgat ccttcttgtt gatcattttg gaatcctccg ctgattgtgt 2607aaattttgta agcaccaccc ctgttcaaaa aaaaaaaaaa aa 2649<210>13<211>672<212>PRT<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>13Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met Pro Asn Leu Ser Gly1 5 10 15
Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gln Gly Glu Asn Phe Thr Tyr His Asp20 25 30Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val Ile Gly Ser Phe Thr35 40 45Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly Ile Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn Ser50 55 60Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr Met Phe Gln Ala Cys65 70 75 80Val Ile Ala Gly Ile Phe Glu Phe Val Gly Ala Val Ser Leu Gly Gly85 90 95Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser Ile Thr Asp Pro Ser Met Phe100 105 110Lys His Gln Pro Gln Ile Phe Ala Tyr Gly Met Leu Gly Ala Ser Thr115 120 125Ser Val Ala Ile Val Leu Phe Leu Ala Thr Tyr Leu Lys Gln Ala Val130 135 140Ser Thr Thr His Thr Ala Ile Gly Ser Val Leu Gly Phe Gly Leu Val145 150 155 160Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Val Thr Trp Asn Glu Val Ser Asp Glu Phe165 170 175Pro Phe Arg Lys Gly Phe Thr Pro Val Val Ile Ser Trp Phe Val Ser180 185 190
Pro Val Phe Thr Ala Ile Leu Ser Ser Gly Phe Phe Ile Ile Thr Arg195 200 205Ile Val Cys Leu Gln Arg Gln Gln Ser Tyr Lys Ile Ala Phe Phe Met210 215 220Ile Pro Val Leu Met Met Ile Thr Ile Phe Ile Val Leu Leu Ala Ile225 230 235 240Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg Glu Gly Glu Leu Asn245 250 255Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala Ile Val Val Gly Ala Gly260 265 270Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro Tyr Thr Ile Trp Leu Arg Lys Ser Met275 280 285Leu Gln Glu Asp Gln Glu Val His Glu Glu Asn Met Ala Arg Asp Ala290 295 300Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu Lys Glu Lys Asn Pro305 310 315 320Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala Glu Lys Phe Met Glu Trp325 330 335Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gln Arg Gln Phe Val Lys Asn Phe Val340 345 350Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His Ala His Val Ala Thr Met Asp Asn355 360 365Pro Lys Val Ala Gln Met His Ala Asp Ala Glu Val Phe Asp Pro Arg370 375 380
Thr Glu Asp Val Phe Lys Arg Met Gln Ile Ile Thr Ala Ser Ala Val385 390 395 400Ala Phe Val His Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn Gly Val Gly Pro Leu405 410 415Ala Gly Ile Trp Asp Thr Tyr Asn Thr Tyr Gln Ser Gly Ser Gly Lys420 425 430Ala Ser Gln Pro Arg Trp Ile Leu Val Ile Gly Ala Ala Gly Ile Val435 440 445Phe Gly Leu Ala Met Tyr Gly Tyr Arg Ile Ile Ala Thr Leu Gly Val450 455 460Asp Leu Val Val Met Thr Pro Asn Arg Gly Tyr Ser Val Glu Leu Ala465 470 475 480Ala Ala Ala Ile Ile Ala Leu Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Pro Val Ser485 490 495Thr Thr Gln Val Val Thr Gly Gly Lys Ile Gly Val Gly Met Cys Glu500 505 510Ser Trp Lys Met Thr Gly Val Asn Trp Leu Leu Phe Ile Arg Thr Phe515 520 525Trp Gly Trp Val Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala Ile Leu Ser Ala Leu530 535 540Leu Phe Ser Ile Gly Val Tyr Gly Pro Ser Arg Thr Asp Leu Asp Tyr545 550 555 560
Val Thr His Tyr Gln Arg Ala Met Lys Ile Asp Ile Asp Gln Ser Met565 570 575Gln Ala Leu Leu Asp Arg Cys Ala Ala Ala Pro Ala Pro Thr Asn Gly580 585 590Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Asp Leu Asn Cys Ser Cys Gln Gln Arg595 600 605Ile Pro Tyr Thr Met Gly Asp Leu Gln Gly Leu Lys Thr Gln Val Asp610 615 620Gly Leu Phe Asn Phe Glu Glu Asn Gly Gln Ile Asn Glu Tyr Asn Met625 630 635 640Met Tyr Met Leu Arg Gln Ile Asn Ser Leu Phe Lys Tyr Thr Phe Phe645 650 655Asp Gly Asp Phe Ser Gln Tyr Glu Asn Val Ser Glu Gln Thr Met Pro660 665 670<210>14<211>7924<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>14tcacttagaa agtgaaaaaa actgaatgct aagatggagc aagtaattac ttgtttatga 60acaaaacaaa caaggagaag cagagggaag tcctctggcc tcacgcatta catcagggca120gctaaatgct cacacacaca cacgtgcgtt aatgcatacg cgcgtgcaca cacaagcgcg180cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacggt ggtggggctc acactagtca240caatgctggt gttgggtctt tccttaatgc ctgctggtta aatccagcgt agacttttac300ttttttacac acgcatacac gcacgcacgc acgcacgcac gcacgcacgc acgcacgcac360
gcacgcacgc acgcgcacac gcacacgcac acacgcacac acacacacac acacacacac420acacacacac acacacacac agaacttgca atgcacaaaa acagcgaaaa aggaatcctt480gaattccaca actttcttgc aagtctgaag gagacagaag agtcatgggg aggacgtgca540ctcgcgttct gggcatgaaa ggcaagaacc cagcacgcat acgctaattc acagcgagca600ccacacccaa ccagaggcga gtggacactc gccctgagcc cacgactgca cctgggcagg660caagcccctt aggatgcaca ttttgccttg acatgcgctg ccattccaag cgcacacaag720caggagcaat ccttgctgtc cacacgcctg cactgccctc acctctcgtg tgcgcgcaca780tcatgtgtgc gcatgcatgc gtgagacgat tgcaagccta ttggcgatta taagtgcagg840gccctgccgg cattgcacga gcgcatgcct tgcaggtgca ccgcgctttg tcccctccat900ctcctggatg tgtgtacaat acctcttgtg ataatactaa ttcaattctc ccaaggaggc960atgggagctg tgaattttct ggcagtgccc cggcacccat gagacgcgtt actcacctga 1020aatatctgcg ctgcatccac atccgatgat acagcaatag cgcgagagcg tctacacact 1080cttcccccaa agaccaagca gcagagccgc ctctctgggc gtgagttcac actgtggtgg 1140tgtgaagcgg ccgtgttcac agtggcatca tcgagagaag atgccctgcc cgaggaaaag 1200tgacccgccg cacccacctg cgccaccaaa caatcatctc ttgtacatcg gtgcacgcac 1260cgagcccctc cccaccgcca cttcgtctgc gaaagcagga ggggtaggca cgcagccatg 1320acggacgtgg acagcttcag cggcaacatg cccaacctct cgggctttga gtccgcagcg 1380ggctggcaag gtgagcgcgg gtgcctgccc cacgcccttg aaaagctggg agctgggcgt 1440gcccagcgag ccgaggaggg agagggccag tggcctattt cgcgtgcgag cgtggccaga 1500aagctgcatc tacacaggag ggggcattcc tgcaccctct tttccatccc actgcggcac 1560tgcactcact ccgccacaca cacccaccca cccacacaca cacacgcaca ggcgagaact 1620tcacctacca cgatggcaag gtgagcgacg ggctgggtgg gtgggccgct gtgcggtagg 1680ggtccctcat gtcatggtcc ctctaagagg atgccgatgc cggatttctg tcgggaggag 1740
ataggcctga gagcattgta gctctccttt gtactgagac ctccattcct gtgctttgcg1800ttgtgtctgc cctgctgctc atcagtgtgt tcagcgcatg gacacgcgag catggtgccc1860agcatctgcc ctgccatccc ctcgctctcg tcctgcagtg gtctgcctac gtgtggctgc1920tggtcatcgg ctccttcacc tcattcatgg ctgcatgggg catcggtgcc aacgatgtgg1980ccaactcctt cgccacaagt gagcactcgg tcaatgtgca tgcctgcatg agcttatgct2040gcacttgtgt gcacgtgtgt gcctatgttt agggatgctg gctgttgagc agtacattgc2100atgtctgaat agatgtgatg atgtgaataa acagctttag atgatgtgaa taaacagctt2160tagactgttg ggcatacccc aacaaccgca tcgtgtcagt gcctctactc tctgtgctct2220cctctccact gcaggtgtgg gctccaaggc tttgaccatg ttccaagcct gcgtggtggg2280tgccccgtgc ttgtgtgggg tttggtgctc ttaggttctt gaaaacccct gcttgccagt2340gccccccttt ttccaaaatg tgtttgagag ttaacgttac catattctcc agtcagactg2400ttaattcctc tggttgagca tcactctgta caactgagca tcagtgctga gccttttctg2460agagcaattc cagtgctcgt tcgatgctgg gcctccaccc agactgacat ctccctttgt2520gtttgacact cgtgcatcac agattgcggg catctttgaa tttgtcggcg ctgtgtccct2580gggtggtact gttgtgaaga ccgtgaaggg ctccatcact gacccctcaa tgttcaagca2640ccagccccag gtatttcttt ctttcgggtg tacctgtgcg agcatgcaca tgtgtgcgca2700ggttatgtgc cccccttttc acaagaaatt ttgtgaatcc tgtttccagc cgagtgttag2760tttctgtccc tttctcccgt ttcatggtgc taaaaccaaa ccaatcatcg ctctcaacct2820gcagattttt gcgtacggca tgcttggtgc ctctacttct gtagccattg tgctcttcct2880ggccacatac ttgaagcagg ctgtgtccac cacacacact gcaagtgagt agcagcagtg2940attgcttgag cctcgtgcta cttgcttgca atctgcttga cgttggaggt taagaaggca3000ctttctggcg taaggatgct ctggatcgtt gtgactgaaa cagcaagcac ttactattat3060taaccagcac tgcacttgcc ttttccgcag ttgggtctgt gcttggcttc ggcttggtgt3120
atggaggcgc tgatggtgtg acctggaacg aggtgtccga tgaggtgaga ccattgcatt3180gctaggagtc atacatagcg ccttactgca agctgctgtg taacaagaac tggtatcctt3240ttagtttttc cgctaattct ctttccaaga gagggaaaac taattgttgc tcctatcatg3300catcaccacc cgtcttcgtt ccctgcagtt ccccttccgc aaggggttca cacctgtcgt3360catctcctgg ttcgtctccc ccgtcttcac tgccattctg tcctccggat tcttcatcat3420caccaggtgt gtgccccaaa ggctgggtgt ccttgattaa ttaaggtgtg tttgctcgtt3480gacatcatct ttctgttgca agttgtagct cacatgccaa gctgcgcaga acaaggtgga3540aggaaggaga aagcacttcc ctctctgaat ccctgtcctc ctgcaggatt gtctgcctgc3600agcgccagca atcctacaag attgccttct tcatgatccc tgtgctgatg atgatcacca3660tcttcattgt cctgctggcc atcttcctga aggtgagcag aattgtctga tctctcttct3720cttgtacgct tgtttctggc ttgtcaagct cgcatgcatt cttgcacatg catacagaca3780tgcatgcaca cacatgcacc aacacgtgca gagtgtggac tctggacacg accgtgaggg3840tgagctgaac tggtccacag acaagaaggc ctgggtggca attgttgtcg gtgctggtgc3900cggtctgctg accatcccct acaccatctg gctgaggaag tccatgctcc agtgagtctc3960tgtttgatcc tgtcatgagt aggctccatt cagtgcagta agttcagcag tgcactgagt4020cttgctcatc ctcatcaaca cacaagtttc ctgtgtttag agacaaaaac caacagcctt4080actggtgctc aacttactcc atgtctcgac acaatcgatc tcaccacaaa ttttcgctgg4140cctacaggga ggaccaggaa gtgcacgagg agaatatggc tcgtgatgct gagaccgccc4200acgtcgcagc tggtggcaca ctgaaggaga agaaccctga ggatgatgtg catgagctga4260ccaaggctga gaagtttatg gagtggttca acggcacctg gttcggccag agacagtttg4320tgaagagtga gtgatgctct gcgatgcttt caatgctctg catgttggat gtgtgtatgt4380tctcacctct tgaggaagac ttcagcatct gtgcattcca aatgcttgat tttggatgcc4440tggctgagat gccctgtact gtacgggaag taagagtctg cagtgtgctc ctgggagttg4500
gaatcctaag gaaatgccag cctgtactaa ccgacctctt ctgcttgcgc ctgcagactt4560tgttgcagct atgacatacg atgtgcacgc ccatgtggcc accatggaca accccaaggt4620tgcccagatg catgcagatg ctgaggtctt cgacccccgc actgaggtgg gtttcgagct4680gctcgctgca gccaagcatg cagaagactg catattccaa tggagtcaag atgatgatat4740gcggagagat ttcatgccgc ccccccccta cccccatgca aactcactgt gaaccatcac4800tgtcctctct tgcaggatgt gtttaagcgc atgcagatca tcactgcctc tgctgtggcc4860ttcgtgcacg gtgccaatga tgtcgccaac ggtgtgggcc ctcttgccgg tatctggtaa4920gtgaacctgg ccttgcgttg atgctgaaag ccactctgca gggggttgtg tagtactgtg4980tgctgtttgt tgggttactc aagttctgga agctgtgccc gtaattcgtc tttgttttcc5040tttcctgcag ggacacctac aacacctacc aagtctggca gtggcaaggc gtctcagccc5100cgcttggatt ctggtcatcg gtgctgctgg cattgtgttc ggcctggcca tgtacggcta5160ccgtatcatt gcggtgagta ttttgttaga cgaggcaggg acgctgtaga atgcagacca5220gtttccagcc tgatgtgttc agcttagcat ctgctgcagg acttgcatgg cgtgcatcct5280tgataactaa tatctctctt tctgtctgtt tttcctgcag accctgggtg tggacttggt5340ggtcatgacc cccagccgtg gttactctgt ggagctggca gcagctgcta tcattgccct5400ggcctccacg tacggtctgc ccgtctccac tacgcaagtt gtggtgagtg atgtgcttgt5460gcaatatggc ggatgttgac atgagctgcc tgctctctgt gcttcacatt gctgcatgtt5520ctgggagtct tgttagttga ctaactacat ggcatccgtc ccttgcagac tggcggtgag5580ataggggtgg gcatgtgcga gagctggaag atgacaggcg tgaactggct cctgtttatc5640cgcaccttct ggggctgggt tggtgctctg gtgactggcg ccatcctctc agctctgctc5700ttctccatcg gtgagtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcgtgtgt5760gtgcgtgtgt gtgcgtgtgt gtgcgtgtgt gcgtgtgcgt gtgtgcgtgt gcgtgtgtgc5820gtgtgcgtgt gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc ctgtgctgac5880
aaaacagagt tctgcttttg tgcgatttgc ttgagcttat gtttgcattc aagggataaa5940taaaaaagaa acaacaatgc ctgcaacgtg tatttcctgc aggtgtgtac ggccccagcc6000gcactgacct ggactacgtg acccactacc agagggcgat gaagatcgac atcgaccagt6060ccatgcaagc tctccttgtg agtcactggt gtaatgcatg catgcaggcc tgctctctct6120aattggtctg tagtccaagt tcgctaccta aactgcttgc accaggagga ggaacctttt6180gcttgcttgt gacatcatct ggactgatgt cccctctttt tctgttttgt tctgcaggac6240cgatgtgctg ctgctcctgc acctaccaat ggtggtggag gctgtggcac cggagacttg6300aactgctctt gccagcagag gatcccctac accatgggta agttctacct gtcactgaag6360gtgcctcaag cagccctgtt gccagtgttt ggttgttgtt aatgaggagg gttgctattt6420tctaggcctt taaatgtgat atggagctga gggagctgat tcacctcctt aaatacgctg6480gttctttctc cttgcaggtg acctgcaagg cctgaagacg caggttgatg ggctgttcaa6540cttcgaggaa aatggccaga tcaacgaggt aagctgtgtg tctttggttg tcttgcagtc6600aggcttcctg gtgtgatact ccctttaaca ccgtcagctt gccttgcatg gatgtacgga6660tgtaactgca agttgccttg ggtgctcttg ggtcagcact gcacaccagc acacaccaag6720tttgacattg ccctcacctg ctttttgtgc gcagtacaac atgatgtaca tgctgaggca6780gatcaacagc ctgttcaagt acaccttctt cgatggcgac ttctctcagt acgagaacgt6840gtctgagcag accatgcctt aattctgaag tcttgacaat cttttccctg ttccactcac6900tgcactcttg ctcttcagtt accaattcat cctttttgaa gtcttgcttt tgttctgaga6960ttgaacacta agcatgaccc gttctgttgt gttcacatag ccatatcatt tagtcaggtg7020ttgtggctgg ttcatatcct gaccaaattt agatctattg ctggtattgt gtactggtgg7080aagcttgggt tcccagcatg gtcgtctccc tcaagtacgc aggctgtatt gcattacctc7140ttgttgaccg aagacagtat ctcttctacc aatgcttgtt gcctgaacct caagcgtgac7200tgtttcgttg cttcactctt gtgtgttggc tcatatttca ttttcacctt cttcagccca7260
ctgaactgat tgaataatgc aactgcaaga ataaacacac gtctatgtat ctgcactgtt7320tgtgcaattg atccttcttg ttgatcattt tggaatcctc cgctgattgt gtaaattttg7380taagcaccac ccctgttcat atgccgtggc tgctcctttg tgtggacata ctatgcaaca7440ataactccca aacaacaatt gggtcccaat ttggtttcgt aattaaatta attatacgaa7500caacgcggca cctgttatac gaagagaaac caccaaataa gtctggatag ttctccctga7560gctgctagga ttaaggttgc attacgccac taaatgaact tgcgcaactt ctgggcaatg7620aggaagatca gtcaggagaa aattcaaaaa ggacagagtt cgtgttgtcc ggttacatta7680aacaagtcaa ccgatctgac tgagtggcgt attgtaactg attagcagac tacattcaat7740gtgttactta agtcaataag gatgaaatca agttgaaaag gcccctgata gtctggtggc7800ttgactgctg ggctaaggag tgcgtctttg tcaaactgag atcagatcag atccgtttta7860catgtaaagt gaaagtgtac acccttttag tcaggtggct taactgctgg gtaaagaact7920gggt 7924<210>15<211>2019<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>gene<222>(1)..(2019)<400>15atgacggacg tggacagctt cagcggcaac atgcccaacc tctcgggctt tgagtccgca 60gcgggctggc aaggcgagaa cttcacctac cacgatggca agtggtctgc ctacgtgtgg120ctgctggtca tcggctcctt cacctcattc atggctgcat ggggcatcgg tgccaacgat180gtggccaact ccttcgccac aagtgtgggc tccaaggctt tgaccatgtt ccaagcctgc240gtgattgcgg gcatctttga atttgtcggc gctgtgtccc tgggtggtac tgttgtgaag300
accgtgaagg gctccatcac tgacccctca atgttcaagc accagcccca gatttttgcg 360tacggcatgc ttggtgcctc tacttctgta gccattgtgc tcttcctggc cacatacttg 420aagcaggctg tgtccaccac acacactgca attgggtctg tgcttggctt cggcttggtg 480tatggaggcg ctgatggtgt gacctggaac gaggtgtccg atgagttccc cttccgcaag 540gggttcacac ctgtcgtcat ctcctggttc gtctcccccg tcttcactgc cattctgtcc 600tccggattct tcatcatcac caggattgtc tgcctgcagc gccagcaatc ctacaagatt 660gccttcttca tgatccctgt gctgatgatg atcaccatct tcattgtcct gctggccatc 720ttcctgaaga gtgtggactc tggacacgac cgtgagggtg agctgaactg gtccacagac 780aagaaggcct gggtggcaat tgttgtcggt gctggtgccg gtctgctgac catcccctac 840accatctggc tgaggaagtc catgctccag gaggaccagg aagtgcacga ggagaatatg 900gctcgtgatg ctgagaccgc ccacgtcgca gctggtggca cactgaagga gaagaaccct 960gaggatgatg tgcatgagct gaccaaggct gagaagttta tggagtggtt caacggcacc1020tggttcggcc agagacagtt tgtgaagaac tttgttgcag ctatgacata cgatgtgcac1080gcccatgtgg ccaccatgga caaccccaag gttgcccaga tgcatgcaga tgctgaggtc1140ttcgaccccc gcactgagga tgtgtttaag cgcatgcaga tcatcactgc ctctgctgtg1200gccttcgtgc acggtgccaa tgatgtcgcc aacggtgtgg gccctcttgc cggtatctgg1260gacacctaca acacctacca gtctggcagt ggcaaggcgt ctcagccccg ctggattctg1320gtcatcggtg ctgctggcat tgtgttcggc ctggccatgt acggctaccg tatcattgcg1380accctgggtg tggacttggt ggtcatgacc cccaaccgtg gttactctgt ggagctggca1440gcagctgcta tcattgccct ggcctccacg tacggtctgc ccgtctccac tacgcaagtt1500gtgactggcg gtaagatagg ggtgggcatg tgcgagagct ggaagatgac aggcgtgaac1560tggctcctgt ttatccgcac cttctggggc tgggttggtg ctctggtgac tggcgccatc1620ctctcagctc tgctcttctc catcggtgtg tacggcccca gccgcactga cctggactac1680
gtgacccact accagagggc gatgaagatc gacatcgacc agtccatgca agctctcctt1740gaccgatgtg ctgctgctcc tgcacctacc aatggtggtg gaggctgtgg caccggagac1800ttgaactgct cttgccagca gaggatcccc tacaccatgg gtgacctgca aggcctgaag1860acgcaggttg atgggctgtt caacttcgag gaaaatggcc agatcaacga gtacaacatg1920atgtacatgc tgaggcagat caacagcctg ttcaagtaca ccttcttcga tggcgacttc1980tctcagtacg agaacgtgtc tgagcagacc atgccttaa 2019<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>16ccctgttcca ctcactgc18<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>17gaacaggggt ggtgcttaca 20
權(quán)利要求
1.鹽藻差減cDNA文庫(kù)，其特征在于它是用抑制差減雜交法構(gòu)建的鹽藻受高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽藻差減cDNA文庫(kù)，其特征在于它是鹽藻在含有0.5M NaCl的DM培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后轉(zhuǎn)移到含有2.0M NaCl的DM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24小時(shí)，用抑制差減雜交法構(gòu)建的差減cDNA文庫(kù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鹽藻差減cDNA文庫(kù)，其特征在于包括SEQ ID NO1～11的cDNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3任一所述的鹽藻差減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括如下步驟(a)鹽藻從低鹽到高鹽脅迫誘導(dǎo)；(b)提取鹽藻誘導(dǎo)前后的mRNA；(c)將(b)所獲得的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，誘導(dǎo)后的cDNA為測(cè)試cDNA(Tester cDNA)，誘導(dǎo)前的cDNA為參照cDNA(Driver cDNA)；(d)將Tester cDNA和Driver cDNA均用RsaI酶切產(chǎn)生較短的平末端片段；將Tester產(chǎn)物分成兩等份，分別與不同的接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R，)連接，而Driver cDNA不與接頭連接；(e)兩份Tester(Tester cDNA-Adaptor1和Tester cDNA-Adaptor2R)分別與Driver cDNA混合，進(jìn)行第一次差減雜交；(f)將(e)的兩份雜交產(chǎn)物未經(jīng)變性即進(jìn)行混合，并加入過(guò)量Driver cDNA混合，進(jìn)行第二次差減雜交；(g)接頭末端填平；(h)抑制性PCR擴(kuò)增差異表達(dá)的序列；(i)用巢式引物(Nested Primer)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，使差異表達(dá)的片段得到富集；和(j)將(i)的擴(kuò)增產(chǎn)物插入克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建獲得鹽藻高鹽脅迫誘導(dǎo)的差減cDNA文庫(kù)，其特征在于，鹽藻在含有0.5M NaCl的DM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有2.0MNaCl的DM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24小時(shí)，誘導(dǎo)前后的鹽藻分別提取mRNA，用抑制差減雜交法構(gòu)建cDNA文庫(kù)。
5.SEQ ID NO1～11任一的鹽藻cDNA片段。
6.含有權(quán)利要求5的鹽藻cDNA片段的載體。
7.包括權(quán)利要求6的鹽藻cDNA片段的載體的轉(zhuǎn)化體。
8.鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的全長(zhǎng)cDNA，SEQ ID NO12。
9.含有權(quán)利要求8的鹽藻Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的全長(zhǎng)cDNA的載體。
10.包括權(quán)利要求9的載體的轉(zhuǎn)化體。
11.鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的全長(zhǎng)基因，SEQ ID NO14。
12.鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO13。
13.編碼如權(quán)利要求12所述的鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的核苷酸序列，SEQ ID NO15。
14.如權(quán)利要求13所述的編碼鹽藻的Na+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)膜通道蛋白的核苷酸序列的片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求8、11、13或14任一的核苷酸序列在植物基因工程育種的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明受高鹽脅迫誘導(dǎo)的鹽藻基因片段和一個(gè)鹽藻Na
文檔編號(hào)C12N15/63GK1840664SQ200510030910
公開日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2005年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月31日
發(fā)明者許政暟, 李啟云, 高孝舒, 孫煜, 張慶琪, 宋任濤 申請(qǐng)人:上海大學(xué)