專利名稱：具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑及其核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑及其核苷酸序列，另外，還涉及上述制劑的制作方法和用途。
背景技術(shù)：
綠色植物占地球陸地生物量的95％，其化學(xué)物質(zhì)組成主要是木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，它們占植物干重的比率分別為15％～20％、45％和20％。但是要充分、有效地利用這類資源卻相當(dāng)困難，這是由于非水溶性木質(zhì)纖維素很難被酸和酶水解。木質(zhì)素與半纖維素以共價(jià)鍵形式結(jié)合，將纖維素分子包埋在其中，形成一種天然屏障，使酶不易與纖維素分子接觸，而木質(zhì)素的非水溶性、化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，導(dǎo)致了木質(zhì)纖維素的難降解性。所以，要利用或徹底降解纖維素，必須首先解決木質(zhì)素的降解問(wèn)題，如木質(zhì)素是造紙工業(yè)中有效利用纖維素的最大障礙，造紙工業(yè)傳統(tǒng)降解木質(zhì)素的方法造不僅成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和大量的能耗，也會(huì)影響紙漿中纖維素的質(zhì)量。因此，木質(zhì)纖維素的降解涉及降解半纖維素木聚糖和木質(zhì)素的酶，它們分別是木聚糖酶(xylanase)、漆酶(Laccase)、錳過(guò)氧化物酶(Maganese peroxidase，簡(jiǎn)稱Mnp)等。
用木聚糖酶對(duì)紙漿進(jìn)行預(yù)漂白，可以減少隨后的化學(xué)漂白用氯量30％～40％。目前，酶法助漂新工藝在歐洲和北美得到應(yīng)用。加拿大已有約10％的硫酸鹽法紙漿廠采用了該新工藝。丹麥諾和諾德公司和美國(guó)山道斯化學(xué)公司等多家酶制劑廠商，紛紛推出了專門用于紙漿處理的木聚糖酶和纖維素酶新產(chǎn)品。木聚糖酶處理工藝是通過(guò)降解除去紙漿表面再沉積的半纖維素等方式來(lái)幫助化學(xué)漂劑漂白的。因此，木聚糖酶只能起到助漂的作用，不能真正替代化學(xué)漂劑。要從根本上消除有毒氯漂液的污染，需最終實(shí)現(xiàn)生物漂白，即利用木質(zhì)素酶對(duì)木質(zhì)素的直接作用來(lái)實(shí)現(xiàn)生物漂白，包括木素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、漆酶和纖維二糖脫氫酶等。日本報(bào)道，利用漆酶進(jìn)行生物漂白，可以去掉50％～60％的殘余木質(zhì)素，減少氯漂50％～60％，然而，木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，并且在紙漿中木質(zhì)素與木聚糖形成復(fù)合體緊密地附著在纖維上，難以除去。僅依賴于一種酶的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，利用木聚糖酶與木質(zhì)素酶兩種酶的共同作用有望完全降解掉紙漿中殘留的木質(zhì)素，實(shí)現(xiàn)真正意義上的生物漂白。未來(lái)生物制漿和生物漂白的技術(shù)突破將使造紙工業(yè)擺脫污染，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)。
飼料中一般含有較多的非淀粉多糖(Non-starchpolysaccharides，NSPs)，主要包括阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、α-半乳糖苷、果膠、纖維素等。其中前二者占NSPS的30％，因單胃動(dòng)物不能利用NSPs，使阿拉伯木聚糖成為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子；NSPs還能結(jié)合大量的水，使消化道中的食糜體積增大，粘度增加，并形成凝膠，干擾消化酶的功能和吸收作用，影響食糜在小腸中滯留，而引起微生物異常繁殖，造成動(dòng)物生長(zhǎng)受阻、飼料轉(zhuǎn)化率降低，從而使其表觀代謝能(AME)受到抑制。飼料中如果添加木聚糖酶，就可顯著降低阿拉伯木聚糖分子大小，將其分解成較小聚合度的低聚木糖，改善飼料性能，消除或降低因粘度增加而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用。由于飼料中一般含有多種抗?fàn)I養(yǎng)成分，所以添加的酶一般含有多種酶成分的復(fù)合酶，如β-葡聚糖酶、纖維素酶、漆酶、過(guò)氧化物酶、半乳糖酶等，特別是β-葡聚糖酶，與木聚糖酶協(xié)同作用，效果非常顯著。
木聚糖酶在食品行業(yè)中也有廣泛的應(yīng)用，主要體現(xiàn)在它能從棉殼、甘蔗渣、玉米皮蕊等天然食物半纖維中分解得到低聚木糖。低聚木糖是由2～7個(gè)木糖，以β-1，4-糖苷鍵連接而成的低聚糖，具有保健特點(diǎn)與功能。低聚木糖具難消化性，低熱量而不會(huì)導(dǎo)致肥胖；有很高的雙歧菌增殖活性，是腸內(nèi)雙歧菌的活化增殖因子；難發(fā)酵性糖，不易造成齲齒。另外，用低聚木糖可制成不同甜度的食品，可代替葡萄糖作為糖尿病人的療效食品。生產(chǎn)低聚木糖最有效、副作用最少的方法是利用木聚糖酶，因此，木聚糖酶在食品行業(yè)的應(yīng)用有著巨大的潛力。造紙工業(yè)廢料及農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被木聚糖酶轉(zhuǎn)化為D-木糖單體。而D-木糖又可被細(xì)菌、酵母及真菌轉(zhuǎn)化成有價(jià)值的燃料。因全世界所面臨的能源危機(jī)問(wèn)題，一定會(huì)導(dǎo)致對(duì)生物資源的大量需求，故木聚糖酶在能源工業(yè)的應(yīng)用存在著巨大的潛力。漆酶在食品工業(yè)如啤酒的生產(chǎn)中也有應(yīng)用，可使用漆酶等進(jìn)行沉淀和絮凝的脫除，使酒類得到澄清。
降解木質(zhì)素的主要酶系是過(guò)氧化物酶系，它們作用于底物的機(jī)制是奪取電子和自由基的形成，這些特點(diǎn)決定了它們底物的非專一性，即它們的底物不是一種而是一類或幾類有機(jī)化合物。以漆酶為例，它是含銅的多酚氧化酶，它的底物涵蓋了多種芳胺、酚類、二茂鐵及共衍生物。鑒于木質(zhì)素降解菌和它們產(chǎn)生的相關(guān)酶類對(duì)多種有機(jī)化合物的降解能力，因此它們也是化工廢水處理研究最為活躍的領(lǐng)域之一，這方面已不乏成功的范例。
以上提出的木質(zhì)素降解過(guò)程仍是不夠全面的，還需要深入研究和探明木素自由基存在種類及化學(xué)反應(yīng)特性。針對(duì)木素降解緩慢的缺點(diǎn)，要強(qiáng)化木素降解酶系動(dòng)力學(xué)分析，以便實(shí)現(xiàn)白腐菌及其酶系的工業(yè)應(yīng)用。由于白腐菌對(duì)底物非特異性機(jī)制，使得該菌不僅可應(yīng)用在木素-纖維素基質(zhì)加工中，如制漿、飼料生產(chǎn)，環(huán)境保護(hù)中，如漂白廢水處理、環(huán)境芳香物降解也日益受到重視。
利用現(xiàn)代生物技術(shù)從絲狀真菌和細(xì)菌中克隆相關(guān)基因，構(gòu)建基因工程菌，大規(guī)模生產(chǎn)木質(zhì)素降解酶，很可能是解決這個(gè)難題的十分有效途徑，故這個(gè)研究領(lǐng)域也成為分子生物學(xué)家競(jìng)相追逐的研究熱點(diǎn)之一。隨著靈芝、云芝等藥用真菌研究的深入，對(duì)它們的認(rèn)識(shí)，也不應(yīng)僅局限于醫(yī)療、保健方面，也應(yīng)該重視它們?cè)谫Y源利用、工業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)、環(huán)保等方面上也有不可忽視的研究?jī)r(jià)值。
漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，和植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅藍(lán)蛋白屬銅藍(lán)氧化酶(blue copper oxidases)家族中的同一小族，在結(jié)構(gòu)和功能上存在著許多相似之處。由于漆酶是一種氧化還原酶，其作用主要是催化氧化還原反應(yīng)。在植物體內(nèi)，它主要是催化木質(zhì)素的聚合過(guò)程，使木質(zhì)素沉積，而真菌產(chǎn)生的漆酶則進(jìn)行相反的過(guò)程，使木質(zhì)素發(fā)生降解。利用漆酶的催化氧化還原性能可以進(jìn)行化學(xué)催化反應(yīng)。對(duì)漆酶基因的克隆和序列分析，實(shí)現(xiàn)其高表達(dá)是一個(gè)重要目的，因此一直有人在研究該基因的異源表達(dá)。Coriolus hirsutus的木素降解酚氧化酶已被克隆并在酵母系統(tǒng)S.cerevisiae中的表達(dá)。編碼白腐菌Phlebia radiata漆酶基因克隆于軟腐菌Trichoderma reesei表達(dá)系統(tǒng)中，用纖維素酶的啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)該酶基因的表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到20mg/L。另外，A.oryzae TATA amylase和Pichia pasti系統(tǒng)也成功地表達(dá)了若干種不同來(lái)源的的漆酶。
錳過(guò)氧化物酶(簡(jiǎn)稱Mnp)，是一種糖蛋白，分子量約46000。由一個(gè)血紅素基和一個(gè)Mn2+構(gòu)成了它的活性中心，另外還有兩個(gè)起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)作用的Ca2+。其分子中有十條長(zhǎng)的蛋白質(zhì)單鏈，一條短的單鏈。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑及其核苷酸序列，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于上述制劑的制作方法和用途。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案為編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶重組酶的核苷酸序列，它的核苷酸序列如序列表中序列1、3、5序列所述；編碼漆酶的核苷酸序列可以從靈芝(Ganodermalucidum)中獲得或據(jù)此序列人工合成；編碼木聚糖酶的核苷酸序列可以從短小芽孢桿菌菌株AS1菌株中獲得或據(jù)此序列人工合成；編碼過(guò)氧化物酶的核苷酸序列可以從雜色云芝(Coriolus versicolor)菌株中獲得或據(jù)此序列人工合成。
編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶重組酶的氨基酸序列，它的氨基酸序列如序列表中序列2、4、6序列所述。
權(quán)利要求1的核苷酸序列表達(dá)載體，生產(chǎn)具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的重組蛋白，其特征是編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶的核苷酸序列受啟動(dòng)子以及終止子的調(diào)控，啟動(dòng)子是真菌或酵母的啟動(dòng)子和終止子；啟動(dòng)子為在絲狀真菌或酵母中表達(dá)能力強(qiáng)的強(qiáng)啟動(dòng)子，有纖維素酶的cbh1、葡糖淀粉酶的glaA、3-磷酸甘油醛脫氫酶的gpdA或乙醇氧化酶基因(AOX1)等啟動(dòng)子；終止子為色氨酸合成酶基因終止子(TtrpC)或AOX1基因終止子；表達(dá)載體具有選擇標(biāo)記，選擇標(biāo)記可以是bar，hygB，pyrG，argB或Zeocin抗性基因。
制備漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶重組蛋白的方法，采用權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，采用宿主細(xì)胞獲得重組的漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶；漆酶重組蛋白在pH值為3-8和30-65℃的條件下都可以保持其活性，最適pH值為4-6，最適溫度為40-55℃。木聚糖酶重組蛋白的特征是在pH值為4.5-9和30-80℃條件下都可以保持其活性，最適pH值為5-8，最適溫度為60-70℃。過(guò)氧化物酶重組蛋白的特征是在pH值為3-8和30-65℃的條件下都可以保持其活性，最適pH值為6-8，最適溫度為40-55℃。
根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是采用曲霉獲得重組的漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶，其具體過(guò)程為含有3-磷酸甘油醛脫氫酶的gpdA啟動(dòng)子和色氨酸合成酶基因終止子(TtrpC)調(diào)控的編碼漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶的核苷酸序列，編碼漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶活性的核苷酸序列符合權(quán)利要求1和2中所述的特征，宿主可以是曲霉絲狀真菌，能夠在曲霉絲狀真菌中表達(dá)具有功能的漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶重組蛋白，可在曲霉絲狀真菌的細(xì)胞中表達(dá)，也可以分泌到胞外，從培養(yǎng)液中回收。
采用酵母獲得重組的漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶，其具體過(guò)程為含有乙醇氧化酶基因(AOX1)的啟動(dòng)子和終止子調(diào)控的編碼具有漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶活性多肽的核苷酸序列，編碼漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶活性的核苷酸序列符合權(quán)利要求1和2中所述的特征，可用畢赤酵母作為生產(chǎn)重組漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶蛋白的宿主，重組漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶蛋白在宿主的細(xì)胞中表達(dá)，也可以分泌到胞外，從培養(yǎng)液中回收。
具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的復(fù)合酶制劑，其特征是編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶的基因在酵母或絲狀真菌中表達(dá)，獲得它們的重組酶，這些重組的漆酶或/和木聚糖酶或/和過(guò)氧化物酶進(jìn)行混合配制成酶制劑。
具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的菌制劑，其特征是編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶的基因?qū)虢湍富蚪z狀真菌中后，酵母和/或絲狀真菌混合制成菌制劑。
具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑的用途，所述的復(fù)合酶制劑或菌制劑用于脫木質(zhì)素或漂白紙漿，其具體過(guò)程為使用復(fù)合酶制劑或菌制劑，在含有N-OH集團(tuán)的芳香族反應(yīng)介質(zhì)、吐溫或聚乙二醇烷酯非離子表面活性劑、金屬離子Cu2+、Mn2+存在下，通入氧氣，在30-65℃，pH值5-7的條件下，攪拌反應(yīng)3-9小時(shí)，再加入EDTA或EPTA螯合除去金屬離子，加入過(guò)氧化氫和亞硫酸鈉漂白。
具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑的用途，所述的復(fù)合酶制劑或菌制劑用于降解苯胺、聯(lián)苯胺、硝基苯、2，4-二硝基氯苯、黃曲霉毒素、五氯酚和木聚糖污染物，其具體過(guò)程為復(fù)合酶制劑或菌制劑，加入到含有污染物的廢液中，在30-65℃、pH值5-8條件下，攪拌反應(yīng)0.5-2小時(shí)，降解廢液中污染物。


圖1靈芝漆酶和其它四種真菌漆酶的氨基酸相似性比較。四種真菌分別是Pycnoporus coccineus；Trametes pubescens；Trametes versicolor；Polyporus ciliatus圖2 pBARGPE1圖3 ApBARGPE-Lac漆酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化曲霉的抗性平板BpBARGPE1載體轉(zhuǎn)化曲霉的抗性平板(陰性對(duì)照)；C漆酶基因轉(zhuǎn)化的Southern blot的鑒定結(jié)果(1#陰性對(duì)照野生型基因組總DNA；2#轉(zhuǎn)化株的基因組總DNA；3#漆酶基因轉(zhuǎn)化株基因組總DNA經(jīng)EcoR I酶切；4#陽(yáng)性對(duì)照pBARGPE-Lac質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoR I酶切)圖4重組漆酶活性圖5 ApBARGPE-mnp錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化曲霉的抗性平板；BpBARMTE載體轉(zhuǎn)化曲霉的抗性平板(陰性對(duì)照)；C錳過(guò)氧化物酶基因基因轉(zhuǎn)化的Southern blot的鑒定結(jié)果(1#陰性對(duì)照野生型基因組總DNA；2#錳過(guò)氧化物酶基因轉(zhuǎn)化株的基因組總DNA；3#錳過(guò)氧化物酶基因轉(zhuǎn)化株基因組總DNA經(jīng)EcoR I酶切；4#陽(yáng)性對(duì)照pBARGPE-mnp質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoR和XhoI酶切)圖6重組錳過(guò)氧化物酶活性圖7載體pPICZα-CX構(gòu)建8轉(zhuǎn)化子在含有0.4％RBB-xylan的MM平板上形成透明環(huán)及生長(zhǎng)情況CGS115/pPICZ/LacZ作為甲醇利用正常型(Mut+)及作為陰性對(duì)照其余為轉(zhuǎn)化子包括菌株1-6圖9菌株1-6號(hào)發(fā)酵4天上清液蛋白SDS-PAGE圖(泳道1-6分別為菌株1-6發(fā)酵4天上清液蛋白電泳圖；泳道7為對(duì)照發(fā)酵4天上清液蛋白電泳圖；泳道8蛋白低分子量Marker)具體實(shí)施方式
靈芝、云芝是漆酶的高產(chǎn)白腐真菌，為了分離完整的漆酶基因，首先構(gòu)建靈芝或云芝的基因組文庫(kù)，將靈芝或云芝基因組DNA進(jìn)行部分酶切，回收9-23kb的片段，構(gòu)建成λ噬菌體文庫(kù)。篩選基因組文庫(kù)，得到陽(yáng)性克隆，進(jìn)行亞克隆，并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見序列表中的序列1。得到的序列經(jīng)DNA序列、氨基酸序列以及蛋白質(zhì)保守功能區(qū)域的同源性比較，證實(shí)克隆的是一種新的漆酶。為了高效率的分離新漆酶的cDNA序列，構(gòu)建了cDNA均一化文庫(kù)，設(shè)計(jì)并合成了探針，從文庫(kù)中得到10個(gè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序，將得到的序列與基因組序列比較，并翻譯成氨基酸序列，見序列表中的序列2，通過(guò)NCBI Conserved Domain Search氨基酸保守序列的分析，證明得到的蛋白是一種新的multicopper oxidases，在組氨酸及其附近的序列高度保守。漆酶屬于銅藍(lán)氧化酶家族，由此可見我們克隆的基因可能是漆酶基因。為了進(jìn)一步鑒定所克隆的基因，把氨基酸序列與已克隆漆酶基因的氨基酸序列，進(jìn)行了相似性比較。從cDNA序列推出該漆酶由511個(gè)氨基酸組成，與四種真菌漆酶的相似性比較可以發(fā)現(xiàn)，在氨基酸序列的COOH端和NH2端有四個(gè)漆酶高度保守的序列(圖1)，這些序列參與銅原子的的螯合，是形成氧化還原中心的重要序列。COOH端的保守氨基酸序列是PHPFHLHGH和PWFLHCHIDFHL；在NH2端保守氨基酸序列是SIHWHGLFQ和TFWYHSHLSTQYCDGLRGP。其中，組氨酸(His)與銅原子配位，構(gòu)成具有氧化還原功能的立體結(jié)構(gòu)。與漆酶LCC3-1(Polyporus ciliatus)的同源性為70％；與Laccase(Pycnoporuscoccineus)的同源性為68％，與Laccase 2(Trametes pubescens)的同源性為66％；與Laccase I(Trametes versicolor)的同源性為67％。
為了大量生產(chǎn)漆酶，構(gòu)建了漆酶基因的表達(dá)載體，將新漆酶的DNA序列或cDNA序列置于強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控下，優(yōu)先采用真菌的啟動(dòng)子和適于在真菌中生產(chǎn)重組蛋白的表達(dá)載體。真菌表達(dá)載體pBARGPE質(zhì)粒(圖2)帶有真菌啟動(dòng)子(Pgpd)和終止子(TtrpC)，并攜帶有分解PPT的bar基因，漆酶全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)表達(dá)載體pBARGPE。構(gòu)建好的pBARGPE-Lac(圖3)漆酶表達(dá)載體，通過(guò)電激法或PEG法導(dǎo)入黑曲酶(Aspergillus niger)，pBARGPE-Lac漆酶表達(dá)載體含有bar基因，能使重組子產(chǎn)生PPT抗性，漆酶能氧化ABTS并生成藍(lán)色環(huán)斑，從圖4可看出，pBARGPE-Lac整合進(jìn)黑曲酶的基因組中，在PPT平板上產(chǎn)生籃斑，Southemblot證實(shí)漆酶基因已導(dǎo)入宿主細(xì)胞。通過(guò)發(fā)酵方法生產(chǎn)重組漆酶，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定了重組漆酶的活性(圖5)，漆酶活性在培養(yǎng)第六天達(dá)到最大值(70.8U/ml)。
依據(jù)云芝(Coriolus versicolor)依賴錳過(guò)氧化物酶基因(manganeseperoxidase isozyme MP2)序列設(shè)計(jì)了兩條引物Mnperox1和Mnperox2，通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增出了1098bp的片段，與報(bào)道的基因有97％的相似性，如序列表序列5所示，根據(jù)克隆的序列翻譯出的氨基酸序列與報(bào)道的依賴錳過(guò)氧化物酶(manganese peroxidase isozyme MP2)的氨基酸序列僅在第198位氨基酸有差別，氨基酸變化為Ala198→Thr198，如序列表序列6所示。采用與生產(chǎn)漆酶重組蛋白的方法，生產(chǎn)依賴錳過(guò)氧化物酶。錳過(guò)氧化物酶基因全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)表達(dá)載體pBARGPE1，通過(guò)PEG介導(dǎo)法導(dǎo)入黑曲酶(Aspergillus niger)，pBARGPE-mnp錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)載體含有bar基因，能使重組子產(chǎn)生PPT抗性，錳過(guò)氧化物酶基因能氧化ABTS并生成藍(lán)色環(huán)斑，從圖6可看出，在PPT平板上產(chǎn)生籃斑，Southern blot證實(shí)錳過(guò)氧化物酶基因已導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
短小芽孢桿菌xylanase耐溫耐堿，生化性質(zhì)穩(wěn)定，在工業(yè)上有廣泛地用途。本專利克隆了短小芽孢桿菌菌株AS1，127的xylanaseB基因，并研究了其在畢赤酵母中的表達(dá)。采用PCR方法克隆到與短小芽孢桿菌xylanase基因(XYNA)序列同源的序列，DNA序列有約7％差異，氨基酸序列有約6％差異。由于克隆的XYNB是根據(jù)同源基因XYNA設(shè)計(jì)引物，而XYNB的5’端與3’端序列可能與XYNA不同，為了得到完整的基因序列，用反向PCR的方法擴(kuò)增5’端與3’端序列。根據(jù)已確定的XYNB基因序列，在其基因內(nèi)部設(shè)計(jì)一對(duì)反向PCR引物引物15’TAATTCATAATCGATCCGCT 3’，引物25’CTATCTATGTGTCTATGGCT 3’，測(cè)序后與第一次PCR結(jié)果合并，得到完整的木聚糖酶基因，由于xylanaseB基因的5’端與3’端序列與其同源基因XYNA有差異，因此，再把此基因DNA序列和推測(cè)的氨基酸序列與XYNA進(jìn)行序列同源性比較，比較結(jié)果表明此基因DNA序列與XYNA長(zhǎng)度完全一樣687bp(含終止密碼子)，如序列表序列3所示，DNA序列有8％差異，推測(cè)的氨基酸序列有7％差異，如序列表序列4所示。選用酵母分泌表達(dá)表達(dá)載體pPICZα-C，克隆到的xylanaseB基因插入到酵母表達(dá)載體pPICZa-C的多克隆位點(diǎn)上，新質(zhì)粒命名為pPICZα-CX(圖7)，鑒定載體正確后。將構(gòu)建好的載體pPICZα-CX利用電激法，將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞中，電激后取100μl涂于含有100μg/mL Zeocin的YPDS平板中，篩選出基因拷貝數(shù)高的菌株。將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種于含有0.4％與藍(lán)色RBB偶連的木聚糖MM平板上，生長(zhǎng)3天，轉(zhuǎn)化子分泌地xylanase會(huì)將的藍(lán)色RBB-xylan底物分解成無(wú)色物質(zhì)(圖8)。取發(fā)酵上清液SDS-PAGE分析，根據(jù)其氨基酸組成準(zhǔn)確計(jì)算出的分子量為22.2kDa。從SDS-PAGE結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)化子在約22kDa出現(xiàn)明顯的蛋白泳帶，而未轉(zhuǎn)化的畢赤酵母未出現(xiàn)此帶。因此，xylanaseB基因在轉(zhuǎn)化的畢赤酵母中成功地分泌表達(dá)出了xylanaseB(圖9)。對(duì)菌株1發(fā)酵上清液不同時(shí)間表達(dá)的蛋白和菌株1-6發(fā)酵4天發(fā)酵上清液蛋白分別用Bradford法和DNS法測(cè)定蛋白含量與酶活力，結(jié)果如表1、表2所示。隨發(fā)酵時(shí)間增加，蛋白含量也增高，第4天蛋白含量最高，酶活力最高，SDS-PAGE電泳帶也最亮。雖然第4天蛋白含量比第3天增高24％，但酶活力只增加14％，酶活力達(dá)到81.2U/ml，木聚糖酶重組蛋白含量達(dá)到67.8μg/ml。對(duì)此酶穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，在pH6.0，50℃下為此酶最適條件，此酶在pH6.0，50℃，16小時(shí)后，仍可保留42％的活性，在pH8.9，50℃，16小時(shí)后，仍可保留12％的活性。以上結(jié)果顯示，此酶在工業(yè)上有很廣泛地用途。

表1 菌株1發(fā)酵上清液不同時(shí)間表達(dá)的蛋白含量與酶活力

表2 菌株1-6發(fā)酵4天發(fā)酵上清液蛋白含量與酶活力實(shí)施例1 漆酶基因的克隆1.構(gòu)建基因組文庫(kù)取菌絲生長(zhǎng)旺盛的搖瓶，菌絲用4-6層紗布過(guò)濾，風(fēng)干菌絲。在液氮中研成細(xì)粉，及時(shí)轉(zhuǎn)入50mL的離心管中，加入10-20mL提取緩沖液(500mmol/LNaCl；100mmol/L tris-HCl pH8；50mmol/L EDTA pH8；10mmol/L β-巰基乙醇)，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。加入1-3mL20％SDS(pH7.2)，混勻，65℃水浴保溫20～30分鐘，并經(jīng)常輕輕混勻。加入5-10mL 5mol/L KAC，混勻后冰浴20～30分鐘。10000rpm，4℃離心10分鐘。取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻，10000rpm，4℃離心10分鐘。取水相，準(zhǔn)確加入0.6-1倍體積的異丙醇，輕輕混勻，冰上放置10分鐘，7000rpm，4℃離心10分鐘，沉淀用70％乙醇洗滌，離心后溶于無(wú)菌雙蒸水中。加入30μl DNase-free RNase(10mg/mL)，37℃溫育30分鐘。加入等體積的酚/氯仿，混勻，10000rpm，4℃離心10分鐘。取水相，加入0.6倍體積異丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗滌，略風(fēng)干，溶于TE中。用Sau3AI部分酶切基因組總DNA，回收9～23Kb的片斷。0.4-0.6％低熔點(diǎn)瓊脂糖(1×TAE Buffer)電泳分離DNA片段，回收9～23Kb片段，稱量膠的重量，加入1/10體積的10×Agarase buffer，65℃下30分鐘，熔解膠，再轉(zhuǎn)入37℃保溫，加入Agarase消化1小時(shí)，加入1/10體積的3M醋酸鈉，冰上放置30分鐘，1,3000rpm離心10分鐘，棄沉淀，上清轉(zhuǎn)入另一支干凈的1.5ml的離心管，加入2倍體積的乙醇，-20℃沉淀DNA30分鐘，1,3000rpm離心10分鐘，70％乙醇洗滌，略干燥，溶于30μl水中。DNA酶切片段與載體在T4 DNA ligase的作用下，置于4-16℃下連接4-24小時(shí)。置于冰上溶解包裝提取物，加入4μl連接產(chǎn)物，22～24℃下包裝3-4小時(shí)。加phage buffer至250μl，并加入10～12μl氯仿，混勻，4℃下可保存4星期。
2基因組文庫(kù)的篩選和陽(yáng)性克隆的鑒定用接種環(huán)挑取E.coli KW251或L325，在LB平板上劃線，置37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。從E.coli KW251LB或L325平板上挑取單菌落，培養(yǎng)過(guò)夜。在10ml的玻璃管中加入30μl 1M MgSO4和2.8ml熔化的上層瓊脂，混勻，置47℃至少溫育30分鐘。分別取各稀釋度的噬菌體0.1ml與0.1ml新鮮培養(yǎng)的E.coli KW251或L325混勻，37℃培養(yǎng)30分鐘，使噬菌體吸附細(xì)菌。噬菌體和細(xì)菌的混合物轉(zhuǎn)入上層瓊脂中，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，迅速均勻鋪到下層瓊脂上，室溫下放置，使上層瓊脂硬化。轉(zhuǎn)入37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16小時(shí)。平板置于4℃下1.5小時(shí)。平板轉(zhuǎn)入室溫，小心慢慢地把硝酸纖維素膜鋪到噬菌體平板，，保持3-5分鐘，使DNA轉(zhuǎn)移到膜上。膜置于變形液濕潤(rùn)的Whatman濾紙上4分鐘。轉(zhuǎn)到另一張被中性液濕潤(rùn)的Whatman濾紙上4分鐘。在空氣中干燥膜，用兩張Whatman濾紙夾住膜，置于120℃，烤膜40分鐘。室溫用5×SSC浸泡5分鐘，平衡膜。
1μg模板DNA(線性或超螺旋)用無(wú)菌雙蒸水調(diào)節(jié)終體積為16μl，沸水浴10分鐘，在冰浴中快速冷卻。充分混合DIG-High引物標(biāo)記溶液，并加4μl到盛有模板DNA的反應(yīng)管中，混勻并且短暫離心。然后37℃溫育1小時(shí)或過(guò)夜。加2μl0.2MEDTA(pH8.0)終止反應(yīng)，并且/或65℃加熱10分鐘終止反應(yīng)。預(yù)熱一個(gè)適當(dāng)體積的DIG Easy Hyb雜交液(10mL/100cm2尼龍膜)到雜交溫度(37～42℃)，然后用它預(yù)雜交膜30分鐘；煮沸5分鐘以變性DIG標(biāo)記的DNA探針(約25ng/mL)，然后迅速在冰浴中冷卻；加變性的DIG標(biāo)記的DNA探針到另一份預(yù)加熱到雜交溫度的DIG Easy Hyb雜交液(3.5ml/100cm2尼龍膜)中，充分混勻，避免氣泡；倒出預(yù)雜交液，然后加探針/雜交液混合物到膜上，雜交4小時(shí)或過(guò)夜。雜交后，先用2×SSC，0.1％SDS在15-25℃，持續(xù)搖動(dòng)下，洗2×5分鐘。6.再用0.5×SSC，0.1％SDS(預(yù)熱到洗滌溫度)在65-68℃，持續(xù)搖動(dòng)下，洗2×15分鐘。
用洗液短暫地沖洗膜1～5分鐘；在100mL封閉液中放置30分鐘；在20mL抗體溶液中放置30分鐘；在100mL洗液中洗2×15分鐘；在20mL檢測(cè)緩沖液中平衡2～5分鐘；在暗室中用一個(gè)合適的容器盛10mL新制備的顏色底物溶液，將膜放入其中顯色。在顏色發(fā)展期間不要搖動(dòng)。反應(yīng)通常在16小時(shí)后完成。當(dāng)所需點(diǎn)或帶的明暗度合適時(shí)，用50mL無(wú)菌雙蒸水或TE緩沖液洗膜5分鐘以停止反應(yīng)。結(jié)果可通過(guò)照相方式記錄下來(lái)。
根據(jù)帶有陽(yáng)性信號(hào)的雜交膜，用牙簽切下平板上相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性噬菌斑(第一輪篩庫(kù)可能不能分離到單噬菌斑)，轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中，并加入1ml的phage elution buffer，在室溫下放置4小時(shí)，使噬菌體顆粒釋放，間或搖動(dòng)。轉(zhuǎn)移上清至另一新管中，加入20μl氯仿，可在4～5℃存放4～5星期。按照第一輪篩庫(kù)的方法，測(cè)定滴度，重新鋪板，進(jìn)行第二輪的篩庫(kù)，直至板上的噬菌斑全是陽(yáng)性克隆。取10μl滴度為1×105噬菌體加入240μl phage buffer，250μl新鮮培養(yǎng)的E.coli KW251混勻，37℃培養(yǎng)30分鐘，使噬菌體吸附細(xì)菌；把上述混合物加到50ml的新鮮制備的LB細(xì)菌培養(yǎng)基中，添加500μl 20％麥芽糖和500μl 1M MgSO4；37℃，250rpm培養(yǎng)，直至裂解發(fā)生，培養(yǎng)物變澄清。收集的培養(yǎng)物9000×g，4℃下離心10分鐘，棄去沉淀，把上清轉(zhuǎn)入另一支管中，并加入20～40μl氯仿，可在4℃存放5星期；上清中加入2～4μg/mlRNase A和DNase I，37℃下消化30～60分鐘。；加入與裂解液等體積的phage precipitationbuffer(30％PEG 8000/2M NaCl)，在冰上放置一小時(shí)；12000×g，4℃下離心15分鐘，棄去上清，在室溫下干燥沉淀5～10分鐘；每10ml最初的噬菌體裂解液加入1mlphage release buffer，懸浮噬菌體顆粒，振蕩，混勻；5000×g，4℃下離心4分鐘，小心轉(zhuǎn)移上清至另一支新管，棄去沉淀；加入等體積的TE飽和的酚/氯仿，振蕩一分鐘，10000×g，4℃下離心10分鐘，轉(zhuǎn)移水相至另一支新管中；重復(fù)上一步；轉(zhuǎn)移上層水相至另一支新管中，并加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，振蕩一分鐘，10000×g，4℃下離心10分鐘，轉(zhuǎn)移水相至另一支新管中；加入2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，在-20℃沉淀2小時(shí)；室溫下10000rpm離心15分鐘，棄上清，用70％乙醇漂洗沉淀，待乙醇揮發(fā)完，溶于50μl的TE或滅菌的ddH2O中。純化的重組噬菌體DNA經(jīng)SalI酶切，電泳，用QIAGEN GelRecovery Kit回收片段，測(cè)序。得到漆酶的序列，如序列表序列1所示。
3構(gòu)建靈芝cDNA均一化文庫(kù)每50～100mg菌絲體中加1ml TRIZOL，使用玻璃勻漿器勻漿樣品，樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIZOL的10％。放置均勻化的樣品在15～30℃、5分鐘，以便使核酸、蛋白復(fù)合物完全解離。每1ml TRIZOL中加0.2ml氯仿。蓋上管蓋，用手用力混勻樣品15秒，15～30℃下放置2～3分鐘。2～8℃、不超過(guò)12000×g離心樣品15分鐘。離心后分成三相一個(gè)底層紅色的苯酚、氯仿相，一個(gè)中間相，一個(gè)無(wú)色的上層水相。RNA全部存在于上層水相中，水相的體積大約占TRIZOL試劑的60％。轉(zhuǎn)移水相到一個(gè)新的管子，如果還需分離DNA或蛋白質(zhì)應(yīng)保留有機(jī)相。水相中加入異丙醇以沉淀RNA。每1ml TRIZOL中加0.5ml異丙醇，15～30℃放置樣品10分鐘，2～8℃、不超過(guò)12000×g離心樣品10分鐘。RNA沉淀再離心前常不可見，離心后形成一個(gè)膠樣的沉淀物。移去上清液，用75％乙醇洗RNA沉淀1次，每1ml TRIZOL中至少加1ml 75％乙醇，混勻，2～8℃、7500×g離心5分鐘。短暫干燥一下RNA沉淀，溶于無(wú)RNase的水中。采用Oligo(dT)纖維素將Poly(A)+RNA從全RNA中分離出來(lái)。在微量離心管中準(zhǔn)備反應(yīng)液，全量50μl(模板RNA5μg，溶液5×1st Strand Synthesis Buffer10μl，dNTP Mixture5μl，RNase Inhibitor 5μl，反轉(zhuǎn)錄引物5μl，RTase(RAV-2)100U，加DEPC-H2O至50μl)。輕柔攪拌混勻。室溫放置10min后，移至42℃恒溫水浴槽內(nèi)。42℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后置于冰中冷卻2分鐘。在第一條鏈合成后的微量離心管中再加入下面反應(yīng)液，全量202.5μl(5×2nd Strand Synthesis Buffer50μl，加DEPC-H2O至202.5μl)。加入32.5μl E.coli DNA Polymerase I和5μlE.coli RNase H/E.coli DNA Ligase Mixture，輕輕攪拌。12℃反應(yīng)1小時(shí)。22℃反應(yīng)1小時(shí)。70℃加熱10分鐘。加入10μl T4 DNA Polymerase，輕輕攪拌。37℃反應(yīng)10分鐘。加入25μl 0.25 M EDTA(pH8.0)以及25μl 10％SDS溶液，混合使反應(yīng)停止。第二鏈cDNA，加上lone接頭，純化；用sseA引物擴(kuò)增cDNA。純化；用50mg擴(kuò)增后的cDNA在65℃做雜交至COt為5至50之間；羥基磷灰石柱層析分離單鏈，Centricon超濾，用sseA引物擴(kuò)增cDNA，純化。均一化進(jìn)行三次。所得產(chǎn)物用Sse8387I/Not I消化，克隆至SK-的Pst I/Not I位點(diǎn)。挑取白色菌落至96孔板，-70℃保存。
根據(jù)克隆的漆酶基因的高度保守序列，設(shè)計(jì)了一條5’-端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄引物RT1。反應(yīng)按照5’-Full Core Set(Takara)的方法進(jìn)行。1st Strand cDNA的合成反應(yīng)體系為AMV Reverse Transcriptase XL 1 l(5U/μl)，Total RNA5μg，10×RT Buffer 1.5μl，RNase Inhibitor 0.5μl(40U/μl)，5’端磷酸化引物RT1 1μl(1μg/μl)，加RNase Free dH2O至15 l。反應(yīng)條件為30℃10min，50℃30min，80℃2min。在上述cDNA溶液中加入5×Hybrid RNA DegenerationBuffer 15μl，加dH2O至75μl，再加入1μl RNase H，30℃反應(yīng)1小時(shí)，降解RNA，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行乙醇沉淀。在經(jīng)乙醇沉淀的單鏈cDNA中加入5×RNA(ssDNA)Ligation Buffer 8μl，40％PEG6000 20μl，加dH2O至40μl，加入1μl T4 RNALigase，16℃反應(yīng)15～18小時(shí)。在反轉(zhuǎn)錄引物的內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)了兩對(duì)反向嵌套PCR引物L(fēng)acA1\LacS1和LacA2\LacS2，擴(kuò)增5’-末端的cDNA片段。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃1min，50℃30s，72℃60s，進(jìn)行30cycle，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物回收測(cè)序。根據(jù)5’-RACE設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA的上游特異引物L(fēng)SH1和下游特異引物L(fēng)SH2，以均一化cDNA文庫(kù)為模板，擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA序列。采用two-stepcycle程序進(jìn)行PCR，條件是7 cycle94℃，25S；72℃，3min；32 cycle94℃，25S；67℃，3min；循環(huán)完成后，67℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳，從凝膠中回收DNA，取10ul純化的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行末端加A的處理反應(yīng)體系如下10ulDNA，5ul 10×tail-A buffer；2μl dATP；2unit Taq酶；加水至50μl。反應(yīng)條件為72℃10 min。用nucleotid removal Kit純化DNA，并與pMD18-Tvector連接，轉(zhuǎn)化，挑單菌落，鑒定陽(yáng)性克隆，測(cè)序。測(cè)得的序列如序列表序列1所示。
實(shí)施例2漆酶基因的表達(dá)以已克隆的靈芝漆酶全長(zhǎng)cDNA克隆到絲狀真菌表達(dá)載體上，構(gòu)建成pBARGPE-Lac重組表達(dá)載。pBARGPE1質(zhì)粒帶有真菌啟動(dòng)子(Pgpd)和終止子(TtrpC)，并攜帶有分解PPT的bar基因，pBARGPE1經(jīng)EcoR I和Xho I酶切后，酶切產(chǎn)物用凝膠電泳回收。并與制備的帶有EcoR I和Xho I粘性末端的靈芝漆酶全長(zhǎng)cDNA在16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，酶切鑒定。
制備曲霉原生質(zhì)體的制備取生長(zhǎng)旺盛的孢子，然后以3000～5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5～10min，去上清液，用0.5～0.8mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑(1M山梨醇)溶液洗滌1～3次，加入用滲透壓穩(wěn)定劑配制的Novozyme，30℃酶解1.5～3.0小時(shí)；將上述酶解液用G3砂芯漏斗過(guò)濾，濾液經(jīng)離心去上清液，再用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌1～3次，得到純化的原生質(zhì)體。
用1M肌醇/50mM Tris.Cl(pH8.0)/50mM CaCl2調(diào)制5mg/ml的肝素，配好的肝素用過(guò)濾器滅菌，1ug pBARGPE-Lac加入5μl亞精氨，20μl肝素，150μl曲霉原生質(zhì)體，冰浴30分鐘，每份樣品加40％PEG4000//50mMTris·Cl(pH8.0)/50mM CaCl2到1.5ml，室溫下放置20分鐘，同時(shí)底層培養(yǎng)基趁熱加過(guò)濾滅菌的FIGS，每個(gè)平板傾倒15ml底層培養(yǎng)基，將DNA從eppendorf管轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的50ml離心管，與添加了FIGS的上層培養(yǎng)基(45℃下保溫)混合，倒在凝固的底層培養(yǎng)基上。
漆酶活力測(cè)定的程序如下10.0ml反應(yīng)混合液中含50mmol/L琥珀酸鈉緩沖液(pH4.5)，0.4mmol愈創(chuàng)木酚和0.5ml粗酶液30℃反應(yīng)30min后于465nm處測(cè)定吸光度酶活單位定義為以酶液事先滅活后的反應(yīng)混合液為對(duì)照以1min內(nèi)催化氧化1nmol愈創(chuàng)木酚的酶量為1個(gè)酶活單位(u)已知465nm處愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)λ465＝1.21×104M-1.cm-1。酶活力為75u/ml。
實(shí)施例3 木聚糖酶基因的克隆以已知的短小芽孢桿菌木聚糖酶同源基因(P00694)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。設(shè)計(jì)一對(duì)引物引物15’GATGAATTCAEGAATTTGAGAAAATTAAG 3’，引物25’GATGGATCCTTAGTTGCCAATAAACATCT 3’，用PCR擴(kuò)出其序列，并進(jìn)行測(cè)序，所得序列見序列表。用DNASIS分析此木聚糖酶基因的酶切位點(diǎn)。選一種此木聚糖酶基因無(wú)酶切位點(diǎn)四堿基酶，用此酶切消化基因組DNA。5μgDNA用限制性內(nèi)切酶消化完全后，苯酚、氯仿各抽提一次，無(wú)水乙醇沉淀，溶于20μl。無(wú)菌的去離子水中。測(cè)定OD260及OD280，確定DNA的純度及含量。取大約200ng消化了的總DNA進(jìn)行自身環(huán)化連接反應(yīng)。體系中總DNA濃度約為20ng/μl；T4DNAligase濃度為1U/μl。連接反應(yīng)在10℃-12℃下進(jìn)行24-48小時(shí)。取1μ用來(lái)做PCR，并進(jìn)行測(cè)序，獲得全長(zhǎng)的木聚糖酶序列，序列如序列表序列3所示。
實(shí)施例4 木聚糖酶基因表達(dá)準(zhǔn)備線形化DNA(含有所克隆的木聚糖酶基因的pICZαC重組質(zhì)粒)(1)DNA用Sac1切DNA 1小時(shí)以上。(2)取酶切線形化DNA補(bǔ)水至300ul，加300ul酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)顛倒混勻。(3)離心12000rpm，5分。(4)取上清，加750ml乙醇，30ul NaAc，-20℃，30分鐘。(5)離心，12000rpm，10分。(6)80％乙醇清洗。(7)吹干。(8)加入10ul水。
準(zhǔn)備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期酵母菌(1)挑單菌落接種于5ml YPD液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)過(guò)夜。(2)取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液0.1-0.5ml接種于50ml新鮮YPD液體培養(yǎng)基，再30℃培養(yǎng)至OD600＝1.3-1.5。(3)在+4℃，1500Xg離心5分鐘，用50ml0℃無(wú)菌水重懸菌體。(4)離心同上，再重懸于25ml0℃無(wú)菌水。(5)離心同上，重懸于20ml0℃1M山梨醇溶液。(6)離心同上，再重懸于1ml0℃1M山梨醇溶液，置于冰上(當(dāng)天使用)。
電擊(1)將制備的細(xì)胞80μl和5-90μg線性化DNA注入0℃電擊池，混勻，置冰上5分鐘。(2)據(jù)酵母脈沖參數(shù)處理細(xì)胞。(電壓1500V；電容25μF；電阻400Ω；次數(shù)1次；時(shí)間8.9s)。后即加1ml0℃1M山梨醇溶液到電擊池內(nèi)，混勻。(3)再將池內(nèi)液體轉(zhuǎn)置1.5ml EP管，30℃培養(yǎng)1-2小時(shí)。(4)取100μl菌液涂布于含ZeocinTM 100μg/ml的YPDS平板，剩余菌液全涂布于另一含ZeocinTM 100μg/ml的YPDS平板，30℃培養(yǎng)3-4天。
重組酵母的發(fā)酵培養(yǎng)(1)挑取酵母轉(zhuǎn)化子單菌落接種于2.5mlBMGY中，置于50ml錐形瓶中，在28-30℃，250-300rpm搖瓶培養(yǎng)至OD600＝2-6(大約16-18個(gè)小時(shí))，酵母細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。(2)3000rpm，室溫下，離心菌體5分鐘，去上清，菌體重懸于10-20mlBMMY中，至OD600＝1。置于100ml錐形瓶中蓋兩層紗布，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)。(3)每隔24小時(shí)加入100％甲醇至終濃度0.5％，保持誘導(dǎo)。(4)每次加甲醇之前收集一次培養(yǎng)物(即在培養(yǎng)的不同時(shí)間段24，48，72，96小時(shí)，分別取樣)，每次取培養(yǎng)物2ml，12000rpm離心3分鐘，取上清貯于-20℃，等待分析。(5)SDS-PAGE。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)表達(dá)的重組蛋白。
取9支試管，分別稀釋樣品至9個(gè)稀釋度，用空白管溶液調(diào)零點(diǎn)，測(cè)OD540值，每個(gè)樣測(cè)三次，取平均值。以木糖濃度為橫坐標(biāo)，OD540值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在最適溫度和pH值的酶活測(cè)定取0.5ml 0.2M，pH6.0磷酸緩沖液，加入蒸餾水0.4ml和含4％燕麥木聚糖溶液0.05ml(即酶反應(yīng)液為0.2％燕麥木聚糖pH6.0，0.1M磷酸緩沖液)，加入0.05ml用pH6.0磷酸緩沖液稀釋10倍的酶液，以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母發(fā)酵液為空白對(duì)照，50℃反應(yīng)5min，加入DNS試劑0.75ml，煮沸5min，立即用流動(dòng)冷水冷卻，加入1.75ml水，測(cè)定OD540，每個(gè)樣測(cè)三次，取平均值，以每min生成1μmol還原糖作為1個(gè)酶活單位(IU)，測(cè)酶活力條件以下均同(除溫度，酶反應(yīng)緩沖液pH值做出相應(yīng)變化，以及在測(cè)pH值對(duì)木聚糖酶活力的影響時(shí)，用相應(yīng)pH值緩沖液稀釋酶液，其他用pH6.0磷酸緩沖液稀釋酶液)。
不同溫度對(duì)木聚糖酶活力的影響酶反應(yīng)液在不同的溫度(30℃，40℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃)的水浴中預(yù)熱5min，而后在每管中同時(shí)加入0.05ml用pH6.0磷酸緩沖液稀釋10倍的酶液，在不同的溫度反應(yīng)5min，測(cè)定酶活力。
不同溫度對(duì)木聚糖酶穩(wěn)定性的影響取pH6.0磷酸緩沖液稀釋10倍的酶液0.5ml，加入到9ml的pH6.0磷酸緩沖液中，分別取0.95ml在不同的溫度(30℃，40℃，50℃，55℃，60℃，70℃，80℃)的水浴中各放置1h，而后在每管中同時(shí)加入含4％燕麥木聚糖溶液0.05ml，50℃反應(yīng)5min，定義未保溫酶在反應(yīng)溫度50℃的相對(duì)酶活力為100％，計(jì)算出各個(gè)溫度的相對(duì)酶活。
不同pH值對(duì)木聚糖酶活力的影響不同pH值(4.0，4.6，5.0，5.6，6.0，6.5，7.0，8.0，8.9，10)的酶反應(yīng)液各0.95ml在50℃的水浴中預(yù)熱5min，而后在每管中同時(shí)加入0.05ml用相應(yīng)pH值緩沖液稀釋10倍的酶液，50℃反應(yīng)5min。
不同pH值對(duì)木聚糖酶穩(wěn)定性的影響不同pH值(4.0，4.6，5.0，5.6，6.0，6.5，7.0，8.0，8.9，10)的緩沖液各0.9ml，在每管中同時(shí)加入0.05ml用相應(yīng)pH值緩沖液稀釋10倍的酶液，在50℃的水浴中放置60min，而后在每管中同時(shí)加入含4％燕麥木聚糖溶液0.05ml，50℃反應(yīng)5min，定義未保溫酶的在pH6.0，反應(yīng)溫度50℃相對(duì)酶活為100％，計(jì)算出各個(gè)溫度的相對(duì)酶活。
木聚糖酶在pH值為8.9，溫度50℃下的穩(wěn)定性取用pH8.9Tris-HCl緩沖液稀釋10倍的酶液0.5ml，加入到9ml pH8.9Tris-HCl緩沖液中，在50℃水浴中保溫，在不同時(shí)間(0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，16h)取0.95ml，加入含4％燕麥木聚糖溶液0.05ml。50℃反應(yīng)5min，定義未保溫酶的反應(yīng)溫度為50℃的相對(duì)酶活為100％，計(jì)算出各個(gè)時(shí)間的相對(duì)酶活。
用SDS-PAGE檢測(cè)到xynalaseB的表達(dá)，Bradford法和DNS法檢測(cè)到六個(gè)轉(zhuǎn)化子中表達(dá)量最高的為67.8μg/ml，酶活力為81.2U/ml。并且檢測(cè)結(jié)果表明抗性越高，表達(dá)量越高，即整合到酵母基因組中XYNB拷貝數(shù)越高，表達(dá)量越高。對(duì)此酶穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，在pH6.0，50℃下為此酶最適條件，此酶在pH6.0，50℃，16小時(shí)后，仍可保留42％的活性，在pH8.9，50℃，16小時(shí)后，仍可保留12％的活性。
實(shí)施例5 依賴錳過(guò)氧化物酶基因的克隆根據(jù)報(bào)道的云芝(Coriolus versicolor)的序列設(shè)計(jì)了兩條引物，反應(yīng)按照RT-PCR Kit(Takara)的方法進(jìn)行。反應(yīng)體系為5μl 10×RT Buffer，10μlMgCl2，10μl dNTPmixture，1μl Mnperox1引物，1μl Mnperox2引物，AMV ReverseTranscriptase XL 1l(5U/l)，Total RNA 5g，TaqDNA聚合酶1l，加水至50l。
PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃30s，60℃30s，72℃2min，進(jìn)行30cycle，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用PCR purify Kit純化，并與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，鑒定陽(yáng)性克隆，測(cè)序如序列表中序列5所示。
實(shí)施例6 依賴錳過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)pBARGPE-mnp絲狀真菌表達(dá)載體的構(gòu)建pBARGPE1質(zhì)粒帶有真菌啟動(dòng)子(Pgpd)和終止子，并攜帶有分解PPT的bar基因，pBARGPE1經(jīng)EcoR I和Xho I酶切后，酶切產(chǎn)物用凝膠電泳回收；并與制備的帶有EcoR I和Xho I粘性末端的錳過(guò)氧化物酶基因全長(zhǎng)cDNA在16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，酶切鑒定。
pBARGPE-mnp轉(zhuǎn)化曲霉曲霉原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法方法同實(shí)施例2。
從轉(zhuǎn)基因的曲霉中提取錳過(guò)氧化物酶，并采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定錳過(guò)氧化物酶的活力反應(yīng)液含0.4mmol/L愈創(chuàng)木酚，0.1mmol/L H2O2，0.2mmol/L MnSO4和50mmol/L琥珀酸鈉緩沖液，pH4.5。測(cè)定反應(yīng)液在465nm處的吸光度在單位時(shí)間的增加數(shù)，這是由于愈創(chuàng)木酚被氧化引起的。一個(gè)活力單位定義為每分鐘引起A465nm一個(gè)單位變化所需的酶液量。酶活力為7.3u/ml。
上述實(shí)施例中具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑的用途，復(fù)合酶制劑或菌制劑可以用于脫木質(zhì)素或漂白紙漿，其具體過(guò)程為使用復(fù)合酶制劑或菌制劑，在含有N-OH集團(tuán)的芳香族反應(yīng)介質(zhì)、吐溫或聚乙二醇烷酯非離子表面活性劑、金屬離子Cu2+、Mn2+存在下，通入氧氣，在30-65℃，pH值5-7的條件下，攪拌反應(yīng)3-9小時(shí)，再加入EDTA或EPTA螯合除去金屬離子，加入過(guò)氧化氫和亞硫酸鈉漂白。
上述實(shí)施例中具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑的用途，復(fù)合酶制劑或菌制劑還可以用于降解苯胺、聯(lián)苯胺、硝基苯、2，4-二硝基氯苯、黃曲霉毒素、五氯酚和木聚糖污染物，其具體過(guò)程為復(fù)合酶制劑或菌制劑，加入到含有污染物的廢液中，在30-65℃、pH值5-8條件下，攪拌反應(yīng)0.5-2小時(shí)，降解廢液中污染物。
<110>李寶健 程度<120>具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的重組酶制劑<160>6<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>3573<212>DNA<213>靈芝(Ganoderma lucidum)<400>1cgtttttggc cagccactgc gtctttttgt tcgcagcgtt gactcgggac ttggactagc60ccccttcacc ttgactcccc tgcatgttgt ggtcgcagac gtggccagca cagctcaacc120ttttaatgag cactgcgctc agtgttagca ggatccatca taggtttcgt cagcgtcggc180cgcagccacc gtccgaatgc acttcggatg ccgcggaacc attggtgcgc ccattctcca240ttgcgacctt cgcacacata gcagcttagc aagctagttc tttatgaccg gtatgcactc300ttacgaactg cgcacaaccg atatgtatag ctcacactgt cgcctgtcca ggtccgagac360aaatggattc aggtacactc ctaccgccag tggcggtccc gaaatgcgtc aagtcggaaa420tcaaacccta caacgctcca caggtcatga aaccaaagtt acactggagg taaggttctg480tcctgtattg tagggaagct ctcacatatg tcgtagaggt cgcccgacaa ccgcgtgcta540tgccacagtc gtatgcgcca ccaaactcgg acagcgtccc gtatccatac aagccaccgt600attagcatag ctatggcggg ccgagacggt tgcgctgacg cgatcgcttt ttccgaagag660tataaaagac atgggtatgc gggggaagcc atcccaaccc aactcctcac tcgataccga720gcagtcctct ccaactgcga ctgccatggc cggacttcaa tcctttcttc cctacttccc780tctccttttt gctgcctcag cgtatgcagc cattgggcct gtcgccaacc tcaccatatc840cgacgcagat attgccccag atggcttcac ccgtgccgct gtcgtagtca acggggtctc900tcctgggccc ctcataactg gcaacaaggt ctgtcccgca aacttatcga tgttcggtaa960ccatcaattc atctattcgg aaataggggg gacaattttc agatcaatgt cattaaccaa1020atgacaaacc acaccatgaa caagactacc agtattgtat gatttattcc cgttatgtct1080atttttcatg ctcacattct ctccagcact ggcatggcct cttccaggag ggcacgaact1140gggctgacgg acctgcgttc gtcacccagt gtccgatcgt cagtgggaac tcgttcctgt1200acaacttcca tgtccctgat caggccggta agtcttcgca ttttgggact gattaaaagc1260gcattgatgc ccttcctcca cgtaggtacc ttctggtatc acagccacct ctcaacgcag1320tactgcgacg gcctgagggg gccattggtt gtatacgatc cccacgatcc tcttgcgcac1380atgtatgacg tgacgcggta tgttttcggc cagcgttgcc actacccctg atactgataa1440taccatctat atagactcga ctgtgatcac tctcactgaa tggtattgga ccgcctccca1500tctcggcacg cgcttcccgt tagtccaaca tgccttaccc ccgagccccc gtgccgttgc1560tgactatatg cgcattttag cgctggcctc gccgattcca cgttgatcaa cggtctgggt1620cggacaactg cgacatctaa tgcagaactt gctgtcgtca acgtcactca aggcaaacgg1680tacgtagatg atgaaatttc cctcgatgtt gggataccga ccgtcctttc acagttatcg1740cttccgcctg gtgtccatgg cgtgcgaccc gagtttcaac ttcagtcatc gatggccacg1800acctcacggt cattgaagcg gatggcgtcg agacccagcc cgtcaccgtc aacagcatca1860acatcttcgc cgcccagcgt tattcgtttg tggtgagtat ctttgtagtg agcattttgg1920gagcggggct gaaatggtat cgtgccttca gctcactgct aaccaaacaa tcgacaacta1980ctggattcga gccaacccct cccttggtgt catgggcttc gatgctggca tcaactccgc2040gatcctgcgc tacgacgggg ctgcaccagt cgagcctgtg acgtcgccgc agtcaacgca2100
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權(quán)利要求
1.編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶重組酶的核苷酸序列，它的核苷酸序列如序列表中序列1、3、5序列所述；編碼漆酶的核苷酸序列可以從靈芝(Ganoderma lucidum)中獲得或據(jù)此序列人工合成；編碼木聚糖酶的核苷酸序列可以從短小芽孢桿菌菌株AS1菌株中獲得或據(jù)此序列人工合成；編碼過(guò)氧化物酶的核苷酸序列可以從雜色云芝(Coriolus versicolor)菌株中獲得或據(jù)此序列人工合成。
2.編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶重組酶的氨基酸序列，它的氨基酸序列如序列表中序列2、4、6序列所述。
3.權(quán)利要求1的核苷酸序列表達(dá)載體，生產(chǎn)具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的重組蛋白，其特征是編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶的核苷酸序列受啟動(dòng)子以及終止子的調(diào)控，啟動(dòng)子是真菌或酵母的啟動(dòng)子和終止子；啟動(dòng)子為在絲狀真菌或酵母中表達(dá)能力強(qiáng)的強(qiáng)啟動(dòng)子，有纖維素酶的cbh1、葡糖淀粉酶的glaA、3-磷酸甘油醛脫氫酶的gpdA或乙醇氧化酶基因(AOX1)等啟動(dòng)子；終止子為色氨酸合成酶基因終止子(TtrpC)或AOX1基因終止子；表達(dá)載體具有選擇標(biāo)記，選擇標(biāo)記可以是bar，hygB，pyrG，argB或Zeocin抗性基因。
4.制備漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶重組蛋白的方法，采用權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，采用宿主細(xì)胞獲得重組的漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶；漆酶重組蛋白在pH值為3-8和30-65℃的條件下都可以保持其活性，最適pH值為4-6，最適溫度為40-55℃。木聚糖酶重組蛋白的特征是在pH值為4.5-9和30-80℃條件下都可以保持其活性，最適pH值為5-8，最適溫度為60-70℃。過(guò)氧化物酶重組蛋白的特征是在pH值為3-8和30-65℃的條件下都可以保持其活性，最適pH值為6-8，最適溫度為40-55℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是采用曲霉獲得重組的漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶，其具體過(guò)程為含有3-磷酸甘油醛脫氫酶的gpdA啟動(dòng)子和色氨酸合成酶基因終止子(TtrpC)調(diào)控的編碼漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶的核苷酸序列，編碼漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶活性的核苷酸序列符合權(quán)利要求1和2中所述的特征，宿主可以是曲霉絲狀真菌，能夠在曲霉絲狀真菌中表達(dá)具有功能的漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶重組蛋白，可在曲霉絲狀真菌的細(xì)胞中表達(dá)，也可以分泌到胞外，從培養(yǎng)液中回收。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是采用酵母獲得重組的漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶，其具體過(guò)程為含有乙醇氧化酶基因(AOX1)的啟動(dòng)子和終止子調(diào)控的編碼具有漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶活性多肽的核苷酸序列，編碼漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶活性的核苷酸序列符合權(quán)利要求1和2中所述的特征，可用畢赤酵母作為生產(chǎn)重組漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶蛋白的宿主，重組漆酶或木聚糖酶或過(guò)氧化物酶蛋白在宿主的細(xì)胞中表達(dá)，也可以分泌到胞外，從培養(yǎng)液中回收。
7.具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的復(fù)合酶制劑，其特征是編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶的基因在酵母或絲狀真菌中表達(dá)，獲得它們的重組酶，這些重組的漆酶或/和木聚糖酶或/和過(guò)氧化物酶進(jìn)行混合配制成酶制劑。
8.具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的菌制劑，其特征是編碼漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶的基因?qū)虢湍富蚪z狀真菌中后，酵母和/或絲狀真菌混合制成菌制劑。
9.權(quán)利要求7或8所述的具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑的用途，所述的復(fù)合酶制劑或菌制劑用于脫木質(zhì)素或漂白紙漿，其具體過(guò)程為使用復(fù)合酶制劑或菌制劑，在含有N-OH集團(tuán)的芳香族反應(yīng)介質(zhì)、吐溫或聚乙二醇烷酯非離子表面活性劑、金屬離子Cu2+、Mn2+存在下，通入氧氣，在30-65℃，pH值5-7的條件下，攪拌反應(yīng)3-9小時(shí)，再加入EDTA或EPTA螯合除去金屬離子，加入過(guò)氧化氫和亞硫酸鈉漂白。
10.權(quán)利要求7或8所述的具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑的用途，所述的復(fù)合酶制劑或菌制劑用于降解苯胺、聯(lián)苯胺、硝基苯、2，4一二硝基氯苯、黃曲霉毒素、五氯酚和木聚糖污染物，其具體過(guò)程為復(fù)合酶制劑或菌制劑，加入到含有污染物的廢液中，在30-65℃、pH值5-8條件下，攪拌反應(yīng)0.5-2小時(shí)，降解廢液中污染物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶活性的制劑及其核苷酸序列，克隆了新的漆酶、木聚糖酶和過(guò)氧化物酶基因，構(gòu)建了漆酶、木聚糖酶和過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)載體，將表達(dá)載體導(dǎo)入酵母或絲狀真菌中表達(dá)，并檢測(cè)出重組酶的活性。將重組表達(dá)的漆酶、木聚糖酶、過(guò)氧化物酶混合酶配制成制劑，可在造紙、環(huán)保、食品和飼料等工業(yè)中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/08GK1657611SQ200510033089
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者李寶健, 程度 申請(qǐng)人:李寶健, 程度