專利名稱：改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中基因工程載體的改造構(gòu)建，具體涉及對(duì)家蠶核型多角體病毒進(jìn)行基因重組構(gòu)成基因工程載體的方法。
背景技術(shù)：
家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)基因組為共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA，分子量約130kb。該病毒的多角體蛋白基因?yàn)椴《緩?fù)制非必需基因，多角體蛋白基因啟動(dòng)子為外源基因超效表達(dá)啟動(dòng)子，可以在該啟動(dòng)子下游插入外源基因構(gòu)建重組家蠶核型多角體病毒，在家蠶幼蟲或蛹體中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，因而，該病毒目前已被越來(lái)越廣泛地用于外源基因的表達(dá)。
通常，構(gòu)建重組家蠶核型多角體病毒要分四步進(jìn)行。第一步，以核型多角體病毒多角體基因的側(cè)翼序列作為同源臂，構(gòu)建含有多角體蛋白基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)移載體；第二步，把外源基因克隆進(jìn)轉(zhuǎn)移載體，使外源基因在多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制之下，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體；第三步，把重組轉(zhuǎn)移載體與家蠶核型多角體病毒基因組DNA一起導(dǎo)入家蠶細(xì)胞(共轉(zhuǎn)染)，在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)同源重組把外源基因插入到病毒基因組中；第四步，通過(guò)空斑篩選，獲得多角體蛋白基因被外源基因取代的重組家蠶核型多角體病毒。該重組病毒接種家蠶細(xì)胞、家蠶(幼蟲或蛹)，即可實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或蟲體中的高效表達(dá)。
用上述方法構(gòu)建的重組病毒不形成多角體，在用家蠶作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源基因時(shí)，難以通過(guò)食下感染蠶體，需花費(fèi)大量的勞力通過(guò)皮下接種；在外源基因表達(dá)后期，往往因核型多角體病毒編碼的半胱氨酸蛋白酶而導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的降解，從而影響表達(dá)水平；在病毒編碼的半胱氨酸蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的雙重作用下，蠶的體表易破裂，使血淋巴流失，不僅影響表達(dá)產(chǎn)物的收獲水平，而且會(huì)因?yàn)榧?xì)菌的繼發(fā)性感染，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物微生物污染的機(jī)會(huì)增加，影響表達(dá)產(chǎn)物的后續(xù)加工。
為解決上述問(wèn)題，使重組家蠶核型多角體病毒更加適合于生產(chǎn)，有必要對(duì)常規(guī)重組病毒進(jìn)行改造，考慮到半胱氨酸蛋白酶基因和幾丁質(zhì)酶基因在病毒復(fù)制中是非必須的，本發(fā)明試圖構(gòu)建使此二基因同時(shí)失活并可形成多角體的重組家蠶核型多角體病毒作為基因工程載體，以表達(dá)外源基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的構(gòu)建方法，同時(shí)提供其在外源基因表達(dá)中的應(yīng)用，以便通過(guò)食下感染家蠶，同時(shí)提高外源基因的表達(dá)水平，減少病毒感染后期由細(xì)菌引起的繼發(fā)感染。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)設(shè)計(jì)引物，采用聚合酶連反應(yīng)技術(shù)分別克隆含家蠶核型多角體病毒的幾丁質(zhì)酶基因編碼區(qū)片段ChiA和半胱氨酸蛋白酶基因編碼區(qū)片段CP；(2)將按步驟1獲得的ChiA和CP二片段按家蠶核型多角體病毒中幾丁質(zhì)酶基因、半胱氨酸蛋白酶基因在基因組中的組織順序同時(shí)克隆進(jìn)細(xì)菌質(zhì)粒，構(gòu)建中間質(zhì)粒pBmChiA-CP；(3)將帶有家蠶核型多角體病毒完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的polh片段克隆進(jìn)按步驟2構(gòu)建的pBmChiA-CP質(zhì)粒的ChiA、CP二片段之間，獲得改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體pBmChiA-polh-CP。
上述技術(shù)方案中，所述帶有家蠶核型多角體病毒完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的polh片段的制備方法是，用限制性內(nèi)切酶SalI酶切家蠶核型多角體病毒的DNA，回收含有完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的1.4kb片段(polh)。
或者，所述帶有家蠶核型多角體病毒完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的polh片段的制備方法是，通過(guò)PCR體外擴(kuò)增的方法從家蠶核型多角體病毒的DNA中克隆含有完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的片段。
上述技術(shù)方案中，首先通過(guò)PCR技術(shù)分別克隆家蠶核型多角體病毒幾丁質(zhì)酶基因、半胱氨酸蛋白酶基因共有啟動(dòng)子區(qū)域的側(cè)翼序列，即含有幾丁質(zhì)酶基因編碼序列的片段和含有半胱氨酶蛋白酶基因編碼序列的片段；從家蠶核型多角體病毒DNA中獲得含有完整多角體蛋白基因編碼序列及其啟動(dòng)子序列的酶切片段。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建含有幾質(zhì)酶基因編碼序列——完整的多角體蛋白基因序列——半胱氨酸蛋白酶基因編碼序列結(jié)構(gòu)的基因工程轉(zhuǎn)移載體。
本發(fā)明采用下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)中的應(yīng)用一種改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的應(yīng)用，將改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體與多角體蛋白基因被外源基因取代的重組家蠶核型多角體病毒DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，獲得幾丁酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的啟動(dòng)子區(qū)域被完整的多角體蛋白基因取代的新的重組病毒，既可通過(guò)針刺感染家蠶，也可通過(guò)食下感染家蠶，使外源基因在家蠶體內(nèi)獲得高效表達(dá)。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1.用本發(fā)明的技術(shù)方案構(gòu)建的基因工程載體與多角體蛋白基因被外源基因取代的重組家蠶核型多角體病毒DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，可獲得家蠶核型多角體病毒幾丁酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的啟動(dòng)子區(qū)域被完整的多角體蛋白基因取代的新的重組病毒，該新重組病毒同時(shí)失活了幾丁質(zhì)酶、半胱氨酸蛋白酶二基因，可形成多角體，明顯提高外源基因在細(xì)胞和家蠶中的表達(dá)水平；新重組病毒感染的蠶體表不易破，有效減少因細(xì)菌的繼發(fā)感染而導(dǎo)致的蠶體腐爛和破皮導(dǎo)致的血淋巴流失，提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的收獲率。
2.用本發(fā)明技術(shù)方案構(gòu)建的新的重組病毒帶有多角體，可以通過(guò)食下高效感染家蠶，與無(wú)多角體重組病毒只能通過(guò)皮下接種的方法相比，可大大節(jié)省勞動(dòng)力。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的構(gòu)建，包括如下步驟，(1)根據(jù)GenBank已公開的家蠶核型多角體病毒(BmNPV)T3株的核苷酸序列(accession numberL33180)設(shè)計(jì)引物，它們是ChiA3ATCGGA TCCAAA TAC TGC AG(下劃線示BamH I位點(diǎn))、ChiA5CAG AAT TCA TGTTGT ACA AAT TGT TAA AC(下劃線為EcoR I位點(diǎn))、CP3GCC TCG AGTTAA TAA ATG ACT GCA G(下劃線為Xho I位點(diǎn))、CP5TGA AGC TTGTTG TAA AGA GCG CGG(下劃線為HindIII位點(diǎn))。
(2)以BmNPV DNA為模板，用ChiA3、ChiA5引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增出的幾丁質(zhì)酶基因ChiA片段(約1.7kb)經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切后克隆進(jìn)pBluescript II SK(+)質(zhì)粒(Stratagene公司產(chǎn)品)的BamH I、EcoRI位點(diǎn)，從而獲得重組質(zhì)粒pBmChiA；同樣，用CP3、CP5引物對(duì)BmNPV DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得半胱氨酸蛋白酶基因CP片段(約1.0kb)，經(jīng)HindIII、Xho I雙酶切后，克隆進(jìn)pBmChiA的HindIII、Xho I位點(diǎn)，獲中間質(zhì)粒pBmChiA-CP。
(3)按常規(guī)方法，提取BmNPV-DNA，用Sal I酶切后，回收Sal I 1.4kb片段(含有完整的多角體蛋白基因及啟動(dòng)子)，klenow酶補(bǔ)平后，克隆進(jìn)pBmChiA-CP質(zhì)粒的EcoR V位點(diǎn)，獲得改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體pBmChiA-polh-CP-1。
實(shí)施例二實(shí)施例一獲得的基因工程載體的應(yīng)用將pBmChiA-polh-CP-1載體與多角體蛋白基因被人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)取代的重組家蠶核型多角體病毒(BmNPV-hGM-CSF)DNA共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，通過(guò)空斑試驗(yàn)，篩選出形成多角體的重組家蠶核型多角體病毒(BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+)，在該重組病毒中，多角體蛋白基因取代了BmNPV-hGM-CSF的幾丁質(zhì)酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的共同啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶、半胱氨酸蛋白酶二基因同時(shí)失活，并可形成多角體。
以感染復(fù)數(shù)為10的BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+感染106細(xì)胞/mL，一周后用MTT法檢測(cè)hGM-CSF的表達(dá)水平，每mL細(xì)胞培養(yǎng)上清中hGM-CSF的生物活性達(dá)6.94×105U，而BmNPV-hGM-CSF感染細(xì)胞上清中的hGM-CSF的生物活性儀為4.34×104U，表達(dá)水平提高了10倍以上，BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+感染細(xì)胞的存活時(shí)間比BmNPV-hGM-CSF的長(zhǎng)2天左右。
以106空斑數(shù)的BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+接種5齡家蠶幼蟲，120小時(shí)后，取血淋巴測(cè)hGM-CSF的活性，每mL血淋巴的表達(dá)水平達(dá)106U以上，是BmNPV-hGM-CSF的2倍左右。
感染BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+的蠶體皮不易破，蠶體不易腐爛，而感染BmNPV-hGM-CSF的蠶破皮泄膿，在感染后期，往往因細(xì)菌的繼發(fā)性感染而導(dǎo)致蠶體腐爛。感染BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+的蠶的存活時(shí)間比感染BmNPV-hGM-CSF的蠶長(zhǎng)1～2天。
以多角體濃度為108/mL的BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+涂布桑葉，添食5齡家蠶24小時(shí)，有60％以上的蠶可被感染，而BmNPV-hGM-CSF涂布桑葉添食家蠶難以引起感染。
實(shí)施例三改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的構(gòu)建，其中第1、2步驟與實(shí)施例1相同，根據(jù)GenBank已公開的家蠶核型多角體病毒(BmNPV)T3株的核苷酸序列(accession numberL33180)設(shè)計(jì)特異性PCR引物對(duì)(引物1CGGTATGTACAGGAAGAGG，引物2GGCGGACGTGTTAGTCGAC)，以家蠶核型多角體病毒的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的polh片段，克隆進(jìn)pBmChiA-CP質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)，獲得改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體pBmChiA-polh-CP-2。
權(quán)利要求
1.一種改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟(1)設(shè)計(jì)引物，采用聚合酶連反應(yīng)技術(shù)分別克隆含家蠶核型多角體病毒的幾丁質(zhì)酶基因編碼區(qū)片段ChiA和半胱氨酸蛋白酶基因編碼區(qū)片段CP；(2)將按步驟1獲得的ChiA和CP二片段按家蠶核型多角體病毒中幾丁質(zhì)酶基因、半胱氨酸蛋白酶基因在基因組中的組織順序同時(shí)克隆進(jìn)細(xì)菌質(zhì)粒，構(gòu)建中間質(zhì)粒pBmChiA-CP；(3)將帶有家蠶核型多角體病毒完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的polh片段克隆進(jìn)按步驟2構(gòu)建的pBmChiA-CP質(zhì)粒的ChiA、CP二片段之間，獲得改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體pBmChiA-polh-CP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的構(gòu)建方法，其特征在于帶有家蠶核型多角體病毒完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的polh片段的制備方法是，用限制性內(nèi)切酶SalI酶切家蠶核型多角體病毒的DNA，回收含有完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的1.4kb片段(polh)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的構(gòu)建方法，其特征在于帶有家蠶核型多角體病毒完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的polh片段的制備方法是，通過(guò)PCR體外擴(kuò)增的方法從家蠶核型多角體病毒的DNA中克隆含有完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的片段。
4.一種改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體的應(yīng)用，其特征在于將改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體與多角體蛋白基因被外源基因取代的重組家蠶核型多角體病毒DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，獲得幾丁酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的啟動(dòng)子區(qū)域被完整的多角體蛋白基因取代的新的重組病毒，通過(guò)食下感染家蠶，使外源基因在家蠶體內(nèi)獲得高效表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改造重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體構(gòu)建方法，其步驟包括PCR分別克隆病毒的ChiA片段和CP片段；將該二片段同時(shí)克隆進(jìn)細(xì)菌質(zhì)粒，構(gòu)建中間質(zhì)粒；將帶有家蠶核型多角體病毒完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的片段克隆進(jìn)中間質(zhì)粒內(nèi)，獲得改造的常規(guī)重組家蠶核型多角體病毒的基因工程載體。該載體與多角體蛋白基因被外源基因取代的重組家蠶核型多角體病毒DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，可獲得同時(shí)失活了幾丁酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的、可形成多角體的新重組病毒。新重組病毒在細(xì)胞和家蠶中表達(dá)外源基因的水平有明顯提高，明顯減少病毒感染后期由細(xì)菌所引起的繼發(fā)感染，并可通過(guò)食下高效感染家蠶。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1673379SQ20051003770
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2005年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月25日
發(fā)明者貢成良, 曹廣力, 薛仁宇, 魏育紅, 朱越雄, 沈衛(wèi)德 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)