專利名稱：一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中制備固體酶制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，并制備穩(wěn)定的固體酶制劑的方法，屬于酶制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase EC 2.3.2.13)，全稱R-glutaminyl-peptideaminee γ-glutamyltransferase，簡(jiǎn)稱TG，是一種催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶。它可以催化大多數(shù)蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基上的γ-羧酰胺基和賴氨酸殘基上的□-氨基之間形成ε-(γ-谷胺?；?賴氨酸共價(jià)鍵。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可以催化大多數(shù)的食品蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)和氨基酸之間連接，以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺酰胺基的水解，如酪蛋白、大豆蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、谷蛋白、禽蛋蛋白等等，很大程度上改善各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，如營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、質(zhì)地結(jié)構(gòu)、口感、貯存期等，被譽(yù)為“21世紀(jì)超級(jí)粘合劑”。因此廣泛被應(yīng)用于肉制品、乳制品、小麥制品、豆制品及可食膜的制備中。在日本，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶已成為食品工業(yè)的第二大酶種，其用量?jī)H次于α-淀粉酶。此外谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶還應(yīng)用于化妝品工業(yè)、制藥工業(yè)及紡織工業(yè)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
目前報(bào)道的生產(chǎn)TG的方法主要有從動(dòng)植物組織中提取和從微生物發(fā)酵法生產(chǎn)兩種。源于動(dòng)植物的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶來源稀少，提取工藝復(fù)雜，因此這種酶的售價(jià)較高，很難用于工業(yè)應(yīng)用。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)可以大幅度降低其生產(chǎn)成本，故而是拓寬谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶應(yīng)用范圍的根本途徑。MTG是一種胞外酶，分泌在發(fā)酵液中，因此，從發(fā)酵液中提取MTG的工藝過程直接影響酶的酶活回收率及生產(chǎn)成本，制備穩(wěn)定的酶制劑是推動(dòng)該酶的研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)。
MTG是胞外酶，蛋白質(zhì)的一般提取方法如離心過濾、超濾等過程都適用于此酶。為了獲得穩(wěn)定的酶制劑，需將其制備成固體劑型以增加穩(wěn)定性。從發(fā)酵液中制備固體酶制劑的過程包括提取和干燥兩個(gè)步驟。目前，冷凍干燥和真空干燥是制備固體酶制劑最常用的方法，但是過程耗能和耗時(shí)，干燥后還需經(jīng)研磨、復(fù)配后方可成產(chǎn)品，易引起酶失活，難于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，在工業(yè)規(guī)模上如何實(shí)現(xiàn)制備高酶活回收率且穩(wěn)定的MTG酶制劑，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用MTG發(fā)酵液制備高品質(zhì)、高得率的酶制劑的方法，制備的MTG以固體粉狀的形式作為產(chǎn)品。該法操作簡(jiǎn)便、高效、費(fèi)用低廉、易于工業(yè)化。
本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液經(jīng)離心或壓濾去除菌體，使用超濾技術(shù)及用或不用乙醇沉淀再酶泥復(fù)溶去除小分子雜質(zhì)和有色物質(zhì)制得濃縮酶液，濃縮酶液與適當(dāng)?shù)妮o料及保護(hù)劑混合后采用噴霧干燥方法可一步制得適用于各種工業(yè)應(yīng)用的MTG固體酶制劑產(chǎn)品。從發(fā)酵液中制備固體酶制劑，具體操作工藝為將MTG發(fā)酵液經(jīng)去除菌體、超濾、用或不用乙醇沉淀再酶泥復(fù)溶，添加輔料及保護(hù)劑，噴霧干燥、成品包裝而制得酶活為50-100U/g的固體MTG產(chǎn)品。
離心或壓濾將發(fā)酵液離心或板框壓濾，棄去菌體，得上清液或?yàn)V液；超濾將上清液或?yàn)V液，按照下列條件0.3MPa、截留分子量為10000或30000的超濾膜超濾，濃縮至5-8倍或3倍，去除小分子雜質(zhì)和有色物質(zhì)得濃縮酶液；乙醇沉淀將濃縮3倍的超濾液用70％體積比的乙醇緩緩加入超濾濃縮3倍的超濾液中，并不斷攪拌，靜置沉淀谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶并離心棄去上清液得酶泥；酶泥復(fù)溶將乙醇沉淀的酶泥重新溶解于一定量的水中，復(fù)溶制得濃縮5-8倍的濃縮酶液；超濾直接得到的濃縮5-8倍的濃縮酶液不必經(jīng)過乙醇沉淀和酶泥復(fù)溶工序；添加輔料及保護(hù)劑將超濾直接得到的或經(jīng)乙醇沉淀酶泥復(fù)溶后得到的濃縮5-8倍的濃縮酶液與重量體積比為25％的麥芽糊精、水溶性淀粉、蔗糖、海藻糖或山梨醇，及重量體積比為0.1-1‰的還原型谷胱甘肽混合；噴霧干燥將混合好的濃縮酶液進(jìn)行噴霧干燥，控制出風(fēng)溫度為60±3℃，進(jìn)料速度為30mL/min；包裝即得成品。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用的過濾去除菌體、使用超濾技術(shù)和乙醇沉淀方法去除小分子雜質(zhì)和有色物質(zhì)，并添加適當(dāng)?shù)妮o料及保護(hù)劑，采用噴霧干燥工藝從發(fā)酵液中制備食品級(jí)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶固體制劑的操作工序，不僅可以在實(shí)驗(yàn)室中方便實(shí)施，而且極易在工業(yè)生產(chǎn)中運(yùn)用。因?yàn)閲婌F干燥對(duì)濃縮酶液濃縮倍數(shù)的要求較高，要求濃縮倍數(shù)達(dá)到5-8時(shí)，工藝才比較合理，所以考慮到生產(chǎn)廠家的超濾濃縮能力，我們采用超濾和乙醇沉淀再酶泥復(fù)溶方法對(duì)酶進(jìn)行提取和濃縮，從而不必對(duì)超濾濃縮裝置過分苛求，并添加輔料及保護(hù)劑進(jìn)行噴霧干燥；本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)之一是對(duì)MTG濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥提高了MTG的酶活收率，產(chǎn)品酶活為50-100U/g的固體MTG產(chǎn)品，賦予產(chǎn)品良好的感官品質(zhì)，且具有優(yōu)良的溶解分散性，整個(gè)操作過程都適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1發(fā)酵得到的MTG發(fā)酵液，成分分析結(jié)果菌體及其它固形物共20.0g/L；MTG酶活4.17U/mL。將上述發(fā)酵液離心去除菌體，取上清液按照下列條件0.3MPa、截留分子量為10000或30000的超濾膜低溫下進(jìn)行超濾，得到濃縮8倍的濃縮酶液，酶活為28.95U/mL，酶活回收率為86.78％。濃縮酶液與25％的麥芽糊精或水溶性淀粉及0.1‰的還原型谷胱甘肽混合后進(jìn)行噴霧干燥，干燥條件為出風(fēng)溫度為60±3℃，進(jìn)料速度為30mL/min即得到干燥的固體酶制劑，此時(shí)酶制劑的酶活為103U/g，酶活回收率為89.16％，水分含量為8.30％。總的酶活回收率為70％。MTG為略顯咖啡色的均勻粉狀，具有良好的分散溶解性。
實(shí)施例2發(fā)酵得到的MTG發(fā)酵液，成分分析結(jié)果菌體及其它固形物共20.0g/L；MTG酶活4.17U/mL。將上述發(fā)酵液離心去除菌體，取上清液按照下列條件0.3MPa、截留分子量為10000或30000的超濾膜低溫下進(jìn)行超濾，得到濃縮3倍的濃縮酶液，酶活為11.82U/mL，酶活回收率為92.12％，濃縮酶液用70％體積比的乙醇沉淀后離心除去上清液得到酶泥，酶泥復(fù)溶后得到體積濃縮5倍的酶液酶活為24.04U/mL。復(fù)溶后的濃縮酶液與25％的蔗糖、海藻糖或山梨醇，及1‰的還原型谷胱甘肽混合后進(jìn)行噴霧干燥，干燥條件為出風(fēng)溫度為60±3℃，進(jìn)料速度為30mL/min即得到干燥的固體酶制劑，酶活為86.83U/g，此步驟酶活回收率為90.29％，水分含量為7.39％?？偟拿富罨厥章蕿?0％。MTG為乳白色的均勻粉狀，具有良好的分散溶解性。
實(shí)施例3發(fā)酵得到的MTG發(fā)酵液，成分分析結(jié)果菌體及其它固形物共20.0g/L；MTG酶活6.21U/mL。進(jìn)行超濾濃縮至5倍，其余條件同實(shí)施例1。此時(shí)酶制劑的酶活為94U/g，酶活回收率為86.25％，水分含量為8.10％。總的酶活回收率為68％。MTG為略顯咖啡色的均勻粉狀，具有良好的分散溶解性。
對(duì)比實(shí)施例1改用乙醇沉淀，離心后的酶泥直接進(jìn)行冷凍干燥，干燥后的樣品再經(jīng)研磨、過篩、與輔料復(fù)配混合后得最終產(chǎn)品。其他操作如去除菌體，超濾去除小分子雜質(zhì)與有色物質(zhì)，乙醇沉淀同實(shí)施例1。結(jié)果產(chǎn)品最終酶活回收率為66.0％，酶粉顏色呈深咖啡色，在水中的分散溶解性很差。
對(duì)比實(shí)施例2改用乙醇沉淀，離心后的酶泥直接進(jìn)行真空干燥，干燥后的樣品再經(jīng)研磨、過篩、與輔料復(fù)配混合后得最終產(chǎn)品。其他操作如去除菌體，超濾去除小分子雜質(zhì)與有色物質(zhì)，乙醇沉淀同實(shí)施例1。結(jié)果產(chǎn)品最終酶活回收率為54.09％，酶粉顏色呈深咖啡色，在水中的分散溶解性很差。
權(quán)利要求
1.一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中制備固體酶制劑的方法，其特征是采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液經(jīng)過離心或壓濾去除菌體，使用超濾技術(shù)和用或不用乙醇沉淀再酶泥復(fù)溶去除小分子雜質(zhì)和有色物質(zhì)制得濃縮酶液，再將濃縮酶液與輔料及保護(hù)劑混合后進(jìn)行噴霧干燥，即可得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶固體酶制劑，具體工藝為對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液離心或壓濾，超濾，用或不用乙醇沉淀再酶泥復(fù)溶，添加輔料及保護(hù)劑，噴霧干燥，成品包裝而制得成品酶制劑；離心或壓濾將發(fā)酵液離心或板框壓濾，棄去菌體，得上清液或?yàn)V液；超濾將上清液或?yàn)V液，按照下列條件0.3MPa、截留分子量為10000或30000的超濾膜超濾，濃縮至5-8倍或3倍，去除小分子雜質(zhì)和有色物質(zhì)得濃縮酶液；乙醇沉淀將濃縮3倍的超濾液用70％體積比的乙醇緩緩加入超濾濃縮3倍的超濾液中，并不斷攪拌，靜置沉淀谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶并離心棄去上清液得酶泥；酶泥復(fù)溶將乙醇沉淀的酶泥重新溶解于一定量的水中，復(fù)溶制得濃縮5-8倍的濃縮酶液；超濾直接得到的濃縮5-8倍的濃縮酶液不必經(jīng)過乙醇沉淀和酶泥復(fù)溶工序；添加輔料及保護(hù)劑將超濾直接得到的或經(jīng)乙醇沉淀酶泥復(fù)溶后得到的濃縮5-8倍的濃縮酶液與重量體積比為25％的麥芽糊精、水溶性淀粉、蔗糖、海藻糖或山梨醇，及重量體積比為0.1-1‰的還原型谷胱甘肽混合；噴霧干燥將混合好的濃縮酶液進(jìn)行噴霧干燥，控制出風(fēng)溫度為60±3℃，進(jìn)料速度為30mL/min；包裝即得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中制備固體酶制劑的方法，其特征是將發(fā)酵液處理后的上清液或?yàn)V液采用超濾去除小分子雜質(zhì)和有色物質(zhì)，并濃縮至5-8倍或濃縮至3倍制得濃縮酶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中制備固體酶制劑的方法，其特征是將超濾濃縮3倍的濃縮酶液經(jīng)乙醇沉淀再酶泥復(fù)溶制備濃縮5-8倍的濃縮酶液，溶劑沉淀所用溶劑是乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中制備固體酶制劑的方法，其特征是干燥方法為噴霧干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中制備固體酶制劑的方法，其特征是噴霧干燥前，濃縮酶液中所添加的輔料及保護(hù)劑為麥芽糊精、水溶性淀粉、蔗糖、海藻糖或山梨醇，每升濃縮酶液中添加量為250g；及還原型谷胱甘肽，每升濃縮酶液中添加量為0.1-1g。
全文摘要
一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中制備固體酶制劑的方法，屬于酶制劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用發(fā)酵液離心或壓濾去除菌體，超濾技術(shù)及用或不用乙醇沉淀復(fù)溶方法去除小分子雜質(zhì)和有色物質(zhì)制得濃縮酶液，濃縮酶液與適當(dāng)?shù)妮o料及保護(hù)劑混合后采用噴霧干燥方法可一步制得酶活為50－100U/g的固體MTG產(chǎn)品，最終酶活回收率為60－70％，產(chǎn)品為均勻粉狀，具有良好的感官品質(zhì)和分散溶解性。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、高效、費(fèi)用低廉、極易在工業(yè)生產(chǎn)中運(yùn)用。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1657612SQ20051003793
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日
發(fā)明者陳堅(jiān), 崔莉, 劉和, 堵國(guó)成 申請(qǐng)人:江南大學(xué)