專利名稱：一種在大腸桿菌中生產(chǎn)重組血管抑素的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血管生成對實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移是必須的。為了促進血管生成，腫瘤組織生成一系列的血管生成因子(如bFGF)，同時許多腫瘤也會產(chǎn)生抗血管生成蛋白。Vasostatin是鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)N端1-180個氨基酸組成的血管生成抑制因子，它能夠呈劑量依賴性地抑制內(nèi)皮細胞的增殖，抑制新生血管生成，在實驗動物上能夠防止或減小腫瘤的生長。近來的研究發(fā)現(xiàn)calreticulin的抗腫瘤活性主要位于其第120-180氨基酸的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明中，我們稱calreticulin第120-180氨基酸的結(jié)構(gòu)域為血管抑素。
人們試圖生產(chǎn)具有生物活性的血管抑素，但重組血管抑素蛋白在大腸桿菌表達時容易形成包涵體。因此，高效、大量、低成本地生產(chǎn)具有生物活性的血管抑素，是其作為抗腫瘤藥物的開發(fā)和應(yīng)用的一個重要的瓶頸環(huán)節(jié)，也是目前血管抑素研究中的一個難點。
二
發(fā)明內(nèi)容
本專利發(fā)明建立在中國發(fā)明專利申請200410065733.X《一種在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性重組蛋白質(zhì)的方法及其應(yīng)用》的基礎(chǔ)上，和中國發(fā)明專利申請200410065733.X配套使用效果最佳。
本發(fā)明專利需要解決的問題是建立適用、簡便、廉價地在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性的、有生物活性的重組人血管抑素的工藝和方法、并建立相應(yīng)的重組人血管抑素純化工藝，為重組人血管抑素作為抑制血管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移的治療藥物用于治療腫瘤和其它血管生成相關(guān)疾病建立大規(guī)模、廉價生產(chǎn)的方法和工藝。本發(fā)明對于重組人血管抑素作為治療腫瘤和其它血管生成相關(guān)疾病藥物的開發(fā)和研究具有重要的實用意義。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到將人血管抑素cDNA基因克隆在大腸桿菌表達質(zhì)粒中，分別構(gòu)建和GST或His-tag融合表達的人血管抑素表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，其表達產(chǎn)物幾乎全部為包涵體產(chǎn)物。將具有分子伴侶活性的蛋白質(zhì)或一組分子伴侶蛋白質(zhì)(如大腸桿菌Trigger Factor(TF)和分子伴侶GroEL/ES，DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL/ES)分別在不同溫度和不同誘導(dǎo)時間下與人血管抑素共表達，結(jié)果顯示低溫和分子伴侶都分別能夠促進可溶性人血管抑素的產(chǎn)量，當將人血管抑素表達菌株在低溫(35℃～16℃)下生長和表達，同時結(jié)合共表達分子伴侶能夠更有效防止人內(nèi)皮抑素包涵體形成(見中國發(fā)明專利申請200410065733.X)。在大腸桿菌中融合表達的人血管抑素，可溶性表達產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化、腸激酶去除融合蛋白，分離純化獲得人血管抑素，純化的人血管抑素能夠特異性、劑量依賴性地抑制人內(nèi)皮細胞的增殖，在雞胚尿囊絨膜(CAM)上，具有抑制新生血管生成的作用。在腫瘤動物模型中具有明顯的抑制腫瘤的生物活性。
本發(fā)明提供了一種簡便、經(jīng)濟的生產(chǎn)具有生物活性的重組人血管抑素純化工藝和方法。本發(fā)明工藝生產(chǎn)的重組人血管抑素可在制備治療腫瘤和血管生成相關(guān)性疾病藥物中應(yīng)用。
同已有的重組人人血管抑素生產(chǎn)工藝相比，本發(fā)明的特色和創(chuàng)新之處在于(1)本發(fā)明建立了在大腸桿菌中以GST形式融合表達人血管抑素的方法，可溶性表達產(chǎn)物經(jīng)谷胱甘肽-Sepharose 4B親和層析、腸激酶降解、SephadexG-50凝膠過濾得以分離純化獲得人血管抑素。
(2)本發(fā)明建立了在大腸桿菌中以His-tag形式融合表達人血管抑素的方法，可溶性表達產(chǎn)物經(jīng)Ni2+親和柱層析、腸激酶降解、Ni2+親和柱分離純化獲得人血管抑素。
以上所用方法都是分子生物學(xué)中最常用的、成熟的分離純化方法，方法簡便、價廉，具有很好的適用性，推廣方便，適于生產(chǎn)。。
四

圖1.純化的重組人GST-血管抑素和血管抑素
1a.SDS-PAGE分析結(jié)果1GST-VAS；2VAS；3分子量標準；1b.Western blot分析結(jié)果1GST-VAS；2VAS。
圖2.重組人血管抑素抑制b-FGF刺激的血管內(nèi)皮細胞增殖實驗。
圖3.重組人血管抑素抑制雞胚尿囊膜新生血管生成活性實驗。
對孵育8天的雞胚尿囊膜施以不同劑量的VAS及其它蛋白質(zhì)。48小時后，觀察并測定每個尿囊膜上的無血管區(qū)域，無血管區(qū)域內(nèi)徑大于8mm的確定為陽性。雞胚尿囊膜血管生成抑制率(％)定義為無血管區(qū)域內(nèi)徑大于8m的雞胚數(shù)占每個VAS劑量參試雞胚總數(shù)的比例(3B)。例如3/7所表示的意思是在VAS的劑量為0.5μg/雞胚的時候，參試的7個雞胚中有3個雞胚呈陽性抑制。3A上和下圖分別圖示的是5μg GST和5μg VAS處理的結(jié)果。正方形表示加樣部位，只有VAS的處理組觀察到了無血管區(qū)域的出現(xiàn)。
圖4.純化的重組人His-VAS和VAS。
4a.SDS-PAGE分析結(jié)果1His-VAS；2VAS；3分子量標準；4b.Western blot分析結(jié)果1His-VAS；2VAS。
圖5.重組人VAS抑制b-FGF刺激的血管內(nèi)皮細胞增殖實驗。
圖6.重組人VAS抑制雞胚尿囊膜新生血管生成活性實驗。
5μg GST和5μg VAS處理的結(jié)果。正方形表示加樣部位，只有VAS的處理組觀察到了無血管區(qū)域的出現(xiàn)。
圖7.小鼠黑色素瘤動物模型腫瘤抑制實驗。
五具體實施例方式實施例1重組人血管抑素基因的合成、克隆、表達、分離純化和性質(zhì)鑒定1.人血管抑素基因的合成、克隆及其表達載體的構(gòu)建參照大腸桿菌偏愛的密碼字，化學(xué)合成了十條寡核苷酸，寡核苷酸的長度為28-35堿基，相鄰的寡核苷酸有5-8堿基相互配對，寡核苷酸的序列以及它們之間的重疊模式參見圖。首先將所有的寡核苷酸稀釋至100pmol/μl，而后按照以下的步驟依次處理T4多聚核苷酸激酶磷酸化，30℃退火，Klenow大片段補平缺口，T4 DNA連接酶連接所有缺刻(nick)，最后得到編碼人calreticulin 120至180位氨基酸的183bp的雙鏈DNA片斷。用PCR的方法將該片斷進行擴增，所用的正向引物為5’-CGGGATCCTGGACGACGACGACAAGATGACTGACATGCACGGTGAC-3’，反向引物為5’-CCCTCGAGTCATTAGTTGTCTGGACGAATCAG-3’。在正向引物中有一個BamH I的酶切位點(黑體)以及編碼腸激酶識別位點DDDDK的序列(下劃線部分)，反向引物中有一個Xho I的酶切位點(黑體)。PCR反應(yīng)的條件為94℃熱變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸30秒，共進行25個循環(huán)。純化的PCR產(chǎn)物采用BamH I和Xho I進行雙酶切，然后插入pALEX的多克隆位點。pALEX是一個T7啟動子控制下的GST融合表達的原核表達載體(Christos，A.，Panagiotidis，Silverstein，S.J.Gene 16445-47，1995)。對重組表達載體pALEX-VAS進行DNA測序，分析其閱讀框和編碼序列的正確性。
2.融合蛋白GST-VAS的表達分別將GST-VAS融合蛋白表達載體pALEX-VAS和對照載體pALEX轉(zhuǎn)入表達宿主菌E.coli BL21(DE3)，和分子伴侶一起在低溫下共表達，表達條件見中國發(fā)明專利申請200410065733.X《一種在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性重組蛋白質(zhì)的方法及其應(yīng)用》。IPTG終濃度為0.6mM。
3.重組人血管抑素的分離純化1升表達菌體用40ml磷酸緩沖液懸浮，冰浴超聲20分鐘(5秒超聲，5秒間隔)。超聲后的混合物12000rpm，4℃下離心30分鐘。在超聲上清液中加入終濃度為3％的谷胱甘肽-Sepharose 4B親和層析介質(zhì)(Amersham Pharmacia Biotech)，4℃保溫2小時，每隔20分鐘混勻一次，然后收集谷胱甘肽-Sepharose 4B親和層析介質(zhì)并用10倍體積的冷磷酸緩沖液洗滌3次，再將洗滌后的層析介質(zhì)懸浮于切割緩沖液中(20mM Tris-HCl，100mMNaCl，5mM EDTA，2μg腸激酶/mg融合蛋白質(zhì)，pH8.0)，16℃孵育10小時，收集酶切緩沖液，凍干濃縮，再將樣品進行Sephadex G50凝膠過濾層析(AmershamPharmacia Biotech)，洗脫緩沖液為20mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH7.4。
用MicroBCA試劑盒和SDS-PAGE凝膠灰度掃描的方法確定GST-VAS和人血管抑素的產(chǎn)率，并用western blotting的方法驗證二者的分子屬性。一抗使用的是羊抗人calreticulin多抗(1∶300稀釋)(Santa Cruz)，二抗使用的是過氧化物酶交聯(lián)的兔抗羊IgG多抗(1∶1000稀釋)。
4.血管內(nèi)皮細胞增殖抑制試驗將3-5代的HUVEC接種到明膠包被的24孔板中，每個孔約1×104細胞，細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清，2ng/ml bFGF，90μg/ml肝素，1％抗生素)，溫度為37℃，CO2濃度為5％，培養(yǎng)24h后，將不同濃度的GST-VAS，人血管抑素和GST加入相應(yīng)的孔中，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，胰酶消化后，重懸細胞并計數(shù)。每個實驗，每個樣品均重復(fù)三次。
5.雞胚尿囊膜血管生成抑制實驗為了確認人血管抑素在活體內(nèi)的對新血管生成的抑制作用，我們進行了雞胚尿囊膜血管生成抑制實驗。實驗選用的是孵化八天的非免雞胚。具體做法如下首先用小鉆子在雞胚的氣室上鑿一小洞，然后用小鑷子將氣室上方的部分蛋殼去除，進而剝?nèi)饽夷?，然后將帶有不同劑量人血管抑素的濾膜覆于尿囊膜的血管密集處，用封口膜封閉氣室。將雞胚置于37.5℃和相對濕度為80-90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時后，用甲醇和丙酮(1∶1)的溶液固定濾膜覆蓋處尿囊膜，15分鐘后，用小剪刀剪下固定部位，用PBS洗滌，而后在解剖鏡下觀察并用數(shù)碼相機拍照，無血管區(qū)域內(nèi)徑大于或者等于8mm的處理確定為陽性。
實施例2重組His-人血管抑素基因的克隆、表達、分離純化和性質(zhì)鑒定1.重組His-VAS原核表達載體pET28-VAS的構(gòu)建以實施例1中構(gòu)建的pALEX-VAS為模板，用PCR反應(yīng)擴增VAS編碼序列，所用的正向引物為5’CGGGATCCGACGACGACGACAAGATGACTGACATGCACGGTGAC-3’，反向引物為5’-CCCTCGAGTCATTAGTTGTCTGGACGAATCAG-3’。在正向引物中有一個BamH I的酶切位點(黑體)以及編碼腸激酶識別位點DDDDK的序列(下劃線部分)，反向引物中有一個Xho I的酶切位點(黑體)。PCR反應(yīng)的條件為94℃熱變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸30秒，共進行25個循環(huán)。純化的PCR產(chǎn)物采用BamH I和Xho I進行雙酶切，然后插入pET28a的多克隆位點。pET28a是一個T7系列的N端融合有6個組氨酸組成的His-tag的原核表達載體。對重組表達載體pET28-VAS進行DNA測序，分析其閱讀框和編碼序列的正確性。
2.融合蛋白His-VAS的表達分別將His-VAS融合蛋白表達載體pET28-VAS和對照載體pET28a轉(zhuǎn)入表達宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中，和分子伴侶一起在低溫下共表達，表達條件見中國發(fā)明專利申請200410065733.X《一種在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性重組蛋白質(zhì)的方法及其應(yīng)用》。
3.重組His-VAS蛋白的純化收集1升發(fā)酵液的細胞，并用40ml冰浴的緩沖液A(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.4)重新懸浮，超聲裂解細胞，離心取上清，硫酸銨鹽析至50％飽和度，離心收集沉淀，用緩沖液B(50mM Na3PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH7.4)溶解沉淀的蛋白，進行緩沖液B預(yù)平衡的Ni2+親和柱層析，上樣完畢后用緩沖液B充分洗滌至基線，而后用緩沖液C(50mM Na3PO4，300mM NaCl，50mM咪唑，pH7.4)洗滌雜蛋白，最后用緩沖液D(50mM Na3PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH7.4)洗脫目的蛋白。
4.重組VAS蛋白的純化對于完整的61個氨基酸的VAS的純化，將上述目的蛋白洗脫液進行G25凝膠過濾層析去除咪唑并換成Tris緩沖液(20mMTris-HCl，200mM NaCl，pH8.0)，按照腸激酶His-VAS等于1∶250的比例加入本室純化的His-EK，混勻后16℃孵育10小時，最后再經(jīng)過Ni2+親和柱，收集穿過峰。
用MicroBCA試劑盒和SDS-PAGE凝膠灰度掃描的方法確定His-VAS和VAS的產(chǎn)率，并用western blotting的方法驗證二者的分子屬性。一抗使用的是羊抗人calreticulin多抗(1∶300稀釋)，二抗使用的是過氧化物酶交聯(lián)的兔抗羊IgG多抗(1∶1000稀釋)。
5.血管內(nèi)皮細胞增值抑制試驗將3-5代的HUVEC接種到明膠包被的24孔板中，每個孔約1×104細胞，細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清，2ng/ml bFGF，90μg/ml肝素，1％抗生素)，溫度為37℃，CO2濃度為5％，培養(yǎng)24小時后，將不同濃度的His-VAS，VAS和PBS加入相應(yīng)的孔中，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，胰蛋白酶消化后，將細胞重新懸浮并計數(shù)。每個樣品處理重復(fù)三次。
6.雞胚尿囊膜血管生成抑制試驗為了確認VAS在活體內(nèi)的對新血管生成的抑制作用，我們做了雞胚尿囊膜血管生成抑制試驗。試驗選用的是孵化八天的非免雞胚。具體做法如下首先用小鉆子在雞胚的氣室上鑿一小洞，然后用小鑷子將氣室上方的部分蛋殼去除，進而剝?nèi)饽夷?，然后將帶有不同劑量VAS的濾膜覆于尿囊膜的血管密集處，用封口膜封閉氣室。將雞胚置于37.5℃和相對濕度為80-90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時后，用甲醇和丙酮(1∶1)的溶液固定濾膜覆蓋處尿囊膜，15分鐘后，用小剪刀剪下固定部位，用PBS洗滌，而后在解剖鏡下觀察并用數(shù)碼相機拍照，無血管區(qū)域內(nèi)徑大于或者等于8mm的處理確定為陽性。
7.小鼠黑色素瘤模型體內(nèi)抗腫瘤活性測定將培養(yǎng)的黑色素瘤細胞B16F10用胰酶消化、吹勻，加血清中止消化，而后離心，PBS洗滌細胞，調(diào)整至濃度為1×107細胞/ml，在6-7周齡C57/BL6雌性小鼠右側(cè)皮下接種5×105細胞，當腫瘤達到100mm3-400mm3(細胞接種后約8天左右)，小鼠隨機分成5組(11只/組)。
第一組注射滅菌PBS作為陰性對照；第二至第四組依次給不同劑量的VAS(VAS1的劑量為2mg/kg/天，VAS3為8mg/kg/天)，PBS和VAS給藥方式為皮下，每只小鼠100μl；第五組設(shè)置環(huán)磷酰氨作為陽性對照，CTX的用量和用法為30mg/kg/2天，腹腔注射，每只鼠200μl，共計給藥十五次。
使用游標卡尺測量腫瘤，每兩天測量一次，分別在腫瘤的垂直方向測量腫瘤的長和寬，腫瘤體積計算采用以下公式長×寬2×0.52，抑瘤率＝(對照腫瘤體積-處理體積)/對照腫瘤體積×100％。
在實施例1中，重組GST-VAS經(jīng)谷胱甘肽-Sepharose 4B親和層析、腸激酶降解、Sephadex G-50凝膠過濾得以分離純化，純化后的重組人血管抑素在SDS-PAGE上的分子量約為7.0kDa，產(chǎn)量為7.2mg/升培養(yǎng)基，純化后的GST-VAS和人血管抑素也為western blotting所證實。重組GST-VAS和人血管抑素都可以抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，并且呈劑量依賴關(guān)系(見附圖)，其ED50＝60nM，高達300nM的人血管抑素對于其它細胞(如NIH3T3等)的細胞增殖沒有抑制活性。重組人血管抑素具有明顯的抑制雞胚尿囊膜新生血管生成活性和明顯的血管抑制作用，在0.5-10μg/雞胚范圍內(nèi)，重組人血管抑素呈劑量依賴性地抑制雞胚尿囊膜新生血管生成。
在實施例2中，重組His-VAS通過硫酸銨沉淀、Ni2+親和層析、G25凝膠分子篩、His-EK酶切以及第二次Ni2+親和層析，我們方便地得到了野生型的VAS蛋白。硫酸銨沉淀去除了核酸和部分雜蛋白、Ni2+親和層析去除了絕大部分菌體雜蛋白、經(jīng)過SephadexG25凝膠分子篩去除咪唑、用His-腸激酶酶切后，不帶任何冗余氨基酸的VAS與His標簽分離開，最后第二次Ni2+親和層析去除了His-tag和His-EK，我們從1升發(fā)酵液中得到了約21mg純度高的野生型VAS，用該工藝生產(chǎn)的VAS產(chǎn)量顯著高于實施例2中使用的GST-VAS的生產(chǎn)方法。
His-VAS和VAS對bFGF刺激的HUVEC增殖都表現(xiàn)出很好的抑制作用，而且呈明顯的劑量依賴性，達到最大抑制效率一半的劑量(ED50)為60nM。300nM的高劑量VAS對NIH3T3細胞的增殖并沒有什么影響，顯示出該分子對血管內(nèi)皮細胞作用的特異性。在雞胚尿囊膜血管生成抑制試驗中，劑量范圍在0.5-10μg/雞胚之間的VAS蛋白對雞胚尿囊膜新血管的生成抑制呈劑量依賴性。實驗中未觀察到VAS的任何毒性作用。
腫瘤動物實驗結(jié)果顯示治療16天后，當VAS劑量為2mg/kg/天時，抑瘤率為50％；當VAS劑量為8mg/kg/天時，抑瘤率為69％；而陽性對照CTX(30mg/kg/2天)的抑瘤率為58％。重組VAS顯示出良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。
權(quán)利要求
1.一種在大腸桿菌中生產(chǎn)有生物活性的重組血管抑素蛋白質(zhì)的方法，其特征是將重組血管抑素表達菌株在低溫下和分子伴侶共表達。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在大腸桿菌中生產(chǎn)有生物活性的重組血管抑素蛋白質(zhì)的方法，其特征是將血管抑素基因克隆在GST融合表達載體中，融合表達GST-血管抑素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)有生物活性的重組血管抑素蛋白質(zhì)的方法，其特征是重組GST-血管抑素融合蛋白質(zhì)可以在35℃-10℃的溫度中和一組分子伴侶或者分子伴侶樣的蛋白質(zhì)一起共表達。
4.一種分離純化可溶性重組血管抑素的方法，其特征是將以可溶性的GST-血管抑素融合蛋白質(zhì)吸附在谷胱甘肽-Sepharose 4B親和層析上，經(jīng)腸激酶降解、Sephadex G-50凝膠過濾分離純化獲得人血管抑素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述方法生產(chǎn)的重組人血管抑素在制備治療腫瘤和血管生成相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在大腸桿菌中生產(chǎn)有生物活性的重組血管抑素蛋白質(zhì)的方法，其特征是將血管抑素基因克隆在His-tag融合表達載體中，融合表達組氨酸標簽的重組血管抑素。
7.根據(jù)權(quán)力要求6所述方法，其特征是重組His-tag-血管抑素融合蛋白質(zhì)可以在35℃-10℃的溫度中和一組分子伴侶或者分子伴侶樣的蛋白質(zhì)一起共表達。
8.一種分離純化可溶性重組血管抑素的方法，其特征是將可溶性的His-血管抑素融合蛋白質(zhì)進行硫酸銨沉淀、Ni2+親和層析、G25凝膠分子篩、His-EK酶切以及第二次Ni2+親和層析，分離純化獲得血管抑素。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或8所述方法生產(chǎn)的重組人血管抑素在制備治療腫瘤和血管生成相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性的、有生物活性的重組人血管抑素的工藝和分離純化方法。利用本發(fā)明表達和純化的重組人血管抑素能夠特異性、劑量依賴性地抑制內(nèi)皮細胞的增殖，在雞胚尿囊絨膜動物實驗中具有抑制新生血管生成的作用，在腫瘤動物模型體內(nèi)具有明顯的腫瘤抑制活性。本發(fā)明適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。
文檔編號C12N15/70GK1648247SQ20051003812
公開日2005年8月3日 申請日期2005年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月18日
發(fā)明者華子春, 孫啟明 申請人:南京大學(xué)