專利名稱：一種抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵法制酶制劑中蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵法制酶制劑中蛋白酶的方法，屬于酶制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase EC 2.3.2.13)，全稱R-glutaminyl-peptideaminee γ-glutamyltransferase，簡稱TG，是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶。它可以催化大多數(shù)蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基上的γ-羧酰胺基和賴氨酸殘基上的γ-氨基之間形成ε-(γ-谷胺酰基)賴氨酸共價鍵。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可以催化大多數(shù)的食品蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)和氨基酸之間連接，以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺酰胺基的水解，很大程度上改善各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，被譽為“21世紀(jì)超級粘合劑”。因此廣泛被應(yīng)用于肉制品、乳制品、小麥制品、豆制品及可食膜的制備中。在日本，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶已成為食品工業(yè)的第二大酶種，其用量僅次于α-淀粉酶。此外谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶還應(yīng)用于化妝品工業(yè)、制藥工業(yè)及紡織工業(yè)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
目前報道的生產(chǎn)TG的方法主要有從動植物組織中提取和從微生物發(fā)酵法生產(chǎn)兩種。源于動植物的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶來源稀少，提取工藝復(fù)雜，因此這種酶的售價較高，很難用于工業(yè)應(yīng)用。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)可以大幅度降低其生產(chǎn)成本，故而是拓寬谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶應(yīng)用范圍的根本途徑。MTG是一種胞外酶，分泌在發(fā)酵液中。在發(fā)酵過程中，菌體從基質(zhì)菌絲轉(zhuǎn)化為氣生菌絲及孢子形成時，需分泌出核酸酶和蛋白酶降解核酸和蛋白質(zhì)來支持氣生菌絲的生長。此外，相關(guān)研究表明降解酶可能在鏈霉菌的形態(tài)改變中起關(guān)鍵作用，同時MTG酶原產(chǎn)出后菌體需要分泌金屬蛋白酶TAMEP切割酶原N端的41個氨基酸而使酶原具有活性，繼而再分泌絲氨酸氨基肽酶SM-TAP切去4肽使其成為成熟的MTG，因此，MTG發(fā)酵中不可避免的存在蛋白酶。蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解作用與MTG的交聯(lián)作用正好是兩個相互矛盾的過程，在MTG產(chǎn)品的制備或應(yīng)用過程中必須對蛋白酶進行抑制才可以避免蛋白酶對MTG作用的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在MTG產(chǎn)品的制備或應(yīng)用過程中對其中的蛋白酶進行抑制的方法，從而避免蛋白酶對MTG的作用產(chǎn)生不利的影響。
本發(fā)明的技術(shù)方案谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中所含有的蛋白酶為金屬離子依賴型蛋白酶，本發(fā)明采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液，在酶制劑的制備過程中或酶制劑的應(yīng)用過程中，以添加金屬離子鰲合劑的方式來抑制蛋白酶的活性，避免蛋白酶的水解作用，使MTG的交聯(lián)作用不受其影響。具體操作工序為將MTG發(fā)酵液的濃縮酶液，添加輔料及保護劑的同時添加金屬離子鰲合劑六偏磷酸鈉或乙二胺四乙酸鈉(EDTA)，添加量為0.002-0.01mmol螯合劑/U蛋白酶，經(jīng)干燥、成品包裝而制得MTG酶活為50-100U/g，蛋白酶活幾乎全部被抑制的固體MTG產(chǎn)品；或者在應(yīng)用MTG的時候同時添加金屬離子鰲合劑六偏磷酸鈉或EDTA。所添加的金屬離子鰲合劑根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域不同進行選擇，紡織工業(yè)應(yīng)用選擇EDTA，食品、醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域應(yīng)用選擇六偏磷酸鈉。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用六偏磷酸鈉或EDTA對金屬離子的鰲合作用抑制MTG酶制劑中蛋白酶的活力，避免蛋白酶對MTG的交聯(lián)作用產(chǎn)生不利的影響。本發(fā)明的關(guān)鍵點是采用添加鰲合劑對MTG應(yīng)用中的蛋白酶活進行抑制，方法簡單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，避免了必須的分離純化工作帶來的MTG酶活損失。
具體實施例方式
實施例1發(fā)酵得到的MTG固體酶制劑產(chǎn)品1，MTG酶活為80U/g，蛋白酶酶活為3000U/g。以酪蛋白為底物進行應(yīng)用性實驗，酶液中添加8mmol六偏磷酸鈉/g酶粉(0.0027mmol六偏磷酸鈉/U蛋白酶)，其中的蛋白酶被全部抑制，MTG酶活不受影響，并且電泳實驗證實形成了交聯(lián)蛋白。
實施例2發(fā)酵得到的MTG固體酶制劑2，MTG酶活為40U/g，蛋白酶酶活為80U/g。以酪蛋白為底物進行應(yīng)用性實驗，酶液中添加0.8mmol六偏磷酸鈉/g酶粉(0.01mmol六偏磷酸鈉/U蛋白酶)，其中的蛋白酶被全部抑制，MTG酶活不受影響，電泳實驗證實形成了交聯(lián)蛋白，并且形成了可倒置的強度較大的凝膠。
實施例3發(fā)酵得到的MTG發(fā)酵液，在提取的過程中，在超濾或干燥前添加六偏磷酸鈉，超濾前添加金屬離子螯合劑，使發(fā)酵液中的金屬離子被螯合，通過超濾過程被除去；或干燥前添加金屬離子螯合劑，使酶制劑中的金屬離子被螯合。添加量為0.002-0.01mmol螯合劑/U蛋白酶，制得的固體酶制劑中蛋白酶的活性全部被抑制，同時MTG的收率不受影響。以酪蛋白為底物進行應(yīng)用性實驗，電泳實驗證實形成了交聯(lián)蛋白，并且很快形成了可倒置的強度較大的凝膠。
實施例4操作過程同實施例3，金屬離子螯合劑改用EDTA。
對比實施例1發(fā)酵得到的MTG固體酶制劑產(chǎn)品1，MTG酶活為80U/g，蛋白酶酶活為3000U/g。在以酪蛋白為底物的應(yīng)用實驗中，始終沒有形成可以倒置的凝膠，電泳實驗證實也沒有形成交聯(lián)蛋白。說明蛋白酶的水解作用遠(yuǎn)超過MTG作用，無法實現(xiàn)MTG對蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)。
對比實施例2發(fā)酵得到的MTG固體酶制劑2，MTG酶活為40U/g，蛋白酶酶活為80U/g。在以酪蛋白為底物的應(yīng)用實驗中，初期形成了強度很弱但仍無法倒置的凝膠，電泳實驗證實形成了交聯(lián)蛋白，但是隨著時間的延長，形成的凝膠逐漸被蛋白酶水解。說明蛋白酶的作用影響了MTG的交聯(lián)反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵法制酶制劑中蛋白酶的方法，其特征是采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液制備酶制劑，在酶制劑的制備過程中或應(yīng)用過程中添加金屬離子鰲合劑抑制其中蛋白酶活性，添加量為0.002-0.01mmol螯合劑/U蛋白酶，螯合劑為六偏磷酸鈉或乙二胺四乙酸鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵法制酶制劑中蛋白酶的方法，其特征是在酶制劑的制備過程中添加鰲合劑在超濾前添加金屬離子螯合劑，使發(fā)酵液中的金屬離子被螯合，通過超濾過程被除去；或干燥前添加金屬離子螯合劑，使酶制劑中的金屬離子被螯合。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵法制酶制劑中蛋白酶的方法，其特征是所添加的金屬離子鰲合劑根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域不同進行選擇，紡織工業(yè)應(yīng)用選擇乙二胺四乙酸鈉，食品、醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域應(yīng)用選擇六偏磷酸鈉。
全文摘要
一種抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵法制酶制劑中蛋白酶的方法，屬于酶制劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液制備酶制劑，在酶制劑的制備過程中或應(yīng)用過程中通過添加金屬離子鰲合劑抑制其中的蛋白酶活性，避免蛋白酶的水解作用對谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的交聯(lián)作用產(chǎn)生不利的影響。本發(fā)明方法操作簡便、高效，省去了分離純化等工序帶來的繁瑣，極易在工業(yè)生產(chǎn)中運用。
文檔編號C12N9/99GK1724658SQ200510040489
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月8日
發(fā)明者陳堅, 劉和, 崔莉, 張東旭, 堵國成 申請人:江南大學(xué)