專利名稱：中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物抗病基因克隆及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及中國葡萄屬野生種芪合成酶基因全長序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(Resveratrol)，化學(xué)名為3，4’，5-三羥基芪(3，4’，5-Trihydrolystilbene)，是植物體內(nèi)一種天然的二苯乙烯類多酚物質(zhì)。1924年就被發(fā)現(xiàn)，1974年在葡萄屬植物中找到了該物質(zhì)。目前已知白藜蘆醇還存在于桑樹、花生、買麻藤、朝鮮槐等12種31個屬的72種植物中，就其含量而言葡萄屬植物位居第一。在葡萄屬植物中，中國野生葡萄部分種白藜蘆醇的含量較高，如毛葡萄(Vitis quinquangularis)商-24、83-4-96和華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)白河-35-1等。白藜蘆醇作為葡萄屬植物的抗逆性物質(zhì)——一種植保素(phytoalexin)具有抗病菌的作用。Kreps研究發(fā)現(xiàn)Seyve Villard、Portugalske Modre、雷司令和米勒吐爾高等品種的葉片接種灰霉病病原菌(Botrytis cinerea)后，品種的抗病性與白藜蘆醇的含量成正相關(guān)。Fregoni研究發(fā)現(xiàn)植物白藜蘆醇含量高者對灰霉病的抗性強。在葡萄受到灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染后，距離壞死果實較近且沒有受到侵染果實中的白藜蘆醇含量很高，它對灰色葡萄孢、金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等均有明顯抑制作用。Giesbrech等從哥倫比亞買麻藤(Gnetunpariculatium)中提取的白藜蘆醇具有抗金黃色葡萄球菌(Slaphylococucsaureus)、表皮葡萄球菌(Sepidermidis)和恥垢分枝桿菌(Mycobacteriam Smegmtics)的作用。此外，白藜蘆醇還有抗氧化、預(yù)防心血管病和防癌、降血脂等作用。
芪合成酶(Stilbene synthase)是白藜蘆醇生物合成過程中起關(guān)鍵作用的酶。Schoppner和kindl(J.Biol.Chem.，1924)研究發(fā)現(xiàn)，芪合成酶能把1分子香豆酰輔酶A(P-Coumaroyl-CoA)和3分子丙二酰輔酶A(Malonyl-CoA)轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。Melchior等(FEBS Letters，1990)研究發(fā)現(xiàn)芪合成酶基因在植物中以基因家族存在，已從松樹、花生、河岸葡萄(Vitis riparia)、歐洲葡萄(Vitis vinifera)等植物中分離了芪合成酶基因。
1992年美國波斯頓Dena-Farber癌癥研究所的兩位科學(xué)家P.Liang和A.D Pardee建立的mRNA差異顯示技術(shù)(mRNA differential display reversetranscription-PCR，DDRT-PCR)(Science，1992)，由于該技術(shù)具有RNA用量少、靈敏度高，操作簡便快速和可分析低豐度mRNA等特點，因而在探討抗病機制及克隆新基因等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶基因序列及其編碼的芪合成酶活性蛋白應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首次采用mRNA差異顯示技術(shù)進行中國葡萄屬野生種抗白粉病(Uncinula necator schw.Burr.)基因克隆，獲得了白粉病抗性基因-芪合成酶基因cDNA片段T11AC/B0320-723的核苷酸序列。以該核苷酸序列為基礎(chǔ)，采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid amplification ofcDNA ends，RACE)(Frohman et al，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)獲得了芪合成酶基因家族成員7個cDNA全長核苷酸序列。
本發(fā)明首次通過基因聚合技術(shù)將中國葡萄屬野生種特有的VPSTS7、VPSTS6、VPSTS5、VPSTS4、VPSTS3、VPSTS2、VPSTS1等7個芪合成酶基因轉(zhuǎn)入感病的歐洲葡萄品種、小麥、番茄、水稻、玉米、大豆、油菜等植物提高抗病性，提高這些植物功能性成分白藜蘆醇的含量，人們?nèi)∈尺@些植物食品時，能達到預(yù)防心血管病和防癌、降血酯等目的，也為進一步研究中國葡萄野生種芪合成酶基因表達機理提供分子依據(jù)。


圖1是5’RACE與3’RACE的圖片；圖2是3’RACE cDNA片斷酶切鑒定結(jié)果圖片；圖3是中國葡萄屬野生種華東葡萄(vitis pseudoreticulata)STS1基因全長序列；圖4是中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS2基因全長序列；圖5是中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS3基因全長序列；圖6中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS4基因全長序列；圖7是中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS5基因全長序列圖8是中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS6基因全長序列；圖9是中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS7基因全長序列；圖10中國葡萄屬野生種芪合成酶基因核苷酸聚類分析圖片；圖11中國葡萄屬野生種芪合成酶基因擴增結(jié)果圖片，其中符號為1.PCR產(chǎn)物，M.DNA Marker DGL 2000；圖12.重組表達載體的雙酶切鑒定圖片，圖中符號為1、2重組表達載體；3、4.BamHI/XhoI雙酶切過的重組表達載體；M.Marker；圖13融合蛋白的表達與純化圖片，圖中符號為1.誘導(dǎo)轉(zhuǎn)空pGEX-4T-1菌體總蛋白；2.誘導(dǎo)重組菌體總蛋白；3.誘導(dǎo)重組菌體裂解液上清蛋白；4.誘導(dǎo)重組菌體裂解液沉淀蛋白；5.洗滌過的包涵體；6、7.復(fù)性并純化的融合蛋白；圖14是中間表達載體的構(gòu)建圖；圖15是芪合成酶基因植物表達載體的構(gòu)建圖。
圖16是OLYMPUS DP70熒光顯微鏡(藍色濾光片)下觀察結(jié)果，A轉(zhuǎn)化芪合成酶基因(STS)葡萄；B未轉(zhuǎn)化小麥；C轉(zhuǎn)化芪合成酶基因(STS)小麥。
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述。
具體實施例方式
本發(fā)明獲得的中國葡萄屬野生種華東葡萄芪合成酶基因序列具體操作步驟如下A.采用改進的SDS/酚法(果樹學(xué)報，張今今等，2003，20(3)178-181)于接種當天，即第0天，及接種后1、3、5、7、9d采樣提取中國葡萄屬野生種華東葡萄白河-35-1葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板，用dT11GG、dT11AG、dT11AC、dT11CC、dT11CG等5個錨定引物與Operon公司生產(chǎn)的S421～S440及B0301～B0326共46個隨機引物組成了引物對(primer pairs)230個，進行了PCR擴增。經(jīng)6％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析DDRT-PCR產(chǎn)物、銀染后，錨定引物5’TTTTTTTTTTTAC 3’(dT11AC)與隨機引物5’CATCAATCGC 3’組成的引物對PCR擴增獲得了中國葡萄野生種抗白粉病基因表達差異的cDNA片段T11AC/B0320-700，該片段在未接種的材料中沒有表達，而在接種葡萄白粉病病原菌后表達；B.用煮沸法(分子克隆實驗指南第二版，J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1998)回收該差異cDNA片段，二次PCR擴增后，回收該差異cDNA片段并與pGEM-T easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有Amp(100μg·ml-1)和X-gal/IPTG的LB平板上培養(yǎng)，藍白斑篩選鑒定挑選白色菌落培養(yǎng)。用UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒回收質(zhì)粒，用EcoR I酶切鑒定有外源DNA片段插入的陽性克隆。將陽性克隆送大連寶生生物公司測序，測序結(jié)果表明，差異cDNA片段T11AC/B0320-700核苷酸序列全長723bp；C.以接種葡萄白粉病病原菌7d提取的中國葡萄屬野生種華東葡萄白河-35-1葉片總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄分別合成5’RACE與3’RACE cDNA第一鏈。用5’RACE引物GSP15’TTCGGAAGGTCCTCGGAATGTAACAGC 3’與3’RACE引物GSP25’CAGGTGGAACTGTCCTTCGAACCGC 3’分別進行了5’RACE與3’RACE PCR擴增。將5’RACE PCR產(chǎn)物7.0μl進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳獲得一條大小約750bp(圖1)，克隆測序后該cDNA片段實際大小為768bp。
取3’RACE PCR產(chǎn)物7.0μl進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，獲得了大小介于900～1000bp的5個cDNA片段(圖1)。用DNA膠回收試劑盒將這5條cDNA片段分別回收、克隆，獲得大量白斑重組子，每個cDNA片段克隆產(chǎn)物隨機挑選5個白斑克隆進行酶切鑒定，5’-1的5個酶切產(chǎn)物產(chǎn)生了大不一致的1條片段，5’-2的5個酶切產(chǎn)物產(chǎn)生了大小不同的3條片段，5’-3、5’-4與5’-5的5個分別產(chǎn)生了大小不同的2條酶切片段，共產(chǎn)生了大小不同的cDNA片段10個(圖2)。將產(chǎn)生這10個cDNA的重組克隆測序，序列大小分別為983bp、933bp、919bp、895bp、839bp、770bp、715bp、491bp、476bp、351bp；D.由于所獲得的5’RACE與3’RACE的cDNA片段有113bp的重疊，因此，將3’RACE獲得的10個cDNA片段分別與5’RACE的1個cDNA片段拼接，除去重疊序列后得到10個cDNA序列，其大小分別為924bp、1049bp 1064bp、1288bp(圖3)、1343bp(圖4)、1411bp(圖5)、1468bp(圖6)、1492bp(圖7)、1506bp(圖8)與1556bp(圖9)。
E.將這10個cDNA序列聯(lián)網(wǎng)到www.ncbi.nlm.nih.gov進行開放閱讀框架分析，其中cDNA片段1556bp、1506bp、1492bp、1468bp、1411bp、1343bp與1288bp具有完整的開放閱讀框架，均編碼392個氨基酸，分別命名為VPSTS7、VPSTS6、VPSTS5、VPSTS4、VPSTS3、VPSTS2、VPSTS1；cDNA片段1064bp、1049bp與924bp具有不完整開放閱讀框架。這樣，我們就獲得了中國葡萄屬野生種芪合成酶基因家族成員7個cDNA全長序列。這7個基因核苷酸序列同源性較高，介于90％-100％之間(圖10)。
經(jīng)在GenBank上檢索，它們與Vitis riparia芪合成酶基因(登錄號為AB046373，全長1618bp)、Vitis labrusca芪合成酶基因(登錄號為AB046374，全長1618bp)、Parthenocissus henryana芪合成酶基因(登錄號為AY094615，全長1179bp)、Cissus rhombifolia芪合成酶基因(登錄號為AY094616，全長1179bp)、Parthenocissus quinquefolia芪合成酶基因(登錄號為AY094617，全長1179bp)的同源性約為94％，證明為新的中國葡萄屬野生種特有的芪合成酶基因。
本發(fā)明的實施例1采用改進SDS/酚法(果樹學(xué)報，2003，20(3)178-181)，提取經(jīng)白粉病病原菌誘導(dǎo)后的中國野生葡萄華東葡萄白河-35-1葉片總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)已獲得的中國葡萄屬野生種芪合成酶基因核苷酸序列設(shè)計一對PCR 引物5‘TAGGATCCATGGCTTCAGTTGAGGAAAT 3’與5‘GCCTCGAGTTAATTTGTAACCATAGG 3’。在25μl反應(yīng)混合液中包含cDNA第一鏈2.5μl、GSP1(10μm)1μl、GSP2(10μm)1μl、1.0μl dNTPs Mix(10mM)、1.0μl Taq DNA polymerase、PCR Buffer 2.5μl、PCR-Grade water34.5μl，混勻后上浮25μl礦物油。PCR擴增程序為94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 2min，35個循環(huán)；72℃ 10min。反應(yīng)結(jié)束后，進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳回收該cDNA片斷(圖11)，并與pGEM-T easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有Amp(100μg·ml-1)和X-gal/IPTG的LB平板上培養(yǎng)，藍白斑篩選挑選白色菌落培養(yǎng)。用UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒回收質(zhì)粒，用EcoR I酶切鑒定有外源DNA片段插入的陽性克隆。測序后該cDNA片段實際大小為1179bp，序列分析表明該cDNA片段為中國葡萄屬野生種芪合成酶基因。
本發(fā)明的實施例2將實施例1獲得的重組克隆載體雙酶切后切下的目的片段與經(jīng)同樣雙酶切過的原核表達載體pGEX-4T-1進行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌BL21細胞，提取質(zhì)粒，BamHI/XhoI酶切鑒定，篩選陽性重組菌(圖12)。重組菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達，離心，重懸于上樣緩沖液(50mM Tris-HCl pH6.8，2％SDS，0.1％溴酚蘭，10％甘油，100mM DTT)，沸水中煮3-5分鐘，進行SDS-PAGE電泳。同時設(shè)定IPTG濃度梯度(0.1mm，0.2mM，0.3mM，0.4mM)及時間對照(1h，2h，3h，4h，5h，6h)，確定最佳表達條件為IPTG 0.3mM，30℃誘導(dǎo)5小時。
重組原核表達載體轉(zhuǎn)化表達菌，37℃下0.3mM IPTG誘導(dǎo)5小時，經(jīng)上樣處理，進行SDS-PAGE電泳檢測，與經(jīng)同樣誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的菌樣品總蛋白對比，重組表達菌在分子量65KD左右有一條特異表達帶，證明目的基因在該表達系統(tǒng)獲得了表達，經(jīng)灰度掃描分析，目的蛋白表達量占菌體總蛋白21％(圖13)。目的蛋白主要以包涵體形式表達，經(jīng)過表達條件優(yōu)化后仍不能改善目的蛋白可溶性，因此通過包涵體變性溶解，梯度復(fù)性，使目的蛋白能夠與GST融合蛋白純化介質(zhì)結(jié)合、洗脫，從而使目的融合蛋白獲得純化(圖13)。
本發(fā)明的實施例3將實施例1獲得的重組克隆載體用BamHI/SacI切下1.1kb的STS基因片段，并定向插入經(jīng)BamHI/SacI雙酶切的中間表達載體(圖14)上，構(gòu)建植物表達載體(圖15)。將構(gòu)建好的植物表達載體經(jīng)改進凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，在附加卡那霉素和慶大霉素的YEB培養(yǎng)基上篩選，挑取抗性克隆，提取質(zhì)粒DNA進行PCR鑒定，特異的擴增出1.1kb的條帶，表明已成功構(gòu)建了芪合成酶基因植物表達載體，并導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101。
從YEB平板上挑取GV3101單菌落(攜帶目的基因的雙元載體pWR-STS)，接種到20mlYEB液體培養(yǎng)基(附加Kan 60ug/ml，Gent 20ug/ml)，200rpm，28℃24h(OD600＝0.6)；取15ml菌液，4℃，5000rpm，5min收集沉淀，并用MS液體培養(yǎng)基(附加1mg/l BAP，0.1mg/l 2，4-D)重懸沉淀，并用上述培養(yǎng)基稀釋至OD600＝0.6，加入AS，終濃度為20mg/l；從無菌試管苗取葉片，切成40mm2的葉盤，將其浸入事先準備好的農(nóng)桿菌菌液中培養(yǎng)10min；取出葉盤置于無菌濾紙上，去除濾紙表面多余的農(nóng)桿菌菌液；將上述葉盤轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基(附加1mg/l BAP，0.1mg/l 2，4-D和1％PVPP)共培養(yǎng)3d(暗培養(yǎng))；將共培養(yǎng)3d后的葉盤轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基MS(固)+1mg/l BAP+0.1mg/l 2，4-D+1％PVPP+15ug/ml Hyg B+400ug/lCef；兩個月后進行GUS活性分析，取在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個月的愈傷組織進行GUS組織化學(xué)染色；同時可進行綠色熒光蛋白檢測(圖16)；生根培養(yǎng)基NN69+1mg/l BAP+0.1mg/l IBA，4℃暗培養(yǎng)2周，然后25℃，16h光培養(yǎng)，8h暗培養(yǎng)，最后獲得芪合成酶基因表達的轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因葡萄新材料和新品種。
本發(fā)明的實施例4
將實施例3獲得的芪合成酶基因植物表達載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，采用根癌農(nóng)桿菌法將芪合成酶基因成功導(dǎo)入番茄、大豆、油菜等優(yōu)良品種，獲得芪合成酶基因表達的轉(zhuǎn)基因番茄、大豆、油菜等新種質(zhì)和新材料(方法同實例3)。
采用基因槍法將芪合成酶基因?qū)胗衩?、小麥、水稻等?yōu)良品種。材料的預(yù)處理在基因槍轟擊前先將小麥外植體轉(zhuǎn)入含滲透劑0.125M甘露醇和0.125M山梨糖醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將產(chǎn)生的淡黃色新鮮愈傷組織在轉(zhuǎn)化前4~6h進行滲透處理，轟擊材料集中置于培養(yǎng)皿(直徑9cm)中心不大于3cm的范圍內(nèi)，25℃，暗培養(yǎng)。用70％乙醇對槍室和氣體加速管消毒滅菌；將飛盤和可裂圓片在100％乙醇中浸泡5min消毒，然后在超凈臺中吹干；分別移取5ul金粉微粒懸浮液于每個飛盤(已安莊在固定環(huán)上)，在超凈臺中吹干(5min)。從A管(對照)中移取金粉微粒懸浮液，用于準備兩個飛盤(供轟擊平板1和2之用)，每個飛盤5ul；從B管中移取金粉微粒懸浮液各準備三個飛盤(分別用于轟擊平板3～5)，每個飛盤5ul。一次可從每管金粉微粒懸浮液中取樣準備5個飛盤，視試驗設(shè)計而定；打開氦氣瓶閥，調(diào)節(jié)壓力調(diào)節(jié)器(在氦氣瓶閥的另一端)，使發(fā)射壓力達到1300psi(即高于可裂圓片承壓值200～300psi)。
開動真空泵；將可裂圓片放在固定蓋內(nèi)，旋緊；將飛盤裝好(帶有微粒的一面朝下)，然后將它們放入槍室內(nèi)(從上往下數(shù)第二層)；將含小麥愈傷組織的培養(yǎng)皿放在樣品支架上，插入槍室內(nèi)第五層，關(guān)上槍室門；打開真空閥，當真空度達到25～28英寸汞柱(inches of Hg)時，按下“Fire”按鈕并保持此狀態(tài)，直至聽見氣體破碎可裂圓片的聲音為止；消除真空態(tài)，將樣品取出；從步驟6開始重復(fù)操作，完成所有樣品的處理；將用未包被DNA的金粉微粒轟擊過的細胞(平板1和2)在非選擇性培養(yǎng)基上23℃下暗黑培養(yǎng)48小時；將用包被pWR-STS質(zhì)粒DNA的金粉微粒轟擊過的細胞(平板3、4和5)在23℃下暗培養(yǎng)24小時；將轟擊后的愈傷組織繼續(xù)在滲透培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，然后轉(zhuǎn)到原培養(yǎng)基中過渡培養(yǎng)2周獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株(圖16)。使這些不含白藜蘆醇的植物也具有合成白藜蘆醇的能力，提高他們對真菌病害的抗病性，同時也提高這些物種的營養(yǎng)保健功能，使人們通過吃這些事物，可以防止血小板凝聚、清除自由基、抗過敏、抗腫瘤等。此外，這些轉(zhuǎn)基因材料也可以作為進一步通過雜交育種選育抗病和提高這些物種營養(yǎng)保健功能的種質(zhì)。
基因序列中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS1基因全長序列1 AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC TGAGAATAAT GCAGGAGCAC GGGTTCTCGT GGTGTGCTCT GAGATCACCG661 TTGTTACATT CTGTGGGCCT TCTGAAACTG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG TTCTGCAGCT GTAATTGTTG GATCAGATCC AGATCTCTCG ATTGAACAAC781 CACTCTTCCA GCTAGTCTCG GCAGCCCAAA CATTCATCCC CAATACCCAA GGTGCTATTG841 CAGGCAACTT ACGTGAAGTG GGTCTCACCT TTCATTTATG GCCTAATGTG CCAACTTTGA901 TCTCCGAAAA TATAGAGAAA TGCTTAACTC AAGCTTTTGA CCCAATTGGA ATCAGCGATT961 GGAATTCCTT ATTTTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCAGC TATTCTTGAT GCAGTTGAAG1021 CAAAATTGAG TTTGGATAAA CAAAAACTTA AAGCAACAAG ACATGTTCTA AGTGAATATG1081 GGAACATGTC AAGGGCTTGT GTCTTGTTTA TTATGGACGA GATGAGAAAG AAATCGTTGA1141 AGGAAGAAAA AACAACAACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG CGTCTTGTTT GGCTTTGGAC1201 CAGGCCTAAC CATCGAGACT GTTGTCCTCC ACAGTATTCC TAGGGATTCC AATTGAGTGA1261 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS2基因全長序列1 AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGTGGTCCT TCTGAAGATG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTAATCGTTG GATCTGATCC AGATATCTCG ATTGAACGAC781 CACTCTTTCA ACTTGTTTCA GCAGCCCAAA CATTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCTATTG841 CAGGCAACTT ACGTGAAGTG GGTCTCACCT TTCATTTGTG GCCTAATGTG CCTACCTTGA901 TCTCCGAAAA CATTGAGAAT TGTTTGACTA AGGCTTTTGA CCCAATTGGT ATTAGTGATT961 GGAATTCCTT ATTCTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCAGC TATTCTCGAC GCAGTTGAAG1021 CAAAAGTCGG TTTAGATAAA CAGAAACTCA AAGCAACAAG GCATATTCTA AGTGAATATG
1081 GGAACATGTC AAGTGCATGT GTCTTATTTA TTTTGGACGA GATGAGAAAG AAATCGCTCA1141 AGGAAGGCAA AACGACAACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG TGTCTTGTTT GGCTTTGGGC1201 CAGGCCTAAC CATTGAGACC GTTGTGCTCC ATAGCGTTGG TACAGATTCA AACTAGGTGA1261 AATGATGGGA AAAGTTATTC ATGAGTCATG TTTTATTAAT CAAATAAAAG GTAGTGAAAA1321 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS3基因全長序列1 AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGAGGACCT TCCGAAGATG CTTTGGATTC TTTAGTTGGT CAAGCTCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTGATTGTTG GATCAGATCC AGATGTCTCA ATTGAAAGAC781 CCCTCTTCCA GCTCGTCTCA GCAGCCCAAA CGTTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCCATTG841 CGGGTAACTT ACGTGAGGTG GGACTCACTT TTCACTTGTG GCCTAATGTG CCTACATTGA901 TTTCCGAGAA TATAGAGAAA TACTTGACTC AAGCTTTTGA TCCACTTGGT ATTAGCGATT961 GGAACTCGTT ATTTTGGATT GCTCACCCTG GTGGCCCTGC AATTCTTGAT GCAGTTGAAG1021 CAAAACTCAA TTTAGATAAA AAGAAACTTG AAGCAACGAG GCATGTGCTA AGTGAGTATG1081 GAAACATGTC AAGTGCATGT GTATTGTTTA TTTTGGATGA GATGAGGAAG AAATCCCTTA1141 AGGGGGAAAA GGCCACCACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG AGTATTATTT GGTTTTGGGC1201 CGGGCTTAAC CATAGAGACT GTTGTGTTGC ATAGCATTCC TATGGTTTCC AATTGAGTGC1261 AAAAGAGTAA GAAAAATGAC AAATGATCCC TATCTTATTG AATTAAGGAG GTGTTAATAA1321 AGATATATAC ATATATCTAC AAAGTTAATA ATACTCCTAA ATTTTTTTAT CCCTATCATA1381 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS4基因全長序列1 AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA
601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGTGGTCCT TCCGAAGATG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTAATCGTTG GATCTGATCC AGATATCTCG ATTGAACGAC781 CACTCTTTCA ACTTGTTTCA GCAGCCCAAA CATTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCTATTG841 CAGGCAACTT ACGTGAAGTG GGTCTCACCT TTCATTTGTG GCCTAATGTG CCTACCTTGA901 TCTCCGAAAA CATTGAGAAT TGTTTGACTA AGGCTTTTGA CCCAATTGGT ATTAGTGATT961 GGAATTCCTT ATTCTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCAGC TATTCTCGAC GCAGTTGAAG1021 CAAAAGTCGG TTTAGATAAA CAGAAACTCA AAGCAACAAG GCATATTCTA AGTGAATATG1081 GGAACATGTC AAGTGCATGT GTCTTATTTA TTTTGGACGA GATGAGAAAG AAATCGCTCA1141 AGGAAGGCAA AACGACGACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG TGTCTTGTTT GGCTTTGGGC1201 CAGGCCTAAC CATTGAGACC GTTGTGCTCC ATAGCGTTGG TACAGATTCA AACTAAGTGA1261 AATGATGGGA AAAGTTATTC ATGAGTCATG TTTTATTAAT CAAATAAAAG GTAGTAAAGA1321 TAATGAATTG TTATTTTACG ATTGTTGGAG GACCTCCTCA AAGACCTCAA GTTAAAGTCA1381 TTGTTTATTC TTGTGTATGT TATCAAAATG AAGGAATAAT ATATCCGAGT TTTTGTTGAA1441 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS5基因全長序列1 AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT CCGAGGACCT TCCGAAGATG CTTTGGATTC TTTAGTTGGT CAAGCCCTTT721 TTGGCGATGG GTCTGCAGCT GTGATTGTTG GATCAGATCC AGATGTCTCG ATTGAACGGC781 CTCTTTTCCA ACTAGTTTCA GCAGCCCAAA CGTTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCCATTG841 CGGGTAACTT ACGTGAGGTG GGACTCACCT TTCACTTGTG GCCTAATGTG CCTACTTTGA901 TTTCCGAGAA CATAGAGAAA TGCTTGACTC AAGCTTTTGA TCCACTTGGT ATTAGCGATT961 GGAACTCGTT ATTTTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCTGC AATTCTTGAT GCAGTTGAAG1021 CAAAACTCAA TTTAGATAAA AAGAAACTTG AAGCAACAAG ACATGTGTTG AGTGAGTATG1081 GTAACATGTC AAGTGCATGT GTGTTGTTTA TTTTGGATGA GATGAGGAGG AAATCATTGA1141 AGGGGGAAAA TGGCACCACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG AGTATTGTTC GGTTTTGGAC1201 CAGGCTTGAC CATCGAGACC GTTGTGCTGC ATAGCGTACC TATGATTACA AATTGAGTGA1261 AGAATGATAA GAAAAGTTAT ATACAAGCCA TGTCTTATTG TATTAAGGAG GTGTTAATGA1321 AGATATATAT ATATCTCCAA AGCTTGTAAT AATCTTACAA TAATTTATTC CTATCATAAA1381 ATTGACGGAT TGTAATTTAG TGATCATTGG AGATTGTAGA GACCTCAAGT TAAAAAAGTG1441 AGACTTCAAG TTCTTGTCTT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA
中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS6基因全長序列1 AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GTAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGTGGTCCT TCCGAAGATG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTAATCGTTG GATCTGATCC AGATATCTCG ATTGAACGAC781 CACTCTTTCA ACTTGTTTCA GCAGCCCAAA CATTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCTATTG841 CAGGCAACTT ACATGAAGTG GGTCTCACCT TTCATTTGTG GCCTAATGTG CCTACCTTGA901 TCTCCGAAAA CATTGAGAAT TGTTTGACTA AGGCTTTTGA CCCAATTGGT ATTAGTGATT961 GGAATTCCTT ATTCTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCAGC TATTCTCGAC GCAGTTGAAG1021 CAAAAGTCGG TTTAGATAAA CGGAAACTCA AAGCAACAAG GCATATTCTA AGTGAATATG1081 GGAACATGTC AAGTGCATGT GTCTTGTTTA TTTTGGACGA GATGAGAAAG AAATCGCTCA1141 AGGAAGGAAA GACAACCACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG TGTTTTGTTT GGCTTTGGGC1201 CAGGCTTGAC CATTGAGACC GTTGTGCTAC ATAGCGTTCA AATGGATTCA AACTAAGTAA1261 AATGATAGGA AAAACGATTC ACGAGCCATG TTCTATTAAC CAAATATAGG TAGTAAAGAT1321 ATATCACCAT GAAATCATCT TTACTCAGAA TTTATTATTT GTTATTTATC GTTGTTGGAG1381 GACTTTTTAA GAGCCCTCAA GTTAAAATCA TTGTTTATCC TTGTGTATGT TATCAAAATG1441 AAAGAAATAA TGGATTTCTA TTTTGTTTAA AAAAAAAAGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA1501 AAAAAA中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)STS7基因全長序列1 AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGCGGCCCT TCCGAAGATG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTAATCGTAG GATCAGATCC GGATATCTCA ATTGAACGAC
781 CACTCTTCCA GCTTGTCTCA GCAGCCCAAA CATTTATTCC TAATTCTGCA GGTGCCATTG841 CAGGAAACTT ACGTGAGGTG GGACTCACCT TTCATTTGTG GCCCAATGTG CCCACTTTAA901 TTTCTGAGAA CATAGAGAAA TGTTTGACTC AGGCTTTTGA CCCACTTGGT ATTAGCGATT961 GGAACTCGTT ATTTTGGATT GCTCACCCAG GTGGCCCTGC AATTCTTGAT GCAGTTGAAG1021 CAAAACTCAA GTTAGATAAA AAGAAACTCG AAGCAACGAG GCATGTGCTA AGTGAGTATG1081 GAAACATGTC AAGTGCATGT GTGTTGTTTA TTTTGGATGA GATGAGAAAG AAATCCCTTA1141 AGGGGGAGAG GGCCACCACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG AGTATTATTC GGTTTTGGAC1201 CAGGCTTGAC TATTGAAACT GTTGTGTTGC ATAGCATTCC TATGGTTACA AATTAAGTGA1261 AGGAAAAGAG AATGGTCCCT TCAATGTCCT ATTATGTTGA ATAGGAGTAA GGTATTTATC1321 TCCGAAACTA AATTATACTC TTAAACTATT TTATTATTTT TTCTAAATTT AGATTGTAAT1381 CTAGTGATTG TTAGGCCCTC TTGGTGAGCT CAAATTAAAC GGTTGAGTTT CAAGTTCAGA1441 CTGTTTTATT ATCTTGAAGA TTCCCCAAAC ATTGTAATGT TGTGTTCATA TGAACATTGT1501 TGAAAAGTAA ATAAAAGAAA TATTGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA
權(quán)利要求
1.中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶基因序列，其特征在于，包括中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶STS1基因、STS2基因、STS3基因、STS4基因、STS5基因、STS6基因、STS7基因全長序列。
2.如權(quán)利要求1所述的基因序列，其特征在于，中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶STS1基因的1288bp全長序列是1AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC TGAGAATAAT GCAGGAGCAC GGGTTCTCGT GGTGTGCTCT GAGATCACCG661 TTGTTACATT CTGTGGGCCT TCTGAAACTG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG TTCTGCAGCT GTAATTGTTG GATCAGATCC AGATCTCTCG ATTGAACAAC781 CACTCTTCCA GCTAGTCTCG GCAGCCCAAA CATTCATCCC CAATACCCAA GGTGCTATTG841 CAGGCAACTT ACGTGAAGTG GGTCTCACCT TTCATTTATG GCCTAATGTG CCAACTTTGA901 TCTCCGAAAA TATAGAGAAA TGCTTAACTC AAGCTTTTGA CCCAATTGGA ATCAGCGATT961 GGAATTCCTT ATTTTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCAGC TATTCTTGAT GCAGTTGAAG1021 CAAAATTGAG TTTGGATAAA CAAAAACTTA AAGCAACAAG ACATGTTCTA AGTGAATATG1081 GGAACATGTC AAGGGCTTGT GTCTTGTTTA TTATGGACGA GATGAGAAAG AAATCGTTGA1141 AGGAAGAAAA AACAACAACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG CGTCTTGTTT GGCTTTGGAC1201 CAGGCCTAAC CATCGAGACT GTTGTCCTCC ACAGTATTCC TAGGGATTCC AATTGAGTGA1261 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA。
3.如權(quán)利要求1所述的基因序列，其特征在于，中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶STS2基因1343bp的全長序列是1 AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGTGGTCCT TCTGAAGATG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTAATCGTTG GATCTGATCC AGATATCTCG ATTGAACGAC781 CACTCTTTCA ACTTGTTTCA GCAGCCCAAA CATTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCTATTG841 CAGGCAACTT ACGTGAAGTG GGTCTCACCT TTCATTTGTG GCCTAATGTG CCTACCTTGA901 TCTCCGAAAA CATTGAGAAT TGTTTGACTA AGGCTTTTGA CCCAATTGGT ATTAGTGATT961 GGAATTCCTT ATTCTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCAGC TATTCTCGAC GCAGTTGAAG1021 CAAAAGTCGG TTTAGATAAA CAGAAACTCA AAGCAACAAG GCATATTCTA AGTGAATATG1081 GGAACATGTC AAGTGCATGT GTCTTATTTA TTTTGGACGA GATGAGAAAG AAATCGCTCA1141 AGGAAGGCAA AACGACAACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG TGTCTTGTTT GGCTTTGGGC1201 CAGGCCTAAC CATTGAGACC GTTGTGCTCC ATAGCGTTGG TACAGATTCA AACTAGGTGA1261 AATGATGGGA AAAGTTATTC ATGAGTCATG TTTTATTAAT CAAATAAAAG GTAGTGAAAA1321 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA。
4.如權(quán)利要求1所述的基因序列，其特征在于，中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶STS3基因1411bp的全長序列是1AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGAGGACCT TCCGAAGATG CTTTGGATTC TTTAGTTGGT CAAGCTCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTGATTGTTG GATCAGATCC AGATGTCTCA ATTGAAAGAC781 CCCTCTTCCA GCTCGTCTCA GCAGCCCAAA CGTTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCCATTG841 CGGGTAACTT ACGTGAGGTG GGACTCACTT TTCACTTGTG GCCTAATGTG CCTACATTGA901 TTTCCGAGAA TATAGAGAAA TACTTGACTC AAGCTTTTGA TCCACTTGGT ATTAGCGATT961 GGAACTCGTT ATTTTGGATT GCTCACCCTG GTGGCCCTGC AATTCTTGAT GCAGTTGAAG1021 CAAAACTCAA TTTAGATAAA AAGAAACTTG AAGCAACGAG GCATGTGCTA AGTGAGTATG1081 GAAACATGTC AAGTGCATGT GTATTGTTTA TTTTGGATGA GATGAGGAAG AAATCCCTTA1141 AGGGGGAAAA GGCCACCACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG AGTATTATTT GGTTTTGGGC1201 CGGGCTTAAC CATAGAGACT GTTGTGTTGC ATAGCATTCC TATGGTTTCC AATTGAGTGC1261 AAAAGAGTAA GAAAAATGAC AAATGATCCC TATCTTATTG AATTAAGGAG GTGTTAATAA1321 AGATATATAC ATATATCTAC AAAGTTAATA ATACTCCTAA ATTTTTTTAT CCCTATCATA1381 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A。
5.如權(quán)利要求1所述的基因序列，其特征在于，中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶STS3基因1468bp的全長序列是1AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGTGGTCCT TCCGAAGATG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTAATCGTTG GATCTGATCC AGATATCTCG ATTGAACGAC781 CACTCTTTCA ACTTGTTTCA GCAGCCCAAA CATTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCTATTG841 CAGGCAACTT ACGTGAAGTG GGTCTCACCT TTCATTTGTG GCCTAATGTG CCTACCTTGA901 TCTCCGAAAA CATTGAGAAT TGTTTGACTA AGGCTTTTGA CCCAATTGGT ATTAGTGATT961 GGAATTCCTT ATTCTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCAGC TATTCTCGAC GCAGTTGAAG1021 CAAAAGTCGG TTTAGATAAA CAGAAACTCA AAGCAACAAG GCATATTCTA AGTGAATATG1081 GGAACATGTC AAGTGCATGT GTCTTATTTA TTTTGGACGA GATGAGAAAG AAATCGCTCA1141 AGGAAGGCAA AACGACGACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG TGTCTTGTTT GGCTTTGGGC1201 CAGGCCTAAC CATTGAGACC GTTGTGCTCC ATAGCGTTGG TACAGATTCA AACTAAGTGA1261 AATGATGGGA AAAGTTATTC ATGAGTCATG TTTTATTAAT CAAATAAAAG GTAGTAAAGA1321 TAATGAATTG TTATTTTACG ATTGTTGGAG GACCTCCTCA AAGACCTCAA GTTAAAGTCA1381 TTGTTTATTC TTGTGTATGT TATCAAAATG AAGGAATAAT ATATCCGAGT TTTTGTTGAA1441 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA。
6.如權(quán)利要求1所述的基因序列，其特征在于，中國葡屬野生種華東葡芪合成酶STS3基因1492bp的全長序列是1 AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT CCGAGGACCT TCCGAAGATG CTTTGGATTC TTTAGTTGGT CAAGCCCTTT721 TTGGCGATGG GTCTGCAGCT GTGATTGTTG GATCAGATCC AGATGTCTCG ATTGAACGGC781 CTCTTTTCCA ACTAGTTTCA GCAGCCCAAA CGTTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCCATTG841 CGGGTAACTT ACGTGAGGTG GGACTCACCT TTCACTTGTG GCCTAATGTG CCTACTTTGA901 TTTCCGAGAA CATAGAGAAA TGCTTGACTC AAGCTTTTGA TCCACTTGGT ATTAGCGATT961 GGAACTCGTT ATTTTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCTGC AATTCTTGAT GCAGTTGAAG1021 CAAAACTCAA TTTAGATAAA AAGAAACTTG AAGCAACAAG ACATGTGTTG AGTGAGTATG1081 GTAACATGTC AAGTGCATGT GTGTTGTTTA TTTTGGATGA GATGAGGAGG AAATCATTGA1141 AGGGGGAAAA TGGCACCACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG AGTATTGTTC GGTTTTGGAC1201 CAGGCTTGAC CATCGAGACC GTTGTGCTGC ATAGCGTACC TATGATTACA AATTGAGTGA1261 AGAATGATAA GAAAAGTTAT ATACAAGCCA TGTCTTATTG TATTAAGGAG GTGTTAATGA1321 AGATATATAT ATATCTCCAA AGCTTGTAAT AATCTTACAA TAATTTATTC CTATCATAAA1381 ATTGACGGAT TGTAATTTAG TGATCATTGG AGATTGTAGA GACCTCAAGT TAAAAAAGTG1441 AGACTTCAAG TTCTTGTCTT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA。
7.如權(quán)利要求1所述的基因序列，其特征在于，中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶STS3基因1506bp的全長序列是1AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GTAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGTGGTCCT TCCGAAGATG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTAATCGTTG GATCTGATCC AGATATCTCG ATTGAACGAC781 CACTCTTTCA ACTTGTTTCA GCAGCCCAAA CATTTATTCC TAATTCAGCA GGTGCTATTG841 CAGGCAACTT ACATGAAGTG GGTCTCACCT TTCATTTGTG GCCTAATGTG CCTACCTTGA901 TCTCCGAAAA CATTGAGAAT TGTTTGACTA AGGCTTTTGA CCCAATTGGT ATTAGTGATT961 GGAATTCCTT ATTCTGGATT GCTCATCCAG GTGGCCCAGC TATTCTCGAC GCAGTTGAAG1021 CAAAAGTCGG TTTAGATAAA CGGAAACTCA AAGCAACAAG GCATATTCTA AGTGAATATG1081 GGAACATGTC AAGTGCATGT GTCTTGTTTA TTTTGGACGA GATGAGAAAG AAATCGCTCA1141 AGGAAGGAAA GACAACCACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG TGTTTTGTTT GGCTTTGGGC1201 CAGGCTTGAC CATTGAGACC GTTGTGCTAC ATAGCGTTCA AATGGATTCA AACTAAGTAA1261 AATGATAGGA AAAACGATTC ACGAGCCATG TTCTATTAAC CAAATATAGG TAGTAAAGAT1321 ATATCACCAT GAAATCATCT TTACTCAGAA TTTATTATTT GTTATTTATC GTTGTTGGAG1381 GACTTTTTAA GAGCCCTCAA GTTAAAATCA TTGTTTATCC TTGTGTATGT TATCAAAATG1441 AAAGAAATAA TGGATTTCTA TTTTGTTTAA AAAAAAAAGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA1501 AAAAAA。
8.如權(quán)利要求1所述的基因序列，其特征在于，中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶STS3基因1556bp的全長序列是1AACCCAGCTC CAAGAACGCT TCTCTTTCCT TCCTCAACTT AATCTTAAGC TTTCATTTCA61 GTACGTAGCT GGCATCAATG GCTTCAGTTG AGGAAATTAG AAACGCTCAA CGTGCCAAGG121 GTCCGGCCAC CATCCTAGCC ATTGGCACAG CTACTCCCGA CCACTGTGTC TACCAGTCTG181 ATTATGCTGA TTACTATTTC AGGGTCACTA AGAGCGAGCA CATGACTGAG TTGAAGAAGA241 AGTTCAATCG CATATGTGAC AAATCAATGA TAAAAAAGCG TTACATTCAT TTGACTGAAG301 AAATGCTTGA AGAACATCCA AACATTGGTG CTTATATGGC TCCATCTCTT AACATACGCC361 AAGAGATTAT CACAGCTGAG GTACCTAAGC TTGGTAAGGA AGCAGCATTG AAGGCACTTA421 AAGAGTGGGG CCAGCCAAAG TCCAAGATCA CCCACCTTGT ATTTTGTACA ACCTCTGGTG481 TAGAAATGCC TGGTGCTGAT TATAAACTTG CTAATCTCTT GGGTCTTGAA ACTTCAGTTA541 GAAGAGTTAT GTTGTACCAT CAAGGGTGCT ATGCAGGTGG AACTGTCCTT CGAACCGCTA601 AGGATCTTGC AGAGAATAAT GCAGGAGCAC GAGTTCTTGT GGTGTGCTCT GAGATCACTG661 TTGTTACATT TCGCGGCCCT TCCGAAGATG CTTTGGACTC TTTAGTTGGC CAAGCCCTTT721 TTGGTGATGG GTCTGCAGCT GTAATCGTAG GATCAGATCC GGATATCTCA ATTGAACGAC781 CACTCTTCCA GCTTGTCTCA GCAGCCCAAA CATTTATTCC TAATTCTGCA GGTGCCATTG841 CAGGAAACTT ACGTGAGGTG GGACTCACCT TTCATTTGTG GCCCAATGTG CCCACTTTAA901 TTTCTGAGAA CATAGAGAAA TGTTTGACTC AGGCTTTTGA CCCACTTGGT ATTAGCGATT961 GGAACTCGTT ATTTTGGATT GCTCACCCAG GTGGCCCTGC AATTCTTGAT GCAGTTGAAG1021 CAAAACTCAA GTTAGATAAA AAGAAACTCG AAGCAACGAG GCATGTGCTA AGTGAGTATG1081 GAAACATGTC AAGTGCATGT GTGTTGTTTA TTTTGGATGA GATGAGAAAG AAATCCCTTA1141 AGGGGGAGAG GGCCACCACA GGTGAAGGAT TGGATTGGGG AGTATTATTC GGTTTTGGAC1201 CAGGCTTGAC TATTGAAACT GTTGTGTTGC ATAGCATTCC TATGGTTACA AATTAAGTGA1261 AGGAAAAGAG AATGGTCCCT TCAATGTCCT ATTATGTTGA ATAGGAGTAA GGTATTTATC1321 TCCGAAACTA AATTATACTC TTAAACTATT TTATTATTTT TTCTAAATTT AGATTGTAAT1381 CTAGTGATTG TTAGGCCCTC TTGGTGAGCT CAAATTAAAC GGTTGAGTTT CAAGTTCAGA1441 CTGTTTTATT ATCTTGAAGA TTCCCCAAAC ATTGTAATGT TGTGTTCATA TGAACATTGT1501 TGAAAAGTAA ATAAAAGAAA TATTGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA。
9.權(quán)利要求1所述的中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶基因序列，在構(gòu)建植物表達載體提高植物的抗病性的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于通過基因工程使植物產(chǎn)生白藜蘆醇，上述涉及的植物包括小麥、番茄、水稻、玉米、大豆、油菜。
11.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于利用芪合成酶基因構(gòu)建原核表達載體表達該基因編碼蛋白及其構(gòu)建各種融合蛋的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及中國葡屬野生種華東葡萄芪合成酶基因序列及其應(yīng)用，本發(fā)明采用mRNA差異顯示技術(shù)(mRNA differential display reverasetranscriptional－PCR，DDRT－PCR)結(jié)合末端快速擴增技術(shù)(Rapid amplificationof cDNA ends，RACE)克隆了中國葡萄屬野生種華東葡萄(Vitispseudoreticulata)抗病相關(guān)基因一芪合成酶(stilbene synthase)基因家族成員7個，其大小分別為1288bp、1343bp、1411bp、1468bp、1492bp、1506bp和1556bp，它們均編碼392個氨基酸。該基因編碼產(chǎn)物芪合成酶能把1分子香豆酰輔酶A(P－Coumaroyl－CoA)和3分子丙二酰輔酶A(Malonyl－CoA)轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。白藜蘆醇作為一種植保素不僅抵抗病菌，還有抗氧化、預(yù)防心血管病和防癌、降血脂等作用。本發(fā)明涉及通過轉(zhuǎn)基因方法使小麥、番茄、水稻、玉米、大豆、油菜等植物具有合成白藜蘆醇的能力，提高這些植物的抗病性和增加其營養(yǎng)保健功能。
文檔編號C12N15/52GK1807604SQ20051004166
公開日2006年7月26日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日
發(fā)明者王躍進, 王西平, 徐偉榮, 郝煒 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)