專利名稱：魚類虹彩病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類虹彩病毒，特別是大黃魚虹彩病毒的定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，由虹彩病毒所引起的魚類養(yǎng)殖病害正日益加劇，已引發(fā)多種經(jīng)濟(jì)名貴魚如大黃魚、石斑魚、鱖魚、鲆魚、鱸魚、美國(guó)紅魚等大規(guī)模死亡。據(jù)估計(jì)每年由虹彩病毒所致水產(chǎn)病害造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元。對(duì)于魚類病毒性疾病，目前尚沒有特效的治療方法，病毒的早期檢測(cè)和診斷仍是最重要的防治手段。因此，建立快速靈敏實(shí)用的魚類虹彩病毒PCR檢測(cè)技術(shù)，不僅能快速診斷病因、及時(shí)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)虹彩病毒所致病害的發(fā)生，減少經(jīng)濟(jì)損失，而且也是今后加強(qiáng)科學(xué)養(yǎng)殖管理，建立種苗檢疫體系所必須的。
目前，對(duì)魚類虹彩病毒的檢測(cè)主要有電鏡觀察、常規(guī)組織學(xué)方法、免役組織化學(xué)法和原位雜交，但這些技術(shù)分別使用時(shí)，卻各有其局限性。電鏡觀察耗時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)用高并需要具備特殊的實(shí)驗(yàn)器材且視野較窄；組織病理觀察則不太適用于早期檢測(cè)，通常在病毒嚴(yán)重感染機(jī)體全身，產(chǎn)生明顯的、不可逆轉(zhuǎn)的組織病變時(shí)，方可得到確證；免疫組織化學(xué)法和原位雜交操作相對(duì)比較煩瑣，靈敏度不高，且不能對(duì)病毒進(jìn)行定量研究。PCR方法因?yàn)槠洳僮骱?jiǎn)單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于魚類虹彩病毒的檢測(cè)。日本學(xué)者Oshima等以虹彩病毒核糖核酸還原酶小亞基基因高度保守序列設(shè)計(jì)合成引物，建立的PCR檢測(cè)方法可用于真鯛虹彩病毒的早期診斷，但由于核糖核酸還原酶小亞基基因在各DNA病毒之間具有較高的同源性，利用其作為靶序列設(shè)計(jì)引物和建立PCR檢測(cè)方法，可能會(huì)發(fā)生非特異性擴(kuò)增，而影響PCR檢測(cè)的特異性。Tamai等以一段與蛙虹彩病毒3型具有高度同源性的片段作為特異性探針，研制了魚類虹彩病毒核酸探針檢測(cè)方法。在實(shí)際應(yīng)用中核酸探針檢測(cè)方法的主要不足是其操作過程繁瑣，且靈敏度不如PCR檢測(cè)技術(shù)。Mao等人根據(jù)脊椎動(dòng)物虹彩病毒主要衣殼蛋白基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增幾種脊椎動(dòng)物虹彩病毒的相應(yīng)序列，認(rèn)為該P(yáng)CR方法可應(yīng)用于魚類虹彩病毒的檢測(cè)，但其僅應(yīng)用于蛙病毒屬的虹彩病毒。近幾年國(guó)內(nèi)在魚類虹彩病毒的研究方面也取得了一些進(jìn)展，鄧敏等根據(jù)DNA病毒核糖核酸還原酶小亞基基因高度保守序列設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物，對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒基因組進(jìn)行了擴(kuò)增，并建立了PCR檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)室通過比較幾種虹彩病毒ATP酶基因序列，選擇其中比較保守的區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，建立了快速、簡(jiǎn)便的PCR檢測(cè)方法。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)巧妙的利用了PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、探針技術(shù)高特異性和光譜技術(shù)的敏感性及定量分析的優(yōu)點(diǎn)，克服了常規(guī)PCR定性檢測(cè)的一些不足，極大地提高了檢測(cè)的敏感性和特異性。目前，熒光定量PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種病毒的檢測(cè)，如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肝炎病毒、HIV、腺病毒等，但還未見熒光定量PCR應(yīng)用于虹彩病毒檢測(cè)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的思路是通過對(duì)發(fā)病魚排進(jìn)行流行病學(xué)及電鏡形態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)引起大黃魚、石斑魚等致病的病原為虹彩病毒。在廣泛查詢分析已報(bào)道虹彩病毒核酸序列的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)手段，確定以虹彩病毒ATPase基因保守區(qū)序列作為擴(kuò)增靶序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物，并根據(jù)引物擴(kuò)增部分的核苷酸序列設(shè)計(jì)了一條分子信標(biāo)探針。
通過優(yōu)化擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系，擴(kuò)增出一條約122bp的條帶，與預(yù)期相符。根據(jù)引物擴(kuò)增的序列，經(jīng)軟件分析設(shè)計(jì)了一條分子信標(biāo)探針，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該探針的熒光信號(hào)強(qiáng)度為19.9∶1，熒光淬滅效率為95％，表明該探針能與目的DNA較好的結(jié)合，其淬滅基團(tuán)具有較好的淬滅效率。將含擴(kuò)增靶序列的陽(yáng)性質(zhì)粒按7×108、7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、3.5×101拷貝數(shù)/μl系列稀釋，各取1ul做模板，以正常魚組織DNA做陰性對(duì)照，在熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果顯示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)(Ct)和起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在明顯的線形關(guān)系(R2＝0.998)，檢測(cè)的最小模板濃度為7×101拷貝數(shù)/μl，相當(dāng)于70個(gè)病毒粒子。然后分別以正常大黃魚DNA、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒DNA以及流行性造血組織壞死病毒DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以測(cè)試該方法檢測(cè)的特異性，結(jié)果僅虹彩病毒感染的魚組織能檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，而大黃魚DNA、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒DNA以及流行性造血組織壞死病毒DNA均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，證明該方法具有很好的檢測(cè)特異性；然后以LYCIV DNA為模板，分別用擴(kuò)增LYCIV主衣殼蛋白(MCP)基因以及DNA聚合酶基因的引物進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)，證明分子信標(biāo)探針具有很好的與目的DNA結(jié)合的特異性。
特異性及靈敏性實(shí)驗(yàn)表明了該P(yáng)CR檢測(cè)方法不僅可應(yīng)用于魚類虹彩病毒早期感染和潛伏感染的檢測(cè)的快速診斷，還能用于魚類虹彩病毒。


圖1分子信標(biāo)探針結(jié)構(gòu)示意圖；圖2不同拷貝數(shù)陽(yáng)性質(zhì)粒熒光PCR擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)曲線；(1～87×108～7×101拷貝，9陰性對(duì)照)圖3熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
具體實(shí)施例方式1.PCR模板的制備1.1分別取健康的、自然感染病毒大黃魚脾和腎，按1∶10(w/v)加入磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.2)，冰浴勻漿。
1.25000rpm，4℃離心10min。
1.3取勻漿離心上清300ul與DNA提取緩沖液等體積混合，同時(shí)加蛋白酶K至終濃度為100ul/ml，置37℃作用15min。
1.4加入400ul平衡好的酚，手搖10min后12000rpm離心5min。
1.5取上清用等體積的酚/氯仿/異丙醇(25∶24∶1)抽提1-2次。
1.6再用氯仿/異丙醇(24∶1)抽提一次以徹底去除蛋白。
1.7取上清加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃放置30min。
1.812000rpm，4℃離心30min，70％預(yù)冷乙醇洗一次，12000rpm離心10min。
1.9風(fēng)干后溶解于20μlTE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.PCR引物及探針查詢分析國(guó)際上已報(bào)道的虹彩病毒核酸序列，選取虹彩病毒ATPase基因保守區(qū)序列作為PCR擴(kuò)增的靶序列，設(shè)計(jì)合成了以下引物對(duì)P15’-CGTCACTGGAATGTTCTGGT-3’P25’-TTGTCCACACATGTCTGGCT-3’
預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為122bp。
根據(jù)引物之間的序列設(shè)計(jì)合成了一條分子信標(biāo)5’-Fam-GCCAGCCGTCTATACAACACCTCAGGCTGGC-Dabcyl-3’(劃線部分為發(fā)夾臂互補(bǔ)序列，其中5’的發(fā)夾臂與模板互補(bǔ)，斜體部分為與模板無(wú)關(guān)序列)。在其5’端標(biāo)記熒光染料Fam，而3’端則標(biāo)記熒光淬滅劑Dabcyl。
3.分子信標(biāo)熒光信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)在比色皿中加入100μl PCR反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2)，測(cè)定其熒光值(Fbuffer)；然后在再加入終濃度為50nM的分子信標(biāo)探針，5分鐘后測(cè)定其熒光值(Fclose)；最后在上述溶液中加入是分子信標(biāo)20倍摩爾濃度的目的DNA，5分鐘后測(cè)定其熒光值(Fopen)。分子信標(biāo)淬滅效率(Eff)按以下公式計(jì)算得出Eff＝〔1-(Fopen-Fbuffer)/(Fclose-Fbuffer)〕×100，分子信標(biāo)熒光信號(hào)強(qiáng)度按照以下公式計(jì)算得出(Fclose-Fbuffer)/(Fopen-Fbuffer)；。
4.PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系為無(wú)菌雙蒸水 15.4ul10倍反應(yīng)緩沖液(10×Buffer) 2.5ulMgCl2(25mM)2ul脫氧核糖核苷酸(dNTP)(2.5mM) 3ul引物1(12.5uM) 0.5ul引物2(12.5uM) 0.5ul分子信標(biāo)探針(12.5uM)0.6ul模板DNA 1ulTaq DNA聚合酶(5U/ul)0.5ul反應(yīng)條件為95℃預(yù)處理3min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)包括94℃30sec，54℃45sec，72℃45sec，于54℃時(shí)測(cè)定熒光值。
5.陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將鑒定好的質(zhì)粒，分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，并計(jì)算出拷貝數(shù)，然后分別稀釋成7×108、7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、3.5×101拷貝數(shù)/μl濃度梯度，按上述PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序在熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析得出不同拷貝數(shù)的Ct值，根據(jù)Ct值以及相應(yīng)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.熒光PCR特異性試驗(yàn)分別以正常大黃魚DNA、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndromevirus，WSSV)DNA以及流行性造血組織壞死病毒(EHNV)DNA作為模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增以測(cè)試該方法檢測(cè)的特異性；以LYCIV DNA為模板，分別用擴(kuò)增LYCIV主衣殼蛋白(MCP)基因以及DNA聚合酶基因的引物進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)分子信標(biāo)與目的DNA結(jié)合的特異性。
權(quán)利要求
1.一種魚類虹彩病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于選取虹彩病毒ATPase基因保守區(qū)序列作為PCR擴(kuò)增的靶序列，設(shè)計(jì)合成特異性的引物和分子信標(biāo)探針，對(duì)魚類虹彩病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類虹彩病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于設(shè)計(jì)合成了以下引物對(duì)和分子信標(biāo)探針P15’-CGTCACTGGAATGTTCTGGT-3’P25’-TTGTCCACACATGTCTGGCT-3’5’-Fam-GCCAGCCGTCTATACAACACCTCAGG CTGGC-Dabcyl-3’
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類虹彩病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于對(duì)大黃魚、石斑魚、美國(guó)紅魚、鱸魚、真鯛等在內(nèi)的魚類虹彩病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類虹彩病毒PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系為無(wú)菌雙蒸水 15.4ul10倍反應(yīng)緩沖液(10×Buffer) 2.5ulMgCl2(25mM)2ul脫氧核糖核苷酸(dNTP)(2.5mM) 3ul引物1(12.5uM) 0.5ul引物2(12.5uM) 0.5ul分子信標(biāo)探針(12.5uM)0.6ul模板DNA 1ulTaqDNA聚合酶(5U/ul) 0.5ul反應(yīng)條件為95℃預(yù)處理3min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)包括94℃30sec，54℃45sec，72℃45sec，于54℃時(shí)測(cè)定熒光值。特異性及靈敏性實(shí)驗(yàn)表明了該P(yáng)CR檢測(cè)方法不僅可應(yīng)用于魚類虹彩病毒早期感染和潛伏感染的檢測(cè)的快速診斷，還能用于魚類虹彩病毒。
全文摘要
本發(fā)明是通過對(duì)發(fā)病魚排進(jìn)行流行病及電鏡形態(tài)學(xué)分析，引起大黃魚、石斑魚等致病的病原為虹彩病毒。確定以虹彩病毒ATPase基因保守區(qū)序列作為擴(kuò)增靶序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物和一條分子信標(biāo)探針應(yīng)用于對(duì)魚類虹彩病毒的定量檢測(cè)。根據(jù)不同濃度梯度的陽(yáng)性質(zhì)粒制作的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，不同梯度定量模板數(shù)的對(duì)數(shù)值與Ct值之間有較好的相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.998；同時(shí)，該檢測(cè)方法具有很高的靈敏度，最低能檢測(cè)到70個(gè)病毒粒子。對(duì)其他病毒以及LYCIV其他基因進(jìn)行檢測(cè)表明，該方法具有很好的特異性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1827778SQ200510042129
公開日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2005年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月2日
發(fā)明者陳新華, 王小文 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所